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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Flujo de trabajo experimental y de análisis de datos para nanoindentación de materia blanda

Published: January 18, 2022 doi: 10.3791/63401
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

Summary

El protocolo presenta un flujo de trabajo completo para experimentos de nanoindentación de materiales blandos, incluidos hidrogeles y células. En primer lugar, se detallan los pasos experimentales para adquirir datos de espectroscopia de fuerza; luego, el análisis de dichos datos se detalla a través de un software Python de código abierto recientemente desarrollado, que se puede descargar gratis desde GitHub.

Abstract

La nanoindentación se refiere a una clase de técnicas experimentales en las que se utiliza una sonda de fuerza micrométrica para cuantificar las propiedades mecánicas locales de biomateriales blandos y células. Este enfoque ha ganado un papel central en los campos de la mecanobiología, el diseño de biomateriales y la ingeniería de tejidos, para obtener una caracterización mecánica adecuada de materiales blandos con una resolución comparable al tamaño de células individuales (μm). La estrategia más popular para adquirir tales datos experimentales es emplear un microscopio de fuerza atómica (AFM); Si bien este instrumento ofrece una resolución sin precedentes en fuerza (hasta pN) y espacio (sub-nm), su usabilidad a menudo está limitada por su complejidad que impide mediciones rutinarias de indicadores integrales de propiedades mecánicas, como el módulo de Young (E). Una nueva generación de nanoindentadores, como los basados en la tecnología de detección de fibra óptica, ha ganado popularidad recientemente por su facilidad de integración al tiempo que permite aplicar fuerzas sub-nN con resolución espacial μm, por lo que es adecuado para sondear las propiedades mecánicas locales de hidrogeles y células.

En este protocolo, se presenta una guía paso a paso que detalla el procedimiento experimental para adquirir datos de nanoindentación en hidrogeles y células utilizando un nanopenetrador de detección de fibra óptica en la parte superior de la virola disponible comercialmente. Mientras que algunos pasos son específicos para el instrumento utilizado en este documento, el protocolo propuesto se puede tomar como guía para otros dispositivos de nanoindentación, siempre que algunos pasos se adapten de acuerdo con las pautas del fabricante. Además, se presenta un nuevo software Python de código abierto equipado con una interfaz gráfica de usuario fácil de usar para el análisis de datos de nanoindentación, que permite la detección de curvas adquiridas incorrectamente, el filtrado de datos, el cálculo del punto de contacto a través de diferentes procedimientos numéricos, el cálculo convencional de E, así como un análisis más avanzado particularmente adecuado para datos de nanoindentación de células individuales.

Introduction

El papel fundamental de la mecánica en biología está hoy establecido 1,2. Desde tejidos enteros hasta células individuales, las propiedades mecánicas pueden informar sobre el estado fisiopatológico del biomaterial investigado 3,4. Por ejemplo, el tejido mamario afectado por el cáncer es más rígido que el tejido sano, un concepto que es la base de la popular prueba de palpación5. En particular, recientemente se ha demostrado que la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) está subrayada por cambios en las propiedades mecánicas de las células sanguíneas, incluida la disminución de la deformabilidad de los eritrocitos y la disminución de la rigidez de los linfocitos y neutrófilos en comparación con las células sanguíneas de individuos sin SARS-CoV-26.

En general, la mecánica de las células y los tejidos está inherentemente entrelazada: cada tejido tiene propiedades mecánicas específicas que influyen y dependen simultáneamente de las células constituyentes y de la matriz extracelular (MEC)5. Debido a esto, las estrategias para estudiar mecánica en biología a menudo implican sustratos de ingeniería con estímulos mecánicos fisiológicamente relevantes para dilucidar el comportamiento celular en respuesta a esos estímulos. Por ejemplo, el trabajo seminal de Engler y sus colegas demostró que el compromiso del linaje de células madre mesenquimales está controlado por la elasticidad de la matriz, como se estudió en hidrogeles de poliacrilamida bidimensional blanda y rígida (PAAm)7.

Existen muchas estrategias para caracterizar mecánicamente el biomaterial bajo investigación, variando en escala espacial (es decir, local a granel) y en el modo de deformación (por ejemplo, axial vs cizallamiento), lo que produce información diferente, lo que requiere una interpretación cuidadosa 3,8,9,10. La mecánica de los biomateriales blandos se expresa comúnmente en términos de rigidez. Sin embargo, la rigidez depende tanto de las propiedades del material como de la geometría, mientras que los módulos elásticos son propiedades fundamentales de un material y son independientes de la geometría del material11. Como tal, diferentes módulos elásticos están relacionados con la rigidez de una muestra dada, y cada módulo elástico abarca la resistencia del material a un modo específico de deformación (por ejemplo, axial vs cizallamiento) bajo diferentes condiciones de contorno (por ejemplo, expansión libre vs confinamiento)11,12. Los experimentos de nanoindentación permiten la cuantificación de propiedades mecánicas a través de la E que se asocia con deformación uniaxial (indentación) cuando el biomaterial no está confinado lateralmente10,11,12.

El método más popular para cuantificar E de sistemas biológicos a microescala es AFM13,14,15,16. AFM es una herramienta extremadamente poderosa con resolución de fuerza hasta el nivel de pN y resolución espacial hasta la escala sub-nm. Además, AFM ofrece una flexibilidad extrema en términos de acoplamiento con herramientas ópticas y mecánicas complementarias, ampliando sus capacidades para extraer una gran cantidad de información del biomaterial bajo investigación13. Esas características atractivas, sin embargo, vienen con una barrera de entrada representada por la complejidad de la configuración experimental. AFM requiere una amplia capacitación antes de que los usuarios puedan adquirir datos sólidos, y su uso para la caracterización mecánica diaria de materiales biológicos a menudo no está justificado, especialmente cuando no se requiere su fuerza única y resoluciones espaciales.

Debido a esto, una nueva clase de nanoindentadores ha ganado popularidad recientemente debido a su facilidad de uso, al tiempo que ofrece datos comparables con AFM con resolución de fuerza sub-nN y resolución espacial μm, reflejando las fuerzas ejercidas y percibidas por las células en escalas de longitud relevantes2. En particular, los dispositivos de nanoindentación de la parte superior de la virola basados en la tecnología de detección de fibra óptica17,18 han ganado popularidad entre los investigadores activos en el campo de la mecanobiología y más allá; y se han publicado una gran cantidad de trabajos que informan sobre las propiedades mecánicas de los biomateriales que utilizan estos dispositivos, incluidas las células19,20, los hidrogeles8,21 y los tejidos22,23. A pesar de las capacidades de estos sistemas para sondear las propiedades mecánicas dinámicas locales (es decir, el módulo de almacenamiento y pérdida), los experimentos cuasiestáticos que producen E siguen siendo la opción más popular 8,19,20,21. En resumen, los experimentos de nanoindentación cuasiestática consisten en sangrar la muestra con una velocidad constante hasta un punto de ajuste definido por un desplazamiento máximo, fuerza o profundidad de hendidura, y registrar tanto la fuerza como la posición vertical del voladizo en las llamadas curvas de fuerza-distancia (F-z). Las curvas F-z se convierten en curvas de fuerza-indentación (F-δ) a través de la identificación del punto de contacto (CP), y se ajustan con un modelo mecánico de contacto apropiado (generalmente el modelo de Hertz13) para calcular E.

Si bien el funcionamiento de los nanopenetradores superiores de virola se asemeja a las mediciones de AFM, hay especificidades que vale la pena considerar. En este trabajo, se proporciona una guía paso a paso para adquirir robustamente curvas F-z de células e hidrogeles que imitan tejidos utilizando un nanoindenter superior de virola disponible comercialmente, con el fin de fomentar la estandarización de procedimientos experimentales entre grupos de investigación que utilizan este y otros dispositivos similares. Además, se dan consejos sobre cómo preparar mejor las muestras y células de hidrogel para realizar experimentos de nanoindentación, junto con consejos de solución de problemas a lo largo de la vía experimental.

Además, gran parte de la variabilidad en los resultados de nanoindentación (es decir, E y su distribución) depende del procedimiento específico utilizado para analizar los datos, que no es trivial. Para abordar este problema, se proporcionan instrucciones para el uso de un software de código abierto recientemente desarrollado programado en Python y equipado con una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar para el análisis por lotes de curvas F-z . El software permite una rápida selección de datos, filtrado de datos, cálculo del CP a través de diferentes procedimientos numéricos, el cálculo convencional de E, así como un análisis más avanzado llamado espectros de elasticidad24, lo que permite estimar el módulo de Young a granel de la célula, el módulo de Young de la corteza de actina y el grosor de la corteza de actina. El software se puede descargar libremente desde GitHub y se puede adaptar fácilmente para analizar datos procedentes de otros sistemas agregando un analizador de datos apropiado. Se enfatiza que este protocolo se puede usar para otros dispositivos de nanoindentación superior de virola, y otros dispositivos de nanoindentación en general, siempre que algunos pasos se adapten de acuerdo con las pautas específicas del instrumento. El protocolo se resume esquemáticamente en la figura 1.

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Protocol

1. Preparación de sustratos/células para mediciones de nanoindentación

  1. Siga los pasos indicados en el Protocolo suplementario para la preparación de hidrogeles/células PAAm para experimentos de nanoindentación. El procedimiento se resume en la figura 2.
    NOTA: Los hidrogeles PAAm han sido elegidos ya que son los hidrogeles más comunes utilizados en el campo de la mecanobiología. Sin embargo, el protocolo es igualmente aplicable a cualquier tipo de hidrogel25 (ver Discusión, modificaciones del método).

2. Inicio del dispositivo, elección de la sonda y calibración de la sonda

  1. Siga los pasos indicados en el Protocolo suplementario para iniciar el dispositivo. Para obtener detalles técnicos sobre el funcionamiento de los nanodentadores superiores de virola de fibra óptica, consulte estas referencias17,18.
  2. Seleccione la sonda de nanoindentación como se describe a continuación.
    NOTA: Todas las sondas disponibles comercialmente, como las utilizadas en este protocolo, están equipadas con una punta esférica (Figura 3A). Por lo tanto, la elección se reduce a dos variables: rigidez del voladizo y radio de la punta (Figura 3B).
    1. Elija la rigidez de un voladizo (k en N/m) que coincida con la rigidez esperada de la muestra para obtener mejores resultados15 (consulte la Figura 3C y Discusión, pasos críticos en el protocolo). Para las celdas, seleccione una sonda con k en el rango 0.01-0.09 N/m. Para hidrogeles, seleccione una sonda con k en el rango de 0.1-0.9 N/m, que produzca resultados óptimos para geles con E esperado entre unos pocos kPa y 100 kPa (ver Resultados representativos).
    2. Elija el radio de la punta (R en μm) de acuerdo con la resolución espacial deseada del proceso de indentación. Para células pequeñas como las células de riñón embrionario humano 293T (HEK293T) (diámetro promedio de ~ 10-15 μm26) seleccione una esfera con R = 3 μm. Para hidrogeles, seleccione una esfera con R = 10-250 μm para sondear las propiedades mecánicas del biomaterial en una gran área de contacto y evitar heterogeneidades locales.
    3. Consulte la Figura 3C y las directrices adicionales del fabricante para seleccionar la sonda adecuada.
  3. Una vez seleccionada la sonda, siga los pasos del Protocolo Suplementario para montarla en el nanopenetrador.

3. Calibración de la sonda

NOTA: Los siguientes pasos son específicos de los dispositivos de nanoindentación superior de virola basados en la tecnología de detección de fibra óptica y se detallan para la versión de software 3.4.1. Para otros dispositivos de nanoindentación, siga los pasos recomendados por el fabricante del dispositivo.

  1. En la ventana principal del software, haga clic en Inicializar. Aparecerá un menú de calibración. Ingrese los detalles de la sonda (se pueden encontrar en el costado de la caja de la sonda; k en N/m, R en μm y factor de calibración en aire) en las cajas de entrada.
  2. Prepare el plato de calibración: una placa de Petri de vidrio grueso con un fondo plano (consulte Discusión, pasos críticos en el protocolo). Llene el plato con el mismo medio que el plato de muestra (esto también puede ser aire). Haga coincidir la temperatura del medio con la de la muestra.
  3. Coloque el plato de calibración debajo de la sonda. Si es necesario, deslice la sonda desde el soporte del brazo del nanoindentador y sosténgala con una mano para dejar espacio para la colocación del plato de calibración. Deslice la sonda hacia atrás en su lugar.
  4. Realice los dos pasos siguientes para la calibración en líquido. Si realiza la medición en aire, utilice el sustrato de politetrafluoroetileno suministrado para la calibración y vaya al paso 5.
    1. Prehumedezca la sonda con una gota de etanol al 70% utilizando una pipeta Pasteur con el extremo de la pipeta en contacto ligero con la virola de vidrio, para que la gota se deslice sobre el voladizo y la punta esférica27 (ver Discusión, pasos críticos en el protocolo).
    2. Deslice manualmente el brazo del nanoindentador hacia abajo hasta que la sonda esté completamente sumergida, pero aún lejos del fondo de la placa de Petri. Si es necesario, agregue más medio al plato de calibración. Espere 5 minutos para que se alcancen las condiciones de equilibrio en el líquido.
  5. En el menú Inicializar del software, haga clic en Escanear longitud de onda. La pantalla del interferómetro mostrará una barra de progreso y la ventana Live Signal en el software de la computadora mostrará el patrón que se muestra en la Figura S1A, izquierda. Para comprobar si el escaneo óptico se realizó correctamente, navegue hasta el panel Escaneo de longitud de onda en el cuadro del interferómetro. Si tiene éxito, una onda sinusoidal debe ser visible (Figura 1A, derecha). Consulte Discusión (solución de problemas del método) si aparece un error.
  6. En el menú Inicializar , haga clic en Buscar superficie, que bajará progresivamente la sonda hasta que se alcance un umbral establecido en la flexión del voladizo. La sonda deja de moverse cuando se hace contacto con la placa de Petri de vidrio.
  7. Compruebe si la sonda está en contacto con la superficie. Mueva la sonda hacia abajo 1 μm usando el botón de flecha y hacia abajo en la ventana principal del software. Observe la señal verde (desviación del voladizo) en la ventana activa del software para detectar cambios en la línea de base con cada paso, cuando el voladizo está en contacto con el sustrato (Figura S1B). Si no hay ningún cambio, el voladizo no está en contacto (consulte el paso siguiente).
  8. Aumente el valor de umbral en el menú Opciones de la ficha Buscar superficie desde su valor predeterminado de 0,01 en un paso de 0,01 a la vez y repita el paso Buscar superficie hasta que esté en contacto. Alternativamente, baje la sonda para que entre en contacto en pequeños pasos de 1 μm hasta que la línea de base verde comience a desplazarse en cada paso hacia abajo.
    NOTA: Para los voladizos más suaves (k = 0,025 Nm-1), aumente el valor de umbral en el menú Opciones en la ficha Buscar superficie a priori de realizar el paso 6. Comience desde un valor umbral de 0.06 o 0.07 y auméntelo hasta 0.1 si es necesario. Esto se debe a que el ruido ambiental probablemente hará que el voladizo se doble por encima del umbral antes del contacto. Para sondas blandas, disminuir la velocidad de aproximación (μm/s) en el mismo menú también mejora el procedimiento.
  9. En el menú Inicializar , haga clic en Calibrar.
  10. Compruebe la ventana Live Signal del software y asegúrese de que tanto el desplazamiento del piezo como las señales de deflexión del voladizo se muevan hacia arriba al mismo tiempo (Figura S1C).
    1. Si hay un desajuste en el tiempo, la sonda no está completamente en contacto con el vidrio. Desplácese hacia abajo de la sonda en pasos de 1 μm hasta que cambie la línea de base de la señal en voladizo (consulte el paso 7) y repita el paso 9.
    2. Si la señal en voladizo no cambia en absoluto durante el paso Calibrar , entonces la sonda está lejos de la superficie. Aumente el umbral de contacto de forma iterativa (consulte el paso 8) hasta que la superficie se encuentre correctamente y repita la calibración desde el principio comenzando con el escaneo de longitud de onda.
  11. Cuando se complete la calibración, compruebe los factores de calibración antiguos y nuevos en la ventana emergente que se muestra. Si el nuevo factor de calibración está en el rango correcto, haga clic en Usar nuevo factor. Si se produce un error en la calibración y el nuevo factor es NaN o no está en el intervalo esperado, consulte Discusión (solución de problemas del método) para obtener información sobre la resolución.
    NOTA: El nuevo factor debe ser ~ n veces menor que el proporcionado en la caja de la sonda si la calibración se realizó en un medio líquido con índice de refracción n (n = 1.33 para agua). Si la calibración se realizó en aire, entonces los factores de calibración nuevos y antiguos deben ser aproximadamente iguales.
  12. Compruebe si el círculo de demodulación se ha calibrado correctamente de la siguiente manera. Vaya a la pestaña Demodulación en el escritorio del interferómetro. Golpee suavemente la mesa óptica o el nanopenetrador para inducir suficiente ruido. Un círculo blanco formado por puntos de datos discretos debe cubrir aproximadamente el círculo rojo (Figura S1D).
  13. Si el círculo blanco no se superpone con el círculo rojo, o aparece una advertencia en la pantalla del interferómetro, el círculo de demodulación necesita recalibración. Esto se puede hacer de dos maneras, como se describe a continuación.
    1. Toque continuamente el cuerpo del nanoindentador para inducir un círculo completo de ruido y presione el botón Calibrar en el interferómetro.
    2. Entra en contacto con el sustrato de vidrio y pulsa Calibrar desde el menú Inicializar de la ventana principal del software. No guarde el factor de calibración. En este punto, verifique nuevamente y asegúrese de que el círculo blanco se superponga con el círculo rojo.
      NOTA: Si la señal no solo se desplaza ligeramente del círculo de demodulación, sino que se vuelve muy pequeña o no es visible en absoluto, significa que el voladizo está pegado a la fibra óptica. Siga los consejos de solución de problemas para este problema (consulte Discusión, solución de problemas del método) y repita los pasos 13.1 o 13.2. Una vez que el voladizo vuelve a su posición horizontal (Figura 3A), la señal se recuperará al círculo de demodulación.
  14. Verifique la calibración realizando una hendidura en el sustrato de vidrio directamente después de la calibración como se describe a continuación.
    1. Cargue o cree un archivo de experimento haciendo clic en Configurar experimento y agregue un paso Buscar superficie y un paso de sangría . Para el paso de sangría, utilice la configuración predeterminada del modo de desplazamiento y cambie el desplazamiento máximo a la distancia de calibración (3.000 nm) para desplazar la sonda contra el sustrato rígido.
    2. Haga clic en Ejecutar experimento y compruebe el círculo de demodulación en la ventana del interferómetro. Compruebe la señal blanca y asegúrese de que esté en la parte superior del círculo rojo durante la sangría.
    3. Verifique los resultados en la ventana principal del software en el gráfico de datos de tiempo y asegúrese de que el desplazamiento del piezo (línea azul) sea igual a la deflexión del voladizo (línea verde) ya que la hendidura comienza en contacto y no se espera ninguna deformación del material. Si las señales no son paralelas, consulte Discusión (solución de problemas del método).
  15. Cambie la ruta local en el menú de calibración estableciendo la ruta de almacenamiento de calibración en un directorio apropiado.
  16. Cuando la sonda se haya calibrado correctamente, mueva el piezo hacia arriba en 500 μm.

4. Medición del módulo de materiales blandos de Young

  1. Nanoindentación de hidrogeles
    1. Cargue la placa de Petri que contiene la(s) muestra(s) en la etapa del microscopio y mueva manualmente la sonda del nanopenetrador a la posición x-y deseada sobre la muestra.
    2. Deslice manualmente la sonda en solución, teniendo cuidado de dejar 1-2 mm entre la sonda y la superficie de la muestra en esta etapa. Espere 5 minutos para que la sonda se equilibre en el medio.
    3. Enfoque el plano z del microscopio óptico para que la sonda sea claramente visible.
    4. Realice una sola sangría para ajustar los parámetros experimentales como se describe a continuación.
      1. Configure un nuevo experimento en la ventana principal del software. Haga clic en Configurar experimento, que abrirá una nueva ventana. Agregue un paso Buscar superficie . Todos los parámetros del paso Buscar superficie se pueden cambiar en el menú Opciones del software si es necesario.
        NOTA: La superficie de búsqueda bajará la sonda hasta que se encuentre la superficie y, a continuación, retraerá la sonda a una distancia definida por Z sobre la superficie (μm), por encima de la superficie de la muestra. Si el voladizo seleccionado es demasiado rígido para la muestra o la muestra está pegajosa, después del paso es probable que la sonda siga en contacto con la muestra, lo que dará lugar a una curva sin una línea de base (Figura 4C). Para resolver este problema, aumente la Z sobre la superficie (μm).
      2. Agregue un paso de sangría . Seleccione la pestaña Perfil y haga clic en Control de desplazamiento. Deje el perfil de sangría predeterminado.
      3. Haga clic en Ejecutar experimento en la ventana principal del software. Esto encontrará la superficie y realizará una sola hendidura. Si la sangría única no tiene el aspecto esperado, ajuste los parámetros experimentales como se describe en la Figura 4 y Discusión (solución de problemas del método).
    5. Una vez que la sangría se vea como se desea, configure el escaneo de matriz para que se sangra un área suficiente de la muestra. Haga clic en Configurar experimento, agregue un paso Buscar superficie con los parámetros experimentales previamente determinados y agregue un paso de escaneo de matriz .
    6. Para hidrogeles planos, configure una exploración matricial que contenga 50-100 puntos (es decir, 5 x 10 o 10 x 10 en x e y) espaciados a 10-100 μm (es decir, dx = dy = 10-100 μm). Haga clic en Usar posición de etapa para iniciar el escaneo de matriz desde la posición de etapa actual. Asegúrese de que la casilla Buscar superficie automática esté marcada para buscar la superficie en cada sangría utilizando los parámetros experimentales establecidos.
      1. Para evitar el muestreo excesivo, establezca el tamaño del paso en al menos el doble del radio de contacto (Equation 1, donde δ es la profundidad de sangría).
      2. Configure el perfil de escaneo de matriz en el control de desplazamiento. Asegúrese de que el perfil no viola los supuestos del modelo de Hertz (consulte Discusión, pasos críticos en el protocolo).
      3. Deje el número de segmentos en 5, que es el valor predeterminado, y utilice el perfil de desplazamiento predeterminado. Si es necesario, cambie el perfil de desplazamiento en términos de desplazamiento máximo y tiempo para cada segmento inclinado, lo que afectará la profundidad máxima de hendidura y la velocidad de deformación, respectivamente. No exceda las tasas de deformación > 10 μm/s (ver Discusión, limitaciones del método).
      4. Introduzca un valor para la velocidad de aproximación, que determina la rapidez con la que se desplaza la sonda hacia la muestra antes del contacto. Haga coincidir la velocidad de retracción con la velocidad de aproximación (consulte la nota a continuación).
        NOTA: Para voladizos blandos y entornos ruidosos, se recomienda una velocidad de aproximación de 1.000-2.000 nm/s. Para voladizos más rígidos y entornos controlados, esto se puede aumentar.
      5. Guarde el experimento configurado en la ruta de experimento deseada y seleccione un directorio donde se guardarán los datos en la ruta de guardado, en la ficha General de la ventana Configurar experimento. Haga clic en Ejecutar experimento.
    7. Una vez que se complete el escaneo de la matriz, eleve la sonda en 200-500 μm y mueva la sonda a un área diferente de la muestra lo suficientemente lejos de la primera área.
    8. Repita el experimento al menos dos veces para que se adquieran suficientes datos sobre cada muestra (es decir, al menos dos escaneos matriciales por muestra, que contengan 50-100 curvas cada uno).
  2. Nanoindentación de células
    1. Cargue la muestra en el microscopio como se describió anteriormente.
    2. Para la hendidura de una sola celda, enfoque el plano z de modo que tanto las celdas como la sonda sean visibles con un aumento de 20x o 40x, dependiendo del tamaño y la propagación de la celda.
    3. Mueva la sonda por encima de la celda que se va a sangrar.
    4. Configure un nuevo experimento en la ventana principal del software. Haga clic en Configurar experimento, que abrirá una nueva ventana. Agregue un paso Buscar superficie y sangría con parámetros predeterminados en el modo de desplazamiento.
    5. Haga clic en Ejecutar experimento, que encontrará la superficie y realizará una sola sangría. Compruebe si la sangría se ha realizado correctamente. Si la curva no tiene el aspecto esperado, ajuste los parámetros experimentales (consulte la Figura 4 y Discusión, solución de problemas del método).
    6. Si la sangría se realizó correctamente, agregue un escaneo de matriz al experimento. Siga los pasos dados para los experimentos de nanoindentación de hidrogeles; configurar el escaneo de matriz para que el tamaño del paso permita sangrar un área pequeña de la celda; 25 puntos espaciados a 0,5-5 μm para las células HEK293T.
      1. Dependiendo del tamaño de la celda, adapte el escaneo de la matriz para asegurarse de que la punta no se incline fuera del límite de la celda, es decir, haciendo una geometría de mapa diferente o sondeando menos puntos.
    7. Haga clic en Ejecutar experimento y espere a que se complete.
    8. Una vez completado el escaneo de la matriz, levante la sonda fuera de contacto (50 μm en el plano z ).
    9. Mueva la sonda por encima de una nueva celda y repita el proceso (consulte Discusión, pasos críticos en el protocolo).
  3. Limpieza de la sonda y apagado del instrumento
    1. Siga los pasos indicados en el Protocolo suplementario para limpiar la sonda y apagar el dispositivo de nanoindentación.

5. Análisis de datos

  1. Descarga e instalación del software
    1. Siga los pasos indicados en el Protocolo Suplementario para descargar e instalar el software para el análisis de datos28,29.
  2. Proyección de curvas F-z y producción de conjuntos de datos limpios en formato JSON
    1. Inicie prepare.py desde la línea de comandos en el equipo laboratorio como se describe en los pasos 2 a 3.
    2. Si usa una computadora con Windows, mantenga presionada la tecla Mayús mientras hace clic derecho en la carpeta NanoPrepare y haga clic en Abrir ventana de PowerShell aquí. Escriba el comando python prepare.py y presione la tecla Enter . Aparecerá una GUI en su pantalla (Figura S2).
    3. Si usa una computadora MacOS, haga clic derecho en la carpeta NanoPrepare y haga clic en Nuevo terminal en la carpeta. Escriba el comando python3 prepare.py y presione la tecla Intro , que iniciará la GUI (Figura S2).
    4. Seleccione el formato de datos O11NEW en la lista desplegable. Si los datos no se cargan correctamente, vuelva a iniciar la GUI y seleccione O11OLD.
      NOTA: El formato O11NEW funciona para datos obtenidos utilizando dispositivos de nanoindentación de detección de fibra óptica superior con virola con la versión de software 3.4.1. Este formato también funcionará para versiones de software anteriores, al menos las pertenecientes a nanoindentadores instalados en 2019-2020.
    5. Haga clic en Cargar carpeta. Seleccione una carpeta que contenga los datos que se van a analizar: escaneo de matriz única o escaneos de matriz múltiple. El gráfico superior (curvas sin procesar) se rellenará con el conjunto de datos cargado. Para visualizar una curva específica, haga clic en ella. Esto lo resaltará en verde y lo mostrará en el gráfico inferior (Curva actual).
    6. Limpie el conjunto de datos utilizando las pestañas presentes en la parte derecha de la GUI como se describe a continuación.
      1. Utilice el botón Segmento para seleccionar el segmento correcto a analizar, que es el segmento hacia adelante de las curvas F-z . El número específico depende del número de segmentos seleccionados en el software de nanoindentación al realizar experimentos.
      2. Utilice el botón Recortar 50 nm para recortar las curvas en 50 nm en el extremo izquierdo (si L está marcado), derecha (si R está marcado) o ambos lados (si tanto R como L están marcados). Haga clic en este botón varias veces para recortar tanto como sea necesario. Utilice esta opción para eliminar los artefactos presentes al principio/al final de las curvas F-z.
      3. Inspeccione la pestaña Voladizo para la constante de resorte, la geometría de la punta y el radio de la punta. Inspeccione la ficha para asegurarse de que los metadatos se han leído correctamente.
      4. Utilice la ficha Filtrado para establecer un umbral de fuerza que descartará todas las curvas que no alcanzaron la fuerza dada. Las curvas descartadas se resaltarán en rojo.
      5. Utilice el botón de alternancia manual para eliminar manualmente las curvas que no se han adquirido correctamente. Elimine cualquier curva haciendo clic en la curva específica y seleccionando OUT, que resaltará la curva en rojo.
    7. Haga clic en Save JSON. Escriba un nombre adecuado para el conjunto de datos limpiado, que es un único archivo JSON. Envíe el archivo JSON a la computadora donde se instaló el software NanoAnalysis.

6. Análisis formal de datos

  1. Inicie el archivo nano.py desde la línea de comandos navegando a la carpeta NanoAnalysis e iniciando un terminal como se explicó anteriormente. Escriba el comando python nano.py o python3 nano.py (dependiendo del sistema operativo) y presione la tecla Enter . Aparecerá una GUI en su pantalla (Figura S3).
  2. En la parte superior izquierda de la GUI, haga clic en Cargar experimento y seleccione el archivo JSON. Esto rellenará la lista de archivos y el gráfico Curvas sin procesar que muestra el conjunto de datos en términos de curvas F-z . Los ejes F y z se muestran en relación con las coordenadas CP, que se calculan en segundo plano al cargar el conjunto de datos (consulte la nota siguiente). En el cuadro Estadísticas , compruebe los valores de los tres parámetros: Nactivado, N fallido y Nexcluido.
    NOTA: Nactivated representa el número de curvas que se analizarán en el análisis posterior de espectros de Hertz/elasticidad y aparecerán en negro en el gráfico de curvas sin procesar . Nfailed representa el número de curvas en las que no se pudo encontrar un CP confiable y aparecen en azul en el gráfico. Estas curvas se descartarán automáticamente en el análisis posterior. Al abrir el software, algunas curvas pueden moverse automáticamente al conjunto fallido. Esto se debe a que el CP se calcula al abrir el software con el algoritmo de umbral predeterminado (ver más abajo). N excluido representa las curvas que se seleccionan manualmente para serexcluidas del análisis y aparecerán en rojo en el gráfico (ver más abajo).
  3. Compruebe si el número de curvas fallidas, excluidas y activadas es razonable. Consulte el gráfico Curvas sin procesar para visualizar las curvas.
  4. Para visualizar una curva específica con más detalle, haga clic en ella. Esto lo resaltará en verde y lo mostrará en el gráfico Curva actual . Una vez que se ha seleccionado una sola curva, los parámetros R y k (que deben ser los mismos para todas las curvas) se rellenarán en el cuadro Estadísticas de la GUI.
  5. Cambie el estado de una curva determinada mediante el cuadro de alternancia . Haga clic en la curva específica cuyo estado desea cambiar y, a continuación, haga clic en Activado, Error o Excluido. El recuento en el cuadro Estadísticas se actualiza automáticamente.
    NOTA: Para cambiar la vista del conjunto de datos en el gráfico Curvas sin procesar, utilice el cuadro Ver . Haga clic en Todo para mostrar todas las curvas (es decir, activadas, fallidas y excluidas en los colores respectivos). Haga clic en Error para mostrar las curvas activadas y fallidas y haga clic en Activado para mostrar solo las curvas activadas. Para restablecer el estado de todas las curvas entre activadas y excluidas, haga clic en Activado o Excluido en el cuadro Restablecer .
  6. Una vez que el conjunto de datos se haya limpiado aún más, siga la canalización de análisis de datos que se describe a continuación.
    1. Filtre cualquier ruido presente en las curvas utilizando los filtros implementados en la GUI (Filtering Box), a saber, un filtro personalizado llamado filtro Prominency, el filtro Savitzky Golay30,31 (SAVGOL) y un filtro de suavizado basado en el cálculo de la mediana de los datos en una ventana determinada (filtro mediano). Consulte Discusión (pasos críticos en el protocolo) para obtener detalles sobre los filtros.
    2. Inspeccione las curvas filtradas en el gráfico Curva actual . La curva filtrada se muestra en negro, mientras que la versión no filtrada de la curva se muestra en verde.
      NOTA: Se recomienda filtrar los datos lo menos posible para preservar las características de la señal original. El filtrado excesivo puede suavizar cualquier diferencia presente en los datos. Trabajar con el filtro de prominencia activado es suficiente para el análisis de Hertz de los datos de nanoindentación. Si los datos son particularmente ruidosos, entonces se puede aplicar adicionalmente un filtro SAVGOL o mediano.
    3. Seleccione un algoritmo para encontrar el CP. En el cuadro Punto de contacto, elija uno de una serie de procedimientos numéricos que se han implementado en el software, a saber, la bondad de ajuste (GoF)32, la relación de varianzas (RoV)32, la segunda derivada 33 o el umbral 33. Consulte Discusión, pasos críticos en el protocolo para obtener detalles sobre los algoritmos.
      NOTA: El CP es el punto en el que la sonda entra en contacto con el material y debe identificarse para convertir los datos F-z en datos F-δ (para materiales blandos, δ es finito y debe calcularse). El algoritmo seleccionado se aplicará a todas las curvas activas del conjunto de datos, y las curvas en las que el algoritmo no localice el CP de forma robusta se moverán al conjunto fallido.
    4. Ajuste los parámetros del algoritmo para que se adapten a su conjunto de datos para que el CP se ubique correctamente como se detalla en la Discusión, pasos críticos en el protocolo. Para ver dónde se ha encontrado el CP en una sola curva, seleccione la curva haciendo clic en ella y haga clic en Inspeccionar. Compruebe la ventana emergente que aparece para identificar dónde se ha ubicado el CP.
    5. Compruebe si la línea roja que aparece, que es el parámetro que el algoritmo calculó en la región de interés seleccionada, tiene un valor máximo o mínimo que corresponde a la ubicación del CP (por ejemplo, para el GoF, el parámetro es el R2). Repita este proceso para todas las curvas si es necesario.
      NOTA: Los ejes de la ventana emergente están en coordenadas absolutas para que se pueda mostrar la ubicación del CP. Por el contrario, los ejes del gráfico Curvas sin procesar y Curva actual se muestran en relación con el CP, es decir, la ubicación del CP es (0,0).
    6. Haga clic en Análisis de hercios. Esto generará tres gráficos que se describen a continuación.
      1. Compruebe las curvas F-δ individuales en el conjunto de datos junto con el ajuste promedio de Hertz (línea discontinua roja). Ajuste la sangría en nm hasta la que se ajusta el modelo de Hertz en el cuadro Resultados en Sangría máxima (nm). Establézcalo en un máximo de ~ 10% de R para que el modelo de Hertz sea válido (consulte Discusión, pasos críticos en el protocolo).
      2. Compruebe la curva F-δ media con una banda de error que muestre una desviación estándar (DE) junto con el ajuste medio de Hertz (línea discontinua roja). Visualice el ajuste de Hertz promedio en el gráfico Curvas sin procesar como referencia y el ajuste de Hertz para cada curva en la curva actual.
      3. Compruebe que el diagrama de dispersión de E se origina al ajustar el modelo de Hertz a cada curva individual.
    7. Haga clic en el nombre del archivo, la curva F-z , la curva F-δ o en un punto del gráfico de dispersión para resaltar la curva en cada gráfico. Si un punto de datos en el diagrama de dispersión parece estar fuera de la distribución de los datos, haga clic en él e inspeccione la curva a la que pertenece. Verifique que el CP se haya localizado correctamente haciendo clic en el botón Inspeccionar . Excluya la curva del análisis si es necesario.
    8. Inspeccione el cuadro Resultados para la media calculada E y su SD (Eγ ± σ) y asegúrese de que sean razonables para el experimento dado.
    9. En el cuadro Guardar , haga clic en Hertz. En la ventana emergente, introduzca el nombre del archivo y el directorio. Una vez hecho esto, haga clic en Guardar. Se creará un archivo .tsv. Abra el archivo .tsv en cualquier software adicional de preferencia y utilice los valores para el análisis estadístico y el trazado posterior.
      NOTA: El archivo contiene la E obtenida de cada curva y la media E y su DE. Además, el archivo contiene metadatos asociados con el análisis, incluido el número de curvas analizadas, R, k y la sangría máxima utilizada para el modelo de Hertz.
    10. Este paso es opcional. Haga clic en Promedio F-Ind para exportar la fuerza promedio y la sangría promedio, junto con una SD en la fuerza.
    11. Para obtener datos de nanoindentación celular, haga clic en Análisis de espectros de elasticidad (consulte Resultados representativos y discusión). Inspeccionar las dos gráficas producidas, a saber, E en función de la profundidad de indentación (E(δ)) para cada curva, y la media E(δ) con banda de error que muestra una SD (línea roja sólida y área sombreada) ajustada por un modelo (línea discontinua negra), que permite estimar el módulo de Young de la corteza de actina de la célula, el módulo de Young a granel de la célula, y el grosor de la corteza de actina. Además, verifique el promedio de E(δ) en el gráfico superior en rojo.
    12. Asegúrese de que la casilla Interpolar esté marcada, lo que garantiza que la derivada necesaria para realizar el análisis de espectros de elasticidad se calcula en la señal interpolada (consulte Resultados representativos).
    13. Inspeccione el cuadro Resultados, informando el módulo de Young de la corteza (E 0 ± σ), el módulo de Young de la célula (Eb ± σ) y el grosor de la corteza (d 0 ± σ).
      NOTA: Los espectros de elasticidad promedio pueden parecer ruidosos al principio, con oscilaciones sinusoidales prominentes. Como resultado, la ecuación (3) puede no ajustarse correctamente. Si este es el caso, aumentar iterativamente la longitud de la ventana del filtro SAVGOL34 de suavizado resuelve este problema.
    14. Una vez finalizado el análisis, haga clic en ES en el cuadro Guardar . Esto exportará un archivo .tsv en el directorio especificado, que contiene la elasticidad promedio en función de la profundidad de sangría promedio y el radio de contacto, los metadatos asociados con el experimento (ver arriba) y los parámetros del modelo estimados explicados anteriormente. Finalmente, también se informa la elasticidad promedio sin tener en cuenta la dependencia de δ y su DE.
    15. Cierre el software e ingrese los resultados guardados en cualquier otro software de preferencia para trazar aún más los datos y realizar análisis estadísticos.
    16. Este paso es opcional: exporte gráficos desde la GUI haciendo clic derecho en el gráfico y seleccionando Exportar. Exporte el gráfico en .svg, de modo que parámetros como fuente, tamaño de fuente, estilo de línea, etc. se puede editar en otro software de su elección.
      NOTA: Los algoritmos y filtros CP personalizados se pueden programar y agregar a los ya existentes. Véase la Nota complementaria 1 para más detalles.

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Representative Results

Siguiendo el protocolo, se obtiene un conjunto de curvas F-z . Lo más probable es que el conjunto de datos contenga curvas buenas y curvas que se descartarán antes de continuar con el análisis. En general, las curvas deben descartarse si su forma es diferente de la que se muestra en la Figura 4A. La Figura 5AI muestra un conjunto de datos de ~100 curvas obtenidas en un hidrogel PAAm blando de E 0.8KPa 35 esperado cargado en la GUI de NanoPrepare. La mayoría de las curvas presentan una línea de base clara y plana, una región de transición y una región inclinada que es proporcional a la rigidez aparente del material13. Sin embargo, una minoría de curvas muestran alteraciones de la forma que se muestra en la Figura 4A, como la ausencia de una línea de base, contacto perdido o una línea de base inclinada. Estas curvas se pueden eliminar fácilmente del conjunto de datos utilizando NanoPrepare (Figura 5AII, curvas rojas) y un conjunto de datos limpio guardado en el formato JSON estándar (Figura 5AIII). El conjunto de datos limpio se carga en NanoAnalysis (Figura 5BIV), que ha sido diseñado para que procese por lotes todas las curvas. Esto significa que cada paso del flujo de trabajo se aplica a todo el conjunto de datos. Después de ser cargadas, las curvas se pueden filtrar para eliminar el ruido aleatorio utilizando uno o más filtros descritos en la Discusión, pasos críticos en el protocolo (Figura 5BV). El CP se localiza utilizando uno de los algoritmos implementados en el software y detallados en la Discusión, pasos críticos en el protocolo (Figura 5BVI). Una vez que se ha identificado el PC, los datos F-z se convierten en datos F-δ . Debido a que el software ha sido diseñado para analizar principalmente datos de dispositivos de nanoindentación superior de virola basados en la detección de fibra óptica, que utilizan sondas que tienen una punta esférica, el análisis de Hertz se basa en el modelo de Hertz que se aproxima al contacto entre una esfera de radio R y un semiespacio isotrópico homogéneo elástico lineal (LEHI) infinitamente extendido13:

Equation 2

donde F es la fuerza, δ es la sangría, E es el módulo de Young, y ν es la relación de Poisson, tomada como 0.5 asumiendo incompresibilidad. Por lo tanto, al ajustar las curvas F-δ con la ecuación (1), se puede estimar E (ver Discusión-pasos críticos en el protocolo-para supuestos del modelo de Hertz) (Figura 5BVII).

Además del análisis de Hertz, el software puede realizar un análisis más avanzado, a saber, los espectros de elasticidad, que son particularmente útiles para los datos de nanoindentación celular; y también se puede utilizar como una herramienta para estimar la influencia del sustrato subyacente en las propiedades mecánicas obtenidas a través del modelo de Hertz. A continuación, el enfoque se resume brevemente. Los detalles completos se pueden encontrar en la publicación original24.

A partir del modelo36 de Oliver-Pharr, que describe la sangría de un punzón axisimétrico de geometría arbitraria y un semiespacio elástico, se puede derivar E(δ) para el caso específico de un penetrador esférico. Tomando ν como 0.5, E(δ) tiene la forma24:

Equation 3

Calcular E(δ) para cada curva F-δ usando la ecuación (2) produce un conjunto de curvas, a saber, los espectros de elasticidad (ES). Al tomar el promedio de todas las curvas en el conjunto de datos, se obtiene el ES promedio (Figura 5BVIII, línea continua roja). El ES promedio es una herramienta útil porque proporciona información sobre cómo E varía con δ en el conjunto de datos. En el caso específico de los experimentos de nanoindentación celular, el grosor de la célula no se conoce a priori, lo que significa que elegir un rango de ajuste apropiado para el análisis de Hertz es algo arbitrario. Al utilizar el ES promedio, los efectos del sustrato en el E(δ) aparente se hacen evidentes, lo que significa que la herramienta se puede utilizar para seleccionar un rango de ajuste apropiado, correspondiente al punto donde E(δ) comienza a aumentar después de su desintegración. Además, se ha demostrado previamente y validado computacional y experimentalmente que un modelo bicapa simple es efectivo en la estimación del grosor de la corteza de actina (d 0), el módulo de Young de la corteza de actina (E 0) y el módulo de Young (E b) de la célula (Eb)24. El modelo describe la celda como una bicapa, con una capa más externa de espesor d 0 y módulo E 0, y una capa interna de espesor infinito con módulo elástico E b 0:

Equation 4

donde R es el radio de la punta y Λ es un parámetro fenomenológico, que se determinó que era 1,74 a partir de simulaciones de análisis de elementos finitos24. Este procedimiento se ha implementado en el software NanoAnalysis, que permite ajustar el ES promedio con la ecuación (3) para obtener una estimación de E 0, E b y d0 (Figura 5BVIII, línea discontinua negra). Para más detalles metodológicos, véase la publicación original24.

Para demostrar la viabilidad del protocolo, se preparó y probó la elasticidad de los hidrogeles PAAm de E conocido (medido por AFM)35 utilizando el procedimiento sugerido en la Parte 1 del protocolo. Para cada gel, se adquirieron dos mapas de rigidez en dos áreas diferentes de la muestra utilizando un nanoindentador comercial de virola equipado con una punta que tiene R = 52 μm y k = 0.46 N / m. Cada mapa consistió en 50 hendiduras realizadas en el control de desplazamiento, y el tamaño del paso en x e y se estableció en 20 μm para evitar el sobremuestreo. La Figura 6A muestra la curva F-δ promedio junto con el modelo de Hertz promedio para un hidrogel PAAm blando (esperado E 0.8 kPa) y un hidrogel PAAm rígido (esperado E 8 kPa)35. Al realizar el análisis de Hertz a través del software NanoAnalysis y trazar valores individuales de E, se recuperó el E esperado para ambos hidrogeles (Figura 6B).

Además, se realizaron experimentos de nanoindentación en células HEK293T. Se sangraron seis celdas individuales realizando un escaneo de matriz con un tamaño de paso x e y establecido en 0.5 μm en cada celda y adquiriendo un mínimo de 25 curvas en cada celda. Esto dio como resultado que el conjunto de datos analizados contuviera ~ 200 curvas. La sonda seleccionada tenía R = 3,5 μm y k = 0,02 N/m.

La Figura 7A muestra la curva de Hertz promedio y el modelo de Hertz promedio correspondiente, trazado usando la media E obtenida de la ecuación de ajuste (1) a cada curva individual en NanoAnálisis hasta una hendidura de 200 nm. Se encontró que E fue 915 ± 633 Pa (media ± DE), lo que está de acuerdo con los valores descritos en la literatura24. A pesar de su amplio uso, el modelo de Hertz no captura completamente la evolución de la fuerza con el aumento de la profundidad de indentación para los experimentos de nanoindentación celular (Figura 7A). Debido a esto, el ES es una herramienta particularmente adecuada para estudiar las propiedades mecánicas de células individuales.

La figura 7B muestra el ES promedio, junto con la ecuación (3) ajustada hasta una hendidura de 200 nm. El ES promedio comienza a aumentar a una profundidad de indentación de ~ 200 nm, lo que indica la contribución del sustrato al E aparente sondeado (Figura S4). Debido a esto, se eligió 200 nm como el rango de ajuste tanto para el modelo Hertz (Figura 7A) como para el modelo bicapa (Figura 7B). El ajuste de la ecuación (3) al ES promedio permitió extraer información importante, que de otro modo permanecería inaccesible a partir de experimentos simples de nanoindentación analizados utilizando el modelo de Hertz. Específicamente, el módulo E 0 de la corteza de actina se estimó en 5.794 ± 0.095 kPa, el grosor de la corteza de actina d 0 se encontró en 311 ± 3 nm y el módulo de volumen Eb se encontró en 0.539 ± 0.002 kPa (media ± DE). Todos los valores están de acuerdo con experimentos previos realizados con AFM en el mismo tipo de célula24, y con valores que han sido reportados en la literatura37,38. Específicamente, se espera que la corteza de actina esté entre 300-400 nm para las células adherentes37, y hasta 10 veces más rígida que la mayor parte de la célula38.

Independientemente del modelo bicapa, en la Figura 7C se ofrece una comparación directa entre los resultados obtenidos con el modelo estándar de Hertz y el enfoque ES, que revela distribuciones superpuestas con medias comparables.

Figure 1
Figura 1: Descripción general del protocolo. El protocolo consta de las siguientes partes: (A) Parte 1: Preparación de la muestra (ya sean hidrogeles o células) para experimentos de nanoindentación. (B) Parte 2: Elegir la sonda correcta y calibrar la sonda. (C) Parte 3: Realización de experimentos de nanoindentación mediante la adquisición de mapas de rigidez en la muestra. (D) Parte 4: Análisis de los datos, que consiste en i) limpiar el conjunto de datos adquirido a través de la primera GUI (NanoPrepare) y guardar el conjunto de datos limpio y los metadatos asociados como un archivo JSON estándar; y ii) analizar el conjunto de datos limpiado en la segunda GUI (NanoAnalysis), que consiste en el filtrado de datos, la identificación de CP y el ajuste del modelo para estimar el módulo E de Young de la muestra. Los resultados se guardan para su posterior trazado y análisis estadístico, que se puede realizar en cualquier software de su elección. Creado con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación de la muestra. (A) Pasos sugeridos para preparar hidrogeles PAAm planos para experimentos de nanoindentación. Estos son: I) verter la solución de hidrogel en un portaobjetos de vidrio hidrófobo y cubrirlo con un cubreobjetos silanizados; II) esperar 20 minutos para que se produzca la polimerización y despegar el compuesto de gel de cobertura del portaobjetos; y III) unir el compuesto de gel de cubierta a una placa de Petri y agregar la solución apropiada (agua purificada en el contexto de este protocolo) para experimentos de nanoindentación. El mismo razonamiento se puede adaptar y aplicar a cualquier otro tipo de hidrogel. (B) Pasos sugeridos para preparar células para experimentos de nanoindentación. Estos son: I) sembrar células y esperar la adhesión celular; II) suero privar a las células para sincronizar la población celular en términos del ciclo celular (opcional); y III) esperar a que las células estén en un estado adherido en la confluencia deseada antes de comenzar los experimentos de nanoindentación. Creado con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Descripción general y selección de la sonda de nanoindentación. (A) Esquema de la sonda superior de virola (izquierda) e imagen de una sonda de la parte superior de la virola con una punta esférica de radio de 250 μm (derecha). Todos los componentes están etiquetados en la foto. (B) Esquema ampliado del voladizo y la punta esférica. El voladizo se trata como un resorte hookeano de constante elástica k (mostrado en ángulo para fines de representación). La punta se define por su radio, R. Cuando la muestra está sangrada, la sonda se desplaza en una cantidad z desde su posición de referencia z 0, lo que resulta en que el voladizo se doble d de su curvatura de referencia d 0. Se aplica una fuerza de F = k (d - d 0) a la muestra, lo que resulta en una hendidura δ = (z - z 0) - (d - d0). (C) La rigidez k del voladizo debe elegirse de acuerdo con la elasticidad esperada del sustrato. La gráfica se obtuvo considerando el contacto hertziano con una hendidura de 1 μm, asumiendo que la energía se comparte por igual entre la flexión del voladizo y la hendidura del sustrato (es decir, d = δ). Cuanto mayor sea el radio de la punta, más rígido debe ser el voladizo para alcanzar la misma hendidura para un sustrato con una E dada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Características morfológicas de las curvas F-z. (A) Un experimento exitoso da como resultado que el segmento de aproximación de una curva F-z tenga una línea de base clara (punta que se acerca a la muestra pero no está en contacto); una región de transición donde la punta entra en contacto primero con la muestra; y una región donde la fuerza aumenta con el desplazamiento, donde la punta va sangrando progresivamente la muestra. La pendiente de esta región es proporcional a la rigidez aparente del material13, lo que significa que las curvas que pertenecen a biomateriales rígidos (por ejemplo, geles altamente reticulados) serán más pronunciadas que las que pertenecen a biomateriales más blandos (por ejemplo, geles y células débilmente reticulados). (B) Una curva de aproximación donde la punta nunca entró en contacto con la muestra. Consulte solución de problemas del método en la Discusión para obtener una solución. (C) Una curva de aproximación donde la punta comenzó en contacto con la muestra. Consulte solución de problemas del método en la Discusión para obtener una solución. Los datos mostrados provienen de un experimento realizado en un hidrogel PAAm blando de E esperado 0.8 kPa35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Flujo de trabajo de análisis de datos utilizando las GUI de Python. (A) Un conjunto de datos de ejemplo de curvas F-z adquiridas utilizando un nanoindentador superior de virola disponible comercialmente en un hidrogel PAAm blando (esperado E 0.8 kPa35) se cargó en NanoPrepare. Las curvas que no siguen la forma descrita en la figura 4A se excluyen del conjunto de datos y el conjunto de datos limpio y los metadatos asociados se guardan como un archivo JSON estándar. (B) El conjunto de datos limpio se carga en la segunda GUI (NanoAnalysis) donde las curvas se pueden filtrar aplicando uno o más filtros para eliminar el ruido (ver Discusión, pasos críticos en el protocolo). Además, se selecciona un algoritmo CP para localizar automáticamente el CP para todas las curvas (ver Discusión, pasos críticos en el protocolo). Luego se realiza el análisis de Hertz, produciendo una curva F-δ para cada sangría, que se ajusta con el modelo de Hertz para producir un diagrama de dispersión de E. Los resultados obtenidos se pueden guardar para su posterior trazado. Para las células, se puede realizar un análisis adicional llamado espectros de elasticidad24 . Todos los gráficos mostrados se exportaron directamente desde las GUI de NanoPrepare y NanoAnalysis. Los detalles de cada paso del flujo de trabajo se dan en el texto principal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Elasticidad de los hidrogeles PAAm. (A) Curva F-δ promedio de un conjunto de ~100 curvas adquiridas en un hidrogel PAAm blando (E esperado 0.8 kPa 35) y un hidrogel PAAm rígido (esperado E 8 kPa35). Las líneas continuas muestran la media y la banda sombreada muestra una DE. La línea discontinua muestra el modelo de Hertz trazado utilizando el promedio E del software NanoAnalysis, obtenido ajustando el modelo de Hertz a cada curva hasta una sangría máxima de 2.000 nm (~4% de R, R = 52 μm, k = 0,46 N/m). Las curvas se suavizaron utilizando el filtro de prominencia con parámetros predeterminados, y el CP se identificó utilizando el algoritmo RoV32. (B) Valores individuales de E obtenidos del análisis realizado en NanoAnalysis trazados para la comparación estadística. El diagrama de nubes de lluvia se obtuvo utilizando el módulo Python descrito en la referencia39. p < 0,0001, prueba t no pareada de dos colas, α=0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Elasticidad de las células HEK293T. (A) Curva F-δ promedio de un conjunto de ~ 200 curvas adquiridas en seis células HEK293T individuales. La línea azul continua muestra la media y la banda sombreada muestra una SD. La línea discontinua muestra el modelo de Hertz trazado utilizando el promedio E calculado utilizando el software NanoAnalysis, obtenido ajustando el modelo de Hertz a cada curva hasta una sangría máxima de 200 nm (~ 6% de R, R = 3.5 μm, k = 0.02 N / m). Las curvas se suavizaron utilizando el filtro de prominencia con parámetros predeterminados y un filtro SAVGOL34 con orden 3 y longitud de ventana 80 nm, y el CP se identificó utilizando el algoritmo Umbral33. Usando el modelo de Hertz, la celda se trata como una esfera homogénea con el módulo E de Young, como se muestra esquemáticamente en el recuadro (el núcleo se representa con fines pictóricos). (B) Espectros de elasticidad promedio calculados en el mismo conjunto de datos descrito en (A). La línea roja continua muestra la media y la banda sombreada muestra una DE. Al ajustar un modelo bicapa a los espectros de elasticidad promedio, se calculan las estimaciones de E 0, Eb y d0. Para el conjunto de datos mostrado: E 0= 5,79 ± 0,09 kPa, Eb= 0,539 ± 0,002 kPa y d0 = 311 ± 3 nm (media ± DE). (C) Comparación entre el modelo de Hertz y el enfoque de espectros de elasticidad en términos de distribución E. Para los espectros de elasticidad, la distribución representa los valores de E de los espectros de elasticidad promedio, independientemente de la profundidad de indentación (hasta una sangría máxima de 200 nm). Las líneas continuas superpuestas a los histogramas son estimaciones de densidad de núcleos gaussianos de las distribuciones subyacentes. E = 915 ± 633 Pa (Hertz) y E = 890 ± 297 Pa (espectros de elasticidad) (media ± DE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  

Figura S1: Procedimiento de calibración. (A) Escaneo de longitud de onda exitoso. La desviación del voladizo y las señales de desplazamiento piezoeléctrico durante el escaneo de longitud de onda (izquierda). La onda sinusoidal en la pantalla del interferómetro al final del escaneo de longitud de onda (derecha). (B) Procedimiento de búsqueda de superficie. La deflexión del voladizo y las señales de desplazamiento de Piezo a medida que la sonda se baja en pasos de 1 μm después del contacto con un sustrato rígido. (C) Calibración del factor geométrico. Durante la hendidura de un sustrato rígido, la deflexión del voladizo sigue el desplazamiento del voladizo (líneas verde y azul, respectivamente). La sangría debe ser aproximadamente cero (línea roja). Si la deflexión retrasa el desplazamiento en el tiempo (línea discontinua verde), la sonda no está completamente en contacto con el sustrato rígido. (D) Señal de demodulación. La señal de demodulación en la pantalla del interferómetro al final del procedimiento de calibración (izquierda) y al tocar el nanopenetrador (derecha). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S2: GUI de NanoPrepar. Capturas de pantalla de la GUI de NanoPrepare. Los detalles sobre la funcionalidad de cada widget se dan en el Protocolo principal y la Discusión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S3: GUI de nanoanálisis. Capturas de pantalla de la GUI de NanoAnalysis. Los detalles sobre la funcionalidad de cada widget se dan en el Protocolo principal y la Discusión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Nota complementaria 1: Adición de filtros personalizados y algoritmos CP al software NanoAnalysis. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Protocolo suplementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S4: Dependencia de profundidad de espectros de elasticidad media. La gráfica muestra los espectros de elasticidad promedio <E (δ)> (línea roja continua) junto con una SD (σ(E(δ)). Después de una decaimiento inicial, los espectros de elasticidad promedio comienzan a aumentar, lo que se asocia principalmente con los efectos del sustrato subyacente rígido en el módulo elástico aparente sondeado. La profundidad de sangría máxima utilizada para ajustar el modelo de Hertz a las curvas F-δ y el modelo de decaimiento a los espectros de elasticidad promedio deben elegirse de modo que el sustrato subyacente no afecte los resultados (rango de ajuste). Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este protocolo muestra cómo adquirir de forma robusta datos de nanoindentación de espectroscopía de fuerza utilizando un nanoindentador superior de virola disponible comercialmente tanto en hidrogeles como en células individuales. Además, se proporcionan instrucciones para el uso de un software de código abierto programado en Python que comprende un flujo de trabajo preciso para el análisis de datos de nanoindentación.

Pasos críticos en el protocolo
Se ha determinado que los siguientes pasos son de particular importancia al seguir este protocolo.

Preparación de muestras

Es crucial que antes de iniciar las mediciones, la muestra se prepare teniendo en cuenta las restricciones de la medición. Es decir, la muestra debe estar adherida a una superficie y ser lo más plana posible. Esto es especialmente importante cuando se preparan muestras que no se adhieren naturalmente a las superficies como lo hacen las células, como los hidrogeles. En primer lugar, la muestra no debe flotar en solución, ya que esto interferirá con las mediciones y potencialmente dañará la sonda. Para ello, se recomienda la funcionalización química de un cubreobjetos, de modo que el hidrogel pueda polimerizarse adherido a una superficie, que posteriormente pueda pegarse a una placa de Petri mientras está sumergido. Además, la superficie de la muestra debe ser lo más plana posible para garantizar una detección de superficie coherente por parte de la sonda y evitar dañar la sonda mientras se mueve en x e y durante un escaneo de matriz. La solución de hidrogel se puede polimerizar en un portaobjetos de vidrio hidrófobo, lo que hace que el hidrogel resultante sea plano sin adherirse a él. Si no se siguen estas consideraciones, será difícil obtener datos limpios de F-z .

En el caso de la preparación celular, es mejor sangrar celdas con morfología similar para mejorar la homogeneidad de los datos. En el caso de que las células crezcan en una población heterogénea, se puede introducir un paso de inanición sérica antes de la medición, para ayudar a la sincronización del ciclo celular y, por lo tanto, eliminar posibles factores de confusión experimentales40,41. En el caso de células no adherentes o cultivos de organoides, se deben realizar pasos adicionales para garantizar la estabilidad y la adherencia de la muestra biológica mientras se realizan las mediciones. Los pasos adicionales pueden incluir la unión química de las células a las placas de cultivo o el uso de adhesivos tisulares que ahora están ampliamente disponibles comercialmente.

Experimentos de nanoindentación

Es importante que se elija un voladizo con la k derecha dependiendo del E15 esperado de la muestra. Esto se debe a que si el voladizo es demasiado rígido, la muestra se sangrará pero no se producirá una flexión significativa del voladizo. Por el contrario, si el voladizo es demasiado blando con respecto a la muestra, el voladizo se doblará excesivamente con una hendidura mínima. Ambas instancias darán lugar a un error de cálculo de E en el análisis posterior.

Para la calibración de la sonda, la sonda debe estar húmeda antes de insertarla en la bandeja de calibración para minimizar la tensión superficial al encontrar el líquido de la placa de calibración. No hacerlo puede causar el atrapamiento de burbujas de aire o empujar el voladizo contra la fibra óptica. Esto también puede provocar daños en la sonda.

Se recomienda el uso de una placa de Petri de vidrio grueso para la calibración. El vidrio es infinitamente rígido en comparación con el voladizo, lo que permite una calibración precisa de la k del voladizo mientras se sangra el vidrio. Además, el peso del vidrio garantiza un sustrato estable que es más robusto contra el ruido (por ejemplo, flujo de aire y vibraciones acústicas) en comparación con una placa de Petri de plástico más ligera. La calibración realiza un procedimiento de linealización de la señal interferométrica medida en el detector (V/t), lo que significa que la señal se convertirá en flexión lineal en voladizo (μm/t) utilizando el círculo unitario (círculo de demodulación) como herramienta de linealización18. La sensibilidad de deflexión (μm/V) se establece por defecto en el interferómetro y se utiliza para convertir V a μm. Durante este procedimiento, también se determina el factor de calibración, que se origina en el desajuste de posición entre la punta esférica y la posición de la fibra donde se produce la lectura de la señal (Figura 3A). Al sangrar en un vidrio rígido similar a un sustrato, la deflexión medida por la fibra es aproximadamente la misma que la distancia desplazada por el piezo, lo que significa que la profundidad de indentación es aproximadamente cero. Tomando su relación se obtiene el factor de calibración. Es importante que la calibración del instrumento se realice correctamente y que se satisfagan todas las comprobaciones antes de continuar adquiriendo datos F-z .

Al configurar un perfil de sangría, es útil tener en cuenta los supuestos del modelo de Hertz, que se utilizarán más adelante para analizar los datos. El modelo de Hertz se deriva asumiendo que la muestra es un semiespacio extendido infinitamente LEHI, lo que resulta en las siguientes consecuencias prácticas: i) las deformaciones aplicadas no deben exceder el 20% (como regla general, δ no debe exceder el 10% de la R de la punta) y ii) δ debe ser inferior al 10% del espesor de la muestra, y pequeña en comparación con las dimensiones de la otra muestra13.

El desplazamiento máximo (o la profundidad/fuerza de indentación dependiendo del modo de operación) se puede ajustar dependiendo de la δ resultante, y si se desean propiedades mecánicas superficiales o a granel. Si la muestra se ha sangrado a un δ ligeramente mayor, el modelo Hertz aún se puede ajustar hasta un máximo δ que se encuentra dentro de sus supuestos en el software NanoAnalysis, y el ES promedio utilizado para estimar este rango (ver Resultados representativos).

Para los experimentos de nanoindentación celular, es difícil realizar múltiples escaneos de matriz en la misma célula. Sin embargo, si la celda es lo suficientemente grande, puede ser posible encontrar otra región adecuada y repetir el procedimiento en la misma celda, por ejemplo, un experimento donde el usuario desea detectar diferencias en las propiedades mecánicas de una determinada región de la célula en comparación con otra. Por lo general, se realiza un mapa por celda y se sangra un mínimo de cinco celdas por condición biológica. Es aconsejable repetir el experimento al menos tres veces para que se adquieran datos suficientes sobre cada muestra (es decir, tres réplicas para cada condición biológica).

Críticamente, las curvas adquiridas deben presentar una línea de base plana, una región de transición y una región inclinada. Las curvas que no presentan una línea de base no pueden ser analizadas posteriormente debido a la incertidumbre sobre la ubicación del PC. Si las curvas se desvían de la forma que se muestra en la Figura 4A, el umbral de contacto debe optimizarse antes de continuar con el experimento (consulte la solución de problemas del método a continuación).

Se deben adquirir datos suficientes para garantizar resultados estadísticamente sólidos, dada la naturaleza de la técnica, que sondea las propiedades mecánicas localmente.

Análisis de datos

El software descrito en este protocolo se adopta rutinariamente para analizar datos de nanoindentación y se ha utilizado para obtener resultados publicados en varias revistas revisadas por pares (por ejemplo, nanoindentación de hidrogeles8,21, nanoindentación de células24,42). El análisis de los datos de nanoindentación no es trivial. Se sugiere prestar especial atención a las siguientes partes:

Cribado del conjunto de datos: El conjunto de datos debe examinarse minuciosamente en el software NanoPrepare y todas las curvas incorrectas deben eliminarse antes de guardar el conjunto de datos limpiado como un archivo JSON. Las curvas aún se pueden excluir del análisis en el software NanoAnalysis, pero el archivo JSON no se puede cambiar. Como tal, para garantizar la coherencia entre el conjunto de datos limpiado y analizado, se sugiere realizar cuidadosamente el proceso de selección en el software NanoPrepare.

Filtrado de datos: El uso de filtros es útil cuando los datos son ruidosos y se recomienda al realizar el análisis ES. Se utilizan tres filtros principales como se describe a continuación.

Prominencia: Este filtro elimina los picos prominentes en el espacio de Fourier, para eliminar las oscilaciones instrumentales típicas de los nanodentadores superiores de virola disponibles comercialmente. El filtro se basa en tres parámetros: Prominencia (u.a.): la prominencia máxima en el espacio de Fourier; Frecuencia mínima (canales): la frecuencia mínima a filtrar; Banda (% de posición de pico): el ancho alrededor de la frecuencia filtrada en porcentaje de la posición de pico. Active este filtro para los datos procedentes de nanoindentadores superiores de virola disponibles comercialmente haciendo clic en la casilla de verificación y dejando los parámetros predeterminados.

Savitzky Golay (SAVGOL), algoritmo de la biblioteca SciPy34 (scipy.signal.savgol_filter): Este filtro suaviza los datos basándose en una aproximación polinómica local de mínimos cuadrados. Active este filtro si los datos son particularmente ruidosos. Cambie el orden del polinomio y la longitud de la ventana de filtro en la GUI dependiendo de cuán ruidosos sean los datos. Para más detalles, véanse las referencias30,31. Active este filtro para el análisis ES.

Filtro mediano, algoritmo de la biblioteca SciPy34 (scipy.signal.medfilt): Este filtro suaviza los datos en función de reemplazar cada punto con la mediana calculada alrededor de ese punto en una ventana determinada. Cambie la longitud de la ventana en la GUI dependiendo de cuán ruidosos sean los datos. Este filtro se utiliza como alternativa al filtro SAVGOL.

La activación del filtro de prominencia ayuda a eliminar el ruido instrumental (oscilaciones de baja frecuencia) típico de los nanodentadores comerciales de virola. En general, no es necesario activar otros filtros como el SAVGOL34 al realizar el análisis simple de Hertz. Al calcular el ES, se recomienda activar tanto el filtro de prominencia como el filtro SAVGOL34, con una ventana de suavizado dependiendo del nivel de ruido presente en los datos. Esto se debe a que el ES contiene un término derivado (ecuación 2), que es muy sensible al ruido. Por ejemplo, los resultados de la Figura 7 se obtuvieron utilizando el filtro de prominencia junto con un filtro SAVGOL34 con ventana 80 nm y orden polinómico 3. Sin embargo, es importante no suavizar demasiado los datos, ya que esto puede ocultar cualquier diferencia que esté presente entre los conjuntos de datos.

Identificación de la PC: La parte más importante del análisis es la identificación de la PC, que influye fuertemente tanto en el valor absoluto de E como en su distribución32,33. Cuatro algoritmos basados en procedimientos de búsqueda automática que localizan el CP con el fin de eliminar el sesgo humano se han implementado en el software NanoAnalysis. Todos los algoritmos han sido documentados en la literatura32,33. En general, cada punto en una región de interés se prueba como un CP de prueba mientras se calcula un parámetro específico del algoritmo. El punto que devuelve el parámetro optimizado, que puede ser su valor máximo o mínimo dependiendo del algoritmo, se toma como CP32. Esos procedimientos se han implementado para eliminar el sesgo humano y adoptar un enfoque estadístico del problema. Debido a que cada algoritmo calcula el CP basado en la optimización de un parámetro dado, el CP identificado será ligeramente diferente para cada algoritmo. Como tal, es primordial mantener el mismo algoritmo CP y parámetros específicos (por ejemplo, longitud de ventana para el algoritmo RoV) entre conjuntos de datos que se desea comparar, ya que se conservarán las diferencias relativas en E. Los diferentes algoritmos CP y sus parámetros se resumen a continuación.

Bondad de ajuste (GoF): Un enfoque basado en ajustar un modelo de mecánica de contacto (Hertz) de cada par (z, F) en una región de interés y seleccionar el ajuste que tiene el valor R2 más alto. Funciona bien donde la transición entre el no contacto y el contacto es evidente, lo que sucede con materiales rígidos como los hidrogeles altamente reticulados. El algoritmo es computacionalmente caro, y generalmente el más lento. Aquí, se ha implementado para que el modelo Hertz solo se ajuste hasta un δ máximo de aproximadamente 10% de R, ya que se ha demostrado que esto produce resultados más precisos32.

Relación de varianzas (RoV): Un enfoque basado en el cálculo de la relación de la varianza de la señal de deflexión (fuerza) en la región de contacto y sin contacto32.

Segunda derivada: Una aproximación basada en la segunda derivada de la señal de deflexión (fuerza)33. Funciona bien cuando la señal está limpia. Si la señal es demasiado ruidosa, no se recomienda este enfoque.

Umbral: Un enfoque basado en la deflexión (fuerza) promedio en la región sin contacto33. En resumen, a partir de un valor de fuerza seleccionado por el usuario cerca de la región de contacto, el algoritmo itera a través de cada punto hacia la línea de base, hasta que encuentra el primer punto cuyo valor de fuerza es mayor que el promedio de la línea de base. Este punto se selecciona como CP. Este algoritmo es muy robusto y es el recomendado para usar.

Los detalles sobre cómo usar cada algoritmo se dan a continuación. Los algoritmos CP implican constantes numéricas que deben cambiarse en la GUI para adaptarse al conjunto de datos específico. Específicamente, los siguientes parámetros son comunes al método GoF, RoV y Second Derivative, lo que permite seleccionar una subregión de las curvas (región de interés o ROI) donde se buscará el CP:

Umbral seguro (nN): Define la fuerza máxima en nN (y el punto z correspondiente) a partir de la cual se buscará el CP. Este es el límite derecho del ROI, cuyo valor predeterminado es 10 nN. Todas las curvas cuya fuerza máxima esté por debajo de este umbral se moverán automáticamente al conjunto fallido. Cambie este valor a un valor de fuerza ligeramente superior a la transición de no contacto a contacto.

Rango X (nm): Define el rango en nm desde el punto z correspondiente al umbral seguro. Este es el límite izquierdo del ROI. El valor predeterminado de 1.000 nm es un buen punto de partida, pero si el CP se encuentra demasiado tarde en la curva (es decir, en la región inclinada), aumente este valor. Por el contrario, si el PC se encuentra demasiado pronto (es decir, en la línea de base), disminuya este valor.

Los parámetros específicos de cada algoritmo se resumen aquí. Para el GoF, el ajuste de ventana (nm) representa la ventana en nm desde el CP de prueba hasta el que se instala el modelo Hertz. Esto está limitado a un valor del 10% de R. Para el RoV, el Window RoV (nm) representa la ventana en nm a la izquierda y derecha del CP de prueba sobre el cual se calcula la varianza de la señal de deflexión (fuerza). Para la segunda derivada, la ventana P (nm) representa la ventana pasada al filtro SAVGOL34 utilizado para calcular la segunda derivada de la señal de deflexión (fuerza). Los valores predeterminados se han establecido a partir de la prueba de los diferentes algoritmos y, por lo general, no es necesario cambiarlos.

Para el algoritmo de umbral, se pueden cambiar los siguientes parámetros:

Umbral de alineación (nN): La fuerza (F0) a partir de la cual se buscará el CP a partir de este punto y avanzando hacia la línea de base. Todas las curvas cuya fuerza máxima esté por debajo de este umbral se moverán automáticamente al conjunto fallido. Su valor predeterminado es 10 nN; Sin embargo, cambie este valor a un valor de fuerza ligeramente superior a la transición de sin contacto a contacto. El punto z correspondiente (z0) se almacena para su uso posterior en el algoritmo (ver más abajo).

Alinear paso izquierdo (nm): Este parámetro define el desplazamiento que se agregará a la izquierda de z 0 (valor predeterminado 2.000 nm), lo que da como resultado el cálculo de un punto definido por (z 0 - alinear paso izquierdo). Este punto es el punto alrededor del cual se calculará el promedio de la línea de base (ver más abajo).

Área promedio (nm): Este parámetro define el área promedio a la izquierda y derecha de (z0 - alinear paso izquierdo), sobre el cual se calculará el promedio de la línea base. Su valor predeterminado es 100 nm y no es necesario cambiarlo.

Iterando hacia abajo desde F0, el CP se toma como el primer punto cuyo valor está por encima de la fuerza definida por el promedio de la línea de base.

Nota sobre el ES y el ruido: El ES promedio puede parecer ruidoso al principio con oscilaciones sinusoidales prominentes, y como resultado la ecuación (3) puede no encajar correctamente. Si este es el caso, aumentar la ventana del filtro SAVGOL34 de suavizado generalmente resuelve este problema.

Modificaciones y solución de problemas del método

Solución de problemas del método

Resolución de problemas de escaneo de longitud de onda
Si aparece un mensaje de error en la pantalla del interferómetro después de realizar el escaneo de longitud de onda, los siguientes problemas pueden ser la causa: i) El ambiente puede estar contaminado por el ruido. Deshágase de cualquier fuente de ruido, incluido el flujo de aire, los ruidos fuertes y las vibraciones mecánicas; ii) Es posible que la sonda no esté conectada correctamente. Desenchufe y vuelva a enchufar el conector de fibra óptica verde; iii) El voladizo puede estar sucio. Límpielo sumergiendo la sonda en una placa de Petri que contenga isopropanol durante unos minutos, y luego agua; iv) Una burbuja de aire puede estar presente en el voladizo. Sumerja la sonda en una placa de Petri que contenga isopropanol y cree algo de flujo pipeteando el líquido hacia arriba y hacia abajo; v) El voladizo puede estar doblado/pegado a la fibra, que se puede ver bajo el microscopio. Suéltelo tocando suavemente el voladizo con una toallita de pañuelo. Tenga especial cuidado al tocar el voladizo, ya que la aplicación de fuerza excesiva puede romperlo; vi) Falta el voladizo de la sonda, que se puede ver bajo el microscopio. La única solución es usar una nueva sonda. Intente el escaneo de longitud de onda nuevamente, que ahora debería ser exitoso.

Solución de problemas de calibración
Si la calibración falla y el nuevo factor es NaN o no está en el rango esperado, los siguientes problemas pueden ser la causa: i) La punta no está completamente en contacto con el sustrato. Asegúrese de que la punta esté en contacto con el sustrato siguiendo los pasos indicados en el Protocolo; ii) Las fuerzas atractivas entre la punta y la superficie del vidrio (comportamiento de acoplamiento) dan como resultado la calibración del voladizo sobredoblado. Limpie la sonda sumergiéndola en isopropanol durante 5 minutos y luego agua. Limpie el plato con isopropanol; iii) La punta / plato puede estar contaminado: Limpie la sonda sumergiéndola en isopropanol durante 5 minutos y luego agua. Limpie el plato con isopropanol; iv) El voladizo puede estar doblado/pegado a la fibra. Suéltelo tocándolo suavemente con una toallita de pañuelos de papel. Repita tanto el escaneo de longitud de onda como la calibración después de solucionar problemas.

Póngase en contacto con la solución de
Si las curvas se desvían de la forma que se muestra en la Figura 4A, los parámetros experimentales deben ajustarse antes de continuar con el experimento. Dos de los problemas más comunes son:

Una curva de aproximación donde la punta nunca entra en contacto con la muestra (Figura 4B). Esto ocurre cuando el umbral de contacto se establece en un valor demasiado bajo y el ruido hace que el voladizo se doble en una cantidad correspondiente al umbral dado. Para resolver este problema, vaya al menú Opciones y aumente lentamente el umbral en los pasos de 0,01 y realice una sangría hasta que la curva se parezca a la que se muestra en la Figura 4A. Disminuir la velocidad en el mismo menú también puede ayudar a resolver este problema.

Una curva de aproximación donde la punta comenzó en contacto con la muestra (Figura 4C). Esto sucede cuando el umbral de contacto se establece en un valor demasiado alto, y el voladizo no se dobla en la cantidad correspondiente al umbral dado al tocar la muestra por primera vez. Para resolver este problema, disminuya lentamente el umbral en el menú Opciones en los pasos de 0,01 y realice una sangría hasta que la curva se parezca a la que se muestra en la figura 4A. Este problema es particularmente problemático porque la ausencia de una línea de base impide el cálculo correcto del CP, lo que eventualmente conduce a un error de cálculo de E.

Modificaciones del método
El protocolo se puede ampliar para cuantificar la E de diferentes tipos de hidrogeles. Los hidrogeles PAAm fueron elegidos para este protocolo ya que son los hidrogeles más comunes utilizados en el campo de la mecanobiología. Sin embargo, el protocolo es igualmente aplicable a cualquier tipo de hidrogel elástico25, tanto sintético, por ejemplo, polietilenglicol (PEG)43 como gelatina metacriloyl (GelMA)44,45; y naturales, como el colágeno46. Además, no hay restricciones en cuanto a las dimensiones de la muestra a probar, dentro de límites razonables. Por ejemplo, este protocolo se ha utilizado para cuantificar la E de hidrogeles sintéticos de PEG que luego se probaron con un reómetro a granel y se requirió que tuvieran ~ 15 mm de diámetro y ~ 2 mm de espesor8. El protocolo también se ha implementado para caracterizar la E de las membranas PDMS que fueron polimerizadas en una placa de Petri (resultados no publicados).

Además de la hendidura estándar de células individuales realizada con un microscopio convencional de contraste de fase invertido, los nanopenetradores superiores de virola son compatibles con sistemas de imagen complejos y se han utilizado para sondear las estructuras subcelulares de elasticidad local, como el núcleo de la célula y el citoplasma47. Mientras que los pasos deberán ajustarse dependiendo del sistema óptico específico, este protocolo es de aplicabilidad general con respecto a la realización de experimentos de nanoindentación y el análisis de los datos resultantes.

Además, el protocolo no se limita a medir las propiedades mecánicas de las células y los hidrogeles y se puede adaptar para medir las propiedades elásticas locales de sistemas más complejos, incluidos los organoides48, los esferoides49 y los tejidos completos como los riñones, el hígado, el bazo y el útero23. El lector es dirigido a las referencias 23,48,49 para especificidades sobre la realización de experimentos de nanoindentación en tales muestras. Un aspecto a considerar es que el control de desplazamiento funciona en modo de bucle abierto y no recibe retroalimentación de la muestra. Como tal, no se garantiza una tensión / deformación y velocidad constantes, y las partes más blandas de la muestra se sangrarán más y más rápido en comparación con las regiones más rígidas. Esto es relevante para muestras mecánicamente heterogéneas, como los tejidos, donde es más apropiado elegir el control de indentación (modo I) o el control de carga (modo P), asegurando una tensión / deformación y velocidad consistentes en regiones mecánicamente heterogéneas de la muestra.

Limitaciones del método
Existe un creciente cuerpo de evidencia de que la viscoelasticidad, además de la elasticidad, juega un papel importante en la regulación de procesos fisiológica y patológicamente relevantes. Esto se debe a que las células, la ECM y los tejidos son viscoelásticos, y la elasticidad representa sólo un componente de su comportamiento mecánico50,51,52,53. Mientras que los nanopenetradores superiores a la virola proporcionan funcionalidad para caracterizar la viscoelasticidad, incluida la relajación del estrés, el cumplimiento de la fluencia y el análisis mecánico dinámico para extraer tanto el módulo de almacenamiento como el de pérdida en diferentes regímenes de frecuencia (tiempo), este protocolo solo se centra en la elasticidad, que sigue siendo la variable mecánica más estudiada en el contexto de la mecanobiología y la ingeniería de tejidos (por ejemplo, consulte la referencia3).

La suposición subyacente con consecuencias tanto en los experimentos como en el análisis de datos es que el sustrato sangrado se comporta como un sólido LEHI. Esto significa que la respuesta tensión-deformación es lineal, no hay comportamientos dependientes del tiempo, y la muestra es mecánicamente homogénea e isotrópica. Sobre la base de estos supuestos, las propiedades mecánicas del sustrato se cuantifican a través del módulo de Young siguiendo un modelo específico de mecánica de contacto, en este caso, el modelo de Hertz (ecuación 1). Para pequeñas fuerzas/deformaciones cuasiestáticas, los hidrogeles reticulados químicamente, como los geles PAAm utilizados en este protocolo35 , se comportan casi como sólidos elásticos y los efectos viscoelásticos son mínimos e insignificantes53. Por otro lado, las células no son sólidos LEHI y muestran un comportamiento mecánico complejo9. El módulo de celdas de Young depende en gran medida de la velocidad de deformación (es decir, la velocidad) del procedimiento de indentación, sin embargo, no se establece una tendencia clara y variables adicionales como el tamaño de la punta y la profundidad máxima de la hendidura influyen en esta relación9. No obstante, para deformaciones cuasiestáticas, como las utilizadas en este protocolo (v = 5 μm/s), las células muestran una marcada respuesta elástica y los efectos disipativos son mínimos9. La dependencia de la tasa de deformación puede ser capturada por modelos más complejos teniendo en cuenta variables dependientes del tiempo, a las que se remite al lector54.

Además, siguiendo el mismo supuesto subyacente, la relación de Poisson (ν) se toma como 0,5 tanto en el análisis de Hertz como en el de ES. Al comparar entre muestras, esto solo afecta los resultados como un coeficiente; sin embargo, se ha demostrado que ν es una cantidad dependiente de la frecuencia para las celdas55 y que se desvía de 0,5 para los hidrogeles56.

Otra limitación del protocolo radica en el hecho de que el software no proporciona cuantificación de E a través de modelos de mecánica de contacto más sofisticados. El modelo Hertz es el modelo de mecánica de contacto más utilizado en los experimentos de AFM y es extremadamente efectivo13,15; Sin embargo, no tiene en cuenta eventos más complejos, como las fuerzas atractivas de corto o largo alcance entre la punta y la muestra. Los modelos más complejos como el modelo de Johnson-Kendall-Roberts pueden capturar estos comportamientos13, pero no están implementados en el software. Para obtener una visión general de los diferentes modelos de mecánica de contacto que varían en complejidad, se dirige al lector a la referencia13.

Importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos
El enfoque más común para cuantificar las propiedades elásticas locales de biomateriales y células individuales a microescala es AFM13,14,15,16. A pesar de ser un instrumento potente y versátil, el AFM requiere una amplia capacitación debido a su compleja configuración antes de que los usuarios puedan realizar experimentos de manera robusta. Los nanopenetradores superiores de virola ofrecen una solución plug-and-play al tiempo que permiten aplicar fuerzas nN con resolución μm para sondear las propiedades mecánicas locales de los biomateriales (por ejemplo, referencias 8,19,20,21). Si bien existen protocolos estandarizados para el uso de la AFM en el contexto de la mecanobiología16 y la ingeniería de tejidos14, no existen protocolos que detallen el funcionamiento de los dispositivos nanopenetradores superiores a virola. Este protocolo permite a un usuario sin experiencia realizar experimentos de nanoindentación tanto en hidrogeles como en células, siguiendo pautas destinadas a estandarizar el flujo de trabajo experimental dentro de la comunidad. Además, el análisis de datos de experimentos de nanoindentación no es trivial y seguiría siendo en gran medida inaccesible para los usuarios sin experiencia en programación. Se proporcionan instrucciones para el uso de un software intuitivo que permite limpiar y guardar el conjunto de datos adquirido en formato ligero y estándar y realizar tanto el análisis estándar de Hertz como el análisis ES24 con unos pocos clics y de manera reproducible.

Siguiendo este protocolo, se obtienen resultados comparables con los obtenidos utilizando el AFM, tanto para los hidrogeles E (resultados en la Figura 6 comparados con los de la referencia35) como para las propiedades mecánicas de las células (resultados en la Figura 7 comparados con los de la referencia24) a una fracción de la complejidad. El método es de aplicabilidad general y se puede adaptar a diferentes tipos de nanopenetradores siempre que algunos pasos se modifiquen en función del dispositivo específico.

Importancia y aplicaciones potenciales del método en áreas de investigación específicas
La caracterización de las propiedades elásticas de las células, hidrogeles y tejidos es una práctica estándar en muchos laboratorios de investigación que se centran en la mecanobiología, la ingeniería de tejidos / medicina regenerativay más allá 3. Este protocolo se puede utilizar para cuantificar las propiedades elásticas de células individuales, hidrogeles y adaptado para tejidos y biomateriales más complejos en el contexto de procesos fisiológicamente relevantes marcados por un cambio en las propiedades mecánicas. Por ejemplo, para imitar la dinámica de la ECM nativa, se ha demostrado que los hidrogeles degradables de PEG-laminina 3D permiten a las células remodelar su entorno circundante, lo que lleva a una disminución en la E de los geles de ~ 50% durante un período de 9 días en comparación con los mismos geles sin células21. El protocolo es de aplicabilidad general y no se limita a las muestras y la configuración óptica descritas en este documento. Se prevé que este protocolo facilite el uso de nanoindentadores en laboratorios de investigación centrados en el estudio de las propiedades mecánicas en fisiología y enfermedad.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

GC y MAGO reconocen a todos los miembros del CeMi. MSS reconoce el apoyo a través de una subvención del programa EPSRC (EP/P001114/1).

GC: software (contribución al desarrollo de software y algoritmos), análisis formal (análisis de datos de nanoindentación), validación, investigación (experimentos de nanoindentación en geles de poliacrilamida), curación de datos, redacción (borrador original, revisión y edición), visualización (figuras y gráficos). MAGO: investigación (preparación de geles y muestras de células, experimentos de nanoindentación en células), redacción (borrador original, revisión y edición), visualización (figuras y gráficos). NA: validación, redacción (revisión y edición). IL: software (contribución al desarrollo de software y algoritmos), validación, escritura (revisión y edición); MV: conceptualización, software (diseño y desarrollo de software original y algoritmos), validación, recursos, redacción (borrador original, revisión y edición), supervisión, administración de proyectos, adquisición de fondos MSS: recursos, redacción (revisión y edición), supervisión, administración de proyectos, adquisición de fondos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm coverslips VWR 631-1577P
35 mm cell treated culture dishes Greiner CELLSTAR 627160
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
Acrylsilane Alfa Aesar L16400
Ammonium Persulfate Merk 7727-54-0
Bisacrylamide Merk 110-26-9
Chiaro nanoindenter Optics 11 Life  no catologue number
Ethanol general
Fetal bovine serum Gibco 16140071
High glucose DMEM Gibco 11995065
Isopropanol general
Kimwipe Kimberly Clark 21905-026
Microscope glass slides VWR 631-1550P
MilliQ system Merk Millipore ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer Optics11 Life no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um) Optics 11 Life no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um) Optics 11 Life no catologue number
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
RainX rain repellent RainX 26012
Standard petri dishes (90 mm) Thermo Scientific 101RTIRR
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich 110-18-9
Vaccum dessicator Thermo Scientific 531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1) Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional) Microsoft
Python 3 Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional) Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Flujo de trabajo experimental y de análisis de datos para nanoindentación de materia blanda
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Ciccone, G., Azevedo Gonzalez Oliva, M., Antonovaite, N., Lüchtefeld, I., Salmeron-Sanchez, M., Vassalli, M. Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation. J. Vis. Exp. (179), e63401, doi:10.3791/63401 (2022).

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