Summary
该协议为软材料纳米压痕实验(包括水凝胶和细胞)提供了完整的工作流程。首先,详细介绍了获取力谱数据的实验步骤;然后,通过新开发的开源Python软件详细分析这些数据,该软件可以从GitHub免费下载。
Abstract
纳米压痕是指一类实验技术,其中使用微米力探针来量化软生物材料和细胞的局部机械性能。这种方法在机械生物学,生物材料设计和组织工程领域获得了核心作用,以获得与单细胞(μm)大小相当的软材料的适当机械表征。获取此类实验数据的最流行策略是使用原子力显微镜(AFM);虽然该仪器在力(低至pN)和空间(亚纳米)方面提供了前所未有的分辨率,但其可用性通常受到其复杂性的限制,这阻碍了对机械性能积分指标(例如杨氏模量(E))的常规测量。新一代纳米压痕,例如基于光纤传感技术的纳米压痕,最近因其易于集成而广受欢迎,同时允许以μm空间分辨率施加亚nN力,因此适用于探测水凝胶和细胞的局部机械性能。
在该协议中,提出了一个分步指南,详细介绍了使用市售的套圈顶部光纤传感纳米压痕仪获取水凝胶和细胞上的纳米压痕数据的实验程序。虽然某些步骤特定于本文中使用的仪器,但所提出的方案可以作为其它纳米压痕装置的指南,前提是某些步骤根据制造商的指南进行调整。此外,提出了一种新的开源Python软件,该软件配备了用于分析纳米压痕数据的用户友好图形用户界面,该软件允许筛选错误获取的曲线,数据过滤,通过不同的数值程序计算接触点, E的常规计算,以及特别适用于单细胞纳米压痕数据的更高级分析。
Introduction
力学在生物学中的基本作用现已确立1,2。从整个组织到单细胞,机械性能可以告知所研究的生物材料的病理生理状态3,4。例如,受癌症影响的乳腺组织比健康组织更硬,这一概念是流行的触诊测试5的基础。值得注意的是,最近已经表明,与SARS-CoV-2幼稚个体的血细胞相比,血细胞机械性能的变化强调了由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病(COVID-19),包括红细胞变形性降低,淋巴细胞和中性粒细胞硬度降低6。
一般来说,细胞和组织的力学本质上是相互交织的:每个组织都具有特定的机械性能,同时影响并依赖于组成细胞和细胞外基质(ECM)的机械性能5。正因为如此,研究生物学力学的策略通常涉及工程基质与生理相关的机械刺激,以阐明细胞对这些刺激的反应行为。例如,Engler及其同事的开创性工作表明,间充质干细胞谱系的承诺受基质弹性控制,正如在软性和硬性二维聚丙烯酰胺(PAAm)水凝胶上研究的那样7。
存在许多机械表征所研究生物材料的策略,在空间尺度(即局部到整体)和变形模式(例如,轴向与剪切)上有所不同,因此产生不同的信息,需要仔细解释3,8,9,10。软生物材料的力学通常用刚度来表示。然而,刚度取决于材料属性和几何形状,而弹性模量是材料的基本属性,与材料的几何形状无关11。因此,不同的弹性模量与给定样品的刚度有关,每个弹性模量包括材料在不同边界条件下(例如,自由膨胀与约束)下对特定变形模式(例如,轴向与剪切)的抵抗力11,12。纳米压痕实验允许通过E量化机械性能,当生物材料未横向限制时,与单轴变形(压痕)相关10,11,12。
在微观尺度上量化生物系统E的最常用方法是AFM13,14,15,16。AFM是一种非常强大的工具,其力分辨率低至pN级,空间分辨率低至亚纳米级。此外,AFM在与互补的光学和机械工具耦合方面提供了极大的灵活性,扩展了其从正在研究的生物材料中提取大量信息的能力13。然而,这些吸引人的功能伴随着以实验设置的复杂性为代表的进入壁垒。在用户获得可靠数据之前,AFM需要经过广泛的培训,并且将其用于生物材料的日常机械表征通常是不合理的,特别是当不需要其独特的力和空间分辨率时。
正因为如此,一类新型纳米压痕器最近因其易用性而广受欢迎,同时仍然提供具有亚nN力分辨率和μm空间分辨率的AFM可比数据,反映细胞在相关长度尺度上施加和感知的力2。特别是,基于光纤传感技术17,18的套圈顶部纳米压痕器件在活跃在机械生物学及其他领域的研究人员中越来越受欢迎;并且已经发表了大量报告使用这些装置的生物材料的机械性能的工作,包括细胞19,20,水凝胶8,21和组织22,23。尽管这些系统能够探测局部动态机械性能(即存储和损耗模量),但产生E的准静态实验仍然是最受欢迎的选择8,19,20,21。简而言之,准静态纳米压痕实验包括以恒定速度压痕样品,直至由最大位移、力或压痕深度定义的设定点,并在所谓的力-距离(F-z)曲线中记录悬臂的力和垂直位置。然后通过识别接触点(CP)将F-z曲线转换为力压痕(F-δ)曲线,并拟合适当的接触力学模型(通常是赫兹模型13)来计算E。
虽然套圈顶部纳米压痕的操作类似于AFM测量,但有一些特殊性值得考虑。在这项工作中,提供了使用市售套圈顶部纳米压痕仪从细胞和组织模拟水凝胶中稳健地获取 F-z 曲线的分步指南,以鼓励使用该装置和其他类似设备的研究小组之间的实验程序标准化。此外,还提供了有关如何最好地制备水凝胶样品和细胞以进行纳米压痕实验的建议,以及实验途径中的故障排除提示。
此外,纳米压痕结果(即E及其分布)的大部分变异性取决于用于分析数据的特定程序,这是不平凡的。为了解决这个问题,提供了使用新开发的开源软件的说明,该软件用Python编程,并配备了用户友好的图形用户界面(GUI),用于F-z曲线的批量分析。该软件允许快速数据筛选,数据过滤,通过不同的数值程序计算CP,E的常规计算,以及称为弹性光谱24的更高级分析,允许估计细胞的体积杨氏模量,肌动蛋白皮层的杨氏模量和肌动蛋白皮层的厚度。该软件可以从GitHub免费下载,并且可以通过添加适当的数据解析器轻松调整以分析来自其他系统的数据。需要强调的是,该协议可用于其它套圈顶部纳米压痕装置,以及一般的其它纳米压痕装置,前提是某些步骤根据特定仪器的指南进行调整。该协议在图1中进行了示意性总结。
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Protocol
1. 制备用于纳米压痕测量的底物/细胞
- 按照 补充方案中 给出的步骤制备用于纳米压痕实验的PAAm水凝胶/细胞。 图 2 总结了该过程。
注意:已选择PAAm水凝胶,因为它们是机械生物学领域最常用的水凝胶。然而,该方案同样适用于任何类型的水凝胶25 (参见 讨论,方法的修改)。
2. 启动设备、探头选择和探头校准
- 按照 补充协议 中给出的步骤启动设备。有关光纤套圈顶部纳米压痕操作的技术细节,请查看这些参考文献17,18。
- 如下所述选择纳米压痕探针。
注意:所有市售探头(例如本协议中使用的探头)都配备了球形尖端(图3A)。因此,选择范围缩小到两个变量:悬臂的刚度和尖端半径(图3B)。- 选择与预期样品刚度相匹配的悬臂刚度(k ,单位为N / m),以获得最佳结果15 (参见 图3C 和 讨论,协议中的关键步骤)。对于细胞,选择 k 在0.01-0.09 N / m范围内的探针。对于水凝胶,选择 k 在0.1-0.9 N/m范围内的探针,对于预期 E 在几kPa至100 kPa之间的凝胶,可获得最佳结果(参见 代表性结果)。
- 根据压痕过程所需的空间分辨率选择尖端半径(R 单位为 μm)。对于小细胞,如人胚胎肾293T(HEK293T)细胞(平均直径~10-15μm26),选择一个 R = 3μm的球体。对于水凝胶,选择一个 R = 10-250μm的球体,以探测生物材料在大接触面积上的机械性能,并避免局部异质性。
- 请参阅 图 3C 和任何其他制造商指南以选择合适的探头。
- 选择探头后,按照 补充协议 中的步骤将其安装在纳米压痕上。
3. 探头校准
注意:以下步骤特定于基于光纤传感技术的套圈顶部纳米压痕设备,并且针对软件版本3.4.1进行了详细说明。对于其他纳米压痕设备,请按照设备制造商建议的步骤操作。
- 在软件的主窗口中,单击 初始化。将出现校准菜单。输入探头详细信息(可在探头盒的侧面找到; k 以N/m为单位, R 以μm为单位,校准因子以空气为单位)在输入框中。
- 准备校准皿:一个平底的厚玻璃培养皿(参见 讨论,协议中的关键步骤)。用与样品培养皿相同的介质填充培养皿(也可以是空气)。使培养基的温度与样品的温度相匹配。
- 将校准盘放在探头下方。如果需要,将探头从纳米压痕仪的臂支架上滑出,并用一只手握住它,为放置校准皿腾出空间。将探头滑回到位。
- 执行以下两个步骤在液体中校准。如果在空气中测量,请使用提供的聚四氟乙烯基材进行校准,然后跳至步骤5。
- 使用巴斯德移液器用一滴70%乙醇预润湿探头,移液器的末端与玻璃套圈轻轻接触,使液滴滑过悬臂和球形尖端27 (参见 讨论,协议中的关键步骤)。
- 手动向下滑动纳米压痕仪的臂,直到探针完全浸没,但仍远离培养皿底部。如果需要,在校准皿中加入更多培养基。等待5分钟,使液体达到平衡条件。
- 在软件的 初始化 菜单中,单击 扫描波长。干涉仪的屏幕将显示进度条,计算机软件上的 实时信号 窗口将显示 图S1A(左)所示的模式。要检查光学扫描是否成功,请导航到干涉仪框上的 波长扫描 面板。如果成功,应该可以看到正弦波(图1A,右)。如果出现错误,请参阅 讨论 (方法的故障排除)。
- 在“ 初始化 ”菜单中,单击 “查找表面”,这将逐渐降低探头,直到达到悬臂弯曲的设定阈值。当与玻璃培养皿接触时,探头停止移动。
- 检查探头是否与表面接触。使用软件主窗口上的 y 向下箭头按钮将探头向下移动1μm。当悬臂与基板接触时,观察软件实时 窗口中 的绿色信号(悬臂偏转),以了解每一步基线的变化(图 S1B)。如果没有变化,则悬臂不接触(见下一步)。
- 将“查找曲面”选项卡下的“选项”菜单中的“阈值”从默认值 0.01 一次增加 0.01,然后重复“查找曲面”步骤直至接触。或者,以 1 μm 的小步长将探针向下接触,直到绿色基线在每个向下的步骤开始移动。
注意: 对于最软的悬臂 (k = 0.025 Nm-1),请在执行步骤 6 时先验地增加“查找表面”选项卡下“选项”菜单中的“阈值”。从阈值 0.06 或 0.07 开始,如有必要,将其增加到 0.1。这是因为环境噪音可能会导致悬臂在接触前弯曲超过阈值。对于软探头,在同一菜单中降低接近速度(μm/s)也可以改进程序。 - 在“ 初始化 ”菜单中,单击“ 校准”。
- 检查软件的实时信号窗口,确保压电陶瓷的位移和悬臂的偏转 信号 同时向上移动(图S1C)。
- 如果时间不匹配,则探头没有与玻璃完全接触。以1μm的步长向下移动探头,直到悬臂信号的基线发生变化(参见步骤7),然后重复步骤9。
- 如果在 校准 步骤中悬臂信号根本没有变化,则探头离表面很远。反复增加接触阈值(参见步骤8),直到正确找到表面,然后从头开始从波长扫描开始重复校准。
- 校准完成后,在弹出的弹出窗口中检查新旧校准因子。如果新的校准因子在正确的范围内,请单击使用新因子。如果校准失败,并且新因子为 NaN 或不在预期范围内,请参阅讨论(方法故障排除)以获取解决方案。
注意:如果在折射率为n(水为n = 1.33)的液体介质中进行校准,则新系数应比探头包装盒上提供的系数低~n倍。如果在空气中进行校准,则新旧校准因子应大致相等。 - 检查解调环是否已正确校准,如下所示。导航到干涉仪桌面上的 解调 选项卡。轻轻敲击光学工作台或纳米压痕仪以产生足够的噪音。由离散数据点组成的白色圆圈应近似覆盖红色圆圈(图S1D)。
- 如果白色圆圈不与红色圆圈重叠,或者干涉仪显示屏上出现警告,则需要重新校准解调圆圈。这可以通过两种方式完成,如下所述。
- 连续敲击纳米压痕仪的主体以产生一整圈噪声,然后按下干涉仪上的 校准 按钮。
- 进入与玻璃基板接触的物体,然后从软件主窗口的初始化菜单中按校准。不要保存校准因子。此时,再次检查并确保白色圆圈与红色圆圈重叠。
注意:如果信号不仅从解调圈中略微偏移,而且变得非常小或根本不可见,则意味着悬臂粘在光纤上。按照此问题的疑难解答建议进行操作(请参阅 讨论,方法疑难解答),然后重复步骤 13.1 或 13.2。一旦悬臂回到其水平位置(图3A),信号将恢复到解调圈。
- 如下所述,在校准后直接在玻璃基板上执行压痕来验证校准。
- 通过单击“配置实验”并添加“查找曲面”步骤和“缩进”步骤来加载或创建实验文件。对于压痕步骤,使用默认位移模式设置并将最大位移更改为校准距离(3,000 nm),以使探头靠在刚性基板上。
- 单击 运行实验 并在干涉仪窗口中检查解调圆圈。检查白色信号,并确保它在压痕过程中位于红色圆圈的顶部。
- 在 时间数据 图中的软件主窗口中检查结果,并确保压电陶瓷的位移(蓝线)等于悬臂的挠度(绿线),因为压痕从接触开始,并且预计不会发生材料变形。如果信号不并行,请参阅 讨论 (方法故障排除)。
- 通过将校准保存路径设置为适当的目录来更改校准菜单中的本地 路径 。
- 成功校准探头后,将压电陶瓷向上移动 500 μm。
4. 测量软材料的杨氏模量
- 水凝胶的纳米压痕
- 将含有样品的培养皿装载到显微镜载物台上,并手动将纳米压痕仪的探针移动到样品上方所需的 x-y 位置。
- 手动将探针滑入溶液中,注意在此阶段在探针和样品表面之间留出1-2毫米。等待5分钟,使探头在培养基中平衡。
- 聚焦光学显微镜的 z 平面,使探头清晰可见。
- 执行单个压痕以调整实验参数,如下所述。
- 在软件的主窗口中配置新实验。单击“配置实验”,这将打开一个新窗口。添加“查找曲面”步骤。如果需要,可以在软件的“选项”菜单中更改“查找表面”步骤的所有参数。
注意:查找表面将降低探针,直到找到表面,然后将探针缩回由Z以上表面(μm)定义的距离,高于样品表面。如果所选悬臂对于样品来说太硬或样品粘稠,则在步骤之后,探针可能仍与样品接触,这将导致没有基线的曲线(图4C)。要解决此问题,请增加表面上的Z值(μm)。 - 添加缩 进 步骤。选择 配置文件 选项卡,然后单击位 移控制。保留默认缩进配置文件。
- 单击主软件窗口上的 运行实验 。这将找到表面并执行单个缩进。如果单个压痕看起来与预期不符,请按照 图4 和 讨论 (方法故障排除)中所述调整实验参数。
- 在软件的主窗口中配置新实验。单击“配置实验”,这将打开一个新窗口。添加“查找曲面”步骤。如果需要,可以在软件的“选项”菜单中更改“查找表面”步骤的所有参数。
- 压痕看起来符合预期后,配置矩阵扫描,以便缩进样品的足够区域。单击“ 配置实验”,使用先前确定的实验参数添加“ 查找表面 ”步骤,并添加 “矩阵扫描 ”步骤。
- 对于扁平水凝胶,配置包含50-100个点(即x和y中的5 x 10或10 x 10)的基质扫描,间隔为10-100μm(即dx = dy = 10-100μm)。单击使用载物台位置从当前载物台位置开始矩阵扫描。确保勾选“自动查找表面”框,以使用设置的实验参数在每个压痕处查找表面。
- 为避免过采样,请将步长设置为接触半径的至少两倍(其中 δ 是压痕深度)。
- 在位移控制中设置矩阵扫描配置文件。确保配置文件不违反赫兹模型的假设(请参阅 讨论,协议中的关键步骤)。
- 将线段数保留为 5(默认值),并使用默认位移轮廓。如有必要,根据每个倾斜段的最大位移和时间更改位移剖面,这将分别影响最大压痕深度和应变率。不要超过10μm/s>应变率(参见 讨论,方法的局限性)。
- 输入接近速度值,该值确定探头在接触前向样品移动的速度。使缩回速度与接近速度相匹配(请参阅下面的注释)。
注意:对于软悬臂和嘈杂的环境,建议接近速度为 1,000-2,000 nm/s。对于较硬的悬臂和受控环境,可以增加这一点。 - 将配置的试验保存在所需的实验路径中,并在“配置试验”窗口的“常规”选项卡中选择将数据保存在“保存路径”中的目录。单击“运行实验”。
- 基质扫描完成后,将探针升高200-500μm,并将探针移动到样品的不同区域,远离第一个区域。
- 重复实验至少两次,以便在每个样品上获得足够的数据(即,每个样品至少两次矩阵扫描,每个包含50-100条曲线)。
- 细胞的纳米压痕
- 如上所述将样品加载到显微镜上。
- 对于单细胞压痕,聚焦 z 平面,使细胞和探针在 20 倍或 40 倍放大倍率下都可见,具体取决于细胞大小和扩散。
- 将探针移到要缩进的单元格上方。
- 在软件的主窗口中配置新实验。单击“ 配置实验”,这将打开一个新窗口。在置换模式下使用默认参数添加“ 查找曲面 和 缩进 ”步骤。
- 单击“ 运行实验”,这将找到表面并执行单个压痕。检查缩进是否成功。如果曲线看起来与预期不符,请调整实验参数(参见 图4 和 讨论,方法的故障排除)。
- 如果压痕成功,则向实验添加矩阵扫描。遵循水凝胶纳米压痕实验给出的步骤;配置矩阵扫描,使步长允许缩进细胞的一小部分区域;HEK293T细胞的25点间隔为0.5-5μm。
- 根据像元大小,调整矩阵扫描以确保针尖不会缩进超出像元限制,即执行不同的地图几何形状或探测更少的点。
- 单击“ 运行实验 ”并等待其完成。
- 基质扫描完成后,将探头脱离接触( z 平面50μm)。
- 将探针移动到新细胞上方并重复该过程(请参阅 讨论,协议中的关键步骤)。
- 清洁探头并关闭仪器
- 按照 补充协议 中给出的步骤清洁探针并关闭纳米压痕装置。
5. 数据分析
- 下载和安装软件
- 按照 补充协议 中给出的步骤下载并安装数据分析软件28,29.
- 筛选 F-z 曲线并生成 JSON 格式的清理数据集
- 从实验室计算机上的命令行启动 prepare.py ,如步骤 2 到 3 中所述。
- 如果使用Windows计算机,请在右键单击 NanoPrepare 文件夹的同时按住shift键,然后单击 在此处打开PowerShell窗口。键入 python prepare.py 命令,然后按 Enter 键。屏幕上将弹出一个 GUI(图 S2)。
- 如果使用MacOS计算机,请右键单击 NanoPrepare 文件夹,然后单击 “文件夹中的新终端”。键入 python3 prepare.py 命令并按 Enter 键,这将启动 GUI(图 S2)。
- 从下拉列表中选择 O11新 数据格式。如果数据未正确加载,请重新启动 GUI 并选择 O11OLD。
注意: O11NEW 格式适用于使用软件版本 3.4.1 的套圈顶部光纤传感纳米压痕设备获得的数据。这种格式也适用于以前的软件版本,至少是那些属于2019-2020年安装的纳米压痕器的版本。 - 单击 加载文件夹。选择包含要分析的数据的文件夹 - 单矩阵扫描或多矩阵扫描。顶部图表(原始曲线)将使用上传的数据集进行填充。要可视化特定曲线,请单击它。这将以绿色突出显示它,并将其显示在底部图形(当前曲线)上。
- 使用 GUI 右侧的选项卡清理数据集,如下所述。
- 使用“线段”按钮选择要分析的正确线段,即 F-z 曲线的前向线段。具体数量取决于进行实验时在纳米压痕软件中选择的片段数。
- 使用裁剪 50 nm 按钮将最左侧(如果勾选 L)、右侧(如果勾选 R)或两侧(如果同时勾选 R 和 L)的曲线裁剪 50 nm。多次单击此按钮可根据需要裁剪尽可能多的内容。使用此选项可消除 F-z 曲线起点/终点处的伪影。
- 检查 悬臂 卡舌的弹簧常数、尖端几何形状和尖端半径。检查选项卡以确保已正确读取元数据。
- 使用 “筛选 ”选项卡设置力阈值,该阈值将丢弃所有未达到给定力的曲线。丢弃的曲线将以红色突出显示。
- 使用“手动切换”按钮手动删除未正确采集的曲线。通过单击特定曲线并选择 OUT来删除任何曲线,这将以红色突出显示曲线。
- 单击 保存 JSON。为清理的数据集输入适当的名称,即单个 JSON 文件。将 JSON 文件发送到安装了 NanoAnalysis 软件的计算机。
6. 形式化的数据分析
- 通过导航到 NanoAnalysis 文件夹并启动终端,从命令行启动 nano.py 文件,如前所述。键入 python nano.py 或 python3 nano.py 命令(取决于操作系统),然后按 Enter 键。屏幕上将弹出一个 GUI(图 S3)。
- 在 GUI 的左上角,单击“ 加载试验 ”并选择 JSON 文件。这将填充文件列表和 原始曲线 图,以 F-z 曲线显示数据集。 F 轴和 z 轴都相对于 CP 坐标显示,CP 坐标在加载数据集时在后台计算(请参阅以下注释)。在 统计信息 框中,选中三个参数的值:N已激活、N 失败 和 N 已排除。
注意:激活 的N表示将在后续赫兹/弹性谱分析中分析的曲线数量,并在 原始曲线 图中显示为黑色。N失败 表示无法找到可靠 CP 并在图形中显示为蓝色的曲线数。这些曲线将在后续分析中自动丢弃。打开软件后,某些曲线可能会自动移动到失败的集合。这是因为 CP 是在使用默认阈值算法打开软件时计算的(见下文)。排除 的 N 表示手动选择要从分析中排除的曲线,并将在图形中显示为红色(见下文)。 - 检查失败曲线、排除曲线和激活曲线的数量是否合理。检查原始曲线图以可视化 曲线 。
- 要更详细地可视化特定曲线,请单击它。这将以绿色突出显示它,并将其显示在 当前曲线 图上。选择单个曲线后, R 和 k 参数(对于所有曲线必须相同)将填充到 GUI 的 “统计 ”框中。
- 使用 切换 框更改给定曲线的状态。单击要更改其状态的特定曲线,然后单击“已 激活”、“失败”或 “已排除”。“ 统计信息 ”框中的计数会自动更新。
注: 要更改“原始曲线”图形中数据集的视图,请使用“视图”框。单击“全部”以显示所有曲线(即,激活、失败和以相应的颜色排除)。单击“失败”以显示已激活和失败的曲线,然后单击“已激活”以仅显示激活的曲线。要重置已激活和已排除之间所有曲线的状态,请单击“重置”框中的“已激活”或“已排除”。 - 进一步清理数据集后,请按照下面概述的数据分析管道进行操作。
- 使用GUI(过滤框)中实现的滤波器过滤曲线中存在的任何噪声,即称为突出滤波器的自定义滤波器,Savitzky Golay30,31(SAVGOL)滤波器,以及基于计算给定窗口中数据的中位数的平滑滤波器(中值滤波器)。有关过滤器的详细信息,请参阅讨论(协议中的关键步骤)。
- 检查 “当前曲线 ”图形中的过滤曲线。过滤后的曲线显示为黑色,而未过滤的曲线版本以绿色显示。
注意:建议尽可能少地过滤数据,以保留原始信号的特征。过度过滤可能会消除数据中存在的任何差异。使用激活的突出滤光片足以对纳米压痕数据进行赫兹分析。如果数据特别嘈杂,则可以额外应用SAVGOL或中值滤波器。 - 选择算法以查找 CP。在“接触点”框中,选择已在软件中实现的一系列数值过程之一,即拟合优度 (GoF)32、方差比 (RoV)32、二阶导数 33 或阈值 33。有关算法的详细信息,请参阅讨论,协议中的关键步骤。
注意:CP是探头与材料接触的点,需要识别才能将F-z数据转换为F-δ数据(对于软材料,δ是有限的,需要计算)。所选算法将应用于数据集的所有活动曲线,算法无法稳健定位CP的曲线将被移动到失败集。 - 调整算法的参数以适合您的数据集,以便正确定位 CP,如 协议中的关键步骤讨论中所述。要查看在单个曲线上找到 CP 的位置,请单击曲线并单击“ 检查”来选择该曲线。检查出现的弹出窗口以识别 CP 所在的位置。
- 检查出现的红线(即算法在所选感兴趣区域中计算的参数)是否具有对应于CP位置的最大值或最小值(例如,对于GoF,参数为 R2)。如果需要,对所有曲线重复此过程。
注: 弹出窗口的轴为绝对坐标,以便显示 CP 的位置。相反, 原始 曲线和 电流曲线 图的轴相对于 CP 显示,即 CP 的位置为 (0,0)。 - 单击 赫兹分析。这将生成下面描述的三个图形。
- 检查数据集中的各个 F-δ 曲线以及平均赫兹拟合(红色虚线)。调整赫兹模型在“ 结果 ”框中的最大 缩进 (nm) 下的缩进(以 nm 为单位)。将其设置为最大 R 的 ~10%,赫兹模型才有效(请参阅 讨论,协议中的关键步骤)。
- 检查平均 F-δ 曲线,误差带显示一个标准偏差 (SD) 以及平均赫兹拟合(红色虚线)。可视化原始曲线图上的平均赫兹拟合以供参考,并可视化当前曲线上每条曲线的赫兹拟合。
- 检查 E 的散点图,该散点图源自将赫兹模型拟合到每条单独的曲线。
- 单击文件名、 F-z 曲线、 F-δ 曲线或散点图上的点以突出显示每个图中的曲线。如果散点图中的数据点似乎位于数据分布之外,请单击该数据点并检查其所属的曲线。通过单击“ 检查 ”按钮验证是否正确定位了 CP。如有必要,从分析中排除曲线。
- 检查计算平均值 E 及其 SD(Eγ ± σ)的结果框,并确保它们对于给定实验是合理的。
- 在“ 保存 ”框中,单击“ 赫兹”。在弹出窗口中,输入文件名和目录。完成后,单击 保存。将创建一个 .tsv 文件。在任何其他首选软件中打开 .tsv 文件,并使用这些值进行统计分析和进一步绘制。
注意:该文件包含从每条曲线获得的 E 和平均值 E 及其 SD。 此外,该文件还包含与分析关联的元数据,包括分析的曲线数、R、k 和用于赫兹模型的最大缩进。 - 此步骤是可选的。单击 平均 F-Ind 以导出平均力和平均压痕,以及力中的一个 SD。
- 有关细胞纳米压痕数据,请单击弹性光谱分析(参见代表性结果和讨论)。检查生成的两个图,即 E 作为每条曲线的压痕深度 (E(δ)) 的函数,以及误差带的平均 E(δ) 显示一个 SD(红色实线和阴影区域)由模型(黑色虚线)拟合,该模型允许估计细胞的肌动蛋白皮层的杨氏模量,细胞的体积杨氏模量, 和肌动蛋白皮层的厚度。此外,检查顶部图中的平均 E(δ) 红色。
- 确保选中插 值 框,以确保在插值信号上计算执行弹性谱分析所需的导数(参见 代表性结果)。
- 检查结果框,报告皮层的杨氏模量(E 0 ± σ),细胞的体积杨氏模量(Eb ± σ)和皮层厚度(d 0 ± σ)。
注意:平均弹性谱起初可能出现噪声,并伴有明显的正弦振荡。因此,方程(3)可能无法正确拟合。如果是这种情况,迭代增加平滑SAVGOL滤波器34 的窗口长度可以解决此问题。 - 分析完成后,单击“保存”框中的“ES”。这将导出指定目录中的 .tsv 文件,其中包含平均压痕深度和接触半径函数的平均弹性、与实验关联的元数据(见上文)以及上面解释的估计模型参数。最后,还报告了不考虑对δ及其SD的依赖性的平均弹性。
- 关闭软件并将保存的结果输入任何其他首选软件,以进一步绘制数据并执行统计分析。
- 此步骤是可选的:通过右键单击图形并选择 导出,从 GUI 导出图形。.svg导出图形,以便参数如字体、字体大小、线条样式等。可以在所选的其他软件中进行编辑。
注意:自定义 CP 算法和滤波器可以编程并添加到现有的算法和滤波器中。详见 补充说明1 。
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Representative Results
按照协议,获得一组F-z曲线。数据集很可能包含良好的曲线,以及在继续分析之前要丢弃的曲线。通常,如果曲线的形状与图4A所示的形状不同,则应丢弃曲线。图5AI显示了在NanoPrepare GUI中上传的预期E 0.8 KPa35的软PAAm水凝胶上获得的~100条曲线的数据集。大多数曲线呈现清晰、平坦的基线、过渡区域和与材料表观刚度成比例的倾斜区域13。然而,少数曲线显示出与图4A所示形状的变化,例如没有基线,错过接触或倾斜基线。这些曲线可以使用NanoPrepare(图5AII,红色曲线)和以标准JSON格式保存的干净数据集(图5AIII)轻松从数据集中删除。干净的数据集被上传到NanoAnalysis(图5BIV)中,该分析的设计使其可以批处理所有曲线。这意味着工作流的每个步骤都将应用于整个数据集。上传后,可以使用讨论中描述的一个或多个滤波器(协议中的关键步骤)对曲线进行滤波以消除随机噪声(图5BV)。然后使用软件中实现的算法之一定位CP,并在讨论中详细介绍,协议中的关键步骤(图5BVI)。一旦确定了CP,F-z数据就会转换为F-δ数据。 由于该软件主要设计为分析来自基于光纤传感的套圈顶部纳米压痕设备的数据,这些设备使用具有球形尖端的探针,因此赫兹分析基于赫兹模型,该模型近似半径为R的球体与无限扩展的线弹性均匀各向同性(LEHI)半空间之间的接触13:
其中 F 是力, δ 是压痕, E 是杨氏模量, ν 是泊松比,假设不可压缩性为 0.5。因此,通过将 F-δ 曲线与方程(1)拟合,可以估计 E (参见协议中的 讨论关键步骤-赫兹模型的假设)(图5BVII)。
除了赫兹分析外,该软件还可以进行更高级的分析,即弹性光谱,这对于细胞纳米压痕数据特别有用;并且还可以用作估计底层基材对通过赫兹模型获得的机械性能的影响的工具。下面简要总结一下该方法。完整的细节可以在原始出版物中找到24。
从 Oliver-Pharr 模型36 开始,该模型描述了任意几何形状和弹性半空间的轴对称冲头的压痕,对于球形压头的特定情况,可以推导出 E(δ)。取 ν 为 0.5, E(δ) 的形式为24:
使用公式(2)计算每条F-δ曲线的E(δ)得到一组曲线,即弹性谱(ES)。通过取数据集中所有曲线的平均值,获得平均ES(图5BVIII,红色实线)。平均 ES 是一个有用的工具,因为它提供了有关 E 如何随数据集中的δ变化的信息。在细胞纳米压痕实验的特定情况下,细胞的厚度是先验未知的,这意味着为赫兹分析选择合适的拟合范围有些武断。通过使用平均ES,基底对表观E(δ)的影响变得明显,这意味着该工具可用于选择合适的拟合范围,对应于E(δ)在衰减后开始增加的点。此外,先前已经证明,并通过计算和实验验证,简单的双层模型可以有效地估计肌动蛋白皮层的厚度(d 0),肌动蛋白皮层的杨氏模量(E 0)和细胞的体积杨氏模量(E b)24。该模型将细胞描述为双层,其最外层厚度为 d 0 且模数为 E 0,内层厚度无限大,弹性模量为 E b<E 0:
其中 R 是尖端的半径,Λ 是现象学参数,根据有限元分析模拟24 确定为 1.74。该程序已在纳米分析软件中实现,该软件允许将平均ES与公式(3)拟合,以获得E 0,Eb和d0的估计值(图5BVIII,黑色虚线)。有关完整的方法学细节,请参阅原始出版物24。
为了证明该方案的可行性,使用协议第1部分中建议的程序制备和测试已知E(通过AFM)35的PAAm水凝胶的弹性。对于每个凝胶,使用配备有R = 52 μm和k = 0.46 N / m尖端的商用套圈顶部纳米压痕仪获取样品两个不同区域的两个刚度图。每个图由在位移控制中执行的50个压痕组成,x和y的步长设置为20μm以避免过度采样。图6A显示了软PAAm水凝胶(预期E 0.8 kPa)和刚性PAAm水凝胶(预期E 8 kPa)的平均F-δ曲线以及平均赫兹模型35。通过纳米分析软件进行赫兹分析并绘制E的单个值,检索到两种水凝胶的预期E(图6B)。
此外,对HEK293T细胞进行了纳米压痕实验。通过在每个细胞上执行 x 和 y 步长设置为0.5μm的矩阵扫描,并在每个细胞上获取至少25条曲线,将六个单独的细胞缩进。这导致分析数据集包含~200条曲线。所选探针的 R = 3.5 μm和 k = 0.02 N / m。
图7A 显示了平均赫兹曲线和相应的平均赫兹模型,使用从拟合方程(1)获得的平均 E 绘制到NanoAnalysis中每条单独的曲线,压痕最大为200nm。发现 E 为915±633 Pa(平均±SD),这与文献24中报道的值一致。尽管赫兹模型被广泛使用,但它并不能完全捕捉到细胞纳米压痕实验中随着压痕深度增加而发生的力的演变(图7A)。正因为如此,ES是研究单细胞机械性能的特别合适的工具。
图7B显示了平均ES,以及公式(3)拟合到200 nm的压痕。平均ES在~200nm的压痕深度处开始增加,这表明基板对探测的表观E的贡献(图S4)。因此,选择200 nm作为赫兹模型(图7A)和双层模型(图7B)的拟合范围。将方程(3)拟合到平均ES允许提取重要信息,否则使用赫兹模型分析的简单纳米压痕实验将无法获得这些信息。具体来说,肌动蛋白皮层的模量E 0估计为5.794±0.095 kPa,肌动蛋白皮层的厚度d 0被发现为311 ± 3 nm,体积模量Eb 被发现为 0.539±0.002 kPa(平均±SD)。所有值均符合先前使用AFM对相同细胞类型24进行的实验,以及文献37,38中已报道的值。具体来说,肌动蛋白皮层预计在贴壁细胞37的300-400nm之间,并且比细胞38的大部分硬10倍。
无论双层模型如何, 图7C都给出了使用标准赫兹模型和ES方法获得的结果之间的直接比较,它揭示了具有可比均值的重叠分布。
图 1:协议概述。 该协议由以下部分组成:(A)第1部分:制备用于纳米压痕实验的样品(水凝胶或细胞)。(B) 第 2 部分:选择正确的探头并校准探头。(C)第3部分:通过获取样品上的刚度图进行纳米压痕实验。(D) 第 4 部分:分析数据,其中包括 i) 通过第一个 GUI (NanoPrepare) 清理获取的数据集,并将清理后的数据集和相关元数据保存为标准 JSON 文件;ii) 在第二个 GUI(纳米分析)中分析清理后的数据集,该 GUI 包括数据过滤、CP 识别和模型拟合,以估计样本的杨氏模量 E 。保存结果以供进一步绘图和统计分析,可以在任何选择的软件中执行。用 Biorender.com 创建。请点击此处查看此图的大图。
图 2:样品制备 。 (A)制备用于纳米压痕实验的扁平PAAm水凝胶的建议步骤。这些是:I)将水凝胶溶液倒在疏水性载玻片上,并用硅烷化盖玻片覆盖;II)等待20分钟发生聚合并从载玻片上剥离盖玻片凝胶复合材料;III)将盖玻片凝胶复合材料附着到培养皿上并加入适当的溶液(本协议范围内的纯净水)用于纳米压痕实验。相同的原理可以适用于任何其他类型的水凝胶。(B)为纳米压痕实验准备细胞的建议步骤。这些是:I)接种细胞并等待细胞粘附;II)血清饥饿细胞以在细胞周期方面同步细胞群(可选);III)在开始纳米压痕实验之前,等待细胞在所需的汇合度下处于粘附状态。用 Biorender.com 创建。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:纳米压痕探头概述和选择。 (A) 套圈顶探头示意图(左)和球尖半径为 250 μm 的套圈顶探头图片(右)。照片中标有所有组件。(B)悬臂和球形尖端的放大示意图。悬臂被视为弹性常数k的胡克弹簧(出于表示目的以一定角度显示)。尖端由其半径 R 定义。 当样品缩进时,探头从其参考位置 z 0 位移 z,这导致悬臂从其参考弯曲 d 0 弯曲 d。对样品施加 F = k (d - d 0) 的力,导致压痕 δ = (z - z 0) - (d - d 0)。(C)悬臂的刚度k应根据基材的预期弹性来选择。该图是考虑赫兹接触与1μm的压痕获得的,假设悬臂的弯曲和基板的压痕之间能量平均分配(即d = δ)。尖端半径越大,悬臂应越硬,以达到具有给定E的基材的相同压痕。请点击此处查看此图的大图。
图 4:F-z 曲线的形态特征。 (A)成功的实验导致F-z曲线的接近段具有清晰的基线(尖端接近样品但不接触);尖端首次接触样品的过渡区域;以及力随位移而增加的区域,其中尖端逐渐缩进样品。该区域的斜率与材料13的表观刚度成正比,这意味着属于刚性生物材料(例如,高度交联凝胶)的曲线将比属于较软生物材料(例如,弱交联凝胶和细胞)的曲线更陡峭。(B)尖端从未与样品接触的接近曲线。有关解决方法,请参阅讨论中的方法疑难解答。(C)尖端开始与样品接触的接近曲线。有关解决方法,请参阅讨论中的方法疑难解答。所示数据来自在预期E 0.8 kPa35的软PAAm水凝胶上进行的实验。请点击此处查看此图的大图。
图 5:使用 Python GUI 的数据分析工作流程。 (A) 在软 PAAm 水凝胶(预计 E 0.8 kPa35)上使用市售的套圈顶部纳米压痕仪获取的 F-z 曲线示例数据集上传到 NanoPrepare。不遵循图 4A 中所述形状的曲线将从数据集中排除,干净的数据集和关联的元数据将另存为标准 JSON 文件。(B)干净的数据集上传到第二个GUI(纳米分析)中,其中可以通过应用一个或多个过滤器来过滤曲线以消除噪声(请参阅讨论,协议中的关键步骤)。此外,选择CP算法以自动定位所有曲线的CP(请参阅讨论,协议中的关键步骤)。然后执行赫兹分析,为每个压痕生成 F-δ 曲线,该曲线与赫兹模型拟合以产生 E 的散点图。获得的结果可以保存以供进一步绘制。对于细胞,可以执行称为弹性光谱24的附加分析。显示的所有图形都是直接从NanoPrepare和NanoAnalysis GUI导出的。正文中给出了工作流程每个步骤的详细信息。请点击此处查看此图的大图。
图6:PAAm水凝胶的弹性。 (A)在软PAAm水凝胶(预期E 0.8 kPa 35)和刚性PAAm水凝胶(预期E 8 kPa35)上获得的一组~100条曲线的平均F-δ曲线。实线表示平均值,阴影带显示一个 SD。虚线显示使用来自NanoAnalysis软件的平均E绘制的赫兹模型,通过将赫兹模型拟合到每条曲线上获得,最大压痕为2,000 nm(~4%的R,R = 52 μm, k = 0.46 N / m)。使用具有默认参数的突出滤波器对曲线进行平滑处理,并使用RoV算法32识别CP。(B)从纳米分析中执行的分析中获得的E的单个值,绘制用于统计比较。雨云图是使用参考文献39中描述的Python模块获得的。p < 0.0001,双尾不成对t检验,α=0.05。请点击此处查看此图的大图。
图 7:HEK293T 细胞的弹性。 (A) 在六个单独的 HEK293T 细胞上获得的一组 ~200 条曲线的平均 F-δ 曲线。蓝色实线显示平均值,阴影带显示一个 SD。虚线表示使用NanoAnalysis软件计算的平均E绘制的赫兹模型,通过将赫兹模型拟合到每条曲线上获得,最大压痕为200 nm(~6%的R,R = 3.5μm,k = 0.02 N / m)。使用具有默认参数的突出滤光片和阶数为3,窗口长度为80 nm的SAVGOL滤光片34对曲线进行平滑处理,并使用阈值算法33识别CP。使用赫兹模型,将细胞视为具有杨氏模量E的均匀球体,如插图所示(为了图形目的,描绘了细胞核)。(B)在(A)中描述的相同数据集上计算的平均弹性谱。红色实线表示平均值,阴影带显示一个标准偏差。通过将双层模型拟合到平均弹性谱,可以计算出E 0、Eb和d0的估计值。对于所示数据集:E 0= 5.79 ± 0.09 kPa,Eb = 0.539 ± 0.002 kPa 和 d0 = 311 ± 3 nm(平均值± SD)。(C)赫兹模型与弹性谱方法在E分布方面的比较。对于弹性光谱,分布表示平均弹性光谱中的E值,与压痕深度无关(最大压痕为200 nm)。叠加在直方图上的连续线是基础分布的高斯核密度估计值。 E = 915 ± 633 Pa(赫兹)和 E = 890 ± 297 Pa(弹性光谱)(平均值±标准偏差)。请点击此处查看此图的大图。
图 S1:校准程序。 (A) 成功的波长扫描。波长扫描期间悬臂的偏转和压电陶瓷的位移信号(左)。波长扫描结束时干涉仪屏幕上的正弦波(右)。(B)查找表面程序。悬臂的偏转和压电陶瓷的位移信号,因为探头在与刚性基板接触后以 1 μm 的步长降低。(C) 几何系数校准。在刚性基板的压痕过程中,悬臂的偏转跟随悬臂的位移(分别为绿线和蓝线)。缩进应近似为零(红线)。如果挠度滞后于时间上的位移(绿色虚线),则探头未与刚性基板完全接触。(D) 解调信号。校准程序结束时(左)和敲击纳米压痕仪(右)时干涉仪屏幕上的解调信号。 请点击此处下载此文件。
图 S2:NanoPrepare GUI。 NanoPrepare GUI 的屏幕截图。有关每个小部件功能的详细信息,请参见主 协议 和 讨论。 请点击此处下载此文件。
图 S3:纳米分析 GUI。 纳米分析 GUI 的屏幕截图。有关每个小部件功能的详细信息,请参见主 协议 和 讨论。 请点击此处下载此文件。
补充说明1:将自定义滤波器和CP算法添加到NanoAnalysis软件中。请点击此处下载此文件。
补充议定书。请点击此处下载此文件。
图S4:平均弹性谱的深度依赖性。该图显示了平均弹性光谱
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Discussion
该协议展示了如何在水凝胶和单细胞上使用市售的套圈顶部纳米压痕仪稳健地获取力谱纳米压痕数据。此外,还提供了使用用Python编程的开源软件的说明,该软件包括用于分析纳米压痕数据的精确工作流程。
协议中的关键步骤
在遵循此协议时,以下步骤已被确定为特别重要。
样品制备
至关重要的是,在开始测量之前,在制备样品时要考虑到测量的限制。也就是说,样品必须粘附在表面上并尽可能平坦。在制备不像细胞那样自然粘附在表面上的样品(例如水凝胶)时,这一点尤其重要。首先,样品不得漂浮在溶液中,因为这会干扰测量并可能损坏探头。为此,建议对盖玻片进行化学功能化,以便水凝胶可以聚合粘附在表面上,以后可以在浸没时将其粘附到培养皿上。此外,样品的表面必须尽可能平坦,以确保探头进行相干表面检测,并避免在基质扫描期间以 x 和 y 移动时损坏探头。水凝胶溶液可以在疏水性载玻片上聚合,这使得所得的水凝胶平坦而不粘附。如果不遵循这些考虑因素,将很难获得干净的 F-z 数据。
在细胞制备的情况下,最好缩进具有相似形态的细胞,以提高数据均匀性。如果细胞在异质群体中生长,则可以在预测量中引入血清饥饿步骤,以帮助细胞周期同步,从而去除潜在的实验混杂因素40,41。对于非贴壁细胞或类器官培养物,在进行测量时,必须执行额外的步骤以确保生物样品的稳定性和粘附性。额外的步骤可能包括将细胞化学结合到培养板上或使用现已广泛使用的组织粘合剂。
纳米压痕实验
重要的是,根据样品的预期E15选择具有正确k的悬臂。这是因为如果悬臂太硬,样品会缩进,但不会发生明显的悬臂弯曲。相反,如果悬臂相对于样品太软,悬臂将以最小的压痕过度弯曲。这两种情况都会导致在后续分析中错误计算 E。
对于探头校准,探头在插入校准盘之前必须弄湿,以便在遇到校准皿的液体时尽量减少表面张力。否则可能会导致气泡被捕获或将悬臂推到光纤上。这也可能导致探头损坏。
建议使用厚玻璃培养皿进行校准。与悬臂相比,玻璃是无限坚硬的,这允许在压进玻璃的同时精确校准悬臂的 k 。此外,玻璃的重量确保了稳定的基材,与较轻的塑料培养皿相比,该基材对噪音(例如气流和声学振动)更坚固。校准对在检测器(V/t)处测量的干涉信号执行线性化程序,这意味着信号将使用单位圆(解调圆)作为线性化工具18转换为线性悬臂弯曲(μm/t)。偏转灵敏度(μm/V)在干涉仪中默认设置,用于将V转换为μm。在此过程中,还确定了校准因子,该系数源于球形尖端与发生信号读出的光纤位置之间的位置不匹配(图3A)。通过在坚硬的基板状玻璃上压痕,光纤测量的偏转与压电陶瓷移位的距离大致相同,这意味着压痕深度约为零。取它们的比率得出校准因子。重要的是正确执行仪器的校准,并且在继续采集 F-z 数据之前满足所有检查。
配置缩进配置文件时,牢记赫兹模型的假设很有用,稍后将使用该模型来分析数据。赫兹模型的推导假设样品是 LEHI 无限扩展的半空间,这会导致以下实际结果:i) 施加的应变不应超过 20%(根据经验,δ不应超过尖端 R 的 10%)和 ii) δ应小于样品厚度的 10%,并且与其他样品的尺寸相比较小13。
最大位移(或压痕深度/力,取决于操作模式)可以根据产生的 δ以及是否需要表面或体积机械性能进行调整。如果样品缩进到稍大的 δ,赫兹模型仍然可以拟合到最大 δ,这在NanoAnalysis软件中的假设范围内,以及用于估计该范围的平均ES(参见 代表性结果)。
对于细胞纳米压痕实验,对同一细胞进行多次基质扫描具有挑战性。但是,如果细胞足够大,则可以找到另一个合适的区域并在同一细胞上重复该过程,例如,用户希望检测细胞某个区域的机械性能与另一个区域之间的差异的实验。通常,每个细胞执行一个图谱,并且每个生物条件至少缩进五个细胞。建议至少重复实验三次,以便在每个样品上获得足够的数据(即,每种生物学条件重复三次)。
至关重要的是,采集的曲线应呈现平坦的基线、过渡区域和倾斜区域。由于CP位置的不确定性,以后无法分析没有基线的曲线。如果曲线偏离 图4A所示的形状,则应在继续实验之前优化接触阈值(请参阅下面的方法故障排除)。
鉴于该技术的性质,应获取足够的数据以确保统计上可靠的结果,该技术在本地探测机械性能。
数据分析
本协议中描述的软件通常用于分析纳米压痕数据,并且已用于获得发表在几个同行评审期刊上的结果(例如,水凝胶的纳米压痕8,21,细胞的纳米压痕24,42)。纳米压痕数据的分析并非易事。建议特别注意以下几部分:
筛选数据集:应在 NanoPrepare 软件中彻底筛选数据集,在将清理后的数据集另存为 JSON 文件之前,应删除所有不成功的曲线。曲线仍然可以从 NanoAnalysis 软件的分析中排除,但不能更改 JSON 文件。因此,为了确保清理和分析数据集之间的一致性,建议在NanoPrepare软件中仔细执行筛选过程。
过滤数据:当数据有干扰时,使用过滤器非常有用,建议在执行 ES 分析时使用过滤器。如下所述,使用三个主要过滤器。
突出性:该滤波器可去除傅里叶空间中的突出峰,以消除市售套圈顶部纳米压痕的典型仪器振荡。滤波器基于三个参数:突出度(a.u.):傅里叶空间中的峰值突出度;最小频率(通道):要滤波的最小频率;频段(峰值位置的百分比):滤波频率周围的宽度,占峰值位置的百分比。通过单击复选框并保留默认参数,为来自市售套圈顶部纳米压痕的数据激活此过滤器。
Savitzky Golay (SAVGOL),来自 SciPy 库34 (scipy.signal.savgol_filter) 的算法:此过滤器基于局部最小二乘多项式近似对数据进行平滑处理。如果数据特别嘈杂,请激活此过滤器。根据数据的噪声程度更改多项式和过滤器窗口长度在 GUI 中的顺序。有关详细信息,请参阅参考文献30,31。激活此过滤器以进行 ES 分析。
中值过滤器,来自 SciPy 库34 (scipy.signal.medfilt) 的算法:此过滤器通过用给定窗口中围绕该点计算的中位数替换每个点来平滑数据。根据数据的干扰程度更改 GUI 中的窗口长度。此滤波器用作 SAVGOL 滤波器的替代方法。
激活突出滤光片有助于消除商用套圈顶部纳米压痕的典型仪器噪声(低频振荡)。通常,在执行简单的赫兹分析时,不需要激活其他滤波器,例如SAVGOL34。在计算ES时,建议同时激活突出滤波器和SAVGOL滤波器34,并根据数据中存在的噪声水平使用平滑窗口。这是因为ES包含一个微分项(公式2),它对噪声非常敏感。例如,使用突出滤光片和窗口为80 nm、多项式阶数为3的SAVGOL滤光片34获得图7中的结果。但是,重要的是不要过度平滑数据,因为这可能会隐藏数据集之间存在的任何差异。
CP识别:分析中最重要的部分是CP的识别,它强烈影响 E 的绝对值及其分布32,33。在NanoAnalysis软件中已经实现了四种基于自动搜索程序的算法,这些算法可以定位CP以消除人为偏见。所有算法均已记录在文献32,33中。通常,在计算特定于算法的参数时,感兴趣区域中的每个点都作为试验 CP 进行测试。返回优化参数的点(根据算法可以是其最大值或最小值)被视为 CP32。实施这些程序是为了消除人为偏见,并对这一问题采取统计办法。由于每个算法都根据给定参数的优化来计算 CP,因此每个算法识别的 CP 将略有不同。因此,在想要比较的数据集之间保持相同的CP算法和特定参数(例如,RoV算法的窗口长度)至关重要, 因为E的 相对差异将被保留。不同的 CP 算法及其参数总结如下。
拟合优度 (GoF):一种基于将每个 (z, F ) 对的接触力学模型 (Hertz) 拟合到感兴趣区域中并选择具有最高 R2 值的拟合的方法。它在非接触和接触之间的转变很明显的地方工作得很好,这发生在刚性材料上,例如高度交联的水凝胶。该算法的计算成本很高,而且通常是最慢的。在这里,它已经实现,使得赫兹模型的最大 δ 约为 R 的10%,因为这已被证明可以产生更准确的结果32。
方差比(RoV):一种基于计算非接触区和接触区32中偏转(力)信号方差比的方法。
二阶导数:基于偏转(力)信号的二阶导数的方法33.当信号干净时,它工作得很好。如果信号太嘈杂,不建议使用此方法。
阈值:一种基于非接触区域平均偏转(力)的方法33。简而言之,从用户在接触区域附近选择的力值开始,该算法向基线迭代每个点,直到找到力值大于基线平均值的第一个点。此点被选为 CP。该算法非常强大,是推荐使用的算法。
下面给出了有关如何使用每种算法的详细信息。CP 算法涉及需要在 GUI 中更改以适应特定数据集的数字常数。具体来说,以下参数是GoF、RoV和二阶导数方法所共有的,允许选择曲线的子区域(感兴趣区域或ROI),其中将搜索CP:
安全阈值 (nN):它定义了从中搜索 CP 的最大力(以 nN 为单位(以及相应的 z 点)。这是 ROI 的右边界,其默认值为 10 nN。最大力低于此阈值的所有曲线将自动移动到失败集。将此值更改为略高于从非接触到接触的过渡的力值。
X 范围 (nm):它定义了从对应于安全阈值的 z 点开始的范围(以 nm 为单位)。这是投资回报率的左边界。默认值 1,000 nm 是一个很好的起点,但如果在曲线中发现 CP 太晚(即在倾斜区域),请增加此值。相反,如果过早发现CP(即在基线中),请降低此值。
此处汇总了特定于每种算法的参数。对于GoF,窗口拟合(nm)表示从试验CP到赫兹模型安装的窗口(以nm为单位)。上限为 R 值的 10%。对于 RoV,窗口 RoV (nm) 表示试验 CP 左侧和右侧的窗口(以 nm 为单位),在该窗口上计算偏转(力)信号的方差。对于二阶导数,窗口P(nm)表示传递给SAVGOL滤波器34 的窗口,该窗口用于计算偏转(力)信号的二阶导数。默认值是通过测试不同的算法设置的,通常不需要更改它们。
对于阈值算法,可以更改以下参数:
对齐阈值 (nN):从该点开始向基线移动 CP 的力 (F0)。最大力低于此阈值的所有曲线将自动移动到失败集。其默认值为 10 nN;但是,将此值更改为略高于从非接触到接触的过渡的力值。相应的 z 点 (z0) 被存储起来供以后在算法中使用(见下文)。
左步对齐 (nm):此参数定义要添加到 z 0 左侧的偏移(默认值 2,000 nm),这将计算由 (z 0 - 左步对齐)定义的点。该点是计算基线平均值的点(见下文)。
平均面积 (nm):此参数定义 (z0 - 左对齐步长)左右的平均面积,在此面积上将计算基线的平均值。其默认值为 100 nm,不需要更改它。
从 F0 向下迭代,CP 被视为第一个点,其值高于基线平均值定义的力。
关于ES和噪声的注意事项:平均ES起初可能出现噪声,并伴有明显的正弦振荡,因此公式(3)可能无法正确拟合。如果是这种情况,增加SAVGOL滤波器34 的平滑窗口通常可以解决这个问题。
方法的修改和故障排除
方法的故障排除
波长扫描故障排除
如果执行波长扫描后干涉仪显示屏上出现错误消息,则可能是以下问题的原因:i)环境可能被噪声污染。清除任何噪声源,包括气流、大噪音和机械振动;ii) 探头可能未正确连接。拔下并重新插入绿色光纤连接器;iii) 悬臂可能很脏。通过将探针浸入含有异丙醇的培养皿中几分钟,然后加水来清洁它;iv) 悬臂上可能存在气泡。将探针浸入含有异丙醇的培养皿中,并通过上下移液液体产生一些流动;v) 悬臂可能弯曲/粘在纤维上,这可以在显微镜下看到。用纸巾轻轻触摸悬臂以释放它。触摸悬臂时要格外小心,因为过度用力可能会折断悬臂;vi) 探头缺少悬臂,可以在显微镜下看到。唯一的解决方案是使用新的探头。再次尝试波长扫描,现在应该成功。
校准故障排除
如果校准失败并且新系数为 NaN 或不在预期范围内,则可能是以下问题的原因:i) 尖端未与基板完全接触。按照 协议中给出的步骤确保尖端与基材接触;ii) 尖端和玻璃表面之间的吸引力(卡扣行为)导致过度弯曲悬臂的校准。通过在异丙醇中搅拌5分钟,然后加水来清洁探针。用异丙醇清洁盘子;iii) 吸头/培养皿可能被污染:将探针在异丙醇中浸泡 5 分钟,然后加水,清洁探头。用异丙醇清洁盘子;iv) 悬臂可能弯曲/粘在纤维上。用纸巾轻轻触摸它来释放它。故障排除后重复波长扫描和校准。
联系人疑难解答
如果曲线偏离 图4A所示的形状,则需要在继续实验之前调整实验参数。两个最常见的问题是:
尖端从不与样品接触的接近曲线(图4B)。当接触阈值设置为过低的值时,就会发生这种情况,并且噪声会导致悬臂弯曲与给定阈值相对应的量。要解决此问题,请导航到 “选项 ”菜单,以0.01的步长缓慢增加阈值,然后执行缩进,直到曲线类似于 图4A所示的曲线。降低同一菜单中的速度也有助于解决此问题。
尖端开始与样品接触的接近曲线(图4C)。当接触阈值设置为过高的值时,就会发生这种情况,并且悬臂在第一次接触样品时不会弯曲与给定阈值相对应的量。要解决此问题,请以 0.01 的步长缓慢降低“ 选项 ”菜单中的阈值,并执行缩进,直到曲线类似于 图 4A 中所示的曲线。这个问题特别成问题,因为缺少基线会阻止CP的正确计算,最终导致E的错误计算 。
方法的修改
该方案可以扩展为定量不同类型水凝胶的 E 。该方案选择了PAAm水凝胶,因为它们是机械生物学领域最常用的水凝胶。然而,该方案同样适用于任何类型的弹性水凝胶25,包括合成的,例如聚乙二醇(PEG)43 和明胶甲基丙烯酰(GelMA)44,45;和天然的,如胶原蛋白46。此外,在合理的范围内,对要测试的样品的尺寸没有限制。例如,该协议已用于量化合成PEG水凝胶的 E ,后来使用体流变仪进行测试,要求直径为~15 mm,厚度为~2 mm8。该协议还用于表征在培养皿中聚合的PDMS膜的 E (结果未发表)。
除了使用传统的倒置相差显微镜对单个细胞进行标准压痕外,套圈顶部纳米压痕仪还与复杂的成像系统兼容,并已用于探测局部弹性亚细胞结构,例如细胞核和细胞质47。虽然步骤需要根据特定的光学系统进行调整,但该协议在执行纳米压痕实验和分析结果数据方面具有普遍适用性。
此外,该方案不限于测量细胞和水凝胶的机械性能,并且可以适于测量更复杂的系统的局部弹性特性,包括类器官48,球状体49和整个组织,例如肾脏,肝脏,脾脏和子宫23。读者被引导到参考文献23,48,49,以获取对此类样品进行纳米压痕实验的特异性。需要考虑的一个方面是位移控制在开环模式下工作,不会接收来自样品的反馈。因此,无法确保恒定的应力/应变和速度,并且与较硬的区域相比,样品的较软部分将缩进得更多更快。这适用于机械异质样品,例如组织,选择压痕控制(I 模式)或负载控制(P 模式)更合适,以确保样品的机械异质区域具有一致的应力/应变和速度。
方法的局限性
越来越多的证据表明,除了弹性之外,粘弹性在调节生理和病理相关过程中起着重要作用。这是因为细胞,ECM和组织是粘弹性的,弹性仅代表其机械行为的一个组成部分50,51,52,53。虽然套圈顶部纳米压痕器提供表征粘弹性的功能,包括应力松弛、蠕变顺应性和动态力学分析,以提取不同频率(时间)状态下的存储和损耗模量,但该协议仅关注弹性,这仍然是机械生物学和组织工程背景下研究最多的机械变量(例如,参见参考文献 3)。
对实验和数据分析产生影响的基本假设是,缩进的基材表现为 LEHI 固体。这意味着应力-应变响应是线性的,没有随时间变化的行为,并且样品在机械上是均匀的和各向同性的。基于这些假设,基板的机械性能通过杨氏模量按照特定的接触力学模型进行量化,在本例中为赫兹模型(方程1)。对于小的准静态力/变形,化学交联的水凝胶(例如本协议中使用的PAAm凝胶35 )的行为几乎与弹性固体和粘弹性效应最小且可忽略不计53一样。另一方面,细胞不是 LEHI 固体,表现出复杂的机械行为9.细胞的杨氏模量高度依赖于压痕过程的应变率(即速度),但是,没有建立明确的趋势,并且诸如尖端尺寸和最大压痕深度之类的其他变量会影响这种关系9。尽管如此,对于准静态变形,例如本协议中使用的变形(v = 5μm / s),细胞显示出明显的弹性响应,耗散效应最小9。应变率依赖性可以通过更复杂的模型捕获,同时考虑到时间因变量,读者参考这些变量54。
此外,遵循相同的基本假设,泊松比(ν)在赫兹和ES分析中均取为0.5。在样本之间比较时,这仅影响结果作为系数;然而,ν 已被证明是细胞55 的频率依赖性量,并且对于水凝胶56偏离0.5。
该协议的另一个限制在于,该软件不能通过更复杂的接触力学模型提供 E 的量化。赫兹模型是AFM实验中最常用的接触力学模型,非常有效13,15;但是,它没有考虑更复杂的事件,例如尖端和样品之间的短程或长程吸引力。更复杂的模型,如约翰逊-肯德尔-罗伯茨模型,可以捕获这些行为13,但没有在软件中实现。有关复杂程度不同的不同接触力学模型的概述,读者可参考参考文献13。
该方法相对于现有/替代方法的重要性
在微观尺度上量化生物材料和单细胞局部弹性特性的最常见方法是AFM13,14,15,16。尽管AFM是一款功能强大且用途广泛的仪器,但由于其复杂的设置,在用户可以稳健地进行实验之前,需要经过广泛的培训。套圈顶部纳米压痕器提供了一种即插即用的解决方案,同时仍然允许以μm分辨率施加nN力来探测生物材料的局部机械性能(例如,参考文献8,19,20,21)。虽然在机械生物学16和组织工程14的背景下存在用于AFM的标准化协议,但没有详细说明套圈顶部纳米压痕设备操作的协议。该协议允许没有经验的用户通过遵循旨在标准化社区内实验工作流程的指南,对水凝胶和细胞进行纳米压痕实验。此外,纳米压痕实验的数据分析并非易事,对于没有编程经验的用户来说,仍然在很大程度上无法访问。提供了使用直观软件的说明,该软件允许以轻型和标准格式清理和保存采集的数据集,只需单击几下并以可重现的方式执行标准赫兹分析和 ES 分析24。
通过遵循该协议,获得与使用AFM获得的结果相当的结果,无论是水凝胶的 E (图 6 中的结果与参考文献35中的结果相比)还是细胞的机械性能( 图7 中的结果与参考文献24中的结果相比)的一小部分复杂性。该方法具有普遍适用性,并且可以适应不同类型的纳米压痕,前提是基于特定设备修改某些步骤。
该方法在特定研究领域的重要性和潜在应用
表征细胞、水凝胶和组织的弹性特性是许多专注于机械生物学、组织工程/再生医学等的研究实验室的标准做法3.该协议可用于量化单细胞,水凝胶的弹性特性,并适用于以机械性能变化为标志的生理相关过程的组织和更复杂的生物材料。例如,为了模拟天然ECM的动力学,已经表明,可降解的3D PEG-层粘连蛋白水凝胶允许细胞重塑其周围环境,导致凝胶的 E 在9天内降低~50%,与没有细胞的相同凝胶相比21。该协议具有普遍适用性,不限于本文描述的样品和光学设置。设想该协议将促进纳米压痕仪在研究实验室中的使用,重点是研究生理学和疾病的机械性能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
GC和MAGO承认CeMi的所有成员。MSS通过EPSRC计划赠款(EP / P001114 / 1) 获得 支持。
GC:软件(对软件开发和算法的贡献),形式分析(纳米压痕数据分析),验证,调查(聚丙烯酰胺凝胶的纳米压痕实验),数据管理,写作(原始草稿,审查和编辑),可视化(图形和图形)。 MAGO:调查(凝胶和细胞样品的制备,细胞的纳米压痕实验),写作(原始草稿,审查和编辑),可视化(图形和图形)。 NA:验证、写作(审查和编辑)。 IL:软件(对软件开发和算法的贡献)、验证、编写(审查和编辑); MV:概念化,软件(原始软件和算法的设计和开发),验证,资源,写作(原始草案,审查和编辑),监督,项目管理,资金获取 MSS:资源,写作(审查和编辑),监督,项目管理,资金获取。所有作者都阅读并批准了最终手稿。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12 mm coverslips | VWR | 631-1577P | |
35 mm cell treated culture dishes | Greiner CELLSTAR | 627160 | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
Acrylsilane | Alfa Aesar | L16400 | |
Ammonium Persulfate | Merk | 7727-54-0 | |
Bisacrylamide | Merk | 110-26-9 | |
Chiaro nanoindenter | Optics 11 Life | no catologue number | |
Ethanol | general | ||
Fetal bovine serum | Gibco | 16140071 | |
High glucose DMEM | Gibco | 11995065 | |
Isopropanol | general | ||
Kimwipe | Kimberly Clark | 21905-026 | |
Microscope glass slides | VWR | 631-1550P | |
MilliQ system | Merk Millipore | ZR0Q008WW | |
OP1550 Interferometer | Optics11 Life | no catalogue number | |
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um) | Optics 11 Life | no catologue number | |
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um) | Optics 11 Life | no catologue number | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
RainX rain repellent | RainX | 26012 | |
Standard petri dishes (90 mm) | Thermo Scientific | 101RTIRR | |
Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | 110-18-9 | |
Vaccum dessicator | Thermo Scientific | 531-0250 | |
Software | |||
Data acquisition software (v 3.4.1) | Optics 11 Life | ||
GitHub Desktop (Optional) | Microsoft | ||
Python 3 | Python Software Foundation | ||
Visual Studio Code (Optional) | Microsoft |
References
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