בפרוטוקול הנוכחי, טכניקת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) משמשת לקביעת התפלגות אורך השרשרת (CLD) ואורך השרשרת הממוצע (ACL) של גליקוגן.
חלקיקי גליקוגן הם פוליסכרידים מסועפים המורכבים משרשראות ליניאריות של יחידות גלוקוזיל המקושרות על ידי קשרי גלוקוזיד α-1,4. האחרונים מחוברים זה לזה על ידי α-1,6 חוליות גלוקוזיד, המכונות נקודות הסתעפות. בין הצורות השונות של אחסון פחמן (כלומר, עמילן, β-גלוקן), גליקוגן הוא ככל הנראה אחד מפוליסכרי האחסון העתיקים והמוצלחים ביותר שנמצאו ברחבי העולם החי. שרשראות גלוקאן מאורגנות כך שניתן לאחסן במהירות כמות גדולה של גלוקוז או לתדלק בתא בעת הצורך. טכניקות משלימות רבות פותחו בעשורים האחרונים כדי לפתור את המבנה העדין של חלקיקי הגליקוגן. מאמר זה מתאר אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE). שיטה זו מכמתת את אוכלוסיית שרשראות הגלוקן המרכיבות חלקיק גליקוגן. פרמטר זה, הידוע גם בשם התפלגות אורך השרשרת (CLD), משקף את גודל החלקיקים ואת אחוז ההסתעפות. זוהי גם דרישה חיונית למודלים מתמטיים של ביוסינתזה של גליקוגן.
גליקוגן, המשמש כאגירת פחמן ואנרגיה, הוא הומופולימר של גלוקוז המורכב משרשראות ליניאריות של יחידות גלוקוזיל המקושרות על ידי (1 → 4)-α קשרים ומחוברים דרך (1 → 6)-α קשרים גליקוזידיים או נקודות הסתעפות. הם מופיעים כחלקיקים β ו-α בציטוזול של מגוון רחב של אורגניזמים. חלקיקי β הם חלקיקים זעירים מסיסים במים שנצפו בעיקר בפרוקריוטים. קוטרם נע בין 20-40 ננומטר, ככל הנראה מוכתב על ידי אנזימי חילוף החומרים של הגליקוגן והעכבה הסטרית 1,2.
החלקיקים α הגדולים יותר, שתוארו לראשונה בתאי בעלי חיים, מציגים קוטר של עד 300 ננומטר עם צורה דמוית כרובית. ארגון מסוים זה עשוי לנבוע מצבירה של מספר חלקיקי β או להיווצר על ידי ניצנים מתוך חלקיק βיחיד 3. באופן מעניין, מחקר שנערך לאחרונה דיווח על נוכחותם של חלקיקי α ב-Escherichia coli4. עם זאת, בניגוד לחלקיקים α מתאי בעלי חיים, האחרון מתפרק במהירות במהלך תהליך החילוץ, מה שעשוי להסביר את היעדר הנתונים בספרות4. הופעתם של חלקיקי α באאוקריוטים ובפרוקריוטים כרוכה באנזימי מטבוליזם גליקוגן שאינם קשורים פילוגנטית5. זה מעלה שאלות לגבי תפקידם של חלקיקים כאלה ואופיים של חומרים מקשרים צולבים פוטנציאליים בין β חלקיקים5.
אף על פי ששני מודלים מתמטיים מנוגדים הוצעו להיווצרות מולקולות גליקוגן 6,7,8,9, מקובל לחשוב שחלקיקים β התפתחו בתגובה לתפקודם המטבולי כמאגר דלק יעיל ביותר לשחרור מהיר של כמויות גדולות של גלוקוז. גוף גדול של ראיות מצביע על כך שתכונות גליקוגן כגון יכולת עיכול ומסיסות במים מתואמות עם אורך השרשרת הממוצע (ACL), אשר לאחר מכן יכתיב את אחוז נקודות ההסתעפות ואת גודל החלקיק 2,6,7,7,8,10,11 . ACL מוגדר על ידי היחס בין המספר הכולל של שאריות גלוקוז לבין מספר נקודות ההסתעפות. בדרך כלל, ערכי ACL נעים בין 11-14 ו-7-23 שאריות גלוקוז באאוקריוטים ובפרוקריוטים, בהתאמה10. בבני אדם, מספר מחלות של הפרעת גליקוגן נובעות מהצטברות גליקוגן חריגה. לדוגמה, מחלת אנדרסן קשורה לפעילות לקויה של אנזים מסתעף גליקוגן, וכתוצאה מכך להצטברות של גליקוגן11 לא תקין. אצל פרוקריוטים, מחקרים מצטברים מצביעים על כך ש-ACL הוא גורם קריטי המשפיע על קצב הפירוק של הגליקוגן ויכולת ההישרדות של החיידקים12,13. דווח כי חיידקים המסנתזים β חלקיקים בעלי ערך ACL נמוך מתפרקים לאט יותר ולכן עומדים בתנאי רעב ארוכים יותר. לפיכך, הידע על הארכיטקטורה של חלקיקי β חיוני להבנת היווצרותם של חלקיקי גליקוגן חריגים במחלות אחסון גליקוגן אנושיות והישרדות פרוקריוטים בסביבה חסרת חומרים מזינים.
מאז הבידוד הראשון של גליקוגן מכבד הכלב על ידי הפיזיולוג הצרפתי קלוד ברנאר בסוף המאה התשע עשרה14, פותחו טכניקות רבות לאפיון חלקיקי גליקוגן בפירוט. לדוגמה, מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה עבור מורפולוגיה של גליקוגן (α או β-חלקיקים)15, ספקטרומטריית פרוטון-NMR לקביעת אחוז הקישורים α-1,616, כרומטוגרפיית אי הכללת גודל עם גלאים מרובים להסקת המשקל המולקולרי, אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)17 או כרומטוגרפיית חילופי אניון בעלת ביצועים גבוהים עם זיהוי אמפרומטרי פועם (HPAEC-PAD) הן עבור התפלגות אורך השרשרת (CLD) והן עבור ACL קביעה 18.
עבודה זו מתמקדת בשיטת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור, המסתמכת על המינוי הרדוקטיבי של קבוצת ההמיאצטלים על ידי פונקציית אמין ראשונית. מבחינה היסטורית, 8-אמינו-1,3,6-נפטלין חומצה טריסולפונית (ANTS) שימשה לראשונה לתיוג. מאוחר יותר, הוא הוחלף על ידי פלואורופור רגיש יותר, 8-אמינו 1,3,6 חומצה פירן טריסולפונית (APTS)19.
איור 1: תגובת האמינוציה הרדוקציוניסטית עם 8-אמינו 1,3,6 חומצה טריסולפונית פירנית (APTS). תגובת המינוי הרדוקטיבית של קבוצת ההמיאצטלים על ידי פונקציית אמין ראשונית של 8-אמינו 1,3,6 חומצה טריסולפונית פירן (APTS) בתנאים רדוקטיביים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כפי שמתואר באיור 1, הפונקציה ההמיאצטלית של הקצה המפחית של שרשרת גלוקן מתקשרת עם האמין העיקרי של APTS בתנאים מפחיתים. הקבוצות הסולפוניות של APTS נושאות מטענים שליליים המאפשרים הפרדת שרשראות גלוקן בהתאם למידת הפילמור שלהן (DP). תגובת האמין הרדוקציוניסטית ניתנת לשחזור ויעילה ביותר. התוויית יעילות ממוצעת של 80% מתקבלת עבור DP3 עד DP135 ועד 88% ו-97% עבור מלטוז (DP2) וגלוקוז, בהתאמה17,20. מאחר שמולקולה אחת של APTS מגיבה עם הקצה המפחית של כל שרשרת גלוקן, ניתן לכמת שרשראות בודדות ולהשוות אותן זו לזו על בסיס טוחן.
התכונות הפיזיקוכימיות של חלקיקי הגליקוגן (למשל, גודל, מורפולוגיה, מסיסות) קשורות ישירות לאורך הגלוקנים המרכיבים את החלקיקים. כל חוסר איזון בין אנזימים ביו-סינטטיים וקבוליים גורם לשינוי בהתפלגות אורך השרשרת, ולכל עצמה, להצטברות של גליקוגן לא תקין שעלול להיות מסוכן עבור התא11. ניתוח FACE הוא שיטה נבחרת לקביעת התפלגות אורך השרשרת של הגליקוגן (CLD). כפי שמתואר באיור 2, קביעת CLD מאפשרת להסיק את הערך הממוצע של אורך השרשרת של גליקוגן (ACL), המשקף את המבנה של חלקיקי גליקוגן. גליקוגנים של בעלי חיים עם ערכי ACL גבוהים קשורים להופעת חלקיקים לא תקינים. הניתוח המשני הוא שיטה מועילה להשוואת שתי דגימות גליקוגן מרקעים גנטיים שונים (מוטציה לעומת wildtype). על ידי התוויה בקנה מידה לוגריתמי CLDs מנורמלים לשיא המקסימלי, לעומת זאת, יש את היתרון של השוואת CLD ללא תלות בהתייחסות ונתנו לנו מידע על מנגנון הגליקוגן הגדל.
בנוסף, ניתוח FACE הוא טכניקה רבת עוצמה לאפיון התכונות הקטליטיות של אנזימים מטבוליזם גליקוגן. לדוגמה, כל האנזימים המסתעפים של הגליקוגן מבקעים (1 → 4)-α מקשרים ומעבירים קבוצות אוליגומלטוסיל למיקום או נקודות הסתעפות של (1 → 6)-α. ניתן להבחין בין אנזימי הסתעפות בשל זיקתם לפוליסכרידים (למשל, אמילופקטין, גליקוגן) ואורך הגלוקנים המועברים למרות המנגנון הקטליטי הדומה22. לפיכך, ניתן לאפיין ולסווג מקורות שונים של אנזימים מסתעפים (אדם, צמח, חיידקים) באמצעות סדרה של ניסויי דגירה והשוואות CLD באמצעות ניתוח פנים23.
כפי שצוין בהקדמה, HPAEC-PAD היא גם שיטה חלופית לקביעת התפלגות אורך השרשרת18. שתי הטכניקות דורשות הידרוליזה מלאה של (1 → 6)-α קשרים או נקודות הסתעפות על ידי אנזימי דברנצ’ינג מסוג איזואמילאז לפני הפרדת מאגר הגלוקנים הליניאריים בהתאם למידת הפילמור שלהם (DP). עם זאת, שיטת HPAEC-PAD טומנת בחובה שני חסרונות בהשוואה לפנים: (1) תגובת הדופק האמפרומטרית פוחתת ככל ששרשראות הגלוקן גדלות, מה שאינו מספק מידע כמותי. ניתן לעקוף את בעיית ההטיה ההמונית הזו באמצעות HPAEC-ENZ-PAD הכולל כור אנזים לאחר טור בין עמודת חילופי האניונים לבין PAD24. כור אנזים העמודה עושה הידרוליזה של מלטו-אוליגוסכרידים לשאריות גלוקוז המאפשרות תגובה אמפרומטרית קבועה של דופק. (2) ה- HPAEC-PAD מאפשר הפרדת שרשראות גלוקאן עם מידה של פילמור עד 70. למרות שהרזולוציה מספיקה לקביעת ה-CLD של דגימות גליקוגן, FACE מפרידה בין שרשראות עם עקורים עד 150, המתאימות לדגימות עמילן17. חשוב לזכור שגם לניתוח HPAEC-PAD וגם לניתוח פנים יש יתרונות וחסרונות. לדוגמה, תגובת המינוי דורשת קבוצה המיאצטלית חופשית כדי להגיב עם פונקציית האמין העיקרית של ה-APTS. משמעות הדבר היא שלא ניתן להשתמש בתיוג APTS עבור שרשראות גלוקן חסרות קצוות מפחיתים (למשל, אינולין). שיטת HPAEC-PAD אינה דורשת נוכחות של קצוות מצמצמים. היבט מעניין נוסף של שיטת HPAEC-PAD הוא שניתן לטעון את עמודת חילופי האניונים בכמה מיליגרמים של גלוקנים ליניאריים, מה שמאפשר טיהור של מלטו-אוליגוסכריד עם DP ספציפי או 14C-radiolabeled malto-oligosaccharide עבור בדיקה אנזימטית 18,25. לבסוף, למרות שספקטרומטריית מסה (למשל, MALDI-TOF) היא טכניקה מהירה ורגישה לקביעת התפלגות אורך השרשרת, נראה כי טכניקה זו פחות ניתנת לשחזור. הוא מעריך יתר על המידה את כמות שרשראות הגלוקן הארוכות26. עם זאת, האחרון יכול לשמש ליישום ספציפי כגון הדמיית MALDI כדי למפות את נוכחותו של גליקוגן על פני רקמה תאית27.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי CNRS, אוניברסיטת ליל CNRS, ומענקי ANR “MathTest” (ANR-18-CE13-0027).
AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |