Summary
Här presenteras en TIRF-mikroskopibaserad in vitro-rekonstitutionsanalys för att samtidigt kvantifiera och jämföra dynamiken hos två mikrotubulipopulationer. En metod beskrivs för att samtidigt se den kollektiva aktiviteten hos flera mikrotubuliassocierade proteiner på tvärbundna mikrotubulibuntar och enstaka mikrotubuli.
Abstract
Mikrotubuli är polymerer av αβ-tubulin heterodimerer som organiserar sig i distinkta strukturer i celler. Mikrotubulibaserade arkitekturer och nätverk innehåller ofta delmängder av mikrotubuli arrays som skiljer sig åt i deras dynamiska egenskaper. Till exempel, i delande celler, samexisterar stabila buntar av tvärbundna mikrotubuli i närheten av dynamiska icke-tvärbundna mikrotubuli. TIRF-mikroskopibaserade in vitro-rekonstitueringsstudier möjliggör samtidig visualisering av dynamiken i dessa olika mikrotubuli-arrayer. I denna analys monteras en bildkammare med ytimmobiliserade mikrotubuli, vilka antingen är närvarande som enskilda filament eller organiserade i tvärbundna buntar. Introduktion av tubulin, nukleotider och proteinregulatorer möjliggör direkt visualisering av associerade proteiner och av dynamiska egenskaper hos enskilda och tvärbundna mikrotubuli. Dessutom kan förändringar som uppstår när dynamiska enskilda mikrotubuli organiseras i buntar övervakas i realtid. Metoden som beskrivs här möjliggör en systematisk utvärdering av aktiviteten och lokaliseringen av enskilda proteiner, liksom synergistiska effekter av proteinregulatorer på två olika mikrotubuli delmängder under identiska experimentella förhållanden, vilket ger mekanistiska insikter som är otillgängliga med andra metoder.
Introduction
Mikrotubuli är biopolymerer som bildar strukturella byggnadsställningar som är väsentliga för flera cellulära processer, allt från intracellulär transport och organellpositionering till celldelning och förlängning. För att utföra dessa olika funktioner organiseras enskilda mikrotubuli i mikronstora arrays, såsom mitotiska spindlar, ciliary axonemes, neuronala buntar, interfasmatriser och växtkortikala arrays. Ett allestädes närvarande arkitektoniskt motiv som finns i dessa strukturer är en bunt mikrotubuli tvärbundna längs deras längder1. En spännande egenskap hos flera mikrotubulibaserade strukturer är samexistensen av buntade mikrotubuli och icke-tvärbundna enskilda mikrotubuli i närheten av rumslig närhet. Dessa mikrotubuli delpopulationer kan uppvisa starkt olika polymerisationsdynamik från varandra, efter behov för deras korrekta funktion2,3,4,5. Till exempel, inom den mitotiska spindeln, finns stabila tvärbundna buntar och dynamiska enskilda mikrotubuli närvarande inom en mikronskala region vid cellcentret6. Att studera hur de dynamiska egenskaperna hos samexisterande mikrotubulipopulationer specificeras är därför centralt för att förstå sammansättningen och funktionen hos mikrotubulibaserade strukturer.
Mikrotubuli är dynamiska polymerer som cyklar mellan faser av polymerisation och depolymerisation och växlar mellan de två faserna i händelser som kallas katastrof och räddning7. Dynamiken hos cellulära mikrotubuli regleras av myriad microtubule associated proteins (MAPs) som modulerar hastigheterna för mikrotubulär polymerisation och depolymerisation och frekvenserna av katastrof- och räddningshändelser. Det är utmanande att undersöka MAPs aktivitet på rumsligt proximala arrays i celler, på grund av begränsningarna av rumslig upplösning i ljusmikroskopi, särskilt i regioner med hög mikrotubulär densitet. Dessutom hindrar närvaron av flera MAPs i samma cellulära region tolkningar av cellbiologiska studier. In vitro-rekonstitutionsanalyser, utförda i samband med TIRF-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence), kringgår utmaningarna med att undersöka mekanismer genom vilka specifika delmängder av MAPs reglerar dynamiken hos proximala cellulära mikrotubuli arrays. Här undersöks dynamiken hos mikrotubuli monterade in vitro i närvaro av en eller flera rekombinanta MAPs under kontrollerade förhållanden8,9,10. Konventionella rekonstitutionsanalyser utförs emellertid vanligtvis på enskilda mikrotubuli eller på en typ av matris, vilket utesluter visualisering av samexisterande populationer.
Här presenterar vi in vitro-rekonstitutionsanalyser som möjliggör samtidig visualisering av två mikrotubulipopulationer under samma lösningsbetingelser11. Vi beskriver en metod för att samtidigt se den kollektiva aktiviteten hos flera MAPs på enstaka mikrotubuli och på mikrotubuli buntar tvärbundna av det mitotiska spindelassocierade proteinet PRC1. Proteinet PRC1 binder företrädesvis vid överlappningen mellan antiparallella mikrotubuli och tvärbinder dem9. Kortfattat består detta protokoll av följande steg: (i) beredning av stamlösningar och reagenser, (ii) rengöring och ytbehandling av täckglas som används för att skapa bildkammaren för mikroskopiexperiment, (iii) beredning av stabila mikrotubuli "frön" från vilka polymerisation initieras under experimentet, (iv) specifikation av TIRF-mikroskopinställningar för att visualisera mikrotubulidynamik, (v) immobilisering av mikrotubulifrön och generering av tvärbundna mikrotubulibuntar i bildkammaren och (vi) visualisering av mikrotubulidynamik i bildkammaren genom TIRF-mikroskopi, vid tillsats av lösligt tubulin, MAPs och nukleotider. Dessa analyser möjliggör kvalitativ utvärdering och kvantitativ undersökning av MAP-lokalisering och deras effekt på dynamiken hos två mikrotubulipopulationer. Dessutom underlättar de utvärderingen av synergistiska effekter av flera MAPs på dessa mikrotubuli populationer, över ett brett spektrum av experimentella förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered reagenser
- Förbereda buffertar och reagenser enligt tabell 1 och tabell 2. Under experimentet, håll alla lösningar på is, om inte annat anges.
| Lösning | Komponenter | Rekommenderad lagringstid | Anteckningar | ||
| 5X BRB80 | 400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 med KOH, filtersterilisera | upp till 2 år | Förvara vid 4 °C | ||
| 1X BRB80 | 80 mM K-PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 | upp till 2 år | Förvara vid 4 °C | ||
| BRB80-DTT | 1X BRB80, 1 mM DTT | upp till 2 dagar | |||
| Analysbuffert | 80 mM K-PIPES, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8, 5% sackaros (ELLER 1X BRB80, 5% sackaros, 2 mM MgCl2) | upp till 1 år | Förvara vid 4 °C | ||
| Huvudbuffert (MB) | Analysbuffert, 5mM TCEP | 1 vecka | Förbered dig på experimentdagen; Separera i två rör: MB-varm vid rumstemperatur och MB-kall på is; inkludera 1 mM DTT vid användning av fluorescerande färgämnen | ||
| Master buffert med metylcellulosa (MBMC) | 1X BRB80, 0,8% metylcellulosa, 5 mM TCEP, 5 mM MgCl2 | 1 vecka | Förbered dig på experimentdagen; inkludera 1 mM DTT vid användning av fluorescerande färgämnen | ||
| Buffert för proteinutspädning (DB) | MB, 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 1 μM ATP | 1 dag, på is | Förbered dig på experimentdagen; inkludera 1 mM DTT vid användning av fluorescerande färgämnen | ||
| Syrerensningsblandning (OSM) | MB, 389 μg/ml katalas, 4,44 mg/ml glukosoxidas, 15,9 mM 2-merkaptoetanol (BME) | 1 dag, på is | Förbered dig på experimentdagen | ||
| Oxygen Scavenging Final (OSF) | MB, 350 μg/ml katalas, 4 mg/ml glukosoxidas, 14,3 mM BME, 15 mg/ml glukos | använd inom 30 min | Förbered omedelbart före användning genom att tillsätta 1 μL glukos till 9 μL OSM | ||
Tabell 1: Förteckning över buffertar som används i detta protokoll och deras komponenter. Se kolumnen "Rekommenderad lagringstid" för vägledning om hur långt i förväg varje buffert kan förberedas.
| Reagens | Koncentration av förvaring | Lösningsmedel för förvaring | Förvaringstemperatur | Arbetskoncentration | Slutlig koncentration | Rekommenderad lagringstid | Anteckningar | |||||||||
| Neutravidin (NA) | 5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 0,2 mg/ml | 0,2 mg/ml | upp till 1 år | Används för att immobilisera mikrotubuli via en biotin-neutravidin-biotin-koppling; lagra i små alikvoter | |||||||||
| Kappa-kasein (KC) | 5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 0,5 mg/ml | 0,5 mg/ml | upp till 2 år | Används för att blockera bildkammarens yta; Förvara i små alikvoter; På experimentdagen, lägg en liten volym åt sidan vid rumstemperatur | |||||||||
| Albumin från bovint serum (BSA) | 50 mg/ml | 1X BRB80 | -20°C | 1 mg/ml (i DB) | Ej tidigare 2019 | upp till 2 år | lagra i små alikvoter | |||||||||
| Katalas | 3,5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 350 μg/ml (i FOS) | 35 μg/ml | upp till 2 år | komponent i syrerensningsblandning; lagra i små alikvoter | |||||||||
| Glukosoxidas | 40 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 4 mg/ml (i FOS) | 0,4 mg/ml | upp till 2 år | komponent i syrerensningsblandning; lagra i små alikvoter | |||||||||
| Tubulin | Frystorkade | Ej tidigare 2019 | 4°C | 10 mg/ml | 2,12 mg/ml (i tubulinblandning) | upp till 1 år | När tubulin är i lösning, håll det kallt för att undvika polymerisation. | |||||||||
| Adenosintrifosfat (ATP) | 100 mM | ultrarent vatten | -20°C | 10 mM | 1 mM | 6 månader | Förbered lösningen i filtersteriliserat vatten, justera pH till ~ 7,0 och frys i små alikvoter. | |||||||||
| Guanosintrifosfat (GTP) | 100 mM | ultrarent vatten | -20°C | 10 mM | 1,29 mM (i tubulinblandning) | 6 månader | Förbered lösningen i filtersteriliserat vatten, justera pH till ~ 7,0 och frys i små alikvoter. | |||||||||
| Guanosin-5'-[(α,β)-metyleno] trifosfat (GMPCPP) | 10 mM | ultrarent vatten | -20°C | 10 μM | 0,5 μM | 6 månader | ||||||||||
| Dithiothreitol (DTT) | 1 M | sterilt vatten | -20°C | 1 mM | Ej tidigare 2019 | upp till 2 år | ||||||||||
| Tris(2-karboxyetyl)fosfin (TCEP) | 0,5 M | filtersteriliserat vatten | Rumstemperatur | 5 mM | Ej tidigare 2019 | upp till 2 år | ||||||||||
| Metylcellulosa | 1% | sterilt vatten | Rumstemperatur | 0.8% (i MBMC) | 0,21% (i tubulinblandning) | upp till 1 år | Lös upp metylcellulosa genom att långsamt tillsätta den till nästan kokande vatten. Låt svalna under omrörning kontinuerligt. | |||||||||
| Beta-merkaptoetanol (BME) | 143 mM | sterilt vatten | Rumstemperatur | 14,3 mM (i FOS) | 1,43 mM | upp till 5 år | 143 mM är en 1:100 utspädning av lager BME | |||||||||
| Glukos | 150 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 15 mg/ml (i FOS) | 1,5 mg/ml | upp till 2 år | Lägg till i OSM omedelbart före användning | |||||||||
| (±)-6-Hydroxi-2,5,7,8-tetrametylkroman-2-karboxylsyra (Trolox) | 10mM | 1X BRB80 | -80°C | 10 mM | 1 mM | upp till 1 år | Löses inte helt upp. Tillsätt lite NaOH, rör om i ~ 4 timmar och filtrera sterilisera före användning | |||||||||
| mPEG-Succinimidylvalerat, MW 5 000 | pulver | Ej tidigare 2019 | -20°C | 333 mg/ml (i 0,1 M natriumbikarbonat) |
324 mg/ml (i 0,1 M natriumbikarbonat) |
6 månader | Förbered ~ 34 mg alikvoter, markera varje rör med en exakt vikt av pulver. För kvävgas över de fasta, täta rören med parafilm och förvara vid -20 ° C i en behållare med torkmedel. | |||||||||
| Biotin-PEG-SVA, MW 5 000 | pulver | Ej tidigare 2019 | -20°C | 111 mg/ml (i 0,1 M natriumbikarbonat) |
3,24 mg/ml (i 0,1 M natriumbikarbonat) | 6 månader | Förbered ~ 3 mg alikvoter, markera varje rör med en exakt vikt av pulver. För kvävgas över de fasta, täta rören med parafilm och förvara vid -20 ° C i en behållare med torkmedel. | |||||||||
Tabell 2: Förteckning över reagenser som används i detta protokoll. Inkluderat är de rekommenderade lagringsförhållandena och koncentrationerna, arbetskoncentrationerna av stamlösningar som används under experimentet och slutlig koncentration i bildkammaren. Ytterligare anteckningar ges i kolumnen längst till höger.
2. Förbered Biotin-PEG-bilder
OBS: Förbered bildkammare så nära starten av ett experiment som möjligt, och inte mer än 2 veckor i förväg.
- Rengör täckglas
- Placera lika många 24 x 60 mm och 18 x 18 mm #1.5 täckglas (figur 1F) i glidfärgningsburkar respektive glidtvättställ (figur 1A,B). Placera glidtvättställen som innehåller 18 x 18 mm täckglas i en 100 ml bägare.
- Skölj alla täckglas 5-6 gånger i ultrarent vatten (18,2 MΩ-cm resistivitet) och ta bort överflödig vätska efter varje sköljning med en pipettspets fäst vid ett vakuumrör (Figur 1C).
- Fyll bägare och glidfärgningsburkar som innehåller täckglasen med ultrarent vatten, försegla med parafilm och sonicate i 10 minuter.
- Fyll två 150 ml bägare med 200-säker etanol. Doppa varje täckglas med pincett i en bägare fylld med etanol och sedan den andra.
- Överför täckglasen till glidtorkningsstället (figur 1D) med pincett, torka dem under kvävgasströmmen och inkubera vid 37 °C tills de är helt torra (~15 min).
- Placera de torkade täckglasen i ett enda lager inuti plasmarengöraren. Forma vakuumtätning och ställ sedan in plasmarengörarens radiofrekvensnivå (RF) till ~ 8 MHz.
- När plasman har genererats, lämna täckglas i plasmarengörare i 5 min. Stäng av plasmarengöraren och släpp vakuumet långsamt.
- När vakuumtätningen har släppts, vänd täckglasen över och upprepa plasmarengöringen i 5 minuter för den andra sidan av täckglasen.
- Alternativ till plasmarengöring: I stället för steg 2.1.2-2.1.3 täcker sonatglas i en varm lösning av 2% tvättmedel (i ultrarent vatten) i 10 min. Tvätta sedan täckglas noggrant med ultrarent vatten och sonicate i ultrarent vatten 2-3 gånger (10 min vardera). Tvätta sedan i etanol och torka som i steg 2.1.4-2.1.5. Hoppa över steg 2.1.6-2.1.8.
- Biotin-PEG-behandling
- Omedelbart före användning, lös upp 400 μL 3-aminopropyltrietoxisilan i 40 ml aceton. Använd pincett och flytta plasmarengjorda täckglas i glidtvättstället och glidfärgningsburkarna. Sänk ner täckglas i 3-aminopropyltrietoxisilanlösning och inkubera i 5 min12,13.
- Tvätta alla täckglas 5-6 gånger med ultrarent vatten.
- Överför täckglas till glidtorkningsstället, torka dem under en kvävgasström och inkubera vid 37 °C tills de är helt torra (~20 min).
- Lägg de torkade täckglasen på känsliga våtservetter och märk varje täckglas i ett hörn, t.ex. "p" på varje 18 x 18 mm täckglas och "b" på varje 24 x 60 mm täckglas (se figur 2).
- På experimentdagen bereder du en färsk 0,1 M natriumbikarbonatlösning genom att lösa upp 0,84 mg NaHCO3 i 10 ml ultrarent vatten.
- Ta alikvoter av mPEG-Succinimidyl Valerate (PEG-SVA) och Biotin-PEG-SVA till rumstemperatur, omedelbart före användning. Se anmärkningar om alikvotberedning av polyetylenglykol (PEG) i tabell 2.
OBS: Arbeta snabbt eftersom hydrolyshaleringstiden för Succinimidyl Valerate (SVA) -delen är ~ 30 min. - Tillsätt 102 μL 0,1 M NaHCO3 till 34 mg PEG-SVA, snurra i en bänkmikrocentrifug vid 2 656 x g i 20 s och blanda sedan genom pipettering upp och ner. Lös upp 3 mg Biotin-PEG-SVA i 27 μL av 0,1 M NaHCO3 genom pipettering upp och ner. Justera utspädningsvolymerna enligt den exakta vikten av PEG som anges på rören (se tabell 2).
- Bered 100:1 vikt/w PEG:biotin-PEG-blandning genom att kombinera 75 μL PEG-SVA-lösning och 2,25 μL Biotin-PEG-SVA-lösning för 20 täckglas, 100 μL och 3 μL för 30 täckglas, eller 125 μL och 3,75 μL för 40 täckglas.
- Konstruera en vätskekammare genom att placera våta pappershanddukar under spetsstället i botten av en tom 10 μL spetslåda (figur 1E). Detta förhindrar avdunstning av PEG-lösningarna.
- Pipett 6 μL av 100:1 PEG-SVA:biotin-PEG-blandning på mitten av en 24 x 60 mm täckglas på den märkta sidan. Placera ytterligare en 24 x 60 mm täckglas ovanpå den första täckglaset så att paret bildar en X-form, med sidorna märkta "b" vända mot varandra. Placera paret på ett tomt spetsställ i vätskekammaren och upprepa för de återstående 24 x 60 mm täckglasen.
- Pipett 6 μL PEG-SVA på mitten av en 18 x 18 mm täckglas på den märkta sidan. Placera ytterligare en 18 x 18 mm täckglas ovanpå den första täckglaset, med sidorna märkta "p" mot varandra. Placera paret på ett tomt spetsställ i vätskekammaren och upprepa för de återstående 18 x 18 mm täckglasen.
- Stäng hydratiseringskammaren och inkubera i 3 timmar eller över natten.
- Separera paren av täckglas och skölj i ultrarent vatten.
- Torka täckglas med en kväveström och placera dem i en 37 ° C inkubator för att torka helt.
- För att konstruera bildkammaren, fäst tre remsor dubbelsidig tejp på en 24 x 60 mm täckglas på sidan märkt "b". På andra sidan tejpremsorna fäster du en 18 x 18 mm täckglas med sidan märkt "p" mot den större täckglaset. Detta bildar två flödeskammare för mikroskopiexperiment, med behandlade ytor vända mot varandra (figur 2 och figur 1G).
Figur 1: Utrustning för täckglasbehandling och beredning av bildkammare. (A) glidfärgningsburkar för 24 x 60 mm täckglas, (B) glidtvättställ för 18 x 18 mm täckglas, (C) vakuumuppsättning, (D) glidtorkningsställ, (E) hydratiseringskammare, (F) täckglas, (G) bildkammare, (H) glidhållare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk för beredning av bildkammare med dubbelsidig tejp (grå) och PEG/Biotin-PEG-behandlade täckglas. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Polymerisera mikrotubuli
- Förbered GMPCPP-frön
OBS: Förbered GMPCPP-frön i ett kallrum, håll alla reagenser, spetsar och rör vid 4 ° C. GMPCPP-frön kan beredas i förväg och förvaras vid -80 ° C i upp till 1 år. Placera ultracentrifugrotor med fast vinkel, innehållande 1 ml centrifugrör, i ultracentrifug och ställ in temperaturen på 4 °C.- Resuspend lyofiliserat tubulin (tabell 2) till ~ 10 mg / ml i 1X BRB80, omedelbart före användning.
- Blanda komponenter i GMPCPP-frön enligt beskrivningen i tabell 3.
OBS: Håll alla tubulinkomponenter på is så mycket som möjligt för att minimera polymerisationen av lösligt tubulin. - Förtydliga blandningen i en ultracentrifugrotor med fast vinkel vid 352 700 x g i 5 min vid 4 °C.
- Separera supernatanten i 5 μL alikvoter, frys dem i flytande kväve och förvara dem vid -80 ° C.
- Polymerisera frön på experimentets dag
- Varm 1-2 ml BRB80-DTT (tabell 1) till 37 °C.
- Placera 5 μL alikvot av GMPCPP-frön (-80 °C) från steg 3.1.4 på is och lös omedelbart upp i 20 μL varm BRB80-DTT. Snurra med 2 000 x g i 5 s vid rumstemperatur och tryck för att blanda.
OBS: Initial utspädningsvolym kan variera mellan 13 μL och 21 μL och bestäms empiriskt för varje sats frön. Om frön misslyckas med att polymerisera, felsök genom att komplettera initial utspädningsbuffert (steg 3.2.2) med 0,5 μM GMPCPP. - Skydda mot ljus och ruva vid 37 °C i 30-45 min.
OBS: Mikrotubuliens längd beror på inkubationstiden. För korta mikrotubuli kan inkubationstiden vara så kort som 15 min. För långa mikrotubuli kan inkubationstiden vara så lång som 2 timmar. Biotinylerade mikrotubuli tenderar att kräva längre inkubationstider än icke-biotinylerade mikrotubuli. - Placera ultracentrifugrotor med fast vinkel, innehållande 500 μL centrifugrör, i ultracentrifug och förvärm till 30 °C.
- Efter inkubation tillsätt 50 μL varm BRB80-DTT (steg 3.2.1) till de polymeriserade GMPCPP-fröna och överför blandningen till ett 500 μL centrifugrör. Tvätta det tomma röret som innehöll GMPCPP-fröna med ytterligare 50 μL varm BRB80-DTT, pipetten upp och ner och tillsätt denna buffert till centrifugröret på 500 μL som innehåller blandningen.
- Innan du snurrar, markera kanten på centrifugröret för att indikera var pelletsen kommer att vara (pelletsen blir för liten för att se). Snurra i 10 min vid 244 900 x g vid 30 °C12.
- Pipettera försiktigt ut supernatanten och kassera. Resuspend pelletsen i 100 μL varm BRB80-DTT. Tryck för att blanda.
- Snurra i 10 min vid 244 900 x g vid 30 °C, justera märkningen med rotorn till pellets på samma plats.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen i 16 μL varm BRB80-DTT. Överför mikrotubulilösningen till ett rent 0,6 ml mikrocentrifugrör. Skydda mot ljus och håll vid eller över rumstemperatur.
OBS: Efter polymerisation, håll mikrotubuli vid eller över rumstemperatur. Om de blir kalla kommer de att depolymerisera. Inkubera vid 28 °C för ökad stabilitet.
- Kontrollera mikrotubuli via TIRF-mikroskopi
- Pipettera en blandning av 4,5 μL BRB80-DTT och 1 μL mikrotubulilösning (steg 3.2.9) på en mikroskopbild. Täck med en 18 x 18 mm täckglas och försegla kanterna med antingen klart nagellack eller en 1:1:1 blandning av petrolatum, lanolin och paraffin (valaptätningsmedel), som är fast vid rumstemperatur och vätska vid 95 °C.
- Placera TIRF-målet under täckglaset (se steg 4 för rekommenderade mikroskopinställningar) och visualisera de nyligen polymeriserade mikrotubuli vid våglängd som är lämpliga för det fluorescerande märkta tubulinet i Bright-blandningen (tabell 3), för att bestämma vilken utspädning av mikrotubuli som ska användas i de kommande experimenten.
| Reagens | Ljus blandning (μL) | Beställning av tillägg | Ljus blandning + biotin (μL) | Beställning av tillägg |
| Fluorescerande tubulin, 10 mg/ml | 2 | 6 | 2 | 7 |
| Biotin-tubulin, 10 mg/ml | 0 | Ej tidigare 2019 | 2 | 6 |
| Omärkt tubulin, 10 mg/ml | 20 | 5 | 18 | 5 |
| GMPCPP, 10 mM | 30 | 4 | 30 | 4 |
| DTT, 0,2 m | 0.7 | 3 | 0.7 | 3 |
| 5X BRB80 | 26.4 | 2 | 26.4 | 2 |
| sterilt vatten | 52.9 | 1 | 52.9 | 1 |
| Total volym (μL) | 132 | 132 |
Tabell 3: GMPCPP-fröblandning. Komponenter av GMPCPP mikrotubuli frön, inklusive volym och tillsatsordning. Förbered 5 μL alikvoter och förvara i upp till 1 år vid -80 °C.
4. Inställningar för mikroskop
- Temperatur: Ställ in mikroskoptemperaturen på 28 °C för att visa dynamiska mikrotubuli.
- Filter: Använd den bästa kombinationen av filterkuber och emissionsfilter, beroende på vilka lysrör som ska avbildas. För att visualisera 488 nm, 560 nm och 647 nm våglängder i samma experiment, använd en 405/488/560/647 nm Laser Quad Band Set, i kombination med emissionsfilter för de angivna våglängderna.
- Justera lasrar: Se till att laserstrålarna som används i experimentet är inriktade. Bestäm laserintensiteten för experimentet empiriskt, så att alla fluorescerande proteiner kan avbildas med högsta möjliga signal-brusförhållande, men inte genomgå signifikant fotoblekning under experimentets gång.
- Mål: Använd linspapper för att rengöra ett 100x mål med 70% etanol. Innan avbildning, tillsätt en droppe mikroskop nedsänkningsolja till målet.
- Ställ in en bildsekvens
- För ett experiment med 647 nm fluoroformärkta biotinylerade mikrotubuli, 560 nm fluoroformärkta icke-biotinylerade mikrotubuli och lösligt tubulin och GFP-märkt protein av intresse, bild i 20 min. Avbilda kanalerna 560 nm och 488 nm var 10:e sekund och 647 nm-kanalen var 30:e sekund.
- För att fånga en referensbild av buntar före tillsats av lösligt tubulin och MAPs, ställ in en sekvens med en bild vardera i 560 nm och 647 nm våglängder.
5. Generera ytimmobiliserade mikrotubulibuntar
OBS: För följande steg, flöda alla lösningar i en flödeskammare genom pipettering i en öppen sida, samtidigt som du placerar ett filterpapper mot den andra sidan. Skydda bildkammaren från ljus för att minska fotoblekning av fluorescerande märkta proteiner. Tejpa den förberedda bildkammaren på en glidhållare (figur 1G,H). Följ stegen i tabell 4, som motsvarar protokoll steps 5.2-6.4.
- Förbered löslig tubulinblandning enligt tabell 5 och håll den på is.
OBS: Lösligt tubulin måste alltid placeras på is för att förhindra polymerisation. Förbered en färsk löslig tubulinblandning ungefär varannan timme, eller när mikrotubuli inte längre polymeriserar. - För att immobilisera mikrotubuli via en biotin-neutravidin-biotin-koppling, flöda först i Neutravidin (NA) lösning tills kammaren är fylld (~ 7,5 μL) och inkubera i 5 min.
- Tvätta med 10 μL MB-kyla.
- Flöda i 7,5 μL av det blockerande proteinet κ-kasein (KC) och inkubera i 2 min.
- Tvätta med 10 μL MB-varm för att förbereda kammaren för införande av mikrotubuli.
- Späd ut beståndet av biotinylerade mikrotubuli (enligt observationer i steg 3.3.2) i 1X BRB80-DTT och tillsätt 1 μL av denna utspädning till 9 μL MB-varm. Flöda blandningen in i kammaren och inkubera i 10 min. Använd en högre koncentration av mikrotubuli för fler buntar.
- Tvätta bort icke-immobiliserade mikrotubuli med 10 μL MB-varm.
- Flöde 7,5 μL varm KC i kammaren och inkubera i 2 min.
- Under inkubationen bereda en 2 nM lösning av tvärbindningsproteinet PRC1 i varm KC. Flöde 10 μL av denna lösning in i flödeskammaren och inkubera i 5 min.
OBS: Rekombinant PRC1 uttrycks och renas från bakterieceller enligt tidigare beskrivits13. - För att göra buntar, flöda 10 μL icke-biotinylerade mikrotubuli in i kammaren och inkubera i 10 min. PRC1 kommer att tvärlänka de icke-biotinylerade och immobiliserade biotinylerade mikrotubuli15,16 (Figur 3).
OBS: Se steg 6.1 för beredning av analysblandningen under inkubationstiden. - Tvätta kammaren två gånger med 10 μL MB-varm. De bifogade mikrotubuli är stabila i cirka 20 minuter från denna punkt.
| Steg | Reagens | Volym (μL) | Inkubationstid (minuter) |
| 1 | Neutravidin | 7.5 | 5 |
| 2 | MB-kall | 10 | - |
| 3 | κ-kasein | 7.5 | 2 |
| 4 | MB-varm | 10 | - |
| 5 | Biotinylerad mikrotubuli (utspädd i MB-varm) | 10 | 10 |
| 6 | MB-varm | 10 | - |
| 7 | Varmt κ-kasein | 7.5 | 2 |
| 8 | 2 nM Kina1 utspädd i κ-kasein | 10 | 5 |
| 9 | Icke-biotinylerad mikrotubuli | 10 | 10 |
| 10 | MB-varm x 2 | 10 | - |
| 11 | Analysblandning | 10 | - |
| Bifogade frön är stabila i cirka 20 minuter vid denna tidpunkt | |||
Tabell 4: Analyssteg. Förteckning över reagenser som tillsatts i bildkammaren, med angivande av tvätt (-) eller inkubationstid.
| Reagens | Volym (μL) |
| Återvunnet tubulin, 10 mg/ml | 10 |
| MB-Kall | 10.3 |
| MBMC | 13.7 |
| BRB80-DTT | 3.4 |
| GTP, 10 mM | 6.7 |
| ATP, 10 mM (Om du använder kinesiner) |
6.7 |
| Fluorescerande märkt tubulin, 10 mg/ml |
1 (Resuspend lyofiliserad märkt tubulin i kall BRB80-DTT) |
Tabell 5: Lösliga tubulinblandningskomponenter. Blanda i början av experimentet och håll på is.
Figur 3: Schematisk tillsats av analyskomponenter för att tillverka och avbilda fluorescerande märkta buntar och enstaka mikrotubuli. Biotinylerade frön visas i blå, icke-biotinylerade frön och lösligt tubulin i rött, PRC1 i svart och protein av intresse för cyan. Stegtalen i figur motsvarar siffrorna i tabell 4. Panelen som motsvarar steg 9 visar ett förformat paket (längst ned till vänster); steg 11 visar ett nybildat paket (uppe till vänster). Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Bildmikrotubulidynamik
- Under inkubationstiden på 10 minuter i steg 5.10 bereder du 10 μL analysblandning innehållande proteiner av intresse, lösligt tubulin, nukleotider, syrerensare14 och antioxidanter enligt tabell 6. Håll blandningen på is.
- Ladda den förberedda bildkammaren, tejpad på glidhållaren, på 100x TIRF-målet. Använd kanalerna 560 nm och 647 nm för att hitta ett synfält som innehåller ett optimalt antal och densitet av enskilda mikrotubuli och buntar.
OBS: Om både biotinylerade och icke-biotinylerade mikrotubuli är märkta med samma fluorofor, kan linjeskanningsanalyser av fluorescensintensiteter skilja mellan enskilda mikrotubuli och buntar. - När ett synfält har identifierats tar du en referensbild.
- Flöda försiktigt i analysblandningen utan att störa bildkammaren.
- Försegla kammarens öppna ändar med valap tätningsmedel.
- Starta avbildningssekvensen enligt beskrivningen i steg 4.5.1.
| Reagens | Volym (μL) |
| Löslig tubulinblandning | 4 |
| FOS | 1 |
| Trolox (om du använder mikrotubuli märkta med en lätt fotoblekning fluorofor) | 1 |
| ATP, 10 mM (Om du använder kinesiner) |
1 |
| PRC1 (eller valfri tvärbindning) | 1 |
| Proteiner av intresse | X |
| MB-kall | 2-X |
Tabell 6: Komponenter för analysblandning. Blanda, flöda in i bildkammaren och bildmikrotubulidynamiken inom 30 minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentet som beskrivs ovan utfördes med användning av 647 nm fluoroformärkta biotinylerade mikrotubuli, 560 nm fluoroformärkta icke-biotinylerade mikrotubuli och 560 nm fluoroformärkt löslig tubulinblandning. Mikrotubuli korslänkades av tvärbindningsproteinet PRC1 (GFP-märkt). Efter att ytimmobiliserade buntar och enstaka mikrotubuli genererats (steg 5.11) monterades bildkammaren på ett TIRF 100X 1.49 NA-oljemål och sågs i fluorescenskanalerna 560 nm och 647 nm. Enstaka mikrotubuli identifierades av deras fluorescenssignal i 647 nm-kanalen. Mikrotubuli med fluorescenssignaler i båda kanalerna identifierades som förformade buntar (figur 4). Om experiment utförs med biotinylerade och icke-biotinylerade mikrotubuli med samma fluorescerande etikett, kommer detekterade fluorescensintensiteter för buntar att vara ungefär tvåfaldiga eller högre än för enskilda mikrotubuli. Baserat på andelen och densiteten hos varje population kan koncentrationen av mikrotubulifrön i steg 5.6 och 5.10 optimeras.
Figur 4: Identifiering av enskilda mikrotubuli och tvärbundna mikrotubuli i synfältet. Representativt synfält som visar 647 nm (vänster), 560 nm (mitten) och sammanslagna (höger) kanaler. Enstaka mikrotubuli (gula pilspetsar) och buntar (vita pilspetsar) anges i den sammanslagna kanalen. Skalstången representerar 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Dynamiken i enskilda mikrotubuli och PRC1-tvärlänkade buntar. Representativ video som visar mikrotubulidynamik, med 647 nm fluoroformärkta biotinylerade mikrotubulifrön (blå), 560 nm fluoroformärkta icke-biotinylerade mikrotubulifrön och 560 nm fluoroformärkt lösligt tubulin (rött) och GFP-märkt PRC1 (grönt). Enkla och tvärbundna mikrotubuli indikeras av vita respektive gula pilar. Filmen spelades in över 10 minuter (61 bilder) och visades med en hastighet av 12 bilder / sekund. Analysförhållanden: 0,5 nM GFP-PRC1, 50 mM KCl och 37 °C. Skala bar: 5 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
När en bildsekvens har förvärvats analyserar du videon för att säkerställa att mikrotubuli är dynamiska (Video 1). Justera analyskomponenter (tubulinvolym i löslig tubulinblandning, nukleotidlager, proteinkoncentrationer) enligt observationer. Till exempel, om mikrotubuli inte polymeriserar, öka koncentrationen av lösligt tubulin och / eller GTP i löslig tubulinblandning. På samma sätt öka arbetskoncentrationerna av fluorescerande märkta MAPs om de inte är synliga på mikrotubuli och minska koncentrationerna om deras bakgrundsfluorescensintensitet i synfältet är jämförbar med deras intensitet på mikrotubuli. När du visualiserar rörliga motorproteiner, öka ATP-koncentrationerna om motorer inte uppvisar rörlighet på mikrotubuli. Justera laserintensiteten för excitationskanalerna som motsvarar mikrotubulifluorescens för att säkerställa att skillnader i fluorescensintensitet mellan enskilda mikrotubuli och buntar kan fångas upp inom detektorns dynamiska område.
Video 2: Skillnader i dynamik hos enskilda mikrotubuli och KINA1-tvärbundna buntar i närvaro av två MAPs: CLASP1 och Kif4A. Representativ video som visar mikrotubulidynamik, med 647 nm fluoroformärkta biotinylerade mikrotubulifrön (blå) och 560 nm fluoroformärkta icke-biotinylerade mikrotubulifrön och 560 nm fluoroformärkt lösligt tubulin (rött). Enkla och tvärbundna mikrotubuli indikeras av vita respektive gula pilar. Filmen spelades in över 20 minuter (121 bilder) och visades med en hastighet av 20 bilder / sekund. Analysförhållanden: 200 nM CLASP1-GFP, 0,5 nM PRC1 och 10 nM Kif4A. Skalstång: 2 μm. Videon återges från referens11. Klicka här för att ladda ner den här videon.
I det representativa exemplet som visas i video 2 visas ett synfält som innehåller enstaka mikrotubuli och tvärbundna buntar. Det konstateras att under dessa analysförhållanden (analysblandning innehållande 0,5 nM PRC1, 50 mM KCl och MAPs av intresse: 200 nM GFP-märkt CLASP1, 10 nM Kinesin Kif4A) förlängs enstaka mikrotubuli under analysens gång, medan tillväxten av tvärbundna mikrotubuli avstannar.
För kvantitativ analys av mikrotubulidynamik, öppna mikroskopifiler i FIJI-programvaran och välj enskilda mikrotubuli och buntar för analys. Använd följande kriterier för att utesluta enskilda mikrotubuli och buntar från vidare analys: uteslut mikrotubuli eller buntar (i) som finns vid kanterna av synfältet, (ii) döljs av proteinaggregat eller (iii) vars filament rör sig i z-riktningen utanför TIRF-området. Parametrar för mikrotubulidynamik, såsom längd, tillväxthastighet, räddningsfrekvens och katastroffrekvens, kan erhållas genom att konstruera och analysera kymografer för varje enskilt mikrotubuli- eller mikrotubulipar11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentet som beskrivs här utökar avsevärt omfattningen och komplexiteten hos konventionella mikrotubuli rekonstitutionsanalyser, som traditionellt utförs på enskilda mikrotubuli eller på en typ av matris. Den nuvarande analysen ger en metod för att samtidigt kvantifiera och jämföra den regulatoriska MAP-aktiviteten på två populationer, nämligen enstaka mikrotubuli och tvärbundna buntar. Vidare möjliggör denna analys undersökning av två typer av buntar: de som är förformade av stabila frön före initieringen av dynamiken, och de som är nybildade när två växande ändar möter varandra och blir tvärbundna (Figur 3). Förutom konventionella experimentella variabler, såsom proteinkoncentrationer och buffertförhållanden, möjliggör dessa analyser dessutom utvärdering av effekterna av geometriska egenskaper hos mikrotubulimatriser, såsom längder och vinklar mellan intilliggande filament i en bunt, som framträder som viktiga determinanter för mikrotubulidynamik och MAP-aktivitet16.
För att utvidga denna experimentella metod för in vitro-rekonstituering av flera mikrotubulibaserade strukturer måste följande nyckelfrågor behandlas: i) Kina1 tvärlänkar företrädesvis mikrotubuli som är orienterade antiparallellt med varandra. Medan sådana buntar finns i cellcentret under mitos, är buntar av parallella mikrotubuli en vanlig egenskap i andra mikrotubulibaserade strukturer inom neuronala axoner och den mitotiska spindeln. Protokollet som beskrivs ovan kan enkelt anpassas för att generera tvärbundna parallella mikrotubuli med hjälp av rekombinanta tvärbindningar som Kinesin-1 och TRIM4610,17. ii) I dessa rekonstitutionsanalyser kan skillnader i fluorescensintensitet användas för att skilja mellan enskilda mikrotubuli och par av mikrotubuli11,15. Under de experimentella förhållanden som används här indikerar intensitetsanalyser att de flesta buntar innehåller två tvärbundna mikrotubuli, och linjeskanningsanalyser ger information om deras relativa positionering. Men när det finns mer än två eller tre filament i en bunt hindrar den rumsliga upplösningen hos TIRF-baserade standardavbildningssystem identifiering av ändarna och polariteten hos enskilda mikrotubuli (~ 25 nm diameter)18. Även om det är möjligt att identifiera plusändarna av tvärbundna antiparallella mikrotubuli från deras tillväxtriktning, hindras särskiljande ändarna av tvärbundna parallella mikrotubuli som växer i samma riktning av den rumsliga upplösningen av optisk mikroskopi. En förlängning av experimentet som beskrivs här är att använda polaritetsmärkta mikrotubuli eller mikrotubuli spetsbindande proteiner för att placera enskilda mikrotubuli. För buntar med tiotals mikrotubuli, som kompletterar den höga temporala upplösningen av TIRF-baserade analyser med tekniker som har hög rumslig upplösning, såsom atomkraftsmikroskopi19, lovar att ge nya insikter i dynamiken hos enskilda mikrotubuli i en bunt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (nr 1DP2GM126894-01) och av medel från Pew Charitable Trusts och Smith Family Foundation till R.S. Författarna tackar Dr. Shuo Jiang för hans bidrag till utveckling och optimering av protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18x18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24x60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 |
References
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L.
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
