Summary
Здесь представлен анализ восстановления in vitro на основе микроскопии TIRF для одновременной количественной оценки и сравнения динамики двух популяций микротрубочек. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких микротрубочек-ассоциированных белков на сшитых пучках микротрубочек и одиночных микротрубочек.
Abstract
Микротрубочки представляют собой полимеры гетеродимеров αβ-тубулина, которые организуются в различные структуры в клетках. Архитектуры и сети на основе микротрубочек часто содержат подмножества массивов микротрубочек, которые различаются по своим динамическим свойствам. Например, в делящихся клетках стабильные пучки сшитых микротрубочек сосуществуют в непосредственной близости от динамических несшитых микротрубочек. Исследования восстановления in vitro на основе TIRF-микроскопии позволяют одновременно визуализировать динамику этих различных массивов микротрубочек. В этом анализе камера визуализации собирается с поверхностно-иммобилизованными микротрубочками, которые либо присутствуют в виде одиночных нитей, либо организованы в сшитые пучки. Введение тубулина, нуклеотидов и белковых регуляторов позволяет непосредственно визуализировать ассоциированные белки и динамические свойства одиночных и сшитых микротрубочек. Кроме того, изменения, которые происходят, когда динамические одиночные микротрубочки организуются в пучки, могут отслеживаться в режиме реального времени. Описанный здесь способ позволяет проводить систематическую оценку активности и локализации отдельных белков, а также синергетических эффектов белковых регуляторов на два разных подмножества микротрубочек в идентичных экспериментальных условиях, тем самым обеспечивая механистические идеи, недоступные другим методам.
Introduction
Микротрубочки представляют собой биополимеры, которые образуют структурные каркасы, необходимые для нескольких клеточных процессов, начиная от внутриклеточного транспорта и позиционирования органелл до деления и удлинения клеток. Для выполнения этих разнообразных функций отдельные микротрубочки организованы в массивы размером с микрон, такие как митотические веретена, цилиарные аксонемы, пучки нейронов, межфазные массивы и растительные корковые массивы. Вездесущим архитектурным мотивом, найденным в этих структурах, является пучок микротрубочек, сшитых по их длине1. Интригующей особенностью нескольких структур на основе микротрубочек является сосуществование пучковых микротрубочек и несшитых одиночных микротрубочек в непосредственной пространственной близости. Эти субпопуляции микротрубочек могут демонстрировать резко отличающуюся динамику полимеризации друг от друга, как это необходимо для их правильного функционирования2,3,4,5. Например, внутри митотического шпинделя стабильные сшитые пучки и динамические одиночные микротрубочки присутствуют в микронной области в центре ячейки6. Таким образом, изучение того, как определяются динамические свойства сосуществующих популяций микротрубочек, имеет решающее значение для понимания сборки и функции структур на основе микротрубочек.
Микротрубочки представляют собой динамические полимеры, которые циклически переключаются между фазами полимеризации и деполимеризации, переключаясь между двумя фазами в событиях, известных как катастрофа и спасение7. Динамика клеточных микротрубочек регулируется мириадами микротрубочек,ассоциированных белков (MAP), которые модулируют скорость полимеризации и деполимеризации микротрубочек и частоты катастроф и спасательных событий. Исследовать активность MAP на пространственно проксимальных массивах в клетках сложно из-за ограничений пространственного разрешения в световой микроскопии, особенно в областях с высокой плотностью микротрубочек. Более того, наличие нескольких MAP в одной и той же клеточной области затрудняет интерпретацию клеточных биологических исследований. Анализы восстановления in vitro, выполняемые в сочетании с микроскопией полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF), обходят проблемы изучения механизмов, с помощью которых конкретные подмножества MAP регулируют динамику проксимальных клеточных микротрубочек. Здесь исследуется динамика собранных in vitro микротрубочек в присутствии одного или нескольких рекомбинантных MAP в контролируемых условиях8,9,10. Однако обычные анализы восстановления обычно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива, что исключает визуализацию сосуществующих популяций.
Здесь мы представляем анализы восстановления in vitro , которые позволяют одновременно визуализировать две популяции микротрубочек в одних и тех же условиях решения11. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких MAP на одиночных микротрубочках и на пучках микротрубочек, сшитых митотическим веретенно-ассоциированным белком PRC1. Белок PRC1 преимущественно связывается при перекрытии между антипараллельными микротрубочками, сшивая их9. Вкратце, этот протокол состоит из следующих этапов: (i) подготовка исходных растворов и реагентов, (ii) очистка и обработка поверхности покровных пластин, используемых для создания камеры визуализации для микроскопических экспериментов, (iii) подготовка стабильных «семян» микротрубочек, из которых полимеризация инициируется в ходе эксперимента, (iv) спецификация настроек микроскопа TIRF для визуализации динамики микротрубочек, (v) иммобилизация семян микротрубочек и генерация сшитых пучков микротрубочек в камере визуализации и (vi) визуализация динамики микротрубочек в камере визуализации с помощью микроскопии TIRF при добавлении растворимого тубулина, MAP и нуклеотидов. Эти анализы позволяют качественно оценить и количественно изучить локализацию MAP и их влияние на динамику двух популяций микротрубочек. Кроме того, они облегчают оценку синергетического воздействия нескольких MAP на эти популяции микротрубочек в широком диапазоне экспериментальных условий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовьте реагенты
- Подготовьте буферы и реагенты, как показано в таблице 1 и таблице 2. Во время эксперимента держите все растворы на льду, если не указано иное.
| Решение | Компоненты | Рекомендуемая продолжительность хранения | Примечания | ||
| 5X BRB80 | 400 мМ K-PIPES, 5 мМ MgCl2, 5 мМ EGTA, рН 6,8 с KOH, фильтр стерилизуется | до 2 лет | Хранить при температуре 4 °C | ||
| 1X BRB80 | 80 мМ K-PIPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, pH 6,8 | до 2 лет | Хранить при температуре 4 °C | ||
| БРБ80-ДТТ | 1X BRB80, 1 мМ DTT | до 2 дней | |||
| Буфер анализа | 80 мМ K-PIPES, 3 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, рН 6,8, 5% сахарозы (OR 1X BRB80, 5% сахарозы, 2 мМ MgCl2) | до 1 года | Хранить при температуре 4 °C | ||
| Главный буфер (МБ) | Буфер анализа, 5 мМ TCEP | 1 неделя | Подготовьтесь в день эксперимента; Разделите на две трубки: MB-теплый при комнатной температуре и MB-холодный на льду; включают 1 мМ DTT при использовании флуоресцентных красителей | ||
| Главный буфер с метилцеллюлозой (MBMC) | 1X BRB80, 0,8% метилцеллюлоза, 5 мМ TCEP, 5 мМ MgCl2 | 1 неделя | Подготовьтесь в день эксперимента; включают 1 мМ DTT при использовании флуоресцентных красителей | ||
| Буфер разбавления белка (DB) | MB, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мкМ АТФ | 1 день, на льду | Подготовьтесь в день эксперимента; включают 1 мМ DTT при использовании флуоресцентных красителей | ||
| Кислородопоглощающая смесь (OSM) | MB, 389 мкг/мл каталазы, 4,44 мг/мл глюкозооксидазы, 15,9 мМ 2-меркаптоэтанола (BME) | 1 день, на льду | Подготовьтесь в день эксперимента | ||
| Финал очистки кислорода (OSF) | MB, 350 мкг/мл каталазы, 4 мг/мл глюкозооксидазы, 14,3 мМ BME, 15 мг/мл глюкозы | использовать в течение 30 мин | Подготовьте непосредственно перед использованием, добавив 1 мкл глюкозы к 9 мкл OSM | ||
Таблица 1: Список буферов, используемых в этом протоколе, и их компонентов. В столбце «Рекомендуемая продолжительность хранения» приведены рекомендации о том, насколько заблаговременно можно подготовить каждый буфер.
| Реагент | Концентрация при хранении | Растворитель для хранения | Температура хранения | Рабочая концентрация | Конечная концентрация | Рекомендуемая продолжительность хранения | Примечания | |||||||||
| Нейтравидин (NA) | 5 мг/мл | 1X BRB80 | -80°С | 0,2 мг/мл | 0,2 мг/мл | до 1 года | Используется для иммобилизации микротрубочек через связь биотин-нейтравидин-биотин; хранить в небольших аликвотах | |||||||||
| Каппа-казеин (KC) | 5 мг/мл | 1X BRB80 | -80°С | 0,5 мг/мл | 0,5 мг/мл | до 2 лет | Используется для блокировки поверхности камеры визуализации; Хранить в небольших аликвотах; В день эксперимента отложите небольшой объем в сторону при комнатной температуре | |||||||||
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | 50 мг/мл | 1X BRB80 | -20°С | 1 мг/мл (в БД) | Н/Д | до 2 лет | хранить в небольших аликвотах | |||||||||
| Каталазы | 3,5 мг/мл | 1X BRB80 | -80°С | 350 мкг/мл (в OSF) | 35 мкг/мл | до 2 лет | компонент кислородопоглощающей смеси; хранить в небольших аликвотах | |||||||||
| Глюкозооксидаза | 40 мг/мл | 1X BRB80 | -80°С | 4 мг/мл (в OSF) | 0,4 мг/мл | до 2 лет | компонент кислородопоглощающей смеси; хранить в небольших аликвотах | |||||||||
| Тубулин | Лиофилизированный | Н/Д | 4°С | 10 мг/мл | 2,12 мг/мл (в смеси тубулина) | до 1 года | Как только тубулин окажется в растворе, держите его холодным, чтобы избежать полимеризации. | |||||||||
| Аденозинтрифосфат (АТФ) | 100 мМ | сверхчистая вода | -20°С | 10 мМ | 1 мМ | 6 месяцев | Приготовьте раствор в фильтрованной стерилизованной воде, отрегулируйте рН до ~7,0 и заморозьте небольшими аликвотами. | |||||||||
| Гуанозинтрифосфат (ГТФ) | 100 мМ | сверхчистая вода | -20°С | 10 мМ | 1,29 мМ (в тубулиновой смеси) | 6 месяцев | Приготовьте раствор в фильтрованной стерилизованной воде, отрегулируйте рН до ~7,0 и заморозьте небольшими аликвотами. | |||||||||
| Гуанозин-5'-[(α,β)-метилено]трифосфат (GMPCPP) | 10 мМ | сверхчистая вода | -20°С | 10 мкМ | 0.5 мкМ | 6 месяцев | ||||||||||
| Дитиотрейтол (DTT) | 1 М | стерильная вода | -20°С | 1 мМ | Н/Д | до 2 лет | ||||||||||
| Трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP) | 0.5 млн | фильтрованно-стерилизованная вода | Комнатная температура | 5 мМ | Н/Д | до 2 лет | ||||||||||
| Метилцеллюлоза | 1% | стерильная вода | Комнатная температура | 0,8% (в МБМК) | 0,21% (в смеси тубулина) | до 1 года | Растворите метилцеллюлозу, медленно добавляя ее в почти кипящую воду. Дайте остыть, постоянно помешивая. | |||||||||
| Бета-меркаптоэтанол (BME) | 143 мМ | стерильная вода | Комнатная температура | 14,3 мМ (в OSF) | 1,43 мМ | до 5 лет | 143 мМ - разбавление запаса BME 1:100 | |||||||||
| Глюкоза | 150 мг/мл | 1X BRB80 | -80°С | 15 мг/мл (в OSF) | 1,5 мг/мл | до 2 лет | Добавление в OSM непосредственно перед использованием | |||||||||
| (±)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота (Тролокс) | 10мМ | 1X BRB80 | -80°С | 10 мМ | 1 мМ | до 1 года | Не растворяется полностью. Добавьте немного NaOH, перемешайте в течение ~ 4 часов и фильтруйте стерилизовать перед использованием | |||||||||
| мПЕГ-Сукцинимидил валерат, МВт 5,000 | порошок | Н/Д | -20°С | 333 мг/мл (в 0,1 М бикарбоната натрия) |
324 мг/мл (в 0,1 М бикарбоната натрия) |
6 месяцев | Приготовьте ~34 мг аликвоты, пометив каждый тюбик точным весом порошка. Пропустите газообразный азот над твердым веществом, запечатайте трубки с парапленкой и храните при -20°C в контейнере с осушителем. | |||||||||
| Биотин-ПЭГ-СВА, МВт 5,000 | порошок | Н/Д | -20°С | 111 мг/мл (в 0,1 М бикарбоната натрия) |
3,24 мг/мл (в 0,1 М бикарбоната натрия) | 6 месяцев | Приготовьте ~3 мг аликвот, пометив каждый тюбик точным весом порошка. Пропустите газообразный азот над твердым веществом, запечатайте трубки с парапленкой и храните при -20°C в контейнере с осушителем. | |||||||||
Таблица 2: Список реагентов, используемых в данном протоколе. Включены рекомендуемые условия хранения и концентрации, рабочие концентрации исходных растворов, используемых во время эксперимента, и конечная концентрация в камере визуализации. Дополнительные примечания приведены в крайнем правом столбце.
2. Подготовьте слайды Biotin-PEG
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте камеры визуализации как можно ближе к началу эксперимента и не более чем за 2 недели.
- Чистые крышки
- Расположите равное количество крышек размером 24 x 60 мм и 18 x 18 мм #1,5 (рисунок 1F) в банках для окрашивания слайдов и стеллажах для мойки слайдов соответственно (рисунок 1A, B). Поместите стеллажи для стирки для скольжения, содержащие крышки размером 18 x 18 мм, в стакан емкостью 100 мл.
- Промывайте все крышки 5-6 раз в сверхчистой воде (удельное сопротивление 18,2 МОм-см) и удаляйте лишнюю жидкость после каждого ополаскивания с помощью наконечника пипетки, прикрепленного к вакуумной трубке (рисунок 1C).
- Наполните стаканы и банки для окрашивания слайдов, содержащие крышки, сверхчистой водой, запечатайте парапленкой и обработайте ультразвуком в течение 10 минут.
- Наполните два стакана по 150 мл 200-стойким этанолом. Используя пинцет, окуните каждую крышку в один стакан, наполненный этанолом, а затем в другой.
- С помощью пинцета переложите крышки в скользящую сушильную стойку (рисунок 1D), высушите их под потоком газообразного азота и инкубируйте при 37 °C до полного высыхания (~15 мин).
- Поместите высушенные крышки в один слой внутри плазменного очистителя. Сформируйте вакуумное уплотнение, а затем установите радиочастотный (РЧ) уровень плазменного очистителя на ~8 МГц.
- Как только плазма сгенерирована, оставьте крышки в плазмоочистителе на 5 минут. Выключите плазмоочиститель и медленно отпустите вакуум.
- Как только вакуумное уплотнение будет освобождено, переверните крышки и повторите плазменную очистку в течение 5 минут для другой стороны обшивки.
- Альтернатива плазменной очистке: Вместо шагов 2.1.2-2.1.3, обтекайте ультразвуком обтекайте крышки в теплом растворе 2% моющего средства (в сверхчистой воде) в течение 10 мин. Затем тщательно промыть крышки сверхчистой водой и обработать ультразвуком в сверхчистой воде 2-3 раза (по 10 мин каждая). Далее промыть в этаноле и высушить, как на этапах 2.1.4-2.1.5. Пропустите шаги 2.1.6-2.1.8.
- Лечение биотин-ПЭГ
- Непосредственно перед применением растворяют 400 мкл 3-аминопропилтриэтоксисилана в 40 мл ацетона. С помощью пинцета переместите очищенные плазмой крышки в стойку для стирки слайдов и банки для окрашивания слайдов. Погружайте покровы в 3-аминопропилтриэтоксисилановый раствор и инкубируйте в течение 5 мин12,13.
- Вымойте все крышки 5-6 раз сверхчистой водой.
- Переложите крышки в сушильную стойку, высушите их под потоком газообразного азота и высиживаете при 37 °C до полного высыхания (~20 мин).
- Положите высушенные крышки на деликатные салфетки и пометьте каждый обложек на одном углу, например, 'p' на каждом чехле 18 x 18 мм и 'b' на каждом чехле 24 x 60 мм (см. Рисунок 2).
- В день эксперимента готовят свежий 0,1 М раствор бикарбоната натрия, растворяя 0,84 мг NaHCO3 в 10 мл сверхчистой воды.
- Доведите аликвоты mPEG-Сукцинимидил валерата (PEG-SVA) и Биотин-PEG-SVA до комнатной температуры непосредственно перед использованием. См. примечания по приготовлению аликвоты полиэтиленгликоля (ПЭГ) в таблице 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, потому что период полураспада гидролиза фрагмента сукцинимидила валерата (SVA) составляет ~ 30 мин. - Добавьте 102 мкл 0,1 М NaHCO3 к 34 мг ПЭГ-СВА, вращайте в настольной микроцентрифуге при 2,656 х г в течение 20 с, а затем перемешайте путем пипетки вверх и вниз. Растворить 3 мг биотина-ПЭГ-СВА в 27 мкл 0,1 М NaHCO3 путем пипетирования вверх и вниз. Отрегулируйте объемы разбавления в соответствии с точным весом ПЭГ, указанным на трубах (см. таблицу 2).
- Приготовьте смесь 100:1 п/б ПЭГ:биотин-ПЭГ, объединив 75 мкл раствора ПЭГ-СВА и 2,25 мкл раствора Биотин-ПЭГ-СВА для 20 облицовок, 100 мкл и 3 мкл для 30 обшивок или 125 мкл и 3,75 мкл для 40 обложек.
- Постройте камеру гидратации, поместив влажные бумажные полотенца под стойку наконечника в нижней части пустого наконечника объемом 10 мкл (рисунок 1E). Это предотвратит испарение растворов ПЭГ.
- Пипетка 6 мкл смеси PEG-SVA:biotin-PEG 100:1 на центр одного чехла размером 24 x 60 мм на маркированной стороне. Поместите еще один обшивочный лист размером 24 x 60 мм поверх первого чехлового листа таким образом, чтобы пара образовывала X-образную форму, а стороны с надписью «b» были обращены друг к другу. Поместите пару на пустую стойку наконечника в увлажняющей камере и повторите для оставшихся 24 x 60 мм обшивочных прорезей.
- Пипетка 6 мкл PEG-SVA по центру одного чехла размером 18 x 18 мм на маркированной стороне. Поместите еще одну крышку размером 18 x 18 мм поверх первой крышки, с боковыми сторонами с надписью «p» лицом друг к другу. Поместите пару на пустую стойку наконечника в гидратационной камере и повторите для оставшихся 18 x 18 мм крышек.
- Закройте гидратационную камеру и инкубируйте в течение 3 ч или на ночь.
- Отделите пары чехлов и промойте в сверхчистой воде.
- Высушите покровы струей азота и поместите их в инкубатор при температуре 37 °C для полного высыхания.
- Чтобы построить камеру визуализации, наклейте три полосы двусторонней ленты на крышку размером 24 x 60 мм с боковой маркировкой «b». К другой стороне ленточных полос прикрепите крышку размером 18 x 18 мм с боковой пометкой «p», обращенную к более крупному чехловому листу. Это образует две проточные камеры для микроскопических экспериментов, с обработанными поверхностями, обращенными друг к другу (рисунок 2 и рисунок 1G).
Рисунок 1: Оборудование для обработки крышки и подготовки камеры визуализации. (A) банки для окрашивания слайдов для 24 x 60 мм обшивки, (B) стойки для стирки для скольжения для 18 x 18 мм чехлов, (C) вакуумная установка, (D) стеллаж для сушки слайдов, (E) гидратационная камера, (F) крышки, (G) камера визуализации, (H) держатель слайдов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема подготовки камер визуализации с использованием двусторонней ленты (серого цвета) и покрытых крышек, обработанных ПЭГ/Биотин-ПЭГ. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Полимеризуйте микротрубочки
- Подготовка семян ГМПЦПП
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте семена GMPCPP в холодном помещении, сохраняя все реагенты, наконечники и трубки при 4 °C. Семена GMPCPP могут быть подготовлены заранее и храниться при -80 °C в течение 1 года. Поместите в ультрацентрифугу ротор ультрацентрифуги с фиксированным углом наклона, содержащий трубки центрифуги объемом 1 мл, и установите температуру до 4 °C.- Повторное суспендирование лиофилизированного тубулина (таблица 2) до ~10 мг/мл в 1X BRB80 непосредственно перед применением.
- Смешайте компоненты семян GMPCPP, как описано в таблице 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все компоненты тубулина на льду как можно больше, чтобы свести к минимуму полимеризацию растворимого тубулина. - Осветлить смесь в ультрацентрифужном роторе с фиксированным углом при 352 700 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Разделите супернатант на 5 мкл аликвот, заморозьте их в жидком азоте и храните при -80 °C.
- Полимеризуйте семена в день эксперимента
- Теплый 1-2 мл BRB80-DTT (таблица 1) до 37 °C.
- Поместите 5 мкл аликвоты семян GMPCPP (-80 °C) со стадии 3.1.4 на лед и немедленно растворите в 20 мкл теплого BRB80-DTT. Открутите при 2 000 х г в течение 5 с при комнатной температуре и постучите для смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный объем разбавления может варьироваться от 13 мкл до 21 мкл и определяется эмпирически для каждой партии семян. Если семена не полимеризуются, устраните неполадки, дополнив первоначальный буфер разбавления (этап 3.2.2) 0,5 мкМ GMPCPP. - Беречь от света и инкубировать при 37 °C в течение 30-45 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина микротрубочек зависит от продолжительности инкубации. Для коротких микротрубочек время инкубации может составлять всего 15 минут. Для длинных микротрубочек время инкубации может составлять до 2 ч. Биотинилированные микротрубочки, как правило, требуют более длительного времени инкубации, чем небиотинилированные микротрубочки. - Поместите ультрацентрифужный ротор с фиксированным углом наклона, содержащий 500 мкл центрифужных трубок, в ультрацентрифугу и предварительно прогрет до 30 °C.
- После инкубации добавляют 50 мкл теплого BRB80-DTT (стадия 3.2.1) к полимеризованным семенам GMPCPP и переносят смесь в центрифужную трубку объемом 500 мкл. Промыть пустую трубку, содержащую семена GMPCPP, еще 50 мкл теплого BRB80-DTT, пипеткой вверх и вниз, и добавить этот буфер в 500-мкл центрифужную трубку, содержащую смесь.
- Перед вращением отметьте ободок трубки центрифуги, чтобы указать, где будет находиться гранула (гранула будет слишком мала, чтобы ее можно было увидеть). Отжим в течение 10 мин при 244 900 х г при 30 °C12.
- Осторожно выложите супернатант и выбросьте. Повторно суспендировать гранулу в 100 мкл теплого BRB80-DTT. Нажмите, чтобы смешать.
- Отжим в течение 10 мин при 244 900 х г при 30 °C, выравнивая маркировку с ротором на гранулу в том же месте.
- Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 16 мкл теплого BRB80-DTT. Перенесите раствор микротрубочек в чистую микроцентрифужную трубку объемом 0,6 мл. Защитите от света и храните при комнатной температуре или выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: После полимеризации держите микротрубочки при комнатной температуре или выше. Если они замерзнут, они деполимеризуются. Инкубировать при температуре 28 °C для дополнительной стабильности.
- Проверка микротрубочек с помощью TIRF-микроскопии
- Пипетка смесью 4,5 мкл BRB80-DTT и 1 мкл раствора микротрубочек (шаг 3.2.9) на предметное стекло микроскопа. Накройте крышкой размером 18 x 18 мм и запечатайте края либо прозрачным лаком для ногтей, либо смесью вазелина, ланолина и парафина (валапный герметик) 1:1: 1, которая является твердой при комнатной температуре и жидкой при 95 ° C.
- Поместите объектив TIRF под крышкой (рекомендуемые настройки микроскопа см. на этапе 4) и визуализируйте вновь полимеризованные микротрубочки на длине волны, соответствующей флуоресцентно меченому тубулину в смеси Bright (таблица 3), чтобы определить, какое разбавление микротрубочек использовать в предстоящих экспериментах.
| Реагент | Яркая смесь (мкл) | Порядок добавления | Яркая смесь + биотин (мкл) | Порядок добавления |
| Флуоресцентный тубулин, 10 мг/мл | 2 | 6 | 2 | 7 |
| Биотин-тубулин, 10 мг/мл | 0 | Н/Д | 2 | 6 |
| Немаркированный тубулин, 10 мг/мл | 20 | 5 | 18 | 5 |
| ГМПКЭС, 10 мМ | 30 | 4 | 30 | 4 |
| Диафрагма, 0,2 М | 0.7 | 3 | 0.7 | 3 |
| 5X BRB80 | 26.4 | 2 | 26.4 | 2 |
| стерильная вода | 52.9 | 1 | 52.9 | 1 |
| Общий объем (мкл) | 132 | 132 |
Таблица 3: Смесь семян ГМПЦПП. Компоненты семян микротрубочек GMPCPP, включая объем и порядок добавления. Приготовьте 5 мкл аликвот и храните до 1 года при -80 °C.
4. Настройки микроскопа
- Температура: Установите температуру микроскопа на 28 °C для просмотра динамических микротрубочек.
- Фильтры: Используйте наилучшую комбинацию кубиков фильтров и эмиссионных фильтров, в зависимости от флуоресцентных каналов, которые будут визуализированы. Чтобы визуализировать длины волн 488 нм, 560 нм и 647 нм в том же эксперименте, используйте лазерный четырехдиапазонный набор 405/488/560/647 нм в сочетании с эмиссионными фильтрами для обозначенных длин волн.
- Выровнять лазеры: убедитесь, что лазерные лучи, используемые в эксперименте, выровнены. Определите интенсивность лазера для эксперимента эмпирически, чтобы все флуоресцентные белки могли быть визуализированы с максимально возможным отношением сигнал/шум, но не подвергались значительному фотоотбеливанию в течение времени эксперимента.
- Цель: Используйте бумагу для линз для очистки 100-кратного объектива с 70% этанолом. Перед визуализацией добавьте каплю погружного масла микроскопа к объективу.
- Настройка последовательности изображений
- Для эксперимента с 647 нм флуорофор-мечеными биотинилированными микротрубочками, 560 нм флуорофор-мечеными небиотинилированными микротрубочками и растворимым тубулином, и интересующим белком, меченым GFP, изображение в течение 20 мин. Снимайте каналы 560 нм и 488 нм каждые 10 с, а канал 647 нм каждые 30 с.
- Чтобы захватить эталонное изображение пучков перед добавлением растворимого тубулина и MAP, настройте последовательность с одним изображением каждый в длинах волн 560 нм и 647 нм.
5. Генерация поверхностно-иммобилизованных пучков микротрубочек
ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующих этапов перетейте все растворы в проточную камеру путем пипетки в одну открытую сторону, поместив фильтровальную бумагу на другую сторону. Защитите камеру визуализации от света, чтобы уменьшить фотоотбеливание флуоресцентно меченых белков. Прикрепите подготовленную камеру визуализации к держателю слайдов (рисунок 1G,H). Выполните действия, описанные в таблице 4, которые соответствуют шагам протокола 5.2-6.4.
- Приготовить растворимую тубулиновую смесь по таблице 5 и держать на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворимый тубулин всегда должен быть помещен на лед, чтобы предотвратить полимеризацию. Готовьте свежую растворимую смесь тубулина примерно каждые 2 ч, или когда микротрубочки больше не полимеризуются. - Чтобы обездвижить микротрубочки через связь биотин-нейтравидин-биотин, сначала текут в растворе нейтравидина (NA) до тех пор, пока камера не будет заполнена (~ 7,5 мкл) и инкубирует в течение 5 мин.
- Промыть 10 мкл МБ-холода.
- Протойте в 7,5 мкл блокирующего белка κ-казеина (KC) и инкубируйте в течение 2 мин.
- Промыть 10 мкл МБ-тепла для подготовки камеры к введению микротрубочек.
- Разбавляют запас биотинилированных микротрубочек (по наблюдениям на стадии 3.3.2) в 1X BRB80-DTT и добавляют 1 мкл этого разведения к 9 мкл MB-теплого. Протейте смесь в камеру и инкубируйте в течение 10 мин. Используйте более высокую концентрацию микротрубочек для большего количества пучков.
- Смойте неиммобилизованные микротрубочки 10 мкл MB-тепла.
- Влить в камеру 7,5 мкл теплого KC и инкубировать в течение 2 мин.
- Во время инкубации готовят 2 нМ раствора сшивающего белка PRC1 в теплом KC. Перетекают 10 мкл этого раствора в проточную камеру и инкубируют в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантный PRC1 экспрессируется и очищается из бактериальных клеток, как описано ранее13. - Чтобы сделать пучки, перетекайте 10 мкл небиотинилированных микротрубочек в камеру и инкубируйте в течение 10 мин. PRC1 будет сшивать небиотинилированные и иммобилизованные биотинилированные микротрубочки15,16 (рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: См. этап 6.1 для приготовления пробирной смеси во время инкубации. - Дважды промыть камеру 10 мкл в тепле. Прикрепленные микротрубочки стабильны в течение примерно 20 минут с этой точки.
| Шаг | Реагент | Объем (мкл) | Время инкубации (минуты) |
| 1 | Нейтравидин | 7.5 | 5 |
| 2 | МБ-холодный | 10 | - |
| 3 | κ-казеин | 7.5 | 2 |
| 4 | МБ-теплый | 10 | - |
| 5 | Биотинилированная микротрубочка (разведенная в MB-теплой) | 10 | 10 |
| 6 | МБ-теплый | 10 | - |
| 7 | Теплый κ-казеин | 7.5 | 2 |
| 8 | 2 нМ PRC1, разбавленный в κ-казеине | 10 | 5 |
| 9 | Небиотинилированная микротрубочка | 10 | 10 |
| 10 | МБ-теплый x 2 | 10 | - |
| 11 | Пробирная смесь | 10 | - |
| Прикрепленные семена стабильны в течение примерно 20 минут в этот момент. | |||
Таблица 4: Этапы анализа. Перечень реагентов, добавляемых в камеру визуализации, с указанием времени промывки (-) или инкубации.
| Реагент | Объем (мкл) |
| Переработанный тубулин, 10 мг/мл | 10 |
| МБ-Холодный | 10.3 |
| МБМК | 13.7 |
| БРБ80-ДТТ | 3.4 |
| ГТП, 10 мМ | 6.7 |
| СПС, 10 мМ (При использовании кинезинов) |
6.7 |
| Флуоресцентно меченый тубулин, 10 мг/мл |
1 (Ресуспенд лиофилизированного меченого тубулина в холодном BRB80-DTT) |
Таблица 5: Компоненты смеси растворимых тубулинов. Перемешайте в начале эксперимента и держите на льду.
Рисунок 3: Схема добавления компонентов анализа для изготовления и изображения флуоресцентно меченых пучков и одиночных микротрубочек. Биотинилированные семена показаны в синих, небиотинилированных семенах и растворимый тубулин в красном, PRC1 в черном, а белок, представляющий интерес, в голубом. Номера шагов на рисунке соответствуют номерам, приведенным в таблице 4. Панель, соответствующая шагу 9, показывает предварительно сформированный пучок (внизу слева); на шаге 11 показан вновь образованный пучок (вверху слева). Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
6. Динамика микротрубочек изображения
- В течение 10 мин инкубационного времени на стадии 5.10 готовят 10 мкл пробирной смеси, содержащей интересующие белки, растворимый тубулин, нуклеотиды, поглотители кислорода14 и антиоксиданты согласно таблице 6. Держите смесь на льду.
- Загрузите подготовленную камеру визуализации, приклеенную к держателю слайда, на объектив 100x TIRF. Используйте каналы 560 нм и 647 нм, чтобы найти поле зрения, содержащее оптимальное количество и плотность одиночных микротрубочек и пучков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если как биотинилированные, так и небиотинилированные микротрубочки помечены одним и тем же флуорофором, анализ интенсивности флуоресценции при линейном сканировании может различать отдельные микротрубочки и пучки. - После определения поля зрения сделайте эталонное изображение.
- Осторожно течь в пробирную смесь, не нарушая камеру визуализации.
- Запечатайте открытые концы камеры валапным герметиком.
- Запустите последовательность изображений, как описано в шаге 4.5.1.
| Реагент | Объем (мкл) |
| Растворимая тубулиновая смесь | 4 |
| ОСФ | 1 |
| Тролокс (при использовании микротрубочек, помеченных легкоотбеливающим флуорофором) | 1 |
| СПС, 10 мМ (При использовании кинезинов) |
1 |
| PRC1 (или поперечный по выбору) | 1 |
| Интересующие белки | X |
| МБ-холодный | 2-Х |
Таблица 6: Компоненты пробирной смеси. Смешайте, перетейте в камеру визуализации и изобразите динамику микротрубочек в течение 30 минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эксперимент, описанный выше, проводили с использованием 647 нм флуорофор-меченых биотинилированных микротрубочек, 560 нм флуорофор-меченых небиотинилированных микротрубочек и 560 нм флуорофор-меченой растворимой тубулиновой смеси. Микротрубочки были сшиты сшиваемым белком PRC1 (меченым GFP). После получения поверхностно-иммобилизованных пучков и одиночных микротрубочек (этап 5.11) камеру визуализации устанавливали на масляный объектив TIRF 100X 1.49 NA и рассматривали в флуоресцентных каналах 560 нм и 647 нм. Одиночные микротрубочки были идентифицированы по их флуоресцентному сигналу в канале 647 нм. Микротрубочки с флуоресцентными сигналами в обоих каналах были идентифицированы как предварительно сформированные пучки (рисунок 4). Если проводить эксперименты с биотинилированными и небиотинилированными микротрубочками с одинаковой флуоресцентной меткой, то обнаруженная интенсивность флуоресценции для пучков будет примерно в два раза или выше, чем у одиночных микротрубочек. Исходя из пропорции и плотности каждой популяции, можно оптимизировать концентрацию семян микротрубочек на этапах 5.6 и 5.10.
Рисунок 4: Идентификация одиночных микротрубочек и сшитых микротрубочек в поле зрения. Репрезентативное поле зрения, показывающее 647 нм (слева), 560 нм (по центру) и объединенные (справа) каналы. Одиночные микротрубочки (желтые наконечники стрелок) и пучки (белые наконечники стрел) обозначены в объединенном канале. Шкала представляет 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Динамика одиночных микротрубочек и сшитых пучков PRC1. Репрезентативное видео, демонстрирующее динамику микротрубочек с 647 нм мечеными флуорофором биотинилированными семенами микротрубочек (синий), 560 нм флуорофорами, мечеными небиотинилированными семенами микротрубочек и 560 нм флуорофорами мечеными растворимыми тубулинами (красный), и меченым GFP PRC1 (зеленый). Одиночные и сшитые микротрубочки обозначены белыми и желтыми стрелками соответственно. Фильм записывался в течение 10 минут (61 кадр) и отображался со скоростью 12 кадров в секунду. Условия анализа: 0,5 нМ GFP-PRC1, 50 мМ KCl и 37 °C. Шкала: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
После получения последовательности изображений проанализируйте видео, чтобы убедиться, что микротрубочки являются динамическими (видео 1). Отрегулируйте компоненты анализа (объем тубулина в растворимой смеси тубулина, запасы нуклеотидов, концентрации белка) в соответствии с наблюдениями. Например, если микротрубочки не полимеризуются, увеличивают концентрацию растворимого тубулина и/или ГТФ в растворимой тубулиновой смеси. Аналогичным образом, увеличивают рабочие концентрации флуоресцентно меченых MAP, если они не видны на микротрубочках, и уменьшают концентрации, если их фоновая интенсивность флуоресценции в поле зрения сопоставима с их интенсивностью на микротрубочках. При визуализации подвижных моторных белков увеличивают концентрацию АТФ, если моторы не проявляют подвижности на микротрубочках. Отрегулируйте интенсивность лазера для каналов возбуждения, соответствующих флуоресценции микротрубочек, чтобы гарантировать, что различия в интенсивности флуоресценции между отдельными микротрубочками и пучками могут быть захвачены в динамическом диапазоне детектора.
Видео 2: Различия в динамике одиночных микротрубочек и PRC1-сшитых пучков при наличии двух MAP: CLASP1 и Kif4A. Репрезентативное видео, показывающее динамику микротрубочек, с 647 нм мечеными флуорофором биотинилированными семенами микротрубочек (синий) и 560 нм флуорофор-мечеными небиотинилированными семенами микротрубочек и 560 нм флуорофор-мечеными растворимыми тубулинами (красный). Одиночные и сшитые микротрубочки обозначены белыми и желтыми стрелками соответственно. Фильм записывался в течение 20 минут (121 кадр) и отображался со скоростью 20 кадров в секунду. Условия анализа: 200 нМ CLASP1-GFP, 0,5 нМ PRC1 и 10 нМ Kif4A. Шкала: 2 мкм. Видео воспроизводится из ссылки11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
В репрезентативном примере, показанном на видео 2, показано поле зрения, содержащее одиночные микротрубочки и сшитые пучки. Установлено, что при этих условиях анализа (пробирная смесь, содержащая 0,5 нМ PRC1, 50 мМ KCl и интересующие МАП: 200 нМ GFP-меченая CLASP1, 10 нМ Kinesin Kif4A) одиночные микротрубочки удлиняются в течение анализа, тогда как рост сшитых микротрубочек останавливается.
Для количественного анализа динамики микротрубочек откройте файлы микроскопии в программном обеспечении FIJI и выберите отдельные микротрубочки и пучки для анализа. Используйте следующие критерии для исключения отдельных микротрубочек и пучков из дальнейшего анализа: исключить микротрубочки или пучки, (i) обнаруженные на краях поля зрения, (ii) скрытые белковыми агрегатами, или (iii) чьи нити движутся в z-направлении вне диапазона TIRF. Параметры динамики микротрубочек, такие как длина, скорость роста, частота спасения и частота катастроф, могут быть получены путем построения и анализа кимографов для каждой отдельной микротрубочки или пары микротрубочек11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь эксперимент значительно расширяет сферу применения и сложность обычных анализов восстановления микротрубочек, которые традиционно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива. Текущий анализ обеспечивает метод одновременной количественной оценки и сравнения регуляторной активности MAP на двух популяциях, а именно на одиночных микротрубочках и сшитых пучках. Кроме того, этот анализ позволяет исследовать два типа пучков: те, которые предварительно сформированы из стабильных семян до начала динамики, и те, которые вновь образуются, когда два растущих конца сталкиваются друг с другом и сшиваются (рисунок 3). Кроме того, в дополнение к обычным экспериментальным переменным, таким как концентрации белка и буферные условия, эти анализы позволяют оценить эффекты геометрических особенностей массивов микротрубочек, таких как длины и углы между соседними нитями в пучке, которые становятся важными детерминантами динамики микротрубочек и активности MAP16.
Чтобы расширить этот экспериментальный метод восстановления in vitro множественных структур на основе микротрубочек, необходимо решить следующие ключевые вопросы: (i) PRC1 преимущественно сшивает микротрубочки, которые ориентированы антипараллельно друг другу. В то время как такие пучки обнаруживаются в клеточном центре во время митоза, пучки параллельных микротрубочек являются общей чертой в других структурах на основе микротрубочек в нейронных аксонах и митотическом веретене. Протокол, описанный выше, может быть легко адаптирован для генерации сшитых параллельных микротрубочек с использованием рекомбинантных сшивающих устройств, таких как Kinesin-1 и TRIM4610,17. ii) В этих анализах восстановления различия в интенсивности флуоресценции могут использоваться для различения отдельных микротрубочек и пар микротрубочек11,15. В экспериментальных условиях, используемых здесь, анализ интенсивности показывает, что большинство пучков содержат две сшитые микротрубочки, а анализ линейного сканирования предоставляет информацию об их относительном позиционировании. Однако, когда в пучке более двух или трех нитей, пространственное разрешение стандартных систем визуализации на основе TIRF затрудняет идентификацию концов и полярности отдельных микротрубочек (диаметр ~ 25 нм)18. Более того, хотя можно идентифицировать плюсовые концы сшитых антипараллельных микротрубочек по направлению их роста, различение концов сшитых параллельных микротрубочек, растущих в одном направлении, затрудняется пространственным разрешением оптической микроскопии. Расширением эксперимента, описанного здесь, является использование микротрубочек с маркировкой полярности или белков, связывающих наконечники микротрубочек, для позиционирования отдельных микротрубочек. Для пучков с десятками микротрубочек, дополняющих высокое временное разрешение анализов на основе TIRF методами с высоким пространственным разрешением, такими как атомно-силовая микроскопия19, обещает дать новое понимание динамики отдельных микротрубочек в пучке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом NIH (No 1DP2GM126894-01), а также средствами Pew Charitable Trusts и Smith Family Foundation для R.S. Авторы благодарят доктора Шуо Цзяна за его вклад в разработку и оптимизацию протоколов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18x18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24x60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 |
References
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L.
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
