Summary
本プロトコールでは、フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)技術を用いて、グリコーゲンの鎖長分布(CLD)および平均鎖長(ACL)を決定しています。
Abstract
グリコーゲン粒子は、直鎖状のグルコシル単位がα-1,4-グルコシド結合により結合したものからなる分岐多糖類である。後者は、α-1,6−グルコシド結合によって互いに結合しており、分岐点と呼ばれる。炭素貯蔵のさまざまな形態(すなわち 、デンプン、βグルカン)の中で、グリコーゲンはおそらく生きている世界で見られる最も古く、最も成功した貯蔵多糖類の1つです。グルカン鎖は、必要に応じて大量のグルコースを細胞内で迅速に貯蔵または燃料供給できるように組織化されている。グリコーゲン粒子の微細構造を解決するために、過去数十年にわたって多数の相補的技術が開発されてきた。この記事では、蛍光色素支援炭水化物電気泳動 (FACE) について説明します。この方法は、グリコーゲン粒子を構成するグルカン鎖の集団を定量する。鎖長分布 (CLD) とも呼ばれるこのパラメーターは、粒子サイズと分岐の割合を反映します。また、グリコーゲン生合成の数学的モデリングにも不可欠な要件です。
Introduction
炭素およびエネルギー貯蔵として使用されるグリコーゲンは、(1→4)-グリコシル結合によって結合され、(1 α 6)-→グリコシド結合または分岐点を介して結合したグルコシル単位の直鎖からなるグルコースのホモポリマー αある。それらは、広範囲の生物の細胞質ゾル中のβ粒子およびα粒子として現れる。β粒子は、主に原核生物で観察される小さな水溶性粒子である。それらの直径は20〜40nmの範囲であり、グリコーゲン代謝酵素および立体障害によって決定される可能性が高い1,2。
動物細胞で最初に説明した、より大きなα粒子はカリフラワーのような形状で直径300nmまで表示します。この特定の組織は、いくつかのβ粒子の凝集に由来するか、または単一のβ粒子3から出芽することによって生じ得る。興味深いことに、最近の研究では、エシェリヒア・コリ4にα粒子が存在することが報告されています。しかし、動物細胞からのα粒子とは異なり、後者は抽出プロセス中に迅速に崩壊し、これは文献4のデータの欠如を説明する可能性がある。真核生物および原核生物におけるα粒子の出現は、系統学的に無関係なグリコーゲン代謝酵素5を含む。これは、そのような粒子の機能およびβ粒子5間の潜在的な架橋剤の性質に関する疑問を提起する。
グリコーゲン分子形成6、7、8、9については2つの相反する数学的モデルが提案されているが、β粒子は、大量のグルコースの迅速な放出のための高効率燃料貯蔵庫としての代謝機能に応答して進化してきたことが一般に受け入れられている。大量の証拠は、消化率や水への溶解度などのグリコーゲン特性が平均鎖長(ACL)と相関していることを示しており、分岐点の割合と粒子サイズ2、6、7、8、10、11を決定します。.ACLは、グルコース残基の総数と分岐点の数との間の比率によって定義される。典型的には、ACL値は、真核生物および原核生物におけるグルコース残基の11〜14および7〜23からそれぞれ10まで変化する。ヒトにおいて、いくつかのグリコーゲン障害疾患は、異常なグリコーゲン蓄積によるものである。例えば、アンデルセン病はグリコーゲン分岐酵素の欠損活性と関連しており、異常なグリコーゲン11の蓄積をもたらす。原核生物では、累積的な研究により、ACLがグリコーゲンの分解速度および細菌生存能力に影響を与える重要な因子であることを示唆している12,13。ACL値の低いβ粒子を合成する細菌は、よりゆっくりと分解するため、飢餓状態に耐えることが報告されています。したがって、β粒子の構造に関する知識は、ヒトグリコーゲン貯蔵疾患における異常なグリコーゲン粒子の形成および栄養欠乏環境における原核生物の生存を理解するために不可欠である。
19世紀後半にフランスの生理学者クロード・ベルナールがイヌの肝臓からグリコーゲンを初めて単離して以来、グリコーゲン粒子を詳細に特徴付けるために多くの技術が開発されました。例えば、グリコーゲン形態(α粒子またはβ粒子)15のための透過型電子顕微鏡、α-1,6結合16の割合を決定するためのプロトンNMR分析、分子量を推測するためのマルチディテクタを備えたサイズ排除クロマトグラフィー、フルオロフォアアシスト炭水化物電気泳動(FACE)17 、または鎖長分布(CLD)とACLの両方のためのパルスアンペロメトリック検出(HPAEC-PAD)による高速陰イオン交換クロマトグラフィー 決定18.
この研究は、第一級アミン機能によるヘミアセタール基の還元的アミノ化に依存する蛍光色素支援炭水化物電気泳動法に焦点を当てています。歴史的に、8-アミノ-1,3,6-ナフタレントリスルホン酸(ANTS)が最初に標識に使用されました。その後、より高感度な蛍光色素である8-アミノ-1,3,6-ピレントリスルホン酸(APTS)19に置換した。
図1:8-アミノ-1,3,6-ピレントリスルホン酸(APTS)との還元的アミノ化反応。還元的条件下での8-アミノ-1,3,6-ピレントリスルホン酸(APTS)の1級アミン機能によるヘミアセタール基の還元的アミノ化反応この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
図1に描かれているように、グルカン鎖の還元末端のヘミアセタール機能は、還元条件下でAPTSの第1級アミンと相互作用する。APTSのスルホン基は、重合度(DP)に応じてグルカン鎖の分離を可能にする負電荷を帯びる。還元性アミン反応は、再現性が高く、効率的である。DP3〜DP135については80%、マルトース(DP2)およびグルコースについてはそれぞれ88%および97%までの平均効率標識が得られ、それぞれ17,20である。APTSの1分子は各グルカン鎖の還元末端と反応するため、個々の鎖を定量し、モルベースで互いに比較することができた。
Protocol
1. 枝切り酵素によるインキュベーション
- 精製グリコーゲン 200 μL を 0.5 ~ 2 mg/mL で 200 μL の 100 mM 酢酸緩衝液 (pH 4.8) と混合します。2 μL のイソアミラーゼ (180 U/mg のタンパク質) と 1.5 μL のプルラナーゼ (30 U/mg のタンパク質) を加え ( 材料表を参照)、上下にピペッティングして穏やかに混合し、1.5 mL チューブ内で 42 °C で 16 時間インキュベートします。
注:分解またはアミラーゼ汚染は、グリコーゲン精製プロセス中に発生する可能性がある。遊離マルトオリゴ糖の存在を理解するために、サンプルは、枝切り酵素カクテルを並行して使用せずにインキュベートすることができる。標準物質(例えば、マルトヘプタオース)が分析に含まれ、溶出時間と重合度との関係を決定する。 - 95°Cで5分間インキュベートすることにより反応を停止した。
- 16,100 x g で室温で5分間遠心分離してペレット化し、不溶性物質を除去します。
- ピペットを使用して上清を除去し、新しい注釈付きチューブに移します。100 μL相当の陰イオン交換樹脂ビーズ(AG-501-X8、 材料表を参照)を加えて上清を脱塩し、攪拌する。
- 定期的にビーズを5分間攪拌する。ピペッティングでサンプルを収集し、新しい注釈付きチューブに入れます。
- フリーズドライするか、30°Cで設置した真空蒸発器( 材料表を参照)を使用してサンプルを乾燥させます。
- 乾燥したサンプルを室温または-20°Cで保存する。
注:サンプルは1ヶ月間保存することができます。
2. 還元的アミノ化
- 乾燥したサンプルを、テトラヒドロフラン中の2 μLの1 Mシアノ水素化ホウ素ナトリウム(THF)および2 μLのAPTS(48 μLの15%酢酸に再懸濁された5mgのAPTS)と混合する( 材料表を参照)。
- 暗所で42°Cで16時間インキュベートする。
警告: シアノ水素化ホウ素ナトリウムは、適合した個人用保護具および化学フードの下で取り扱われます。吸入および皮膚との接触は非常に毒性が高く、致命的であり、重度の皮膚火傷および眼の損傷を引き起こす可能性がある。シアノ水素化ホウ素ナトリウムと酢酸を混合すると毒性の高いガスが発生することがあります。水と接触すると、シアノ水素化ホウ素ナトリウムは可燃性ガスを放出し、自発的に発火する可能性がある。濃縮されたサンプルは、化学フードの下で処理され、このステップから適応した個人用保護具を使用します。
3. 顔分析
- 各サンプルに46 μLの超純水を加える。
- 1 μL の超純水に 1 μL のサンプルを加えて、100 μL のマイクロバイアルでサンプルを直接 1/50 に希釈します。FACEを設定している間(5〜10分)、サンプルを暗闇に保ちます。
- レーザー誘起蛍光(LIF)検出器を備えたキャピラリー電気泳動装置を用いて逆極性電気泳動を行います( 材料表を参照)。極性を分離のために「逆モード」に設定し、LIFを発光波長488nmに設定し、検出器を512nmに設定する。
- 射出時間を 10 秒、射出圧力を 0.5 psi に設定します。
- 超純水で1/3に希釈したN結合炭水化物分離バッファーで、長さ60.2cm、内径50μm(外径375μm)の裸の溶融シリカキャピラリーで30kVでAPTS標識グルカン分離を行います( 原料表参照)。
注: N 結合炭水化物分離バッファーは、20 回の実行ごとに交換されます。
4. データ処理
- "をエクスポートします。ASC "および ".CDF "は、それぞれ電気泳動プロファイルおよび積分データを含むファイル。
- を開きます 。ASC ファイルを作成し、タイムチャートに従って相対蛍光単位を描画する。
- を開きます 。CDF ファイルでは、最初の自動統合を続行し、次のパラメータを調整します。谷から谷への統合。最小面積。
- 不適切な統合イベントを手動で確認して修正します。
Representative Results
グリコーゲンの平均鎖長の決定
図2 は、グリコーゲンの鎖長分布と平均鎖長(ACL)を推測するために必要なワークフローを表しています。
図 2: チェーン長分布 (CLD) と平均チェーン長を決定するワークフロー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3は、市販のマルトヘキサオースおよび脱分岐ウシ肝臓グリコーゲンの電気泳動図を表示する。すべての実験で4.13〜4.67分の間に観察された蛍光シグナルは、未反応のAPTSに由来する。標識マルトヘキサオース(DP6)の溶出時間は8.49分と推定された(図3A)。ウシグリコーゲンのAPTS標識グルカンを、DP6の溶出時間に基づいて同定した(図3B)。対照試料(脱枝酵素と共にインキュベートされていないグリコーゲン)において、微量の遊離マルトオリゴ糖は検出されなかった(図3C)。
図3:標準物質およびウシ肝臓グリコーゲンの電気泳動図(A)グルカン標準物質マルトヘキサオース(DP6)の溶出時間(8.49分)を基準として使用し、分枝酵素活性(B).差し込みパネルは、最大44DPのグルカン鎖の分離を示しています。並行して、未処理のウシグリコーゲンをAPTSで標識し、サンプル(C)中の遊離マルトオリゴ糖の痕跡の可能性を検出した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
APTS標識グルカンの放出は、イソアミラーゼ活性およびプルラナーゼ活性の両方による分岐点の切断に起因すると結論付けることができる。キャピラリー電気泳動プロファイルをより適切な形式で再描画して、複数のプロファイルを含むモザイク図を作成できることに注意する必要があります。これを行うには、蛍光値を含むDATAファイルを「asc」拡張子で生成し、CSV(カンマ区切り値)形式を選択してスプレッドシートプログラムで開きます。残念ながら、エクスポートされた蛍光値は、対応する溶出時間とは関連付けられていません。したがって、FACE装置の集録周波数設定に従って手動で追加する必要があります(4Hzは0.25秒ごとに1つの値集録を意味します)。
ピークエリアは、FACEインストゥルメントのネイティブアプリケーションを使用して推測されるか、別のアプリケーションを使用するために拡張子が「cdf」のDATAファイルとしてエクスポートされました。面積の値はスプレッドシート プログラムにエクスポートされ、DP を総表面積に対する割合で表すことによって正規化されます (図 4)。
図 4: データの正規化、チェーン長の分布、および平均チェーン長の値。 蛍光ピーク領域をインポートし、スプレッドシートで正規化しました。鎖長分布は、各DPのDPの割合として示される。平均鎖長(ACL)は、各パーセンテージ鎖を対応する重合度に掛けて合計することによって計算される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
最後に、平均鎖長(ACL)は、各百分率鎖の合計を対応する重合度に掛けることによって推測される。同様の実験を、ウサギ肝グリコーゲン(図5A)、ウシ肝臓グリコーゲン(図5B)、およびカキグリコーゲン(図5C)について三連で行った。
図5:市販のグリコーゲンの鎖長分布。 ウサギ肝臓(A)、ウシ肝臓(B)、およびカキグリコーゲン(C)を、枝切り酵素(イソアミラーゼおよびプルラナーゼ)の存在下でインキュベートした。次いで、APTS標識グルカンを、FACE分析を用いてそれらの重合度(DP)に従って分離した。マルトース(DP2)、マルトヘキサオース(DP6)、マルトヘプタオース(DP7)は、それぞれウサギ肝臓、カキ、およびウシ肝臓グリコーゲンにおいて最も豊富なグルカンを表す。平均の標準誤差(SEM)は、3つの独立した実験から推測された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ウサギ肝グリコーゲンの鎖長分布は、ウシ肝臓グリコーゲン(DP7)またはカキグリコーゲン(DP6)よりも短いマルトオリゴ糖(DP2)の含有量が高いことを明らかに示しました。その結果、ウサギ肝グリコーゲンは、ウシ肝臓グリコーゲン(ACL = 11.9)およびカキグリコーゲン(ACL = 12.6)と比較して、最も低い平均鎖長(ACL = 9.8)を有する。なお、市販のグリコーゲンは、通常、グリコーゲンホスホリラーゼまたはグリコーゲン合成酵素活性をアッセイするために使用される。このことは、グリコーゲン代謝酵素活性の速度論的パラメータ(Vmax およびKm)の決定がグリコーゲンの供給源に応じて変化することを示唆している。
減法分析
減法分析は、2つのサンプルのグルカン鎖分布を比較する簡単な方法です。例えば、野生型(WT) シネコシスティス PCC6803株ならびに単一同種異性 glgA1 および glgA2 変異株によって産生されるグリコーゲンのCLDsが決定された(図6A)。
(A)シアノバクテリア株から精製されたグリコーゲンの鎖長分布:野生型(WT)シネコシスティスPCC6803および単一同種遺伝子glgA1およびglgA2変異株をFACE分析を用いて決定した。平均の標準誤差(SEM)は、3つの独立した実験から推測された。(B)減法分析は、WTの各DPの%をΔglgA1の各DPの%から減算し、WTの各DPの%をDP ΔglgA2の各DPの%に減算することによって行った。この単純な数学的操作は、変異株におけるグルカン鎖の変化(黒い線)を表示する。(c)シネコシスチスの野生型および変異体由来のグリコーゲンの平均鎖長分布を、各CLD(すべてのサンプルについてDP6)について観察される最大ピークに従って標準化した。2つの成分は、正規化されたCLDを対数スケール(Nde(DP))でプロットすることによって証明されます。各成分は、成長停止の異なるメカニズムを示す(詳細については、参考文献2を参照されたい)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
想起するために、ほとんどのシアノバクテリア株は、グリコーゲン合成酵素活性をコードする2つの遺伝子、すなわちGlgA1およびGlgA221を有する。両方の酵素は、ADPグルコースの残留グルコースを直鎖状グルカン鎖の非還元末端に転移する。図6Aに示すように、チェーン長分布プロファイルのみを見てサンプルを比較することは困難です。減法分析は、サンプル間の各DPの割合を減算することで構成されます(図6B)。WTの%DPからDPの%を引いたΔglgA1変異体の減算分析は、DP3、4、および5の過剰(負の値)およびDP10〜20の含有量の減少を明らかにする。対照的に、WTの%DPと%DPのΔglgA2変異体との間の減法分析は、逆の効果を示す。減法分析プロファイルはGlgA1とGlgA2とで異なるので、このことは、グリコーゲン生合成における各グリコーゲン合成酵素アイソフォームの特異的な機能を示唆している21。
減法分析は、サンプルと並行して実行される参照サンプルを含む実験にのみ適用されることに注意することが重要です。それ以外の場合、減法分析は参照の正規化されたCLD上にあるため、経験的になる可能性があります。2015年、マウスとヒトにおけるグリコーゲン増殖の停止メカニズムを調査したDengと共同研究者は、この問題に対処するためにグリコーゲンCLDの別のプロットと解釈を提案した。このプロットでは、最大ピーク面積を使用して各CLDを正規化します。次に、データは 2 つの成分を強調する対数スケールでプロットされます。後者は、鎖伸長停止のための2つの異なるメカニズムを示す2。より高いDP成分にフィットする線を描くことによって、絶対パラメータ(すなわち、線の傾きおよび切片)を、参照プロファイルへの正規化なしにCLD比較に使用することができる。野生型(WT)シネコシスティスPCC6803株および単一のアイソジェニックglgA1およびglgA2変異体のCLDを対数スケールでプロットし、各プロファイルについてフィッティングラインを決定した(図6C)。最初の成分はサンプル間で非常に類似しており、DP 6で最大でピークに達しました。これは、分岐酵素がそのような鎖の最大を明示的に産生することを示している。第2の成分は広い肩として現れ、これはマウスおよびヒトグリコーゲン2について既に記載されていた。第2成分の傾きは、ΔglgA1においてより高いDPで生じ、対応するフィッティングライン(赤線)の傾きは野生型プロファイルよりも低かった。したがって、GlgA1の欠如は、マウスおよびヒトグリコーゲン2に対する立体障害によって起こることが提案された生合成中の鎖伸長の停止を遅らせる。これらのデータは、残りの伸長酵素(すなわち、GlgA2)が鎖の混雑の前により長い鎖を生成することを示唆している。Δ glgA2では、フィッティングラインのより劇的な低下で反対の効果が観察され、残りのGlgA1によって生成された鎖は、立体障害の前にGlgA2単独で合成された鎖よりも全体的に短いことが裏付けられた。この解析は、両方のアイソフォームが異なる動態を有すること、および/または分岐酵素活性とのそれぞれの協同が異なることを示唆している。
Discussion
グリコーゲン粒子の物理化学的特性(例えば、サイズ、形態、溶解度)は、粒子を構成するグルカンの長さに直接関連している。生合成酵素と異化酵素との間の任意の不均衡は、鎖長分布の変化をもたらし、 それ自体、 細胞11にとって有害であり得る異常なグリコーゲンの蓄積をもたらす。FACE分析は、グリコーゲンの鎖長分布(CLD)を決定するために選択される方法です。 図2に示されているように、CLDの決定は、グリコーゲン粒子の構造を反映するグリコーゲン(ACL)の平均鎖長値の推論を可能にする。高いACL値を有する動物グリコーゲンは、異常な粒子の出現と関連している。サブトラクティブ分析は、異なる遺伝的背景(変異型と野生型)からの2つのグリコーゲンサンプルを比較するのに役立つ方法です。一方、最大ピークまで正規化されたCLDsを対数スケールでプロットすることにより、CLDを基準とは無関係に比較できるという利点があり、グリコーゲンの増殖メカニズムに関する情報が得られました。
さらに、FACE分析は、グリコーゲン代謝酵素の触媒特性を特徴付けるための強力な技術です。例えば、すべてのグリコーゲン分岐酵素は、(1→4)-α結合を切断し、オリゴマルトシル基を(1→6)-α位置または分岐点に転移する。分岐酵素は、類似の触媒機構22にもかかわらず、多糖類(例えば、アミロペクチン、グリコーゲン)および移されたグルカンの長さに対するそれらの親和性のために区別可能である。したがって、枝分かれ酵素の様々な供給源(ヒト、植物、細菌)を、一連のインキュベーション実験およびFACE分析23を用いたCLD比較を通して特徴付けおよび分類することができる。
序文で述べたように、HPAEC−PADはまた、鎖長分布18を決定するための代替方法でもある。どちらの技術も、重合度(DP)に応じて直鎖状グルカンのプールを分離する前に、イソアミラーゼ型分岐酵素による(1→6)-α結合または分岐点の完全な加水分解を必要とする。しかし、HPAEC−PAD法には、FACEと比較して2つの欠点がある:(1)グルカン鎖が増加するにつれてアンペロメトリックパルス応答が低下し、定量的情報を提供しない。この質量バイアスの問題は、陰イオン交換カラムとPAD24の間のポストカラム酵素反応器を含むHPAEC−ENZ-PADを使用して回避することができる。カラム酵素反応器は、マルトオリゴ糖をグルコース残基に加水分解し、一定のパルスアンペロメトリック応答を可能にします。(2)HPAEC−PADは、重合度が70までのグルカン鎖の分離を可能にする。グリコーゲンサンプルのCLDを決定するには分解能で十分ですが、FACEはデンプンサンプルに適した最大150のDPで鎖を分離します17。HPAEC-PADとFACE分析の両方に長所と短所があることに留意することが不可欠です。例えば、アミノ化反応は、APTSの第1級アミン機能と反応するために遊離ヘミアセタール基を必要とする。これは、APTS標識が還元末端を欠くグルカン鎖(例えば、イヌリン)には使用できないことを意味する。HPAEC−PAD法は、還元末端の存在を必要としない。HPAEC−PAD法の第2の興味深い側面は、陰イオン交換カラムに数ミリグラムの直鎖状グルカンを装填することができ、酵素アッセイのために特定のDPまたは14C放射性標識マルトオリゴ糖を有するマルトオリゴ糖の精製を可能にすることである18,25。最後に、質量分析(例えば、MALDI−TOF)は、鎖長分布を決定するための高速かつ高感度な技術であるが、この技術は再現性が低いようである。長グルカン鎖26の量を過大評価する。それにもかかわらず、後者は、細胞組織全体にわたるグリコーゲンの存在をマッピングするためのMALDI画像化などの特定の用途に使用することができる27。
Disclosures
著者は、この作品に関連する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究はCNRS、リール大学CNRS、ANR助成金「MathTest」(ANR-18-CE13-0027)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
| 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
| APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
| Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
| Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
| Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
| Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
| Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
| N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
| Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
| Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |
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