Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63377
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

Abstract

Microtubules הם פולימרים של הטרודימרים αβ-tubulin המארגנים למבנים נפרדים בתאים. ארכיטקטורות ורשתות מבוססות Microtubule מכילות לעתים קרובות תת-קבוצות של מערכי מיקרוטובולים השונים במאפייניהם הדינמיים. לדוגמה, בתאים מתחלקים, חבילות יציבות של מיקרוטובולות מקושרות מתקיימות בסמיכות למיקרוטובולות דינמיות שאינן מקושרות. מחקרי שחזור במבחנה מבוססי מיקרוסקופיה TIRF מאפשרים הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מערכי מיקרוטובולה שונים אלה. בבדיקה זו, תא הדמיה מורכב עם microtubules משותק פני השטח, אשר נמצאים גם חוטים בודדים או מאורגן לתוך חבילות מוצלבות. המבוא של טובולין, נוקלאוטידים, ויסותים חלבון מאפשר הדמיה ישירה של חלבונים הקשורים ושל תכונות דינמיות של microtubules יחיד מוצלב. יתר על כן, שינויים המתרחשים כמו microtubules יחיד דינמי לארגן לתוך חבילות ניתן לפקח בזמן אמת. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הערכה שיטתית של הפעילות והלוקליזציה של חלבונים בודדים, כמו גם השפעות סינרגטיות של רגולטורים של חלבונים על שתי תתי-קבוצות מיקרוטובולה שונות בתנאים ניסיוניים זהים, ובכך מספקת תובנות מכאניסטיות שאינן נגישות בשיטות אחרות.

Introduction

מיקרוטובולים הם ביופולימרים היוצרים פיגומים מבניים החיוניים לתהליכים תאיים מרובים, החל מתחבורה תאית ומיצוב אברונים ועד לחלוקת תאים והתארכות. כדי לבצע פונקציות מגוונות אלה, microtubules בודדים מאורגנים לתוך מערכים בגודל מיקרון, כגון צירים מיטוטיים, אקסונמים ciliary, חבילות עצביות, מערכים אינטרפאזי, ומערכים קליפת המוח הצמחית. מוטיב אדריכלי הנמצא בכל מקום במבנים אלה הוא צרור של מיקרוטובולים המקושרים לאורכם1. מאפיין מסקרן של מספר מבנים מבוססי מיקרוטובולה הוא הדו-קיום של מיקרוטובולים ארוזים ומיקרוטובולות בודדות שאינן מקושרות בקרבה מרחבית קרובה. תת-אוכלוסיות מיקרוטובולות אלה יכולות להציג דינמיקת פילמור שונה בתכלית זו מזו, לפי הצורך לתפקודן התקין 2,3,4,5.5. לדוגמה, בתוך הציר המיטוטי, חבילות מקושרות יציבות ומיקרוטובולות בודדות דינמיות נמצאות בתוך אזור בקנה מידה מיקרוני במרכז התא6. לימוד האופן שבו המאפיינים הדינמיים של אוכלוסיות מיקרוטובולות מתקיימות יחד מצוין הוא, אם כן, מרכזי להבנת ההרכבה והתפקוד של מבנים מבוססי מיקרוטובולה.

מיקרוטובולים הם פולימרים דינמיים העוברים בין שלבי פילמור ודה-פילמור, ועוברים בין שני השלבים באירועים המכונים קטסטרופה והצלה7. הדינמיקה של מיקרוטובולים תאיים מוסדרת על ידי חלבונים נלווים Microtubule רבים (MAPs) המווסתים את שיעורי פילמור microtubule ו depolymerization ואת התדרים של קטסטרופה ואירועי הצלה. זה מאתגר לחקור את הפעילות של MAPs על מערכים פרוקסימליים מרחביים בתאים, בשל המגבלות של רזולוציה מרחבית במיקרוסקופיה קלה, במיוחד באזורים של צפיפות microtubule גבוהה. יתר על כן, נוכחותם של מספר MAPs באותו אזור תאי מעכבת פרשנויות של מחקרים ביולוגיים של התא. בדיקות שיחזור במבחנה, המבוצעות בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית השתקפות פנימית כוללת (TIRF), עוקפות את האתגרים של בחינת מנגנונים שבאמצעותם תת-קבוצות ספציפיות של MAPs מווסתות את הדינמיקה של מערכי מיקרוטובולה תאיים פרוקסימליים. כאן, הדינמיקה של microtubules מורכב במבחנה נבדקים בנוכחות אחד או יותר MAPs רקומביננטי בתנאים מבוקרים8,9,10. עם זאת, בדיקות שיקום קונבנציונליות מבוצעות בדרך כלל על מיקרוטובולות בודדות או על סוג אחד של מערך, ומונעות הדמיה של אוכלוסיות דו-קיום.

כאן, אנו מציגים בדיקות שיחזור במבחנה המאפשרות הדמיה סימולטנית של שתי אוכלוסיות microtubule תחת אותם תנאי פתרון11. אנו מתארים שיטה כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של MPs מרובים על microtubules יחיד ועל חבילות microtubule מוצלב על ידי ציר מיטואטי הקשורים חלבון PRC1. החלבון PRC1 נקשר באופן מועדף בחפיפה בין מיקרוטובולות אנטי-מקביליות, ומקשר אותן 9. בקצרה, פרוטוקול זה מורכב מהשלבים הבאים: (1) הכנת פתרונות מלאי ורגנטים, (ii) ניקוי וטיפול על פני השטח של כיסויים המשמשים ליצירת תא ההדמיה לניסויים במיקרוסקופיה, (iii) הכנת "זרעים" מיקרוטובוליים יציבים שמהם מתבצעת פילמור במהלך הניסוי, (4) מפרט של הגדרות מיקרוסקופ TIRF להדמיית דינמיקת מיקרוטובולה, (v) הטמעת זרעי מיקרוטובולה ויצירת חבילות מיקרוטובולה מקושרות בתא ההדמיה, ו-(vi) הדמיה של דינמיקת מיקרוטובול בתא ההדמיה באמצעות מיקרוסקופיה TIRF, בתוספת טובולין מסיס, MAPs ונוקלאוטידים. בדיקות אלה מאפשרות הערכה איכותית ובדיקה כמותית של לוקליזציה MAP והשפעתן על הדינמיקה של שתי אוכלוסיות מיקרוטובולות. בנוסף, הם מאפשרים את ההערכה של השפעות סינרגטיות של MAPs מרובים על אוכלוסיות microtubule אלה, על פני מגוון רחב של תנאים ניסיוניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכינו ריאגנטים

  1. הכן מאגרים ורגנטים כמפורט בטבלה 1 ובטבלה 2. במהלך הניסוי, לשמור את כל הפתרונות על קרח, אלא אם כן צוין אחרת.
תמיסה רכיבים משך אחסון מומלץ הערות
5X BRB80 400 מ"מ K-PIPES, 5 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ EGTA, pH 6.8 עם KOH, מסנן לחיטוי עד שנתיים יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F)
1X BRB80 80 מ"מ K-PIPES, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ EGTA, pH 6.8 עד שנתיים יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F)
BRB80-DTT 1X BRB80, 1 מ"מ DTT עד יומיים
מאגר בדיקה 80 מ"מ K-PIPES, 3 מ"מ MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8, 5% סוכרוז (OR 1X BRB80, 5% סוכרוז, 2 מ"מ MgCl2) עד שנה אחת יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F)
מאגר ראשי (MB) מאגר בדיקה, 5mM TCEP שבוע אחד היכונו ביום הניסוי; נפרדים לשתי שפופרות: MB-חם בטמפרטורת החדר ו MB-קר על קרח; כוללים 1 מ"מ DTT אם אתה משתמש בצבעי פלואורסצנט
מאגר ראשי עם מתיל-צלולוז (MBMC) 1X BRB80, 0.8% מתיל צלולוז, 5 מ"מ TCEP, 5 מ"מ MgCl2 שבוע אחד היכונו ביום הניסוי; כוללים 1 מ"מ DTT אם אתה משתמש בצבעי פלואורסצנט
מאגר דילול חלבונים (DB) MB, 1 מ"ג/ מ"ל סרום בקר אלבומין (BSA), 1 מיקרומטר ATP יום אחד, על הקרח היכונו ביום הניסוי; כוללים 1 מ"מ DTT אם אתה משתמש בצבעי פלואורסצנט
תערובת ניקוי חמצן (OSM) MB, 389 מיקרוגרם/ מ"ל קטלאז, 4.44 מ"ג / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 15.9 מ"מ M 2-mercaptoethanol (BME) יום אחד, על הקרח היכונו ביום הניסוי
גמר ניקוי חמצן (OSF) MB, 350 מיקרוגרם/מ"ל קטלאז, 4 מ"ג/מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 14.3 מ"מ BME, 15 מ"ג/מ"ל גלוקוז לשימוש תוך 30 דקות הכנה מיד לפני השימוש על ידי הוספת 1 μL של גלוקוז ל 9 μL של OSM

טבלה 1: רשימת המאגרים המשמשים בפרוטוקול זה וברכיבים שלהם. עיין בעמודה "משך אחסון מומלץ" לקבלת הדרכה לגבי כמה זמן מראש ניתן להכין כל מאגר.

מגיב ריכוז אחסון ממס אחסון טמפרטורת אחסון ריכוז עבודה ריכוז סופי משך אחסון מומלץ הערות
נויטרווידין (NA) 5 מ"ג/מ"ל 1X BRB80 -80°C 0.2 מ"ג/מ"ל 0.2 מ"ג/מ"ל עד שנה אחת משמש לשתק microtubules באמצעות הצמדת ביוטין-neutravidin-ביוטין; חנות ב aliquots קטן
קאפה-קזאין (KC) 5 מ"ג/מ"ל 1X BRB80 -80°C 0.5 מ"ג/מ"ל 0.5 מ"ג/מ"ל עד שנתיים משמש לחסימת משטח תא ההדמיה; לאחסן ב aliquots קטן; ביום הניסוי, הניחו נפח קטן בצד בטמפרטורת החדר
סרום בקר אלבומין (BSA) 50 מ"ג/מ"ל 1X BRB80 -20°C 1 מ"ג /מ"ל (ב- DB) N/A עד שנתיים חנות ב aliquots קטן
קטלאזה 3.5 מ"ג/מ"ל 1X BRB80 -80°C 350 מיקרוגרם/מ"ל (ב-OSF) 35 מיקרוגרם/מ"ל עד שנתיים רכיב של תערובת ניקוי חמצן; חנות ב aliquots קטן
גלוקוז אוקסידאז 40 מ"ג/מ"ל 1X BRB80 -80°C 4 מ"ג/מ"ל (ב-OSF) 0.4 מ"ג/מ"ל עד שנתיים רכיב של תערובת ניקוי חמצן; חנות ב aliquots קטן
טובולין ליופילציה N/A 4°C 10 מ"ג/מ"ל 2.12 מ"ג/מ"ל (בתערובת טובולין) עד שנה אחת ברגע טובולין הוא פתרון, לשמור אותו קר כדי למנוע פילמור.
אדנוזין טריפוספט (ATP) 100 מ"ר מים אולטרה-פור -20°C 10 מ"מ 1 מ"מ 6 חודשים הכינו פתרון במים מעוקרים במסננים, התאימו את רמת החומציות ל-7.0 אירו (pH) והקפאו באותיות קטנות.
גואנוסין טריפוספט (GTP) 100 מ"ר מים אולטרה-פור -20°C 10 מ"מ 1.29 מ"מ (בתערובת טובולין) 6 חודשים הכינו פתרון במים מעוקרים במסננים, התאימו את רמת החומציות ל-7.0 אירו (pH) והקפאו באותיות קטנות.
גואנוסין-5'-[(α,β)-מתילנו] טריפוספט (GMPCPP) 10 מ"מ מים אולטרה-פור -20°C 10 מיקרומטר 0.5 מיקרומטר 6 חודשים
Dithiothreitol (DTT) 1 מטר מים סטריליים -20°C 1 מ"מ N/A עד שנתיים
טריס (2 קרבוקסיתיל) פוספין (TCEP) 0.5 מטר מים מעוקרים במסנן טמפרטורת החדר 5 מ"מ N/A עד שנתיים
מתילצלולוז 1% מים סטריליים טמפרטורת החדר 0.8% (ב-MBMC) 0.21% (בתערובת טובולין) עד שנה אחת להמיס מתיל צלולוז על ידי הוספתו לאט למים כמעט רותחים. אפשר להתקרר תוך ערבוב מתמיד.
בטא-מרקפטואתנול (BME) 143 מ"מ מים סטריליים טמפרטורת החדר 14.3 מ"ק (ב-OSF) 1.43 מ"ק עד 5 שנים 143 mM הוא דילול 1:100 של מניות BME
גלוקוז 150 מ"ג/מ"ל 1X BRB80 -80°C 15 מ"ג/מ"ל (ב-OSF) 1.5 מ"ג/מ"ל עד שנתיים הוסף ל- OSM מיד לפני השימוש
(±)-6-הידרוקסי-2,5,7,8-טטרמתיל כרומאן-2-חומצה קרבוקסילית (Trolox) 10 מטר 1X BRB80 -80°C 10 מ"מ 1 מ"מ עד שנה אחת אינו מתמוסס לחלוטין. מוסיפים מעט NaOH, מערבבים כ-4 שעות ומסננים לפני השימוש
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 אבקה N/A -20°C 333 מ"ג/מ"ל
(ב 0.1 M נתרן ביקרבונט)		 324 מ"ג/מ"ל
(ב 0.1 M נתרן ביקרבונט)		 6 חודשים הכן ~ 34 מ"ג aliquots, סימון כל צינור עם משקל מדויק של אבקה. מעבירים גז חנקן מעל הצינורות המוצקים, האטומים עם parafilm, ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס במיכל עם ייבוש.
ביוטין-PEG-SVA, MW 5,000 אבקה N/A -20°C 111 מ"ג/מ"ל
(ב 0.1 M נתרן ביקרבונט)		 3.24 מ"ג /מ"ל (ב 0.1 M נתרן ביקרבונט) 6 חודשים הכן ~ 3 מ"ג aliquots, סימון כל צינור עם משקל מדויק של אבקה. מעבירים גז חנקן מעל הצינורות המוצקים, האטומים עם parafilm, ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס במיכל עם ייבוש.

טבלה 2: רשימת הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. כלולים תנאי האחסון והריכוזים המומלצים, ריכוזי עבודה של פתרונות מלאי המשמשים במהלך הניסוי, וריכוז סופי בתא ההדמיה. הערות נוספות ניתנות בעמודה השמאלית-קיצונית.

2. הכינו שקופיות ביוטין-PEG

הערה: הכינו תאי הדמיה קרוב ככל האפשר לתחילת הניסוי, ולא יותר משבועיים מראש.

  1. כתמי כיסוי נקיים
    1. מקם מספר שווה של 24 x 60 מ"מ ו-18 x 18 מ"מ #1.5 כיסויים (איור 1F) בצנצנות מכתימות שקופיות ובמתלים לשטיפת שקופיות, בהתאמה (איור 1A,B). מניחים את מתלים לשטיפת שקופיות המכילים כיסויים בגודל 18 x 18 מ"מ בכוס בגודל 100 מ"ל.
    2. יש לשטוף את כל כיסויי הכיסוי 5-6 פעמים במים אולטרה-פוריים (התנגדות של 18.2 MΩ-ס"מ) ולהסיר נוזל עודף לאחר כל שטיפה עם קצה פיפטה המחובר לצינור ואקום (איור 1C).
    3. מלאו כוסות וצנצנות מכתימות שקופיות המכילות את כיסויי הכיסוי במים אולטרה-פורר, אטמו עם parafilm, ו sonicate במשך 10 דקות.
    4. מלאו שתי כוסות 150 מ"ל עם אתנול 200 חסין. בעזרת פינצטה, טובלים כל כיסוי לכוס אחת מלאה באתנול, ולאחר מכן השנייה.
    5. באמצעות פינצטה, העבירו כיסויים למתלה לייבוש החלקות (איור 1D), ייבשו אותם תחת זרם גז חנקן ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס עד לייבוש מלא (כ-15 דקות).
    6. מניחים את כיסויי הכיסוי היבשים בשכבה אחת בתוך מנקה הפלזמה. צור חותם ואקום ולאחר מכן הגדר את רמת תדר הרדיו (RF) של מנקה הפלזמה ל- ~ 8 MHz.
    7. לאחר הפלזמה נוצרת, להשאיר כיסויים מנקה פלזמה במשך 5 דקות. כבה את מנקה הפלזמה ושחרר את הוואקום לאט.
    8. לאחר שחרור חותם ואקום, להפוך את כיסויים מעל ולחזור על ניקוי פלזמה במשך 5 דקות עבור הצד השני של כיסויים.
    9. חלופה לניקוי פלזמה: במקום שלבים 2.1.2-2.1.3, sonicate מכסה אתlips בתמיסה חמה של 2% דטרגנט (במים אולטרה-פור) במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף ביסודיות כיסויים עם מים ultrapure sonicate במים אולטרה-פור 2-3 פעמים (10 דקות כל אחד). לאחר מכן, לשטוף אתנול ויבש כמו בשלבים 2.1.4-2.1.5. דלג על שלבים 2.1.6-2.1.8.
  2. טיפול ביוטין-PEG
    1. מיד לפני השימוש, להמיס 400 μL של 3-Aminopropyltriethoxysilane ב 40 מ"ל של אצטון. באמצעות פינצטה, העבירו כיסויים לניקוי פלזמה לתוך מתלה שטיפת השקופיות וצנצנות מכתימות שקופיות. כיסויי שקיעה בתמיסת 3-Aminopropyltriethoxysilane ודגרו במשך 5 דקות12,13.
    2. לשטוף את כל כיסויים 5-6 פעמים עם מים אולטרה-איפור.
    3. מעבירים כיסויים למתלה ייבוש החלקות, מייבשים אותם תחת זרם גז חנקן ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לייבוש מלא (כ-20 דקות).
    4. הניחו את כיסויי הכיסוי היבשים על מגבוני משימה עדינים ותייגו כל כיסוי בפינה אחת, למשל, 'p' על כל כיסוי בגודל 18 x 18 מ"מ ו-'b' על כל כיסוי בגודל 24 x 60 מ"מ (ראו איור 2).
    5. ביום הניסוי, להכין פתרון טרי 0.1 M נתרן ביקרבונט על ידי המסת 0.84 מ"ג של NaHCO3 ב 10 מ"ל של מים אולטרה-פור.
    6. הביאו את ה-aliquots של mPEG-Succinimidyl Valerate (PEG-SVA) וביוטין-PEG-SVA לטמפרטורת החדר, מיד לפני השימוש. ראה הערות על פוליאתילן גליקול (PEG) הכנה aliquot בטבלה 2.
      הערה: עבוד במהירות כי מחצית החיים הידרוליזה של Succinimidyl Valerate (SVA) moiety הוא ~ 30 דקות.
    7. הוסף 102 μL של 0.1 M NaHCO3 ל 34 מ"ג של PEG-SVA, לסובב ב microcentrifuge ספסל ב 2,656 x גרם עבור 20 s, ולאחר מכן לערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה. להמיס 3 מ"ג של ביוטין-PEG-SVA ב 27 μL של 0.1 M NaHCO3 על ידי צנרת למעלה ולמטה. התאם את נפחי הדילול בהתאם למשקל המדויק של PEG שצוין בצינורות (ראה טבלה 2).
    8. הכן 100:1 w / w PEG: תערובת ביוטין-PEG על ידי שילוב של 75 μL של פתרון PEG-SVA ו 2.25 μL של פתרון ביוטין-PEG-SVA עבור 20 כיסויים, 100 μL ו 3 μL עבור 30 כיסויים, או 125 μL ו 3.75 μL עבור 40 כיסויים.
    9. בנו תא לחות על ידי הנחת מגבות נייר רטובות מתחת למתלה הקצה בתחתית קופסת קצה ריקה של 10 μL (איור 1E). פעולה זו תמנע אידוי של פתרונות PEG.
    10. Pipette 6 μL של 100:1 PEG-SVA:תערובת ביוטין-PEG למרכז אחד 24 x 60 מ"מ כיסוי בצד המסומן. מניחים עוד כיסוי של 24 x 60 מ"מ על גבי כיסוי הראשון כך שהזוג יוצר צורת X, כאשר הצדדים מסומנים 'b' זה מול זה. מניחים את הזוג על מתלה קצה ריק בתא הידרציה וחוזרים על 24 x 60 מ"מ המכסים הנותרים.
    11. פיפטה 6 μL של PEG-SVA למרכז אחד 18 x 18 מ"מ כיסוי מכסה בצד המסומן. מניחים עוד כיסוי של 18 x 18 מ"מ על גבי כיסוי הראשון, כאשר הצדדים מסומנים 'p' זה מול זה. מניחים את הזוג על מתלה קצה ריק בתא הידרציה וחוזרים על 18 x 18 מ"מ הנותרים כיסויים.
    12. סגור את תא הידרציה ודגר במשך 3 שעות או לילה.
    13. מפרידים את זוגות כיסויי הכיסוי ושוטפים במים אולטרה-רפואיים.
    14. כיסוי יבש עם זרם חנקן ומניחים אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לייבוש מלא.
    15. כדי לבנות את תא ההדמיה, מקל שלוש רצועות של סרט דו-צדדי על כיסוי 24 x 60 מ"מ בצד שכותרתו 'b'. לצד השני של רצועות סרט הדבקה, חבר כיסוי בגודל 18 x 18 מ"מ כשצדו מסומן כ-p' הפונה לכיסוי הגדול יותר. זה יוצר שני תאי זרימה לניסויים במיקרוסקופיה, כשמשטחים מטופלים פונים זה לזה (איור 2 ואיור 1G).

Figure 1
איור 1: ציוד לטיפול בכיסוי והכנת תאי הדמיה. (A) צנצנות מכתימות שקופיות עבור 24 x 60 מ"מ מכסים, (B) מתלים לשטיפת שקופיות עבור 18 x 18 מ"מ מכסים, (C) הגדרת ואקום, (D) מתלה לייבוש שקופיות, (E) תא לחות, (F) כיסויים, (G) תא הדמיה, מחזיק שקופיות (H). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמטית להכנת תאי הדמיה באמצעות סרט דו-צדדי (אפור) וכיסויים שטופלו ב-PEG/Biotin-PEG. נוצר באמצעות BioRender.com. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. מיקרוטובולים פולימריים

  1. הכנת זרעי GMPCPP
    הערה: להכין זרעי GMPCPP בחדר קר, שמירה על כל ריאגנטים, טיפים, צינורות ב 4 °C (60 °F. זרעי GMPCPP ניתן להכין מראש ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד 1 שנה. מניחים רוטור אולטרה-מרכזי בזווית קבועה, המכיל צינורות צנטריפוגה 1 מ"ל, בצנטריפוגה אולטרה-מרכזית ומגדירים את הטמפרטורה ל-4 °C (60 °F).
    1. טובולין ליופילי (טבלה 2) ל-10 מ"ג/מ"ל ב-1X BRB80, מיד לפני השימוש.
    2. ערבבו רכיבים של זרעי GMPCPP כמתואר בטבלה 3.
      הערה: שמור את כל רכיבי טובולין על קרח ככל האפשר כדי למזער את פילמור של טובולין מסיס.
    3. הבהירו לערבב ברוטור אולטרה-מרכזי בזווית קבועה בטמפרטורה של 352,700 x g למשך 5 דקות ב-4 °C (4 °F).
    4. להפריד את supernatant לתוך 5 μL aliquots, להצמיד להקפיא אותם בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 °C (80 °F).
  2. פילמור זרעים ביום הניסוי
    1. חם 1-2 מ"ל של BRB80-DTT (טבלה 1) עד 37 °C (37 °F).
    2. מניחים 5 μL aliquot של זרעי GMPCPP (-80 °C )) משלב 3.1.4 על קרח ומיד להתמוסס ב 20 μL של חם BRB80-DTT. יש לסובב ב-2,000 x גרם ל-5 שניות בטמפרטורת החדר ולהקיש כדי לערבב.
      הערה: נפח הדילול הראשוני עשוי להשתנות בין 13 μL ו 21 μL והוא נקבע אמפירית עבור כל אצווה של זרעים. אם זרעים אינם מצליחים פולימריזציה, לפתור בעיות על ידי השלמת מאגר דילול ראשוני (שלב 3.2.2) עם 0.5 μM GMPCPP.
    3. יש להגן מפני אור ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות.
      הערה: אורך המיקרוטובולים תלוי במשך הדגירה. עבור microtubules קצר, זמן הדגירה יכול להיות קצר כמו 15 דקות. עבור microtubules ארוך, זמן הדגירה יכול להיות ארוך ככל 2 שעות. microtubules biotinylated נוטים לדרוש זמני דגירה ארוכים יותר מאשר microtubules שאינם biotinylated.
    4. מניחים רוטור אולטרה-מרכזי בזווית קבועה, המכיל 500 צינורות צנטריפוגות μL, בצנטריפוגה אולטרה-מרכזית וחם מראש עד 30 °C (30 °F).
    5. לאחר הדגירה, מוסיפים 50 μL של BRB80-DTT חם (שלב 3.2.1) לזרעי GMPCPP פולימריים ולהעביר את התערובת לצינור צנטריפוגה 500 μL. לשטוף את הצינור הריק שהכיל את זרעי GMPCPP עם עוד 50 μL של BRB80-DTT חם, פיפטה למעלה ולמטה, ולהוסיף את המאגר הזה לצינור צנטריפוגה 500 μL המכיל את התערובת.
    6. לפני ספינינג, לסמן את שפת צינור צנטריפוגה כדי לציין איפה הכדור יהיה (הכדור יהיה קטן מדי כדי לראות). ספין במשך 10 דקות ב 244,900 x g ב 30 °C12 °F.
    7. בזהירות פיפטה החוצה את supernatant ולהשליך. Resuspend את הכדור ב 100 μL של חם BRB80-DTT. הקש כדי לערבב.
    8. לסובב במשך 10 דקות ב 244,900 x g ב 30 °C (50 °F), יישור הסימון עם הרוטור לכדור באותו מקום.
    9. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 16 μL של BRB80-DTT חם. מעבירים את תמיסת המיקרוטובולה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 0.6 מ"ל. יש להגן מפני אור ולשמור בטמפרטורת החדר או מעליה.
      הערה: לאחר פילמור, יש לשמור על המיקרוטובולות בטמפרטורת החדר או מעליה. אם הם יתקררו, הם יהפכו למפורסמים. דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס לתוספת יציבות.
  3. בדיקת מיקרוטובולים באמצעות מיקרוסקופיה TIRF
    1. Pipette תערובת של 4.5 μL של BRB80-DTT ו 1 μL של פתרון microtubule (שלב 3.2.9) על שקופית מיקרוסקופ. מכסים עם כיסוי של 18 x 18 מ"מ וחותמים את הקצוות עם לק שקוף או תערובת של 1:1:1:1 של פטרולאטום, לנולין ופרפין (איטום valap), שהוא מוצק בטמפרטורת החדר ונוזל בטמפרטורת החדר ונוזל בטמפרטורת 95 מעלות צלזיוס.
    2. מקם את מטרת TIRF מתחת לכיסוי (ראה שלב 4 להגדרות מיקרוסקופ מומלצות) ודמיין את המיקרוטובולות הפולימריות החדשות באורך הגל המתאימות לאבולין המסומן בפלואורסצנטיות בתערובת הבהירה (טבלה 3), כדי לקבוע באיזו דילול של מיקרוטובולות להשתמש בניסויים הקרובים.
מגיב תערובת בהירה (μL) סדר התוספת תערובת בהירה + ביוטין (μL) סדר התוספת
טובולין פלואורסצנטי, 10 מ"ג/מ"ל 2 6 2 7
ביוטין-טובולין, 10 מ"ג/מ"ל 0 N/A 2 6
טובולין ללא תווית, 10 מ"ג/מ"ל 20 5 18 5
GMPCPP, 10 מ"ר 30 4 30 4
DTT, 0.2 M 0.7 3 0.7 3
5X BRB80 26.4 2 26.4 2
מים סטריליים 52.9 1 52.9 1
נפח כולל (μL) 132 132

טבלה 3: תערובת זרעים GMPCPP. רכיבים של זרעי microtubule GMPCPP, כולל נפח וסדר של תוספת. הכן 5 μL aliquots ולאחסן עד 1 שנה ב -80 °C (80 °F).

4. הגדרות מיקרוסקופ

  1. טמפרטורה: הגדר את טמפרטורת המיקרוסקופ ל-28 °C (50 °F) כדי להציג מיקרוטובולות דינמיות.
  2. מסננים: השתמש בשילוב הטוב ביותר של קוביות מסנן ומסנני פליטה, בהתאם לערוצי הפלואורסצנט שיש לדמיין. כדי להמחיש 488 ננומטר, 560 ננומטר ואורכי גל של 647 ננומטר באותו ניסוי, השתמש בערכת רצועת לייזר מרובעת של 405/488/488/560/647 ננומטר, בשילוב עם מסנני פליטה לאורכי הגל המיועדים.
  3. יישור לייזרים: ודא שקרני הלייזר המשמשות בניסוי מיושרות. קבעו את עוצמת הלייזר לניסוי בצורה אמפירית, כך שניתן יהיה לצלם את כל החלבונים הפלואורסצנטיים עם יחס האות לרעש הגבוה ביותר האפשרי, אך אינם עוברים צילום משמעותי במהלך הניסוי.
  4. מטרה: השתמש בנייר עדשה לניקוי מטרה של 100x עם 70% אתנול. לפני ההדמיה, להוסיף טיפה של שמן טבילה מיקרוסקופ למטרה.
  5. הגדרת רצף הדמיה
    1. לניסוי עם 647 ננומטר מיקרוטובולות ביו-טינוריות עם תווית פלואורופור, 560 ננומטר פלואורופור עם תווית לא ביו-ביוטינילט וצינורולין מסיס, וחלבון מעניין בעל תווית GFP, תמונה למשך 20 דקות. דמיינו את הערוצים של 560 ננומטר ו-488 ננומטר כל 10 שניות, ואת הערוץ 647 ננומטר כל 30 שניות.
    2. כדי ללכוד תמונת ייחוס של חבילות לפני הוספת טובולין מסיסים ו- MAPs, הגדר רצף עם תמונה אחת כל אחת באורכי גל של 560 ננומטר ו- 647 ננומטר.

5. צור חבילות מיקרוטובולה משותקות על פני השטח

הערה: עבור השלבים הבאים, הזרם את כל הפתרונות לתא זרימה על-ידי הזרמה לצד פתוח אחד, תוך הצבת נייר סינון בצד השני. הגן על תא ההדמיה מפני אור כדי להפחית את ההלבנה הפוטואורסצנטית של חלבונים המסומנים בפלואורסצנטיות. הקליטו את תא ההדמיה המוכן למחזיק שקופיות (איור 1G, H). בצע את השלבים בטבלה 4, התואמים ל- steps פרוטוקול 5.2-6.4.

  1. הכינו תערובת טובולין מסיסה לפי שולחן 5 ושמרו אותה על הקרח.
    הערה: טובולין מסיס חייב תמיד להיות ממוקם על קרח כדי למנוע פילמור. הכן תערובת טובולין מסיס טרי כ כל 2 שעות, או כאשר microtubules כבר לא פילמור.
  2. כדי לשתק microtubules באמצעות הצמדת ביוטין-neutravidin-ביוטין, זרימה ראשונה בתמיסת Neutravidin (NA) עד שהתא מתמלא (~ 7.5 μL) ודגר במשך 5 דקות.
  3. לשטוף עם 10 μL של MB-קר.
  4. זרימה ב 7.5 μL של חלבון חוסם κ-קזאין (KC) ודגר במשך 2 דקות.
  5. לשטוף עם 10 μL של MB-חם כדי להכין את החדר להכנסה של microtubules.
  6. לדלל את המלאי של microtubules biotinylated (על פי תצפיות בשלב 3.3.2) ב 1X BRB80-DTT ולהוסיף 1 μL של דילול זה ל 9 μL של MB-חם. מזרימים את התערובת לתא ודגורים במשך 10 דקות. השתמש בריכוז גבוה יותר של microtubules עבור חבילות נוספות.
  7. לשטוף את microtubules לא משותק עם 10 μL של MB-חם.
  8. זרימה 7.5 μL של KC חם לתוך התא ודגר במשך 2 דקות.
  9. במהלך הדגירה, להכין פתרון 2 ננומטר של חלבון crosslinker PRC1 ב KC חם. זרימה 10 μL של פתרון זה לתוך תא הזרימה ודגור במשך 5 דקות.
    הערה: PRC1 רקומביננטי מתבטא ומטוהר מתאי חיידקים כפי שתואר בעבר13.
  10. כדי ליצור חבילות, הזרימה 10 מיקרו-מיקרוגל של מיקרוטובולים שאינם ביו-ביוטינילים לתוך התא ותדגור במשך 10 דקות. PRC1 תצליב את המיקרוטובולים הביו-ביוטינילים הלא-ביו-טיניליים והמנותקים15,16 (איור 3).
    הערה: ראה שלב 6.1 להכנת תערובת הבדיקה במהלך זמן הדגירה.
  11. לשטוף את התא פעמיים עם 10 μL של MB-חם. המיקרוטובולות המצורפות יציבות במשך כ -20 דקות מנקודה זו.
צעד מגיב עוצמת קול (μL) זמן דגירה (דקות)
1 נויטרווידין 7.5 5
2 MB-קר 10 -
3 κ-casein 7.5 2
4 MB-חם 10 -
5 מיקרוטובולה ביו-טינילט (מדולל בחום MB) 10 10
6 MB-חם 10 -
7 חם κ-קזאין 7.5 2
8 2 nM PRC1 מדולל ב κ-casein 10 5
9 מיקרוטובולה ללא ביו-ביוטינילציה 10 10
10 MB-חם x 2 10 -
11 תערובת אסאיט 10 -
הזרעים המצורפים יציבים במשך כ -20 דקות בשלב זה

טבלה 4: צעדי בדיקה. רשימת ריאגנטים שנוספו לתא ההדמיה, עם אינדיקציה של זמן שטיפה (-) או דגירה.

מגיב עוצמת קול (μL)
טובולין ממוחזר, 10 מ"ג/מ"ל 10
MB-קר 10.3
MBMC 13.7
BRB80-DTT 3.4
GTP, 10 מ"ר 6.7
ATP, 10 מ"ר
(אם משתמשים בקינסינים)		 6.7
טובולין עם תווית פלואורסצנטית,
10 מ"ג/מ"ל		 1

(Resuspend lyophilized מתויג טובולין קר BRB80-DTT)

טבלה 5: רכיבי תערובת טובולין מסיסים. מערבבים בתחילת הניסוי ושומרים על קרח.

Figure 3
איור 3: סכמטי של תוספת של רכיבי בדיקה כדי ליצור ולדמות חבילות המסומנות בפלואורסצנטיות ומיקרוטובולות בודדות. זרעים ביוטינילטים מוצגים בזרעים כחולים, לא ביו-ביוטינילציה וטובולין מסיס באדום, PRC1 בשחור, וחלבון מעניין בכחלון. מספרי שלבים באיור תואמים לאלה בטבלה 4. החלונית המתאימה לשלב 9 מציגה חבילה שנוצרה מראש (משמאל למטה); שלב 11 מציג חבילה חדשה שנוצרה (משמאל למעלה). נוצר באמצעות BioRender.com. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

6. דינמיקת מיקרוטובול תמונה

  1. במהלך זמן הדגירה של 10 דקות בשלב 5.10, להכין 10 μL של תערובת בדיקה המכיל חלבונים של עניין, טובולין מסיסים, נוקלאוטידים, אוכלי נבלות חמצן14, ונוגדי חמצון על פי טבלה 6. שמור את התערובת על קרח.
  2. טען את תא ההדמיה המוכן, מודבק למחזיק השקופית, במטרה 100x TIRF. השתמש בערוצים של 560 ננומטר ו- 647 ננומטר כדי למצוא שדה ראייה המכיל מספר וצפיפות אופטימליים של מיקרוטובולות וחבילות בודדות.
    הערה: אם הן microtubules biotinylated ולא ביו-ביוטינילated מסומנים עם אותו פלואורופור, ניתוחי סריקת קו של עוצמות פלואורסצנטיות יכולים להבחין בין microtubules יחיד וחבילות.
  3. לאחר זיהוי שדה תצוגה, צולם תמונת הפניה.
  4. בזהירות לזרום בתערובת הבדיקה מבלי להפריע לתא ההדמיה.
  5. לאטום את הקצוות הפתוחים של התא עם איטום valap.
  6. התחל את רצף ההדמיה כמתואר בשלב 4.5.1.
מגיב עוצמת קול (μL)
תערובת טובולין מסיס 4
OSF 1
Trolox (אם משתמשים במיקרוטובולות המסומנות בפלואורופור מצלם בקלות) 1
ATP, 10 מ"ר
(אם משתמשים בקינסינים)		 1
PRC1 (או crosslinker של בחירה) 1
חלבונים מעניינים X
MB-קר 2-X

טבלה 6: רכיבי תערובת של Assay. לערבב, לזרום לתוך תא הדמיה, ודינמיקה microtubule תמונה, בתוך 30 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הניסוי שתואר לעיל בוצע באמצעות 647 ננומטר מיקרוטובולות ביו-טינוליות עם תווית פלואורופור, 560 ננומטר פלואורופור שכותרתו מיקרוטובולות שאינן ביו-ביוטיניל, ותערובת טובולין מסיסה של 560 ננומטר פלואורופור. Microtubules היו מוצלבים על ידי חלבון crosslinker PRC1 (GFP שכותרתו). לאחר שנוצרו חבילות משותקות פני השטח ומיקרוטובולות בודדות (שלב 5.11), תא ההדמיה הותקן על יעד שמן TIRF 100X 1.49 NA וצפו בו בערוצי הפלואורסצנטיות של 560 ננומטר ו-647 ננומטר. מיקרוטובולות בודדות זוהו על ידי אות הפלואורסצנטיות שלהם בערוץ 647 ננומטר. מיקרוטובולים עם אותות פלואורסצנטיים בשני הערוצים זוהו כחבילות שנוצרו מראש (איור 4). אם הניסויים מבוצעים עם microtubules biotinylated ולא ביו-ביוטיניל עם אותה תווית פלואורסצנטית, עוצמות פלואורסצנטיות מזוהות עבור חבילות יהיו סביב פי שניים או גבוה יותר מזה של microtubules יחיד. בהתבסס על היחס והצפיפות של כל אוכלוסייה, ריכוז זרעי microtubule בשלבים 5.6 ו 5.10 ניתן לייעל.

Figure 4
איור 4: זיהוי של מיקרוטובולים בודדים ומיקרוטובולים מקושרים בשדה הראייה. שדה תצוגה מייצג המציג 647 ננומטר (משמאל), 560 ננומטר (במרכז) וערוצים ממוזגים (מימין). מיקרוטובולות בודדות (ראשי חץ צהובים) וחבילות (ראשי חץ לבנים) מצוינות בערוץ הממוזג. סרגל קנה המידה מייצג 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: דינמיקה של מיקרוטובולות בודדות וחבילות מוצלבות של PRC1. וידאו מייצג המציג דינמיקה microtubule, עם 647 ננומטר זרעי microtubule biotinylated biotinylated (כחול), 560 ננומטר פלואורופור שכותרתו זרעי microtubule שאינם ביוטיניל ו 560 ננומטר פלואורופור שכותרתו טובולין מסיס (אדום), ו- PRC1 עם תווית GFP (ירוק). מיקרוטובולים יחידים ומחוברים מסומנים על ידי חצים לבנים וצהובים, בהתאמה. הסרט הוקלט במשך 10 דקות (61 פריימים) והוצג בקצב של 12 פריימים לשנייה. תנאי בדיקה: 0.5 nM GFP-PRC1, 50 מ"מ KCl ו 37 °C (37 °F). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הווידאו הזה.

לאחר שרצף הדמיה נרכש, נתח את הווידאו כדי להבטיח שמיקרוטובולים דינמיים (וידאו 1). התאם רכיבי בדיקה (נפח טובולין בתערובת טובולין מסיס, מלאי נוקלאוטידים, ריכוזי חלבון) על פי תצפיות. לדוגמה, אם microtubules לא פולימריזציה, להגדיל את הריכוז של טובולין מסיס ו/או GTP בתערובת טובולין מסיס. באופן דומה, להגדיל את ריכוזי העבודה של MAPs מתויגים פלואורסצנטית אם הם אינם נראים על microtubules, ולהפחית ריכוזים אם עוצמת פלואורסצנטיות הרקע שלהם בשדה הראייה דומה לעוצמתם על microtubules. כאשר מדמיינים חלבונים מוטוריים מוטוריים, להגדיל את ריכוזי ATP אם המנועים אינם מפגינים תנועתיות על microtubules. התאם את עוצמת הלייזר עבור ערוצי העירור המתאימים לפלואורסצנטיות מיקרוטובולה כדי להבטיח שניתן יהיה ללכוד הבדלים בעוצמת הפלואורסצנטיות בין מיקרוטובולות בודדות לחבילות בטווח הדינמי של הגלאי.

וידאו 2: הבדלים בדינמיקה של מיקרוטובולות בודדות וחבילות מוצלבות של PRC1 בנוכחות שני MAPs: CLASP1 ו- Kif4A. וידאו מייצג המציג דינמיקה microtubule, עם 647 ננומטר זרעי microtubule biotinylated biotinylated biotinylated (כחול), ו 560 ננומטר פלואורופור שכותרתו זרעים מיקרוטובול שאינו ביוטיניל ו 560 ננומטר פלואורופור שכותרתו טובולין מסיס (אדום). מיקרוטובולים יחידים ומחוברים מסומנים על ידי חצים לבנים וצהובים, בהתאמה. הסרט הוקלט במשך 20 דקות (121 פריימים) והוצג בקצב של 20 פריימים לשנייה. תנאי בדיקה: 200 nM CLASP1-GFP, 0.5 nM PRC1, ו 10 nM Kif4A. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. הווידאו משוכפל מהפניה11. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

בדוגמה הייצוגית המוצגת בסרטון 2, מוצג שדה תצוגה המכיל מיקרוטובולות בודדות וחבילות מוצלבות. נמצא כי בתנאי בדיקה אלה (תערובת בדיקה המכילה 0.5 nM PRC1, 50 mM KCl, ו- MAPs של עניין: 200 nM GFP שכותרתו CLASP1, 10 nM Kinesin Kif4A), microtubules יחיד להאריך במהלך הבדיקה, ואילו הצמיחה של microtubules מקושר תקוע.

לניתוח כמותי של דינמיקת מיקרוטובול, פתחו קבצי מיקרוסקופיה בתוכנת FIJI, ובחרו מיקרוטובולים וחבילות בודדות לניתוח. השתמש בקריטריונים הבאים כדי לא לכלול מיקרוטובולים וחבילות בודדים מניתוח נוסף: אל תכלול מיקרוטובולים או חבילות (i) שנמצאו בשולי שדה הראייה, (ii) מוסתרים על ידי אגרגטים של חלבונים, או (iii) שסיבים שלהם נעים בכיוון z מחוץ לטווח TIRF. ניתן להשיג פרמטרים של דינמיקת מיקרוטובולה, כגון אורך, קצב גדילה, תדירות הצלה ותדירות קטסטרופה, על ידי בנייה וניתוח של קימוגרפיות עבור כל זוג מיקרוטובולה או מיקרוטובולה בודדים11,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הניסוי המתואר כאן מרחיב באופן משמעותי את ההיקף והמורכבות של בדיקות שיקום מיקרוטובולות קונבנציונליות, המבוצעות באופן מסורתי על מיקרוטובולות בודדות או על סוג אחד של מערך. הבדיקה הנוכחית מספקת שיטה לכמת ולהשוות בו זמנית את פעילות MAP הרגולטורית על שתי אוכלוסיות, כלומר מיקרוטובולות בודדות וחבילות מוצלבות. יתר על כן, בדיקה זו מאפשרת בחינה של שני סוגים של חבילות: אלה שנוצרו מראש מזרעים יציבים לפני תחילת הדינמיקה, ואלה שנוצרו לאחרונה כאשר שני קצוות גדלים פוגשים זה את זה ומקבלים קישור צולב (איור 3). יתר על כן, בנוסף למשתנים ניסיוניים קונבנציונליים, כגון ריכוזי חלבונים ותנאי חיץ, בדיקות אלה מאפשרות להעריך את ההשפעות של תכונות גיאומטריות של מערכי מיקרוטובולה, כגון האורכים והזוויות בין חוטים סמוכים בצרור, המתהווים כגורמים חשובים לדינמיקת המיקרוטובולה ופעילות MAP16.

על מנת להרחיב שיטה ניסיונית זו עבור שחזור אין ויטרו של מבנים מבוססי microtubule מרובים, הנושאים העיקריים הבאים יש לטפל: (i) PRC1 מצליב באופן מועדף microtubules כי הם מכוונים אנטי מקבילים זה לזה. בעוד צרורות כאלה נמצאים במרכז התא במהלך מיטוזה, חבילות של microtubules מקביל הם תכונה נפוצה במבנים אחרים מבוססי microtubule בתוך אקסונים עצביים ואת הציר המיטוטי. הפרוטוקול המתואר לעיל יכול להיות מותאם בקלות כדי ליצור microtubules מקביל מוצלב באמצעות crosslinkers רקומביננטי כגון Kinesin-1 ו TRIM4610,17. (ii) בבדיקות שחזור אלה, ניתן להשתמש בהבדלים בעוצמת הפלואורסצנטיות כדי להבחין בין מיקרוטובולות בודדות וזוגות של מיקרוטובולות11,15. תחת התנאים הניסיוניים המשמשים כאן, ניתוחי עוצמה מצביעים על כך שרוב החבילות מכילות שתי מיקרוטובולות מקושרות, וניתוחי סריקת קו מספקים מידע על המיקום היחסי שלהם. עם זאת, כאשר יש יותר משניים או שלושה חוטים בצרור, הרזולוציה המרחבית של מערכות הדמיה סטנדרטיות מבוססות TIRF מעכבת זיהוי של הקצוות והקוטביות של מיקרוטובולות בודדות (בקוטר ~ 25 ננומטר)18. יתר על כן, בעוד שניתן לזהות את הקצוות פלוס של microtubules אנטי מקבילים מקושרים מכיוון הצמיחה שלהם, הבחנה בין הקצוות של microtubules מקבילים מקושרים גדל באותו כיוון הוא הפריע על ידי רזולוציה מרחבית של מיקרוסקופיה אופטית. הרחבה של הניסוי המתואר כאן היא להשתמש microtubules מסומן קוטביות או חלבונים מחייב קצה microtubule למקם microtubules בודדים. עבור חבילות עם עשרות microtubules, משלים את הרזולוציה הזמנית הגבוהה של בדיקות מבוססות TIRF עם טכניקות בעלות רזולוציה מרחבית גבוהה, כגון Microscopy כוח אטומי19, מבטיח להניב תובנות חדשות על הדינמיקה של microtubules בודדים בתוך חבילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם NIH (מס ' 1DP2GM126894-01), ועל ידי כספים מקרנות הצדקה של פיו וקרן משפחת סמית ל- R.S. המחברים מודים לד"ר שו ג'יאנג על תרומתו לפיתוח ואופטימיזציה של הפרוטוקולים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Sigma Aldrich 238813
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) Sigma Aldrich P6757
18x18 mm #1.5 coverslips  Electron Microscopy Sciences 63787
2-Mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich M-6250
24x60 mm #1.5 coverslips Electron Microscopy Sciences 63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band  Chroma TRF89901-NK
Acetone Sigma Aldrich 320110
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma Aldrich A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) Thermo Fischer Scientific A2666
Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner Branson CPX2800H
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm Beckman-Coulter  343778
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm Beckman-Coulter  343776
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Laysan Bio #Biotin-PEG-SVA-5000
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich 2905
Catalase Sigma Aldrich C40
Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V Corning 6670
Delicate Task Wipes Kimtech 34120
Dithiothreitol (DTT) GoldBio DTT10
Emission filter Chroma ET610/75m
Ethanol (200-proof) Decon Labs 2705
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Sigma Aldrich 3777
Glucose Oxidase Sigma Aldrich G2133
GMPCPP Jena Bioscience  NU-405
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma Aldrich G8877
Hellmanex III detergent  Sigma Aldrich Z805939
Immersion oil, Type A Fisher Scientific 77010
Kappa-casein Sigma Aldrich C0406
Lanolin Fisher Scientific S25376
Lens Cleaning Tissue ThorLabs MC-5
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M9272
Methylcellulose Sigma Aldrich M0512
Microfuge 16 Benchtop Centrifuge Beckman-Coulter  A46474
Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted Globe Scientific 1380-50W
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000  Laysan Bio #NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge Beckman-Coulter  393315
Paraffin Fisher Scientific P31-500
PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers Ted Pella 5377-NM
Petrolatum, White Fisher Scientific 18-605-050
Plasma Cleaner, 115V Harrick Plasma PDC-001
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma Aldrich 221473
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath USA Scientific 2510-1101
Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes USA Scientific 2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM Thermo Fischer Scientific PI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil
TIRF microscope Nikon Eclipse Ti
TLA 120.1 rotor Beckman-Coulter  362224
TLA 120.2 rotor Beckman-Coulter  357656
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain Cytoskeleton T240
Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain Cytoskeleton T333P
Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain Cytoskeleton TL670M
Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain Cytoskeleton TL620M
VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion Vector Biolabs SP-1800-7
VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A VWR 97025-630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  3. Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
  4. Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
  5. Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
  6. Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  9. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  10. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  11. Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
  12. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  13. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  14. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  15. Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
  16. Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
  17. Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
  18. Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
  19. Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).

Tags

ביוכימיה גיליון 180
הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים <em>במבחנה</em> על ידי מיקרוסקופיה TIRF
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mani, N., Marchan, M. F.,… More

Mani, N., Marchan, M. F., Subramanian, R. Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63377, doi:10.3791/63377 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter