Studere membranproteinhandel i Drosophila Fotoreseptorceller ved hjelp av eGFP-taggede proteiner

GFP-taggede fotoreseptorproteiner, som ionkanalen TRPL GFP, lar oss studere proteintransport i nevroner ved hjelp av ikke-invasive teknikker. Denne metoden kan også brukes til å overvåke fotoreseptordegenerasjon. Dermed kan det molekylære grunnlaget for arvelige sykdommer som resulterer i blindhet hos mennesker studeres i Drosophila-øyet.

Cellulær lokalisering av GFP-merkede proteiner kan vurderes ved å observere fluorescensen i den dype pseudopupilen eller ved vanninnlevelsesmikroskopi. Begge metodene tillater rask bestemmelse av lokalisering av visuelle proteiner og observere strukturelle feil av rabdomer på grunn av degenerasjon av fotoreseptorceller. For å få bilder av høy kvalitet er det viktigste aspektet retningen til flyøyet.

Mens man utfører denne teknikken, bør man fokusere på ommatidia som ligger litt mot øyets periferi. Jeg vil demonstrere prosedyren for DPP-avbildning, mens de to teknikkene ved hjelp av vanninnlevelsesmikroskopi vil bli demonstrert av min kollega, Dr.Krystina Wagner og Matthias Zeger, en ph.d.-student i vår gruppe. For å begynne dyp pseudopupil, eller DPP, bildebehandling, bedøve en-til-tre-dagers-gamle fluer, og plassere en av dem i midten av mikroskopet mål på sin side slik at enten venstre eller høyre øye står overfor målet nøyaktig radially.

Øk forstørrelsen slik at den passer til hele øyet, og midtstill øyets sentrale ommatidia. Hvis det er mulig, reduser dybden på mikroskopet ved å justere dobbel-irismembranen til en grunne innstilling. Slå deretter på UV-lampen på mikroskopet med maksimal intensitet.

Velg deretter mikroskopets fluorescensfiltersett i henhold til fluorescensproteinet uttrykt i øynene, og sett lysbanen mot det mikroskopmonterte kameraet. Bruk funksjonen for direkte bildebehandling i programvaren til å justere lysstyrken i bildet til en innstilling som bare oppdager bestemte signaler fra øyet ved å øke eksponeringstiden og oppnå verdi. Juster mikroskopfokuset inn i øyet for å generere det overliggende bildet av DPP.

Ta deretter et øyeblikksbilde av den fluorescerende DPP. For å forberede en flue i en dødelig variasjon, fest et stykke Plasticine på et objektsklie og et annet stykke inn i midten av en Petri-tallerken. Fyll Petri-fatet med iskjølt destillert vann og noen isflak.

Legg deretter en isbedøvelsesfly under et stereomikroskop på toppen av plasticine-belagt objektsklie. Snu flyet på ryggen, og pierce en insektpinne gjennom midten av thoraxen. Fest pinnen horisontalt på den plasticine-belagte gjenstandsskuffen, og orienter enten venstre eller høyre øye på fluen oppover.

Fest deretter objektskuffen forsiktig med den plasticinefrie siden vendt ned i Petri-parabolen, og forhindre rotasjon av flyhodet. Pass på at flyøyet er dekket med vann. Alternativt, for å forberede en flue i en ikke-dødelig variasjon, overfør det isbedøvelsesflyhodet først til en 200-mikroliter pipettespiss, og skyv forsiktig flyet mot spissen med trykkluft.

Deretter, ved hjelp av en skalpell, kutt av pipettespissen rett foran hodet, og bruk pinsett forsiktig skyv flyet noen få millimeter inn i pipettespissen. Klipp av pipettespissen igjen, og skyv flyet tilbake mot spissen med trykkluften slik at bare flyets hode stikker ut fra pipettespissen. Når du har sett et stykke Plasticine på et objektsklie, trykker du pipettespissen inn i den slik at venstre eller høyre øye vender oppover.

Pass på at øyet er riktig orientert under mikroskopet. Velg et mål for vanninnlevelse for bildeanskaffelse. Ved ikke-dødelig variasjon, bruk en laboratoriepipette for å feste en stor dråpe kjølt vann til undersiden av vanninnlevelsesmålet.

Plasser objektskuffen forsiktig med den forberedte fluen på mikroskopstadiet. Senk deretter vanninnlevelsesmålet manuelt til det kommer i kontakt med vannoverflaten eller flyets øye berører dråpen. Deretter bytter du lysbanen mot mikroskopkameraet og genererer et levende bilde.

Juster fokuset for kameraet, og evaluer øyets retning, med tanke på at øyet må møte mikroskopmålet radialt. Bruk oppslagstabellprogramvaren til å oppdage overmetning. Når det gjelder ikke-pigmenterte fluer, juster eksponeringstiden slik at de lyseste pikslene er like under metningsgrensen for hvert bilde.

Ta opp et bilde, og lagre det som en rå fil for å arkivere alle tilsvarende metadata for innspillingen. Deretter eksporterer du bildet i et tif-format. Hvis du vil kvantifisere relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres av mikrografer for vanninnlevelse, justerer du ImageJ-innstillingene ved å klikke på Analyser, deretter Angi målinger og bare merke av i boksen for Middelgrå verdi.

Importer tif-bildet ved å klikke på Fil og deretter Åpne. Velg et representativt område av bildet i fokus, og forstørr det til 200 til 300 %, ved å trykke kontroll og sammen gjentatte ganger. Deretter velger du ellipseverktøyet, og mens du trykker skifttasten, genererer du en sirkulær markering i bildet som er betydelig mindre enn én fluorescerende rhabdomere.

Deretter ser du etter den nøyaktige størrelsen som vises under verktøylinjen i hovedvinduet i ImageJ. Hvis du vil måle fluorescensintensitetene i sirkelvalget, flytter du sirkelen til den første rhabdomereen med piltastene på tastaturet, og deretter klikker du Analyser og deretter Mål. Et resultatvindu som viser den målte grå verdien, dukker opp.

Fortsett med målinger av rabdomer to til seks, og mål også bakgrunnssignalet. Når det gjelder ikke-pigmenterte fluer, gjør du ytterligere målinger av de tilsvarende cellekroppsområdene. Mål fluorescensen til to ommatidia, noe som resulterer i tre tekniske repliker.

Merk den analyserte ommatidien ved hjelp av blyantverktøyet, og lagre dette bildet for dokumentasjon. Velg og kopier de målte grå verdiene fra resultatvinduet, og lim dem inn i regnearkprogramvaren for ytterligere beregninger. Sorter fluorescensintensitetsverdiene i henhold til opprinnelsen i kategoriene rhabdomere, cellekropp og bakgrunn, og beregn gjennomsnittsintensiteten fra hver kategori.

Beregn deretter den relative mengden eGFP som er tilstede i rhabdomere ved hjelp av den første formelen for ikke-pigmenterte øyne og den andre for pigmenterte øyne. Alternativt, for å kvantifisere øyemorfologi ved eGFP fluorescens i vann-nedsenkningsmikrografer, velg tre tilstøtende ommatidia i en representativ region av bildet som er i fokus. Evaluer de 18 rabdomere av utvalget individuelt i henhold til deres eGFP-intensitet, kantskarphet og kontrast med hensyn til det omkringliggende bakgrunnssignalet.

Til slutt scorer du de tydelig synlige rhabdomeres med en verdi på to, ukentlige synlige rhabdomeres med en verdi på en, og fraværende rhabdomeres med en verdi på null for å generere en degenerasjonsindeks. I transgene Drosophila-fluer som uttrykker et eGFP TRPL-fusjonsprotein, forsvinner rabdomeral fluorescens i lys på grunn av translokasjon av eGFP TRPL. Dette gjør det mulig å utføre en genetisk skjerm for å identifisere mutanter som er defekte i internaliseringen av eGFP TRPL.

I kontrollfluer translokaliserer eGFP TRPL ut av rhabdomeres inn i cellekroppen etter 16 timers belysning, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av rhabdomeral fluorescens sammenlignet med den mørktilpassede tilstanden. Den andre mørke inkubasjonen øker rhabdomeral fluorescens igjen mot startverdien. Men i TRPL-translokasjonen defekt mutant vps35MH20 endres fluorescensmønsteret ikke drastisk etter 16 timers belysning og en påfølgende mørk tilpasning i 24 timer.

Denne kvantifiseringsmetoden kan oppdage en statistisk svært betydelig resirkuleringsfeil. Hviteøyne fluer tillater påvisning av fluorescenssignaler fra både rhabdomere og cellekropp. I motsetning, i rødøyde fluer, kan fluorescenssignaler bare påvises i rabdomerer, men ikke i cellekroppen.

Når det gjelder kvantifisering av retinal degenerasjon, kan eGFP TRP fluorescens vurderes i løpet av flere uker. Når den holdes i en 12-timers lys, 12-timers mørk syklus i to uker, falt degenerasjonsindeksen i mutante fluer, men ikke i kontrollfluer. I denne protokollen må man skille mellom pigmenterte og ikke-pigmenterte øyne.

Siden pigmentering påvirker fluorescerende signal, har kvantitativ vann-nedsenkningsmikroskopi blitt optimalisert for begge tilfeller individuelt. DPP-avbildning og mikroskopi for vanninnlevelse er metoder med høy gjennomstrømning med begrenset oppløsning. For å undersøke subcellulær lokalisering anbefaler vi immunfluorescensmikroskopi på vevsseksjoner.

For en detaljert analyse av degenerative fenotyper kan elektronmikroskopi utføres.