Determinazione della distribuzione della lunghezza della catena glucano del glicogeno utilizzando il metodo dell'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)

Summary

Nel presente protocollo, la tecnica di elettroforesi dei carboidrati assistiti da fluorofori (FACE) viene utilizzata per determinare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) e la lunghezza media della catena (ACL) del glicogeno.

Abstract

Le particelle di glicogeno sono polisaccaridi ramificati composti da catene lineari di unità glucosiliche legate da legami glucosidi α-1,4. Questi ultimi sono attaccati l’uno all’altro da legami α-1,6 glucosidi, indicati come punti di diramazione. Tra le diverse forme di stoccaggio del carbonio (cioè amido, β-glucano), il glicogeno è probabilmente uno dei polisaccaridi da accumulo più antichi e di maggior successo trovati in tutto il mondo vivente. Le catene di glucano sono organizzate in modo che una grande quantità di glucosio possa essere rapidamente immagazzinata o alimentata in una cella quando necessario. Numerose tecniche complementari sono state sviluppate negli ultimi decenni per risolvere la struttura fine delle particelle di glicogeno. Questo articolo descrive l’elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE). Questo metodo quantifica la popolazione di catene di glucani che compongono una particella di glicogeno. Conosciuto anche come distribuzione della lunghezza della catena (CLD), questo parametro rispecchia la dimensione delle particelle e la percentuale di ramificazione. È anche un requisito essenziale per la modellizzazione matematica della biosintesi del glicogeno.

Introduction

Il glicogeno, usato come accumulo di carbonio ed energia, è un omopolimero del glucosio costituito da catene lineari di unità glucosiliche collegate da legami (1 → 4)-α e attaccate attraverso (1 → 6)-α legami glicosidici o punti di ramificazione. Appaiono come particelle β e α nel citosol di una vasta gamma di organismi. β particelle sono minuscole particelle solubili in acqua osservate principalmente nei procarioti. Il loro diametro varia da 20-40 nm, probabilmente dettato dagli enzimi che metabolizzano il glicogeno e dall’ostacolo sterico ^1,2.

Descritte per la prima volta nelle cellule animali, le particelle α più grandi mostrano fino a 300 nm di diametro con una forma simile al cavolfiore. Questa particolare organizzazione può avere origine dall’aggregazione di più particelle β o può sorgere dal germogliamento di una singola particella β³. È interessante notare che un recente studio ha riportato la presenza di particelle di α in Escherichia coli⁴. Tuttavia, a differenza delle particelle α provenienti da cellule animali, queste ultime cadono rapidamente a pezzi durante il processo di estrazione, il che può spiegare la mancanza di dati nella letteratura⁴. La comparsa di particelle di α negli eucarioti e nei procarioti coinvolge enzimi che metabolizzano il glicogeno filogeneticamente non correlati⁵. Ciò solleva interrogativi riguardanti la funzione di tali particelle e la natura dei potenziali agenti reticolanti tra β particelle⁵.

Sebbene siano stati proposti due modelli matematici opposti per la formazione di molecole di glicogeno ^6,7,8,9, è generalmente accettato che le particelle di β si siano evolute in risposta alla loro funzione metabolica come riserva di carburante altamente efficiente per il rapido rilascio di grandi quantità di glucosio. Un ampio corpus di prove indica che le proprietà del glicogeno come la digeribilità e la solubilità in acqua sono correlate con la lunghezza media della catena (LCA), che determinerà quindi la percentuale di punti di ramificazione e la dimensione delle particelle ^{2,6,7,8,10,11} . L’ACL è definito dal rapporto tra il numero totale di residui di glucosio e il numero di punti di ramificazione. Tipicamente, i valori ACL variano da 11-14 e 7-23 residui di glucosio in eucarioti e procarioti, rispettivamente¹⁰. Nell’uomo, diverse malattie da disturbo del glicogeno sono dovute all’accumulo anormale di glicogeno. Ad esempio, la malattia di Andersen è associata all’attività carente di un enzima di ramificazione del glicogeno, con conseguente accumulo di glicogeno¹¹ anormale. Nei procarioti, studi cumulativi suggeriscono che l’ACL è un fattore critico che influisce sul tasso di degradazione del glicogeno e sulla capacità di sopravvivenza batterica^12,13. È stato riportato che i batteri che sintetizzano particelle β con un basso valore ACL si degradano più lentamente e quindi resistono più a lungo alle condizioni di fame. Pertanto, la conoscenza dell’architettura delle particelle di β è essenziale per comprendere la formazione di particelle di glicogeno anormali nelle malattie da accumulo di glicogeno umano e la sopravvivenza dei procarioti in un ambiente carente di nutrienti.

Dal primo isolamento del glicogeno dal fegato di cane da parte del fisiologo francese Claude Bernard alla fine del XIX secolo¹⁴, sono state sviluppate molte tecniche per caratterizzare in dettaglio le particelle di glicogeno. Ad esempio, microscopia elettronica a trasmissione per la morfologia del glicogeno (α o β particelle)¹⁵, spettrometria protone-NMR per determinare la percentuale di collegamenti α-1,6¹⁶, cromatografia di esclusione dimensionale con multi-rivelatori per dedurre il peso molecolare, elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)¹⁷ o cromatografia a scambio anionico ad alte prestazioni con rilevamento amperometrico pulsato (HPAEC-PAD) sia per la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) che per l’ACL determinazione¹⁸.

Questo lavoro si concentra sul metodo di elettroforesi dei carboidrati assistiti da fluorofori, che si basa sull’aminazione riduttiva del gruppo emiacetale per funzione ammiacetale primaria. Storicamente, l’acido trisolfonico 8-ammino-1,3,6-naftalene (ANTS) è stato utilizzato per la prima volta per l’etichettatura. Successivamente, è stato sostituito dal fluoroforo più sensibile, acido 8-ammino 1,3,6 pirene trisolfonico (APTS)¹⁹.

Figura 1: La reazione di aminazione riduttiva con acido 8-ammino 1,3,6 pirene trisolfonico (APTS). Reazione di aminazione riduttiva del gruppo emiacetale per funzione ammiminativa primaria dell’acido 8-ammino 1,3,6 pirene trisolfonico (APTS) in condizioni riduttive Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Come illustrato nella Figura 1, la funzione emiacetale dell’estremità riducente di una catena glucano interagisce con l’ammina primaria di APTS in condizioni riducenti. I gruppi solfonici di APTS portano cariche negative che consentono la separazione delle catene di glucano in base al loro grado di polimerizzazione (DP). La reazione riduttiva dell’ammina è altamente riproducibile ed efficiente. Un’etichettatura di efficienza media dell’80% si ottiene per DP3 a DP135 e fino all’88% e 97% per maltosio (DP2) e glucosio, rispettivamente^17,20. Poiché una molecola di APTS reagisce con l’estremità riducente di ciascuna catena glucanica, le singole catene potrebbero essere quantificate e confrontate tra loro su base molare.

Protocol

1. Incubazione con enzimi di deramificazione Miscelare 200 μL di glicogeno purificato a 0,5-2 mg/mL con 200 μL di 100 mM di tampone acetato (pH 4,8). Aggiungere 2 μL di isoamilasi (180 U/mg di proteine) e 1,5 μL di pullulanasi (30 U/mg di proteine) (vedere Tabella dei materiali), mescolare delicatamente per pipettatura su e giù e incubare a 42 °C per 16 ore in un tubo da 1,5 ml.NOTA: la degradazione o la contaminazione da amilasi potrebbero verificarsi durante il processo di purificazione del glicogeno. Per apprezzare la presenza di malto-oligosaccaridi liberi, i campioni possono essere incubati senza il cocktail enzimatico di deristrazione in parallelo. Uno standard (ad esempio, maltoeptasio) è incluso nell’analisi per determinare la relazione tra il tempo di eluizione e il grado di polimerizzazione. Interrompere le reazioni incubando a 95 °C per 5 minuti. Centrifugare a 16.100 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettizzare e rimuovere qualsiasi materiale insolubile. Rimuovere i supernatanti utilizzando una pipetta e trasferirli in nuovi tubi annotati. Dissalare i supernatanti aggiungendo l’equivalente di 100 μL di perle di resina a scambio anionico/cationico (AG-501-X8, vedi Tabella dei materiali) e agitare. Agitare regolarmente le perline per 5 minuti. Raccogliere i campioni mediante pipettaggio e inserirli in nuovi tubi annotati. Liofilizzare o utilizzare un evaporatore sottovuoto impostato (vedi Tabella dei materiali) a 30 °C per asciugare i campioni. Conservare i campioni essiccati a temperatura ambiente o a -20 °C.NOTA: I campioni possono essere conservati per 1 mese. 2. Aminazione riduttiva Mescolare i campioni essiccati con 2 μL di cianoboroidruro di sodio 1 M in tetraidrofurano (THF) e 2 μL di APTS (5 mg di APTS risospeso in 48 μL di acido acetico al 15%) (vedere Tabella dei materiali). Incubare a 42 °C per 16 ore al buio.ATTENZIONE: Il cianoboroidruro di sodio viene maneggiato con dispositivi di protezione individuale adattati e sotto un cappuccio chimico. L’inalazione e il contatto con la pelle sono altamente tossici e possono essere fatali, causando gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Gas altamente tossici possono essere generati quando si mescola cianoboroidruro di sodio con acido acetico. A contatto con l’acqua, il cianoboroidruro di sodio rilascia gas infiammabili, che possono infiammarsi spontaneamente. I campioni concentrati vengono maneggiati sotto un cappuccio chimico e utilizzando dispositivi di protezione individuale adattati a partire da questa fase. 3. Analisi DEL VISO Aggiungere 46 μL di acqua ultrapura a ciascun campione. Diluire i campioni direttamente a 1/50 in micro flaconcini da 100 μL aggiungendo 1 μL del campione a 49 μL di acqua ultrapura. Tenere i campioni al buio mentre si imposta il VISO (5-10 min). Eseguire l’elettroforesi a polarità inversa con uno strumento di elettroforesi capillare con un rivelatore a fluorescenza indotta da laser (LIF) (vedere Tabella dei materiali). Impostare la polarità su “modalità inversa” per la separazione, impostare l’LIF a 488 nm di lunghezza d’onda di emissione e il rivelatore a 512 nm. Impostare il tempo di iniezione per 10 s e la pressione di iniezione a 0,5 psi. Effettuare la separazione dei glucani marcati APTS a 30 kV in un capillare di silice fusa nuda di 60,2 cm di lunghezza con un diametro interno di 50 μm (diametro esterno 375 μm) nel tampone di separazione dei carboidrati N-linked diluito a 1/3 in acqua ultrapura (vedi Tabella dei materiali).NOTA: il buffer di separazione dei carboidrati legato all’N viene sostituito ogni 20 corse. 4. TRATTAMENTO DEI DATI Esporta il file “. ASC “e “. CDF “file contenenti rispettivamente il profilo dell’elettroferogramma e i dati di integrazione. Aprire il file . ASC e disegnare l’unità di fluorescenza relativa in base al grafico temporale. Aprire il file . CDF , procedere con una prima integrazione automatica e regolare i seguenti parametri: larghezza; integrazione da valle a valle; area minima. Controllare e correggere manualmente qualsiasi evento di integrazione improprio.

Representative Results

Determinazione della lunghezza media della catena del glicogenoLa Figura 2 rappresenta il flusso di lavoro necessario per dedurre la distribuzione della lunghezza della catena e la lunghezza media della catena (LCA) del glicogeno. Figura 2: Flusso di lavoro per determinare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) e la lunghezza media della catena. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La Figura 3 mostra gli elettroferogrammi della maltoesasio commerciale e del glicogeno epatico bovino ramificato. I segnali di fluorescenza osservati tra 4,13-4,67 minuti in tutti gli esperimenti hanno avuto origine dall’APTS non reagito. Il tempo di eluizione del maltoesaoso marcato (DP6) è stato stimato in 8,49 minuti (Figura 3A). I glucani marcati con APTS del glicogeno bovino sono stati identificati in base al tempo di eluizione di DP6 (Figura 3B). Nessuna traccia di malto-oligosaccaride libero è stata rilevata nel campione di controllo (glicogeno non incubato con enzimi di derisaggio) (Figura 3C). Figura 3: Elettroferogrammi di un glicogeno epatico standard e bovino. (A) L’eluizione temporale (8,49 min) di uno standard glucano, il maltoesaosio (DP6), è stata utilizzata come riferimento per determinare il grado di polimerizzazione (DP) dei glucani marcati con APTS rilasciati dal glicogeno epatico bovino dopo l’azione delle attività enzimatiche di detrassorbimento (B ). Il pannello inserto mostra una separazione delle catene glucaniche fino a 44 DP. Parallelamente, il glicogeno bovino non trattato è stato etichettato con APTS per rilevare possibili tracce di malto-oligosaccaridi liberi nel campione (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Si può concludere che il rilascio di glucano marcato con APTS è dovuto alla scissione dei punti di ramificazione da parte delle attività di isoamilasi e pullulanasi. Va notato che il profilo di elettroforesi capillare può essere ridisegnato in un formato più appropriato per creare una figura a mosaico contenente più profili. Per fare ciò, i file DATA contenenti valori di fluorescenza vengono generati con estensione “asc” e aperti nel programma di fogli di calcolo scegliendo il formato CSV (valore separato da virgole). Sfortunatamente, i valori di fluorescenza esportati non sono associati al corrispondente tempo di eluizione. Di conseguenza, devono essere aggiunti manualmente in base alla configurazione della frequenza di acquisizione sull’apparecchio FACE (4 Hz significa un’acquisizione di valore ogni 0,25 s). Le aree di picco sono state quindi dedotte utilizzando l’applicazione nativa dello strumento FACE o esportate come file DATA con estensione “cdf” per utilizzare un’altra applicazione. I valori dell’area vengono esportati in un programma di fogli di calcolo e normalizzati esprimendo il DP come percentuale della superficie totale (Figura 4). Figura 4: Normalizzazione dei dati, distribuzione della lunghezza della catena e valore medio della lunghezza della catena. Le aree di picco di fluorescenza sono state importate e normalizzate in un foglio di calcolo. La distribuzione della lunghezza della catena è mostrata come percentuale di DP per ogni DP. La lunghezza media della catena (ACL) viene calcolata sommando ogni catena percentuale per il corrispondente grado di polimerizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Infine, la lunghezza media della catena (ACL) viene dedotta calcolando la somma di ciascuna catena percentuale per il corrispondente grado di polimerizzazione. Esperimenti simili sono stati condotti nel tripliceto sul glicogeno epatico di coniglio (Figura 5A), sul glicogeno epatico bovino (Figura 5B) e sul glicogeno delle ostriche (Figura 5C). Figura 5: Distribuzione della lunghezza della catena del glicogeno commerciale. Il fegato di coniglio (A), il fegato bovino (B) e il glicogeno delle ostriche (C) sono stati incubati in presenza di enzimi disincrostanti (isoamilasi e pullulanasi). I glucani marcati con APTS sono stati quindi separati in base al loro grado di polimerizzazione (DP) utilizzando l’analisi FACE. Il maltosio (DP2), il maltoesasio (DP6) il maltoeptasio (DP7) rappresentano i glucani più abbondanti nel fegato di coniglio, nell’ostrica e nel glicogeno epatico bovino, rispettivamente. L’errore standard di media (SEM) è stato dedotto da tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La distribuzione a catena del glicogeno epatico di coniglio ha mostrato chiaramente un contenuto più elevato di malto-oligosaccaride corto (DP2) rispetto al glicogeno epatico bovino (DP 7) o al glicogeno ostrica (DP6). Di conseguenza, il glicogeno epatico di coniglio possiede la lunghezza media della catena più bassa (ACL = 9,8) rispetto al glicogeno epatico bovino (ACL = 11,9) e al glicogeno delle ostriche (ACL = 12,6). Va notato che questi glicogeni commerciali sono solitamente utilizzati per valutare l’attività della glicogeno fosforilasi o della glicogeno sintasi. Ciò suggerisce che la determinazione dei parametri cinetici (Vmax e Km) delle attività enzimatiche di metabolizzazione del glicogeno varierà a seconda della fonte di glicogeno. Analisi sottrattiveL’analisi sottrattiva è un metodo semplice per confrontare la distribuzione delle catene glucaniche di due campioni. Ad esempio, sono stati determinati CLD di glicogeno prodotti dal ceppo wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 e singoli ceppi isogenici glgA1 e glgA2 mutanti (Figura 6A). Figura 6: Confronto delle distribuzioni di lunghezza della catena utilizzando l’analisi sottrattiva. (A) Le distribuzioni di lunghezza della catena del glicogeno purificato da ceppi cianobatterici: Wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 e singoli ceppi isogenici glgA1 e glgA2 mutanti sono stati determinati utilizzando l’analisi FACE. L’errore standard di media (SEM) è stato dedotto da tre esperimenti indipendenti. (B) Le analisi sottrattive sono state eseguite sottraendo la % di ciascun DP di WT alla % di ciascun DP di ΔglgA1 e sottraendo la % di ciascun DP di WT alla % di ciascun DP di DP ΔglgA2. Questa semplice manipolazione matematica mostra l’alterazione delle catene glucaniche nei ceppi mutanti (linee nere). (C) Le distribuzioni medie di lunghezza della catena del glicogeno da wildtype e mutanti di Synechocystis sono state normalizzate in base al picco massimo osservato per ciascun CLD (DP6 per tutti i campioni). Due componenti sono evidenziate tracciando il CLD normalizzato su una scala logaritmica (Nde (DP)). Ogni componente indica un diverso meccanismo di arresto della crescita (per ulteriori informazioni, vedere riferimento2). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Per ricordare, la maggior parte dei ceppi di cianobatteri possiede due geni che codificano per le attività della glicogeno sintasi: GlgA1 e GlgA221. Entrambi gli enzimi trasferiscono il glucosio residuo di ADP-glucosio sulle estremità non riducenti delle catene lineari di glucano. Come illustrato nella Figura 6A, è difficile confrontare i campioni osservando solo i profili di distribuzione della lunghezza della catena. L’analisi sottrattiva consiste nel sottrarre la percentuale di ciascun DP tra i campioni (Figura 6B). L’analisi sottrattiva di %DP di WT meno % di DP ΔglgA1 mutante rivela un eccesso di DP3, 4 e 5 (valori negativi) e un contenuto ridotto di DP 10-20. Al contrario, l’analisi sottrattiva tra %DP di WT e % di DP ΔglgA2 mutante indica un effetto opposto. Poiché i profili di analisi sottrattiva sono diversi tra GlgA1 e GlgA2, ciò suggerisce una funzione specifica di ciascuna isoforma di glicogeno sintasi nella biosintesi del glicogeno21. È importante notare che l’analisi sottrattiva è applicabile solo agli esperimenti che coinvolgono un campione di riferimento eseguito in parallelo con i campioni. Altrimenti, l’analisi sottrattiva può essere empirica poiché si trova sul CLD normalizzato del riferimento. Nel 2015, Deng e collaboratori, che hanno studiato i meccanismi di arresto della crescita del glicogeno nei topi e negli esseri umani, hanno proposto un diagramma alternativo e l’interpretazione dei CLD di glicogeno per affrontare questo problema. Questo plottaggio utilizza l’area massima di picco per normalizzare ogni CLD. I dati vengono quindi tracciati su una scala logaritmica evidenziando due componenti. Questi ultimi illustrano due diversi meccanismi per l’arresto dell’allungamento della catena2. Disegnando linee che si adattano al componente DP superiore, i parametri assoluti (ad esempio, pendenze e intercettazioni delle linee) possono essere utilizzati per il confronto CLD senza normalizzazione a un profilo di riferimento. I CLD del ceppo Wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 e dei singoli mutanti isogenici glgA1 e glgA2 sono stati tracciati su una scala logaritmica e sono state determinate linee di adattamento per ciascun profilo (Figura 6C). Il primo componente era molto simile tra i campioni, con un picco massimo a DP 6. Ciò dimostra che l’enzima ramificato produce esplicitamente un massimo di tali catene. Il secondo componente è apparso come una spalla larga, che era già stata descritta per topi e glicogeni umani2. L’inclinazione del secondo componente è sorta a un DP più elevato in ΔglgA1 e la pendenza della corrispondente linea di raccordo (linea rossa) era inferiore al profilo wildtype. Pertanto, la mancanza di GlgA1 rallenta l’arresto dell’allungamento della catena durante la biosintesi che è stato proposto per effetto di un ostacolo sterico per topi e glicogenoumano 2. Questi dati suggeriscono che il rimanente enzima allungante (cioè GlgA2) produce catene più lunghe prima dell’affollamento della catena. In ΔglgA2, l’effetto opposto è stato osservato con una caduta più drammatica della linea di raccordo, confermando che le catene prodotte dal glgA1 rimanente sono complessivamente più corte di quelle sintetizzate dal solo GlgA2 prima dell’ostacolo sterico. Questa analisi suggerisce che entrambe le isoforme possiedono una cinetica distinta e/o che la loro rispettiva concertazione con l’attività enzimatica ramificata differisce.

Discussion

Le proprietà fisico-chimiche delle particelle di glicogeno (ad esempio, dimensioni, morfologia, solubilità) sono direttamente associate alla lunghezza dei glucani che compongono le particelle. Qualsiasi squilibrio tra enzimi biosintetici e catabolici provoca l’alterazione della distribuzione della lunghezza della catena e, di per sé, l’accumulo di glicogeno anormale che può essere pericoloso per la cellula¹¹. L’analisi FACE è un metodo di scelta per determinare la distribuzione della lunghezza della catena del glicogeno (CLD). Come illustrato nella Figura 2, la determinazione del CLD consente l’inferenza del valore medio di lunghezza della catena del glicogeno (LCA), che rispecchia la struttura delle particelle di glicogeno. I glicogeni animali con alti valori di LCA sono associati alla comparsa di particelle anormali. L’analisi sottrattiva è un metodo utile per confrontare due campioni di glicogeno provenienti da diversi background genetici (mutante contro wildtype). Tracciando su scala logaritmica i CLD normalizzati al picco massimo, d’altra parte, hanno il vantaggio di confrontare CLD indipendentemente da un riferimento e ci hanno dato informazioni sul meccanismo del glicogeno in crescita.

Inoltre, l’analisi FACE è una potente tecnica per caratterizzare le proprietà catalitiche degli enzimi che metabolizzano il glicogeno. Ad esempio, tutti gli enzimi ramificati del glicogeno scisdono (1 → 4)-α legami e trasferiscono gruppi oligomaltosilici su una posizione (1 → 6)-α o punti di ramificazione. Gli enzimi ramificati sono distinguibili per la loro affinità con i polisaccaridi (ad esempio, amilopectina, glicogeno) e la lunghezza dei glucani trasferiti nonostante il meccanismo catalitico simile²². Pertanto, varie fonti di enzimi ramificati (umani, vegetali, batteri) possono essere caratterizzate e classificate attraverso una serie di esperimenti di incubazione e confronti CLD utilizzando l’analisi FACE²³.

Come accennato nell’introduzione, HPAEC-PAD è anche un metodo alternativo per determinare la distribuzione della lunghezza della catena¹⁸. Entrambe le tecniche richiedono l’idrolisi completa di (1 → 6)-α collegamenti o punti di ramificazione da parte di enzimi di debranching di tipo isoamilasi prima di separare il pool di glucani lineari in base al loro grado di polimerizzazione (DP). Tuttavia, il metodo HPAEC-PAD presenta due svantaggi rispetto a FACE: (1) la risposta amperometrica all’impulso diminuisce all’aumentare delle catene glucano, il che non fornisce informazioni quantitative. Questo problema di polarizzazione di massa può essere aggirato utilizzando HPAEC-ENZ-PAD che coinvolge un reattore enzimatico post-colonna tra la colonna di scambio anionico e PAD²⁴. Il reattore enzimatico a colonna idrolizza i malto-oligosaccaridi in residui di glucosio consentendo una risposta amperometrica a impulsi costanti. (2) L’HPAEC-PAD consente la separazione di catene di glucano con un grado di polimerizzazione fino a 70. Sebbene la risoluzione sia sufficiente per determinare il CLD dei campioni di glicogeno, FACE separa le catene con DP fino a 150, adatto per campioni di amido¹⁷. È essenziale tenere presente che sia l’analisi HPAEC-PAD che FACE hanno pro e contro. Ad esempio, la reazione di aminazione richiede un gruppo emiacetale libero per reagire con la funzione amminica primaria dell’APTS. Ciò implica che l’etichettatura APTS non può essere utilizzata per catene di glucani prive di estremità riducenti (ad esempio, inulina). Il metodo HPAEC-PAD non richiede la presenza di estremità riducenti. Un secondo aspetto interessante del metodo HPAEC-PAD è che la colonna a scambio anionico può essere caricata con pochi milligrammi di glucani lineari, consentendo la purificazione del malto-oligosaccaride con uno specifico DP o ¹⁴C-radiomarcato malto-oligosaccaride per il saggio enzimatico ^18,25. Infine, sebbene la spettrometria di massa (ad esempio, MALDI-TOF) sia una tecnica veloce e sensibile per determinare la distribuzione della lunghezza della catena, questa tecnica sembra essere meno riproducibile. Sovrastima la quantità di lunghe catene di glucani²⁶. Tuttavia, quest’ultimo può essere utilizzato per un’applicazione specifica come l’imaging MALDI per mappare la presenza di glicogeno attraverso il tessuto cellulare²⁷.

Materials

AG-501-X8 Resin	BioRad	#1436424	Storage Room temperature
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8			Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature.
APTS stock solution	Merck	09341-5MG	Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C.
Capillary	Sciex Separations, Les Ulis, France
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623	Thermofisher		select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf  file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min.
Excel	Microsoft		Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or  Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph.
Free-Dry apparatus	Christ	alpha 2-4 LO plus	before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h.
Isoamylase	Megazyme	E-ISAMY	180 U/mg of protein
Maltoheptaose	Merck	M7753
N-Linked carbohydrate separation buffer	Sciex Separations, Les Ulis, France	477623	Storage at 4 °C
Pullulanase	Megazyme	E-PULKP	30 U/mg of protein
Sodium cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	296813-100ML	1 M Sodium cyanoborohydride in THF
Vaccum-evaporator	Eppendorf	Concentrator 5301	Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried