Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Flux de travail expérimental et d’analyse de données pour la nanoindentation de matière molle

Published: January 18, 2022 doi: 10.3791/63401
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

Summary

Le protocole présente un flux de travail complet pour les expériences de nanoindentation de matériaux mous, y compris les hydrogels et les cellules. Tout d’abord, les étapes expérimentales pour acquérir des données de spectroscopie de force sont détaillées; ensuite, l’analyse de ces données est détaillée par un logiciel Python open-source nouvellement développé, téléchargeable gratuitement à partir de GitHub.

Abstract

La nanoindentation fait référence à une classe de techniques expérimentales où une sonde de force micrométrique est utilisée pour quantifier les propriétés mécaniques locales des biomatériaux mous et des cellules. Cette approche a acquis un rôle central dans les domaines de la mécanobiologie, de la conception de biomatériaux et de l’ingénierie tissulaire, afin d’obtenir une caractérisation mécanique correcte des matériaux mous avec une résolution comparable à la taille des cellules individuelles (μm). La stratégie la plus populaire pour acquérir de telles données expérimentales consiste à utiliser un microscope à force atomique (AFM); Bien que cet instrument offre une résolution sans précédent en force (jusqu’au pN) et en espace (sub-nm), sa facilité d’utilisation est souvent limitée par sa complexité qui empêche les mesures de routine d’indicateurs intégraux des propriétés mécaniques, tels que le module de Young (E). Une nouvelle génération de nanopénétrateurs, tels que ceux basés sur la technologie de détection de fibre optique, a récemment gagné en popularité pour sa facilité d’intégration tout en permettant d’appliquer des forces inférieures à nN avec une résolution spatiale en μm, ce qui convient pour sonder les propriétés mécaniques locales des hydrogels et des cellules.

Dans ce protocole, un guide étape par étape détaillant la procédure expérimentale pour acquérir des données de nanoindentation sur des hydrogels et des cellules à l’aide d’un nanopénétrateur de détection de fibre optique sur virole disponible dans le commerce est présenté. Alors que certaines étapes sont spécifiques à l’instrument utilisé ici, le protocole proposé peut servir de guide pour d’autres dispositifs de nanoindentation, à condition que certaines étapes soient adaptées conformément aux directives du fabricant. En outre, un nouveau logiciel Python open-source équipé d’une interface utilisateur graphique conviviale pour l’analyse des données de nanoindentation est présenté, qui permet le criblage des courbes mal acquises, le filtrage des données, le calcul du point de contact par différentes procédures numériques, le calcul conventionnel de E, ainsi qu’une analyse plus avancée particulièrement adaptée aux données de nanoindentation unicellulaire.

Introduction

Le rôle fondamental de la mécanique en biologie est aujourd’hui établi 1,2. Des tissus entiers aux cellules individuelles, les propriétés mécaniques peuvent renseigner sur l’état physiopathologique du biomatériau étudié 3,4. Par exemple, le tissu mammaire affecté par le cancer est plus rigide que le tissu sain, un concept qui est à la base du test de palpation populaire5. Il a notamment été récemment démontré que la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est soulignée par des modifications des propriétés mécaniques des cellules sanguines, notamment une diminution de la déformabilité des érythrocytes et une diminution de la rigidité des lymphocytes et des neutrophiles par rapport aux cellules sanguines d’individus naïfs du SRAS-CoV-26.

En général, la mécanique des cellules et des tissus est intrinsèquement imbriquée : chaque tissu possède des propriétés mécaniques spécifiques qui influencent et dépendent simultanément de celles des cellules constitutives et de la matrice extracellulaire (MEC)5. Pour cette raison, les stratégies d’étude de la mécanique en biologie impliquent souvent des substrats d’ingénierie avec des stimuli mécaniques physiologiquement pertinents pour élucider le comportement cellulaire en réponse à ces stimuli. Par exemple, les travaux fondateurs d’Engler et de ses collègues ont démontré que l’engagement de la lignée des cellules souches mésenchymateuses est contrôlé par l’élasticité de la matrice, comme étudié sur des hydrogels de polyacrylamide bidimensionnels (PAAm) mous et rigides7.

Il existe de nombreuses stratégies pour caractériser mécaniquement le biomatériau à l’étude, variant en échelle spatiale (c.-à-d. locale à en vrac) et en mode de déformation (p. ex., axial vs cisaillement), ce qui donne des informations différentes, qui nécessitent une interprétation prudente 3,8,9,10. La mécanique des biomatériaux mous est généralement exprimée en termes de rigidité. Cependant, la rigidité dépend à la fois des propriétés du matériau et de la géométrie, tandis que les modules élastiques sont des propriétés fondamentales d’un matériau et sont indépendants de la géométrie du matériau11. Ainsi, différents modules d’élasticité sont liés à la rigidité d’un échantillon donné, et chaque module d’élasticité englobe la résistance du matériau à un mode de déformation spécifique (p. ex., axial vs cisaillement) dans différentes conditions aux limites (p. ex., expansion libre vs confinement)11,12. Les expériences de nanoindentation permettent de quantifier les propriétés mécaniques grâce au E qui est associé à une déformation uniaxiale (indentation) lorsque le biomatériau n’est pas confiné latéralement10,11,12.

La méthode la plus populaire pour quantifier l’E des systèmes biologiques à l’échelle microscopique est AFM13,14,15,16. AFM est un outil extrêmement puissant avec une résolution de force jusqu’au niveau pN et une résolution spatiale jusqu’à l’échelle sub-nm. En outre, AFM offre une flexibilité extrême en termes de couplage avec des outils optiques et mécaniques complémentaires, étendant ainsi ses capacités à extraire une mine d’informations du biomatériau à l’étude13. Ces caractéristiques attrayantes, cependant, s’accompagnent d’une barrière à l’entrée représentée par la complexité du dispositif expérimental. L’AFM nécessite une formation approfondie avant que les utilisateurs puissent acquérir des données robustes, et son utilisation pour la caractérisation mécanique quotidienne des matériaux biologiques est souvent injustifiée, en particulier lorsque sa force unique et ses résolutions spatiales ne sont pas requises.

Pour cette raison, une nouvelle classe de nanopénétrateurs a récemment gagné en popularité en raison de leur facilité d’utilisation, tout en offrant des données comparables AFM avec une résolution de force inférieure à nN et une résolution spatiale μm, reflétant les forces exercées et perçues par les cellules sur des échelles de longueur pertinentes2. En particulier, les dispositifs de nanoindentation à virole basés sur la technologie de détection de fibre optique17,18 ont gagné en popularité parmi les chercheurs actifs dans le domaine de la mécanobiologie et au-delà; et une multitude de travaux rapportant les propriétés mécaniques des biomatériaux utilisant ces dispositifs, y compris les cellules19,20, les hydrogels8,21 et les tissus22,23 ont été publiés. Malgré la capacité de ces systèmes à sonder les propriétés mécaniques dynamiques locales (c.-à-d. le module de stockage et de perte), les expériences quasi statiques donnant E restent le choix le plus populaire 8,19,20,21. En bref, les expériences quasi-statiques de nanoindentation consistent à indenter l’échantillon avec une vitesse constante jusqu’à un point de consigne défini soit par un déplacement maximal, une force ou une profondeur d’indentation, et à enregistrer à la fois la force et la position verticale du porte-à-faux dans des courbes dites force-distance (F-z). Les courbes F-z sont ensuite converties en courbes d’indentation de force (F-δ) par l’identification du point de contact (CP), et équipées d’un modèle de mécanique de contact approprié (généralement le modèleHertz 13) pour calculer E.

Bien que le fonctionnement des nanopénétrateurs à dessus de la ferrule ressemble aux mesures AFM, il existe des spécificités à prendre en compte. Dans ce travail, un guide étape par étape pour acquérir de manière robuste des courbes F-z à partir de cellules et d’hydrogels imitant les tissus à l’aide d’un nanopénétrateur de virole disponible dans le commerce est fourni, afin d’encourager la normalisation des procédures expérimentales entre les groupes de recherche utilisant ce dispositif et d’autres dispositifs similaires. En outre, des conseils sur la meilleure façon de préparer des échantillons d’hydrogel et des cellules pour effectuer des expériences de nanoindentation sont donnés, ainsi que des conseils de dépannage tout au long de la voie expérimentale.

De plus, une grande partie de la variabilité des résultats de nanoindentation (c.-à-d. E et sa distribution) dépend de la procédure spécifique utilisée pour analyser les données, qui n’est pas triviale. Pour résoudre ce problème, des instructions pour l’utilisation d’un logiciel open source nouvellement développé programmé en Python et équipé d’une interface utilisateur graphique (GUI) conviviale pour l’analyse par lots des courbes F-z sont fournies. Le logiciel permet un filtrage rapide des données, le filtrage des données, le calcul du CP à travers différentes procédures numériques, le calcul conventionnel de E, ainsi qu’une analyse plus avancée appelée spectres d’élasticité24, permettant d’estimer le module de Young de la cellule, le module de Young du cortex d’actine et l’épaisseur du cortex d’actine. Le logiciel peut être téléchargé gratuitement à partir de GitHub et peut être facilement adapté pour analyser des données provenant d’autres systèmes en ajoutant un analyseur de données approprié. Il est souligné que ce protocole peut être utilisé pour d’autres dispositifs de nanoindentation à haut de la virole, et d’autres dispositifs de nanoindentation en général, à condition que certaines étapes soient adaptées selon les directives de l’instrument spécifique. Le protocole est schématiquement résumé à la figure 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation des substrats/cellules pour les mesures de nanoindentation

  1. Suivez les étapes indiquées dans le Protocole additionnel pour la préparation des hydrogels/cellules PAAm pour les expériences de nanoindentation. La procédure est résumée à la figure 2.
    NOTE: Les hydrogels PAAm ont été choisis car ce sont les hydrogels les plus couramment utilisés dans le domaine de la mécanobiologie. Cependant, le protocole est également applicable à tout type d’hydrogel25 (voir Discussion, modifications de la méthode).

2. Démarrage de l’appareil, choix de la sonde et étalonnage de la sonde

  1. Suivez les étapes indiquées dans le protocole supplémentaire pour démarrer l’appareil. Pour plus de détails techniques sur le fonctionnement des nanopénétrateurs à fibre optique, consultez ces références17,18.
  2. Sélectionnez la sonde de nanoindentation comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : Toutes les sondes disponibles dans le commerce, telles que celles utilisées dans ce protocole, sont équipées d’une pointe sphérique (Figure 3A). Par conséquent, le choix se réduit à deux variables : la rigidité du porte-à-faux et le rayon de pointe (Figure 3B).
    1. Choisissez la rigidité d’un porte-à-faux (k dans N/m) qui correspond à la rigidité attendue de l’échantillon pour obtenir les meilleurs résultats15 (voir Figure 3C et Discussion, étapes critiques du protocole). Pour les cellules, sélectionnez une sonde avec k compris entre 0,01 et 0,09 N/m. Pour les hydrogels, sélectionnez une sonde avec k dans la plage de 0,1 à 0,9 N/m, ce qui donne des résultats optimaux pour les gels dont l’indice E attendu se situe entre quelques kPa et 100 kPa (voir Résultats représentatifs).
    2. Choisissez le rayon de la pointe (R en μm) en fonction de la résolution spatiale souhaitée du processus d’indentation. Pour les petites cellules telles que les cellules 293T (rein embryonnaire humain) (HEK293T) (diamètre moyen de ~10-15 μm26), sélectionnez une sphère avec R = 3 μm. Pour les hydrogels, sélectionnez une sphère avec R = 10-250 μm pour sonder les propriétés mécaniques du biomatériau sur une grande surface de contact et éviter les hétérogénéités locales.
    3. Consultez la figure 3C et les directives supplémentaires du fabricant pour choisir la sonde appropriée.
  3. Une fois la sonde sélectionnée, suivez les étapes du protocole additionnel pour la monter sur le nanopénétrateur.

3. Calibrage de la sonde

REMARQUE: Les étapes suivantes sont spécifiques aux dispositifs de nanoindentation à virole basés sur la technologie de détection de fibre optique, et elles sont détaillées pour la version logicielle 3.4.1. Pour les autres dispositifs de nanoindentation, suivez les étapes recommandées par le fabricant de l’appareil.

  1. Dans la fenêtre principale du logiciel, cliquez sur Initialiser. Un menu d’étalonnage apparaîtra. Entrez les détails de la sonde (se trouvent sur le côté de la boîte de la sonde; k en N/m, R en μm et le facteur d’étalonnage en air) dans les zones d’entrée.
  2. Préparez la boîte d’étalonnage : une boîte de Petri en verre épais à fond plat (voir Discussion, étapes critiques dans le protocole). Remplissez le plat avec le même milieu que le plat d’échantillon (cela peut aussi être de l’air). Faire correspondre la température du milieu avec celle de l’échantillon.
  3. Placez le plat d’étalonnage sous la sonde. Si nécessaire, faites glisser la sonde du support de bras du nanopénétrateur et tenez-la dans une main pour faire de la place pour le placement de la parabole d’étalonnage. Faites glisser la sonde en place.
  4. Effectuez les deux étapes suivantes pour l’étalonnage dans un liquide. Si vous mesurez dans l’air, utilisez le substrat en polytétrafluoroéthylène fourni pour l’étalonnage et passez à l’étape 5.
    1. Prémouiller la sonde avec une goutte d’éthanol à 70% à l’aide d’une pipette Pasteur avec l’extrémité de la pipette en contact léger avec la virole en verre, pour que la goutte glisse sur le porte-à-faux et la pointe sphérique27 (voir Discussion, étapes critiques dans le protocole).
    2. Faites glisser manuellement le bras du nanopénétreur vers le bas jusqu’à ce que la sonde soit complètement immergée, mais toujours loin du fond de la boîte de Pétri. Si nécessaire, ajouter plus de milieu à la boîte d’étalonnage. Attendez 5 minutes pour que les conditions d’équilibre soient atteintes dans le liquide.
  5. Dans le menu Initialiser du logiciel, cliquez sur Scan Wavelength. L’écran de l’interféromètre affiche une barre de progression et la fenêtre Live Signal du logiciel de l’ordinateur affiche le motif illustré à la figure S1A, à gauche. Pour vérifier si le balayage optique a réussi, accédez au panneau Balayage de longueur d’onde sur le boîtier de l’interféromètre. En cas de succès, une onde sinusoïdale devrait être visible (Figure 1A, à droite). Voir Discussion (dépannage de la méthode) si une erreur apparaît.
  6. Dans le menu Initialiser , cliquez sur Rechercher une surface, ce qui abaissera progressivement la sonde jusqu’à ce qu’un seuil défini dans la flexion du porte-à-faux soit atteint. La sonde cesse de bouger lorsque le contact avec la boîte de Petri en verre est établi.
  7. Vérifiez si la sonde est en contact avec la surface. Déplacez la sonde vers le bas de 1 μm à l’aide du bouton flèche y vers le bas de la fenêtre principale du logiciel. Observez le signal vert (déviation du porte-à-faux) dans la fenêtre Live du logiciel pour les changements dans la ligne de base à chaque étape, lorsque le porte-à-faux est en contact avec le substrat (Figure S1B). S’il n’y a pas de changement, le porte-à-faux n’est pas en contact (voir étape suivante).
  8. Augmentez la valeur de seuil dans le menu Options sous l’onglet Rechercher une surface par rapport à sa valeur par défaut de 0,01 d’une étape de 0,01 à la fois et répétez l’étape Rechercher une surface jusqu’au contact. Sinon, abaissez la sonde au contact par petits pas de 1 μm jusqu’à ce que la ligne de base verte commence à se déplacer à chaque étape vers le bas.
    REMARQUE: Pour les porte-à-faux les plus mous (k = 0,025 Nm-1), augmentez la valeur de seuil dans le menu Options sous l’onglet Rechercher une surface a priori de l’exécution de l’étape 6. Partez d’une valeur seuil de 0,06 ou 0,07 et augmentez-la jusqu’à 0,1 si nécessaire. En effet, le bruit ambiant entraînera probablement une courbure du porte-à-faux au-dessus du seuil avant le contact. Pour les sondes souples, la diminution de la vitesse d’approche (μm/s) dans le même menu améliore également la procédure.
  9. Dans le menu Initialiser , cliquez sur Calibrer.
  10. Vérifiez la fenêtre Live Signal du logiciel et assurez-vous que les signaux de déplacement du piézo et de déviation du porte-à-faux montent en même temps (Figure S1C).
    1. S’il y a un décalage dans le temps, la sonde n’est pas complètement en contact avec le verre. Déplacez la sonde vers le bas par pas de 1 μm jusqu’à ce que la ligne de base du signal en porte-à-faux change (voir étape 7) et répétez l’étape 9.
    2. Si le signal en porte-à-faux ne change pas du tout pendant l’étape d’étalonnage , la sonde est loin de la surface. Augmentez le seuil de contact de manière itérative (voir étape 8) jusqu’à ce que la surface soit trouvée correctement et répétez l’étalonnage depuis le début en commençant par le balayage de longueur d’onde.
  11. Lorsque l’étalonnage est terminé, vérifiez les anciens et les nouveaux facteurs d’étalonnage dans la fenêtre contextuelle affichée. Si le nouveau facteur d’étalonnage se situe dans la plage correcte, cliquez sur Utiliser un nouveau facteur. Si l’étalonnage échoue et que le nouveau facteur est NaN ou n’est pas dans la plage attendue, reportez-vous à la section Discussion (dépannage de la méthode) pour la résolution.
    NOTE: Le nouveau facteur doit être ~n fois inférieur à celui fourni sur la boîte de la sonde si l’étalonnage a été effectué dans un milieu liquide avec un indice de réfraction n (n = 1,33 pour l’eau). Si l’étalonnage a été effectué dans l’air, les nouveaux et les anciens facteurs d’étalonnage doivent être approximativement égaux.
  12. Vérifiez si le cercle de démodulation a été correctement calibré comme suit. Accédez à l’onglet Démodulation sur le bureau de l’interféromètre. Tapotez doucement sur la table optique ou sur le nanopénétrateur pour induire suffisamment de bruit. Un cercle blanc composé de points de données discrets devrait couvrir approximativement le cercle rouge (figure S1D).
  13. Si le cercle blanc ne chevauche pas le cercle rouge ou si un avertissement apparaît sur l’écran de l’interféromètre, le cercle de démodulation doit être recalibré. Cela peut être fait de deux manières, comme décrit ci-dessous.
    1. Appuyez continuellement sur le corps du nanopénétrateur pour induire un cercle complet de bruit et appuyez sur le bouton Calibrer de l’interféromètre.
    2. Entrez en contact avec le substrat de verre et appuyez sur Calibrer dans le menu Initialiser de la fenêtre principale du logiciel. N’enregistrez pas le facteur d’étalonnage. À ce stade, vérifiez à nouveau et assurez-vous que le cercle blanc chevauche le cercle rouge.
      REMARQUE: Si le signal n’est pas seulement légèrement déplacé du cercle de démodulation, mais est devenu très petit ou n’est pas visible du tout, cela signifie que le porte-à-faux est collé à la fibre optique. Suivez les conseils de dépannage pour ce problème (voir Discussion, dépannage de la méthode) et répétez les étapes 13.1 ou 13.2. Une fois que le porte-à-faux revient à sa position horizontale (Figure 3A), le signal reviendra dans le cercle de démodulation.
  14. Vérifiez l’étalonnage en effectuant une indentation sur le substrat de verre directement après l’étalonnage comme décrit ci-dessous.
    1. Chargez ou créez un fichier d’expérience en cliquant sur Configurer l’expérience et ajoutez une étape Rechercher une surface et une étape Indentation . Pour l’étape d’indentation, utilisez les paramètres de mode de déplacement par défaut et définissez le déplacement maximal sur la distance d’étalonnage (3 000 nm) pour déplacer la sonde contre le substrat rigide.
    2. Cliquez sur Run Experiment et vérifiez le cercle de démodulation dans la fenêtre de l’interféromètre. Vérifiez le signal blanc et assurez-vous qu’il se trouve au-dessus du cercle rouge lors de l’indentation.
    3. Vérifiez les résultats dans la fenêtre principale du logiciel dans le graphique Données temporelles et assurez-vous que le déplacement du piézo (ligne bleue) est égal à la déviation du porte-à-faux (ligne verte) lorsque l’indentation commence au contact et qu’aucune déformation du matériau n’est attendue. Si les signaux ne sont pas parallèles, voir Discussion (dépannage de la méthode).
  15. Modifiez le chemin local dans le menu d’étalonnage en définissant le chemin d’enregistrement de l’étalonnage sur un répertoire approprié.
  16. Lorsque la sonde a été calibrée avec succès, déplacez le piézo vers le haut de 500 μm.

4. Mesure du module de Young des matériaux souples

  1. Nanoindentation d’hydrogels
    1. Chargez la boîte de Petri contenant le(s) échantillon(s) sur la platine du microscope et déplacez manuellement la sonde du nanopénétrateur à une position x-y souhaitée au-dessus de l’échantillon.
    2. Faites glisser manuellement la sonde en solution, en prenant soin de laisser 1-2 mm entre la sonde et la surface de l’échantillon à ce stade. Attendez 5 minutes que la sonde s’équilibre dans le milieu.
    3. Focalisez le plan z du microscope optique de manière à ce que la sonde soit clairement visible.
    4. Effectuez une seule indentation pour régler les paramètres expérimentaux comme décrit ci-dessous.
      1. Configurez une nouvelle expérience dans la fenêtre principale du logiciel. Cliquez sur Configurer l’expérience, ce qui ouvrira une nouvelle fenêtre. Ajoutez une étape Rechercher une surface . Tous les paramètres de l’étape Rechercher une surface peuvent être modifiés dans le menu Options du logiciel si nécessaire.
        REMARQUE : La surface de recherche abaissera la sonde jusqu’à ce que la surface soit trouvée, puis rétractera la sonde à une distance définie par Z au-dessus de la surface (μm), au-dessus de la surface de l’échantillon. Si le porte-à-faux choisi est trop rigide pour l’échantillon ou si l’échantillon est collant, après l’étape, la sonde est susceptible d’être encore en contact avec l’échantillon, ce qui entraînera une courbe sans ligne de base (Figure 4C). Pour résoudre ce problème, augmentez le Z au-dessus de la surface (μm).
      2. Ajoutez une étape de retrait . Sélectionnez l’onglet Profil et cliquez sur Contrôle de déplacement. Conservez le profil de retrait par défaut.
      3. Cliquez sur Run Experiment dans la fenêtre principale du logiciel. Cela permettra de trouver la surface et d’effectuer une seule indentation. Si l’indentation unique ne ressemble pas aux attentes, ajustez les paramètres expérimentaux comme indiqué à la figure 4 et à la section Discussion (dépannage de la méthode).
    5. Une fois que l’indentation semble comme vous le souhaitez, configurez l’analyse matricielle de sorte qu’une zone suffisante de l’échantillon soit mise en retrait. Cliquez sur Configurer l’expérience, ajoutez une étape de recherche de surface avec les paramètres expérimentaux précédemment déterminés et ajoutez une étape de balayage matriciel .
    6. Pour les hydrogels plats, configurez un balayage matriciel contenant 50 à 100 points (c.-à-d. 5 x 10 ou 10 x 10 po x et y) espacés de 10 à 100 μm (c.-à-d. dx = dy = 10-100 μm). Cliquez sur Utiliser la position de la scène pour lancer l’analyse matricielle à partir de la position actuelle de l’étape. Assurez-vous que la case Recherche automatique de surface est cochée pour trouver la surface à chaque indentation à l’aide des paramètres expérimentaux définis.
      1. Pour éviter le suréchantillonnage, définissez la taille de l’étape sur au moins deux fois le rayon de contact (Equation 1, où δ est la profondeur d’indentation).
      2. Configurez le profil de balayage matriciel dans le contrôle de déplacement. Assurez-vous que le profil ne viole pas les hypothèses du modèle Hertz (voir Discussion, étapes critiques dans le protocole).
      3. Laissez le nombre de segments à 5, qui est la valeur par défaut, et utilisez le profil de déplacement par défaut. Si nécessaire, modifiez le profil de déplacement en termes de déplacement maximal et de temps pour chaque segment incliné, ce qui affectera respectivement la profondeur d’indentation maximale et la vitesse de déformation. Ne pas dépasser les vitesses de déformation > 10 μm/s (voir Discussion, limites de la méthode).
      4. Entrez une valeur pour la vitesse d’approche, qui détermine la vitesse à laquelle la sonde est déplacée vers l’échantillon avant le contact. Faire correspondre la vitesse de rétraction à la vitesse d’approche (voir note ci-dessous).
        REMARQUE: Pour les porte-à-faux souples et les environnements bruyants, une vitesse d’approche de 1 000 à 2 000 nm / s est recommandée. Pour les porte-à-faux plus rigides et les environnements contrôlés, cela peut être augmenté.
      5. Enregistrez l’expérience configurée dans le chemin d’expérience souhaité et sélectionnez un répertoire dans lequel les données seront enregistrées dans le chemin d’enregistrement, dans l’onglet Général de la fenêtre Configurer l’expérience . Cliquez sur Run Experiment (Exécuter l’expérience).
    7. Une fois le balayage matriciel terminé, augmenter la sonde de 200 à 500 μm et déplacer la sonde vers une autre zone de l’échantillon suffisamment éloignée de la première zone.
    8. Répéter l’expérience au moins deux fois afin d’obtenir suffisamment de données sur chaque échantillon (c.-à-d. au moins deux balayages matriciels par échantillon, contenant 50 à 100 courbes chacun).
  2. Nanoindentation de cellules
    1. Chargez l’échantillon sur le microscope comme décrit ci-dessus.
    2. Pour l’indentation d’une seule cellule, concentrez le plan z de sorte que les cellules et la sonde soient visibles à un grossissement de 20x ou 40x, selon la taille et l’étalement de la cellule.
    3. Déplacez la sonde au-dessus de la cellule à mettre en retrait.
    4. Configurez une nouvelle expérience dans la fenêtre principale du logiciel. Cliquez sur Configurer l’expérience, ce qui ouvrira une nouvelle fenêtre. Ajoutez une étape Rechercher une surface et une indentation avec les paramètres par défaut en mode déplacement.
    5. Cliquez sur Run Experiment, qui trouvera la surface et effectuera une seule indentation. Vérifiez si l’indentation a réussi. Si la courbe ne ressemble pas aux attentes, ajustez les paramètres expérimentaux (voir Figure 4 et Discussion, dépannage de la méthode).
    6. Si l’indentation a réussi, ajoutez un balayage matriciel à l’expérience. Suivez les étapes données pour les expériences de nanoindentation des hydrogels; configurer l’analyse matricielle de sorte que la taille de l’étape permette de mettre en retrait une petite zone de la cellule ; 25 points espacés de 0,5 à 5 μm pour les cellules HEK293T.
      1. Selon la taille de la cellule, adaptez le balayage matriciel pour vous assurer que la pointe ne s’indente pas en dehors de la limite de la cellule, c’est-à-dire en effectuant une géométrie de carte différente ou en sondant moins de points.
    7. Cliquez sur Run Experiment et attendez qu’il soit terminé.
    8. Une fois le balayage matriciel terminé, soulevez la sonde hors de contact (50 μm dans le plan z ).
    9. Déplacez la sonde au-dessus d’une nouvelle cellule et répétez le processus (voir Discussion, étapes critiques dans le protocole).
  3. Nettoyage de la sonde et extinction de l’instrument
    1. Suivez les étapes indiquées dans le protocole additionnel pour nettoyer la sonde et éteindre le dispositif de nanoindentation.

5. Analyse des données

  1. Téléchargement et installation du logiciel
    1. Suivez les étapes indiquées dans le Protocole additionnel pour télécharger et installer le logiciel d’analysedes données 28,29.
  2. Criblage des courbes F-z et production d’un ensemble de données nettoyées au format JSON
    1. Lancez prepare.py à partir de la ligne de commande sur l’ordinateur de laboratoire, comme indiqué aux étapes 2 et 3.
    2. Si vous utilisez un ordinateur Windows, maintenez la touche Maj enfoncée tout en cliquant avec le bouton droit sur le dossier NanoPrepare et cliquez sur Ouvrir la fenêtre PowerShell ici. Tapez la commande python prepare.py et appuyez sur la touche Entrée . Une interface graphique apparaîtra sur votre écran (Figure S2).
    3. Si vous utilisez un ordinateur MacOS, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le dossier NanoPrepare et cliquez sur Nouveau terminal dans le dossier. Tapez la commande python3 prepare.py et appuyez sur la touche Entrée , ce qui lancera l’interface graphique (Figure S2).
    4. Sélectionnez le format de données O11NEW dans la liste déroulante. Si les données ne sont pas chargées correctement, relancez l’interface graphique et sélectionnez O11OLD.
      REMARQUE: Le format O11NEW fonctionne pour les données obtenues à l’aide de dispositifs de nanoindentation à fibre optique à base de virole avec la version logicielle 3.4.1. Ce format fonctionnera également pour les versions précédentes du logiciel, du moins celles appartenant aux nanopénétrateurs installés en 2019-2020.
    5. Cliquez sur Charger le dossier. Sélectionnez un dossier contenant les données à analyser : analyse matricielle unique ou analyse matricielle multiple. Le graphique du haut (courbes brutes) sera rempli avec l’ensemble de données téléchargé. Pour visualiser une courbe spécifique, cliquez dessus. Cela le mettra en surbrillance en vert et l’affichera sur le graphique du bas (courbe actuelle).
    6. Nettoyez l’ensemble de données à l’aide des onglets présents dans la partie droite de l’interface graphique, comme indiqué ci-dessous.
      1. Utilisez le bouton Segment pour sélectionner le segment correct à analyser, qui est le segment avant des courbes F-z . Le nombre spécifique dépend du nombre de segments sélectionnés dans le logiciel de nanoindentation lors de la réalisation d’expériences.
      2. Utilisez le bouton Recadrer 50 nm pour rogner les courbes de 50 nm à l’extrême gauche (si L est coché), à droite (si R est coché) ou des deux côtés (si R et L sont cochés). Cliquez plusieurs fois sur ce bouton pour recadrer autant que nécessaire. Utilisez cette option pour supprimer les artefacts présents au début/à la fin des courbes F-z.
      3. Examinez la languette Cantilever pour la constante du ressort, la géométrie de la pointe et le rayon de la pointe. Inspectez l’onglet pour vous assurer que les métadonnées ont été lues correctement.
      4. Utilisez l’onglet Filtrage pour définir un seuil de force qui annulera toutes les courbes qui n’ont pas atteint la force donnée. Les courbes abandonnées seront surlignées en rouge.
      5. Utilisez le bouton bascule manuel pour supprimer manuellement les courbes qui n’ont pas été correctement acquises. Supprimez toutes les courbes en cliquant sur la courbe spécifique et en sélectionnant OUT, ce qui mettra la courbe en surbrillance en rouge.
    7. Cliquez sur Enregistrer JSON. Entrez un nom approprié pour l’ensemble de données nettoyé, qui est un fichier JSON unique. Envoyez le fichier JSON à l’ordinateur sur lequel le logiciel NanoAnalysis a été installé.

6. Analyse formelle des données

  1. Lancez le fichier nano.py à partir de la ligne de commande en accédant au dossier NanoAnalysis et en lançant un terminal comme expliqué précédemment. Tapez la commande python nano.py ou python3 nano.py (selon le système d’exploitation) et appuyez sur la touche Entrée . Une interface graphique apparaîtra sur votre écran (Figure S3).
  2. En haut à gauche de l’interface graphique, cliquez sur Load Experiment et sélectionnez le fichier JSON. Cela remplira la liste des fichiers et le graphique Courbes brutes montrant l’ensemble de données en termes de courbes F-z. Les axes F et z sont affichés par rapport aux coordonnées CP, qui sont calculées en arrière-plan lors du chargement du jeu de données (voir la remarque suivante). Dans la zone Statistiques, vérifiez les valeurs des trois paramètres : Nactivé, N a échoué et Nexclu.
    REMARQUE : Nactivé représente le nombre de courbes qui seront analysées dans l’analyse ultérieure des spectres Hertz/élasticité et qui apparaissent en noir dans le graphique Courbes brutes . Nfailed représente le nombre de courbes sur lesquelles un CP fiable n’a pas pu être trouvé et apparaissent en bleu dans le graphique. Ces courbes seront automatiquement écartées dans l’analyse ultérieure. Lors de l’ouverture du logiciel, certaines courbes peuvent être automatiquement déplacées vers le jeu défaillant. En effet, le CP est calculé à l’ouverture du logiciel avec l’algorithme de seuil par défaut (voir ci-dessous). Nexclu représente les courbes sélectionnées manuellement pour être exclues de l’analyse et apparaîtra en rouge dans le graphique (voir ci-dessous).
  3. Vérifiez si le nombre de courbes échouées, exclues et activées est raisonnable. Consultez le graphique Courbes brutes pour visualiser les courbes.
  4. Pour visualiser une courbe spécifique plus en détail, cliquez dessus. Cela le mettra en surbrillance en vert et l’affichera sur le graphique Courbe actuelle . Une fois qu’une seule courbe a été sélectionnée, les paramètres R et k (qui doivent être les mêmes pour toutes les courbes) seront renseignés dans la zone Statistiques de l’interface graphique.
  5. Modifiez l’état d’une courbe donnée à l’aide de la zone Basculer . Cliquez sur la courbe spécifique dont vous souhaitez modifier l’état, puis cliquez sur Activé, Échec ou Exclu. Le nombre dans la zone Statistiques est automatiquement mis à jour.
    Remarque : Pour modifier l’affichage de l’ensemble de données dans le graphique Courbes brutes , utilisez la zone Affichage . Cliquez sur Tout pour afficher toutes les courbes (c’est-à-dire activées, échouées et exclues dans les couleurs respectives). Cliquez sur Impossible d’afficher les courbes activées et les courbes échouées et cliquez sur Activé pour afficher uniquement les courbes activées. Pour réinitialiser l’état de toutes les courbes entre activé et exclu, cliquez sur Activé ou Exclu dans la zone Réinitialiser .
  6. Une fois que le jeu de données a été nettoyé, suivez le pipeline d’analyse des données décrit ci-dessous.
    1. Filtrez tout bruit présent dans les courbes à l’aide des filtres implémentés dans l’interface graphique (Filtering Box), à savoir un filtre personnalisé appelé filtre Prominency, le filtre Savitzky Golay30,31 (SAVGOL) et un filtre de lissage basé sur le calcul de la médiane des données dans une fenêtre donnée (filtre médian). Voir Discussion (étapes critiques du protocole) pour plus de détails sur les filtres.
    2. Examinez les courbes filtrées dans le graphique Courbe actuelle . La courbe filtrée est représentée en noir tandis que la version non filtrée de la courbe est représentée en vert.
      REMARQUE: Il est conseillé de filtrer les données le moins possible pour préserver les caractéristiques du signal d’origine. Le filtrage excessif peut lisser les différences présentes dans les données. Travailler avec le filtre de proéminence activé est suffisant pour l’analyse Hertz des données de nanoindentation. Si les données sont particulièrement bruyantes, un filtre SAVGOL ou médian peut également être appliqué.
    3. Sélectionnez un algorithme pour trouver le CP. Dans la zone Point de contact, choisissez l’une des nombreuses procédures numériques implémentées dans le logiciel, à savoir la qualité de l’ajustement (GoF)32, le rapport de variances (RoV)32, la dérivée secondaire 33 ou le seuil 33. Voir Discussion, étapes critiques du protocole pour plus de détails sur les algorithmes.
      REMARQUE: Le CP est le point auquel la sonde entre en contact avec le matériau et doit être identifié afin de convertir les données F-z en données F-δ (pour les matériaux mous, δ est fini et doit être calculé). L’algorithme sélectionné sera appliqué à toutes les courbes actives de l’ensemble de données, et les courbes où l’algorithme ne parvient pas à localiser le CP de manière robuste seront déplacées vers l’ensemble défaillant.
    4. Ajustez les paramètres de l’algorithme en fonction de votre jeu de données afin que le CP soit localisé correctement, comme indiqué dans la discussion, étapes critiques du protocole. Pour voir où le CP a été trouvé sur une seule courbe, sélectionnez la courbe en cliquant dessus et cliquez sur Inspecter. Vérifiez la fenêtre contextuelle qui apparaît pour identifier l’emplacement du CP.
    5. Vérifiez si la ligne rouge qui apparaît, qui est le paramètre que l’algorithme a calculé dans la région d’intérêt sélectionnée, a une valeur maximale ou minimale qui correspond à l’emplacement du CP (par exemple, pour le GdF, le paramètre est le R2). Répétez ce processus pour toutes les courbes si nécessaire.
      REMARQUE: Les axes de la fenêtre contextuelle sont en coordonnées absolues afin que l’emplacement du CP puisse être affiché. Inversement, les axes des courbes brutes et du graphique de la courbe actuelle sont représentés par rapport au CP, c’est-à-dire que l’emplacement du CP est (0,0).
    6. Cliquez sur Analyse Hertz. Cela générera trois graphiques décrits ci-dessous.
      1. Vérifiez les courbes F-δ individuelles dans l’ensemble de données ainsi que l’ajustement moyen en Hertz (ligne pointillée rouge). Ajustez l’indentation en nm jusqu’à laquelle le modèle Hertz est ajusté dans la zone Résultats sous Indentation maximale (nm). Réglez-le sur un maximum de ~10% de R pour que le modèle Hertz soit valide (voir Discussion, étapes critiques dans le protocole).
      2. Vérifiez la courbe moyenne F-δ avec la bande d’erreur montrant un écart type (ET) ainsi que l’ajustement Hertz moyen (ligne pointillée rouge). Visualisez l’ajustement Hertz moyen sur le graphique Courbes brutes pour référence et l’ajustement Hertz pour chaque courbe sur la courbe actuelle.
      3. Vérifiez le nuage de points de E provenant de l’ajustement du modèle Hertz à chaque courbe individuelle.
    7. Cliquez sur le nom du fichier, la courbe F-z , la courbe F-δ ou un point sur le nuage de points pour mettre en surbrillance la courbe de chaque tracé. Si un point de données dans le nuage de points semble se trouver en dehors de la distribution des données, cliquez dessus et inspectez la courbe à laquelle il appartient. Vérifiez que le CP a été localisé correctement en cliquant sur le bouton Inspecter . Exclure la courbe de l’analyse si nécessaire.
    8. Examinez la boîte Résultats pour la moyenne calculée E et son écart-type (Eγ ± σ) et assurez-vous qu’ils sont raisonnables pour l’expérience donnée.
    9. Dans la zone Enregistrer , cliquez sur Hertz. Dans la fenêtre contextuelle, entrez le nom du fichier et le répertoire. Une fois terminé, cliquez sur Enregistrer. Un fichier .tsv sera créé. Ouvrez le fichier .tsv dans n’importe quel logiciel supplémentaire de votre préférence et utilisez les valeurs pour l’analyse statistique et le traçage ultérieur.
      Remarque : Le fichier contient le E obtenu à partir de chaque courbe et la moyenne E et son écart-type. En outre, le fichier contient les métadonnées associées à l’analyse, y compris le nombre de courbes analysées, R, k et l’indentation maximale utilisée pour le modèle Hertz.
    10. Cette étape est facultative. Cliquez sur Average F-Ind pour exporter la force moyenne et l’indentation moyenne, ainsi qu’un SD dans la force.
    11. Pour les données de nanoindentation cellulaire, cliquez sur Analyse des spectres d’élasticité (voir Résultats représentatifs et discussion). Inspecter les deux tracés produits, à savoir, E en fonction de la profondeur d’indentation (E(δ)) pour chaque courbe, et la moyenne E(δ) avec bande d’erreur montrant un SD (ligne rouge continue et zone ombrée) ajustée par un modèle (ligne pointillée noire), ce qui permet d’estimer le module de Young du cortex d’actine de la cellule, le module de Young de la cellule, et l’épaisseur du cortex d’actine. De plus, vérifiez la moyenne E(δ) dans le graphique du haut en rouge.
    12. Assurez-vous que la case Interpoler est cochée, ce qui garantit que la dérivée nécessaire pour effectuer l’analyse des spectres d’élasticité est calculée sur le signal interpolé (voir Résultats représentatifs).
    13. Inspectez la boîte Résultats, en indiquant le module de Young du cortex (E 0 ± σ), le module de Young de la cellule (Eb ± σ) et l’épaisseur du cortex (d 0 ± σ).
      REMARQUE: Les spectres d’élasticité moyens peuvent sembler bruyants au début, avec des oscillations sinusoïdales proéminentes. Par conséquent, l’équation (3) peut ne pas être ajustée correctement. Si tel est le cas, l’augmentation itérative de la longueur de la fenêtre du filtre de lissage SAVGOL34 résout ce problème.
    14. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur ES dans la case Enregistrer . Cela exportera un fichier .tsv dans le répertoire spécifié, contenant l’élasticité moyenne en fonction de la profondeur d’indentation moyenne et du rayon de contact, les métadonnées associées à l’expérience (voir ci-dessus) et les paramètres estimés du modèle expliqués ci-dessus. Enfin, l’élasticité moyenne sans tenir compte de la dépendance à l’égard de δ et de son écart-type est également rapportée.
    15. Fermez le logiciel et entrez les résultats enregistrés dans tout autre logiciel de votre préférence pour tracer davantage les données et effectuer une analyse statistique.
    16. Cette étape est facultative : Exportez des graphiques à partir de l’interface graphique en cliquant avec le bouton droit sur le graphique et en sélectionnant Exporter. Exportez le graphique dans .svg, de sorte que les paramètres tels que la police, la taille de la police, le style de ligne, etc. peut être édité dans un autre logiciel de votre choix.
      REMARQUE:Des algorithmes et des filtres CP personnalisés peuvent être programmés et ajoutés à ceux déjà existants. Voir la note complémentaire 1 pour plus de détails.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En suivant le protocole, un ensemble de courbes F-z est obtenu. L’ensemble de données contiendra très probablement de bonnes courbes et des courbes à écarter avant de poursuivre l’analyse. En général, les courbes doivent être écartées si leur forme est différente de celle de la figure 4A. La figure 5AI montre un ensemble de données de ~100 courbes obtenues sur un hydrogel PAAm mou de E 0,8 KPa35 attendu téléchargé dans l’interface graphique de NanoReady. La plupart des courbes présentent une ligne de base claire et plate, une région de transition et une région inclinée proportionnelle à la rigidité apparente du matériau13. Cependant, une minorité de courbes présentent des altérations par rapport à la forme illustrée à la figure 4A, telles que l’absence d’une ligne de base, un contact manqué ou une ligne de base inclinée. Ces courbes peuvent être facilement supprimées de l’ensemble de données à l’aide de NanoPrepare (Figure 5AII, courbes rouges) et d’un jeu de données propre enregistré au format JSON standard (Figure 5AIII). L’ensemble de données propre est téléchargé dans NanoAnalysis (Figure 5BIV), qui a été conçu pour traiter par lots toutes les courbes. Cela signifie que chaque étape du workflow est appliquée à l’ensemble du jeu de données. Après avoir été téléchargées, les courbes peuvent être filtrées pour supprimer le bruit aléatoire à l’aide d’un ou de plusieurs filtres décrits dans la discussion, étapes critiques du protocole (Figure 5BV). Le CP est ensuite localisé à l’aide de l’un des algorithmes implémentés dans le logiciel et détaillés dans la discussion, étapes critiques du protocole (Figure 5BVI). Une fois que le PC a été identifié, les données F-z sont converties en données F-δ . Parce que le logiciel a été conçu pour analyser principalement les données des dispositifs de nanoindentation de la virole basée sur la détection de fibre optique, qui utilisent des sondes ayant une pointe sphérique, l’analyse Hertz est basée sur le modèle de Hertz approximant le contact entre une sphère de rayon R et un demi-espace linéaire élastique homogène isotrope élastique infiniment étendu (LEHI)13:

Equation 2

où F est la force, δ est l’indentation, E est le module de Young et ν est le rapport de Poisson, pris comme 0,5 en supposant l’incompressibilité. En ajustant les courbes F-δ à l’équation (1), E peut donc être estimé (voir Discussion-étapes critiques dans le protocole-pour les hypothèses du modèle de Hertz) (Figure 5BVII).

En plus de l’analyse Hertz, le logiciel peut effectuer une analyse plus avancée, à savoir les spectres d’élasticité, ce qui est particulièrement utile pour les données de nanoindentation cellulaire; et peut également être utilisé comme outil pour estimer l’influence du substrat sous-jacent sur les propriétés mécaniques obtenues via le modèle Hertz. Ci-dessous, l’approche est brièvement résumée. Tous les détails peuvent être trouvés dans la publication originale24.

En partant du modèle Oliver-Pharr36, qui décrit l’indentation d’un poinçon axisymétrique de géométrie arbitraire et d’un demi-espace élastique, on peut dériver E(δ) pour le cas spécifique d’un pénétrateur sphérique. En prenant ν comme 0,5, E(δ) a la forme24:

Equation 3

Le calcul de E(δ) pour chaque courbe F-δ à l’aide de l’équation (2) donne un ensemble de courbes, à savoir les spectres d’élasticité (ES). En prenant la moyenne de toutes les courbes de l’ensemble de données, on obtient le SE moyen (figure 5BVIII, ligne continue rouge). Le SE moyen est un outil utile parce qu’il fournit des informations sur la façon dont E varie avec δ dans l’ensemble de données. Dans le cas spécifique des expériences de nanoindentation cellulaire, l’épaisseur de la cellule n’est pas connue a priori, ce qui signifie que le choix d’une plage d’ajustement appropriée pour l’analyse Hertz est quelque peu arbitraire. En utilisant le SE moyen, les effets du substrat sur le E(δ) apparent deviennent évidents, ce qui signifie que l’outil peut être utilisé pour sélectionner une plage d’ajustement appropriée, correspondant au point où E(δ) commence à augmenter après sa décroissance. De plus, il a déjà été démontré et validé par calcul et expérimentalement qu’un modèle bicouche simple est efficace pour estimer l’épaisseur du cortex d’actine (d 0), le module de Young du cortex d’actine (E 0) et le module de Young (E b) de la cellule (Eb)24. Le modèle décrit la cellule comme une bicouche, avec une couche la plus externe d’épaisseur d 0 et de module E 0, et une couche interne d’épaisseur infinie avec un module élastique E b 0:

Equation 4

où R est le rayon de la pointe et Λ est un paramètre phénoménologique, qui a été déterminé à 1,74 à partir de simulations d’analyse par éléments finis24. Cette procédure a été implémentée dans le logiciel NanoAnalysis, qui permet d’ajuster le ES moyen avec l’équation (3) pour obtenir une estimation de E 0, Eb et d0 (Figure 5BVIII, ligne pointillée noire). Pour plus de détails méthodologiques, se reporter à la publication originale24.

Pour démontrer la viabilité du protocole, l’élasticité des hydrogels PAAm d’E connus (mesurée par AFM)35 a été préparée et testée selon la procédure suggérée dans la partie 1 du protocole. Pour chaque gel, deux cartes de rigidité dans deux zones différentes de l’échantillon ont été acquises à l’aide d’un nanopénétrateur commercial à dessus de virole équipé d’une pointe ayant R = 52 μm et k = 0,46 N/m. Chaque carte se composait de 50 indentations effectuées dans le contrôle du déplacement, et la taille des pas en x et y a été fixée à 20 μm pour éviter le suréchantillonnage. La figure 6A montre la courbe moyenne F-δ ainsi que le modèle Hertz moyen pour un hydrogel PAAm mou (E 0,8 kPa attendu) et un hydrogel PAAm rigide (E 8 kPa attendu)35. En effectuant l’analyse Hertz à l’aide du logiciel de nanoanalyse et en traçant les valeurs individuelles de E, l’E attendu a été récupéré pour les deux hydrogels (Figure 6B).

En outre, des expériences de nanoindentation sur des cellules HEK293T ont été réalisées. Six cellules individuelles ont été indentées en effectuant un balayage matriciel avec une taille de pas x et y fixée à 0,5 μm sur chaque cellule et en acquérant un minimum de 25 courbes sur chaque cellule. Cela a abouti à l’ensemble de données analysé contenant ~ 200 courbes. La sonde sélectionnée avait R = 3,5 μm et k = 0,02 N/m.

La figure 7A montre la courbe Hertz moyenne et le modèle Hertz moyen correspondant, tracés à l’aide de la moyenne E obtenue à partir de l’équation d’ajustement (1) à chaque courbe individuelle en nanoanalyse jusqu’à une indentation de 200 nm. E s’est avéré être de 915 ± 633 Pa (moyenne ± écart-type), ce qui est conforme aux valeurs rapportées dans la littérature24. Malgré sa large utilisation, le modèle Hertz ne saisit pas complètement l’évolution de la force avec une profondeur d’indentation croissante pour les expériences de nanoindentation cellulaire (Figure 7A). Pour cette raison, l’ES est un outil particulièrement approprié pour étudier les propriétés mécaniques des cellules individuelles.

La figure 7B montre le SE moyen, ainsi que l’équation (3) ajustée à une indentation de 200 nm. Le SE moyen commence à augmenter à une profondeur d’indentation de ~200 nm, ce qui indique la contribution du substrat au E apparent sondé (Figure S4). Pour cette raison, 200 nm a été choisi comme plage d’ajustement pour le modèle Hertz (Figure 7A) et le modèle bicouche (Figure 7B). L’ajustement de l’équation (3) à la moyenne ES a permis d’extraire des informations importantes, qui resteraient autrement inaccessibles à partir de simples expériences de nanoindentation analysées à l’aide du modèle Hertz. Plus précisément, le module E 0 du cortex d’actine a été estimé à 5,794 ± 0,095 kPa, l’épaisseur d 0 du cortex d’actine à 311 ± 3 nm et le module de volume Eb à 0,539 ± 0,002 kPa (moyenne ± écart-type). Toutes les valeurs sont conformes aux expériences antérieures réalisées à l’aide de l’AFM sur le même type de cellule24, et aux valeurs qui ont été rapportées dans la littérature37,38. Plus précisément, le cortex d’actine devrait être compris entre 300 et 400 nm pour les cellules adhérentes37, et jusqu’à 10 fois plus rigide que la majeure partie de la cellule38.

Quel que soit le modèle bicouche, une comparaison directe entre les résultats obtenus avec le modèle Hertz standard et l’approche ES est donnée à la figure 7C, qui révèle des distributions qui se chevauchent avec des moyennes comparables.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole. Le protocole comprend les parties suivantes: (A) Partie 1: Préparation de l’échantillon (hydrogels ou cellules) pour les expériences de nanoindentation. (B) Partie 2 : Choisir la bonne sonde et étalonner la sonde. (C) Partie 3: Réalisation d’expériences de nanoindentation en acquérant des cartes de rigidité sur l’échantillon. (D) Partie 4: Analyse des données, qui consiste à i) nettoyer l’ensemble de données acquis via la première interface graphique (NanoPrepare) et enregistrer l’ensemble de données nettoyé et les métadonnées associées en tant que fichier JSON standard; et ii) l’analyse de l’ensemble de données nettoyé dans la deuxième interface graphique (NanoAnalysis), qui consiste en un filtrage des données, une identification CP et un ajustement du modèle pour estimer le module E de Young de l’échantillon. Les résultats sont enregistrés pour un traçage ultérieur et une analyse statistique, qui peuvent être effectués dans n’importe quel logiciel de votre choix. Créé avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Préparation de l’échantillon. (A) Étapes suggérées pour préparer des hydrogels PAAm plats pour les expériences de nanoindentation. Il s’agit de: I) verser la solution d’hydrogel sur une lame de verre hydrophobe et la recouvrir d’une lamelle de couverture silanisée; II) attendre 20 minutes pour que la polymérisation se produise et décoller le composite couvercle-gel de la lame de verre; et III) fixer le composite couvercle-gel à une boîte de Pétri et ajouter une solution appropriée (eau purifiée dans le contexte du présent protocole) pour les expériences de nanoindentation. Le même raisonnement peut être adapté et appliqué à tout autre type d’hydrogel. (B) Étapes suggérées pour préparer les cellules aux expériences de nanoindentation. Ce sont: I) les cellules d’ensemencement et l’attente de l’adhésion cellulaire; II) sérum affamant les cellules pour synchroniser la population cellulaire en termes de cycle cellulaire (facultatif); et III) attendre que les cellules soient dans un état adhérent à la confluence souhaitée avant de commencer des expériences de nanoindentation. Créé avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Vue d’ensemble et sélection de la sonde de nanoindentation. (A) Schéma de la sonde à sommet de la virole (à gauche) et image d’une sonde à sommet de la virole avec l’extrémité sphérique de rayon 250 μm (à droite). Tous les composants sont étiquetés sur la photo. (B) Schéma agrandi du porte-à-faux et de la pointe sphérique. Le porte-à-faux est traité comme un ressort hookéen de constante élastique k (représenté à un angle à des fins de représentation). La pointe est définie par son rayon, R. Lorsque l’échantillon est en retrait, la sonde est déplacée d’une quantité z par rapport à sa position de référence z 0, ce qui entraîne la flexion en porte-à-faux d de sa courbure de référence d0. Une force de F = k (d - d 0) est appliquée à l’échantillon, ce qui donne une indentation δ = (z - z 0) - (d - d 0). (C) La rigidité k du porte-à-faux doit être choisie en fonction de l’élasticité attendue du substrat. Le tracé a été obtenu en considérant le contact hertzien avec une indentation de 1 μm, en supposant que l’énergie est également partagée entre la flexion du porte-à-faux et l’indentation du substrat (c.-à-d. d =δ). Plus le rayon de la pointe est grand, plus le porte-à-faux doit être rigide pour atteindre la même indentation pour un substrat avec un E donné. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Caractéristiques morphologiques des courbes F-z. (A) Une expérience réussie permet au segment d’approche d’une courbe F-z d’avoir une ligne de base claire (pointe s’approchant de l’échantillon mais n’étant pas en contact); une région de transition où la pointe entre en contact avec l’échantillon pour la première fois; et une région où la force augmente avec le déplacement, où la pointe indente progressivement l’échantillon. La pente de cette région est proportionnelle à la rigidité apparente du matériau13, ce qui signifie que les courbes appartenant à des biomatériaux rigides (par exemple, gels fortement réticulés) seront plus raides que celles appartenant à des biomatériaux plus mous (par exemple, gels et cellules faiblement réticulés). (B) Une courbe d’approche où l’extrémité n’est jamais entrée en contact avec l’échantillon. Voir dépannage de la méthode dans la discussion pour la résolution. (C) Une courbe d’approche où la pointe a commencé au contact de l’échantillon. Voir dépannage de la méthode dans la discussion pour la résolution. Les données présentées proviennent d’une expérience réalisée sur un hydrogel PAAm mou de E 0,8 kPa35 attendu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Workflow d’analyse de données à l’aide des interfaces graphiques Python. (A) Un exemple d’ensemble de données de courbes F-z acquis à l’aide d’un nanopénétrateur de virole disponible dans le commerce sur un hydrogel PAAm mou (E 0,8 kPa35 attendu) a été téléchargé dans NanoPrepare. Les courbes qui ne suivent pas la forme décrite à la figure 4A sont exclues du jeu de données, et le jeu de données propre et les métadonnées associées sont enregistrés en tant que fichier JSON standard. (B) Le jeu de données propre est téléchargé dans la deuxième interface graphique (NanoAnalysis) où les courbes peuvent être filtrées en appliquant un ou plusieurs filtres pour éliminer le bruit (voir Discussion, étapes critiques dans le protocole). De plus, un algorithme CP est sélectionné pour localiser automatiquement le CP pour toutes les courbes (voir Discussion, étapes critiques dans le protocole). L’analyse de Hertz est ensuite effectuée, donnant une courbe F-δ pour chaque indentation, qui est ajustée avec le modèle Hertz pour donner un nuage de points de E. Les résultats obtenus peuvent être enregistrés pour un traçage ultérieur. Pour les cellules, une analyse supplémentaire appelée spectres d’élasticité24 peut être effectuée. Tous les graphiques présentés ont été directement exportés à partir des interfaces graphiques NanoPrepare et NanoAnalysis. Les détails pour chaque étape du flux de travail sont donnés dans le texte principal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Élasticité des hydrogels PAAm. (A) Courbe moyenne F-δ à partir d’un ensemble de ~100 courbes acquises sur un hydrogel PAAm mou (attendu E 0,8 kPa 35) et un hydrogel PAAm rigide (E 8 kPa35 attendu). Les lignes pleines montrent la bande moyenne et la bande ombrée montre un écart-type. La ligne pointillée montre le modèle Hertz tracé à l’aide de la moyenne E du logiciel NanoAnalysis, obtenue en ajustant le modèle Hertz à chaque courbe jusqu’à une indentation maximale de 2 000 nm (~4% de R, R = 52 μm, k = 0,46 N/m). Les courbes ont été lissées à l’aide du filtre de prominence avec les paramètres par défaut, et le CP a été identifié à l’aide de l’algorithme RoV32. (B) Valeurs individuelles de E obtenues à partir de l’analyse effectuée en nanoanalyse tracées à des fins de comparaison statistique. Le diagramme de nuages de pluie a été obtenu à l’aide du module Python décrit dans la référence39. p < 0,0001, test t bilatéral non apparié, α=0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Élasticité des cellules HEK293T. (A) Courbe moyenne F-δ à partir d’un ensemble de ~200 courbes acquises sur six cellules HEK293T individuelles. La ligne bleue continue montre la moyenne et la bande ombrée montre un écart-type. La ligne pointillée montre le modèle Hertz tracé à l’aide de la moyenne E calculée à l’aide du logiciel NanoAnalysis, obtenue en ajustant le modèle Hertz à chaque courbe jusqu’à une indentation maximale de 200 nm (~6% de R, R = 3,5 μm, k = 0,02 N/m). Les courbes ont été lissées à l’aide du filtre de prominence avec paramètres par défaut et d’un filtre SAVGOL34 avec un ordre 3 et une longueur de fenêtre de 80 nm, et le CP a été identifié à l’aide de l’algorithme de seuil33. En utilisant le modèle de Hertz, la cellule est traitée comme une sphère homogène avec le module E de Young, comme le montre schématiquement l’encart (le noyau est représenté à des fins picturales). (B) Spectres d’élasticité moyens calculés sur le même ensemble de données décrit au point (A). La ligne rouge continue montre la moyenne et la bande ombrée montre un écart-type. En ajustant un modèle bicouche aux spectres d’élasticité moyens, des estimations de E 0, Eb et d0 sont calculées. Pour l’ensemble de données indiqué : E 0= 5,79 ± 0,09 kPa, Eb= 0,539 ± 0,002 kPa et d0 = 311 ± 3 nm (moyenne ± écart-type). (C) Comparaison entre le modèle Hertz et l’approche des spectres d’élasticité en termes de distribution E. Pour les spectres d’élasticité, la distribution représente les valeurs de E à partir des spectres d’élasticité moyens, quelle que soit la profondeur d’indentation (jusqu’à une indentation maximale de 200 nm). Les lignes continues superposées aux histogrammes sont des estimations de densité de noyau gaussien des distributions sous-jacentes. E = 915 ± 633 Pa (Hertz) et E = 890 ± 297 Pa (spectres d’élasticité) (moyenne ± écart-type). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.  

Figure S1 : Procédure d’étalonnage. (A) Balayage réussi de longueur d’onde. La déviation du porte-à-faux et les signaux de déplacement piézoélectriques pendant le balayage de longueur d’onde (à gauche). L’onde sinusoïdale sur l’écran de l’interféromètre à la fin du balayage de longueur d’onde (à droite). (B) Trouver la procédure de surface. La déviation de Cantilever et le déplacement de Piezo signalent que la sonde est abaissée par pas de 1 μm après contact avec un substrat rigide. (C) Calibrage des facteurs géométriques. Lors de l’indentation d’un substrat rigide, la déviation du porte-à-faux suit le déplacement du porte-à-faux (lignes vertes et bleues, respectivement). L’indentation doit être approximativement nulle (ligne rouge). Si la déviation retarde le déplacement dans le temps (ligne pointillée verte), la sonde n’est pas complètement en contact avec le substrat rigide. D) Signal de démodulation. Le signal de démodulation sur l’écran de l’interféromètre à la fin de la procédure d’étalonnage (à gauche) et lors du tapotement sur le nanopénétrateur (à droite). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S2 : Interface graphique de NanoReady. Captures d’écran de l’interface graphique de NanoReady. Les détails sur la fonctionnalité de chaque widget sont donnés dans le protocole principal et la discussion. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S3 : Interface graphique de NanoAnalysis. Captures d’écran de l’interface graphique de NanoAnalysis. Les détails sur la fonctionnalité de chaque widget sont donnés dans le protocole principal et la discussion. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Note supplémentaire 1 : Ajout de filtres personnalisés et d’algorithmes CP au logiciel NanoAnalysis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Protocole additionnel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S4 : Dépendance en profondeur des spectres d’élasticité moyenne. Le graphique montre les spectres d’élasticité moyens δ)> (ligne rouge continue) ainsi qu’un écart-type (σ(E(δ)). Après une désintégration initiale, les spectres d’élasticité moyens commencent à augmenter, ce qui est principalement associé aux effets du substrat sous-jacent rigide sur le module d’élasticité apparent sondé. La profondeur d’indentation maximale utilisée pour ajuster le modèle Hertz aux courbes F-δ et le modèle de désintégration aux spectres d’élasticité moyens doivent être choisis de manière à ce que le substrat sous-jacent n’affecte pas les résultats (plage d’ajustement). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce protocole montre comment acquérir de manière robuste des données de nanoindentation par spectroscopie de force à l’aide d’un nanopénétrateur de virole disponible dans le commerce sur des hydrogels et des cellules individuelles. En outre, des instructions pour l’utilisation d’un logiciel open-source programmé en Python comprenant un flux de travail précis pour l’analyse des données de nanoindentation sont fournies.

Étapes critiques du protocole
Les étapes suivantes ont été identifiées comme étant particulièrement importantes pour suivre ce protocole.

Préparation des échantillons

Il est crucial qu’avant de commencer les mesures, l’échantillon soit préparé en gardant à l’esprit les contraintes de la mesure. C’est-à-dire que l’échantillon doit être collé à une surface et être aussi plat que possible. Ceci est particulièrement important lors de la préparation d’échantillons qui n’adhèrent pas naturellement aux surfaces comme le font les cellules, comme les hydrogels. Tout d’abord, l’échantillon ne doit pas flotter dans la solution car cela interférerait avec les mesures et pourrait endommager la sonde. Pour cela, la fonctionnalisation chimique d’une lamelle de couverture est recommandée, de sorte que l’hydrogel puisse être polymérisé collé à une surface, qui peut ensuite être collée à une boîte de Petri en immersion. De plus, la surface de l’échantillon doit être aussi plate que possible pour assurer une détection de surface cohérente par la sonde et éviter d’endommager la sonde lors du déplacement en x et y lors d’un balayage matriciel. La solution d’hydrogel peut être polymérisée sur une lame de verre hydrophobe, ce qui rend l’hydrogel résultant plat sans y adhérer. Si ces considérations ne sont pas suivies, il sera difficile d’obtenir des données F-z propres.

Dans le cas de la préparation cellulaire, il est préférable d’indenter des cellules ayant une morphologie similaire pour améliorer l’homogénéité des données. Dans le cas où les cellules se développent dans une population hétérogène, une étape de famine sérique peut être introduite avant la mesure, pour faciliter la synchronisation du cycle cellulaire et, par conséquent, éliminer les facteurs de confusion expérimentaux potentiels40,41. Dans le cas de cellules non adhérentes ou de cultures organoïdes, il faut effectuer des étapes supplémentaires pour assurer la stabilité et l’adhérence de l’échantillon biologique pendant les mesures. Des étapes supplémentaires pourraient inclure la liaison chimique des cellules à des plaques de culture ou l’utilisation d’adhésifs tissulaires qui sont maintenant largement disponibles dans le commerce.

Expériences de nanoindentation

Il est important qu’un porte-à-faux avec le k droit soit choisi en fonction de l’échantillon attendu E15. En effet, si le porte-à-faux est trop rigide, l’échantillon sera indenté, mais aucune flexion significative du porte-à-faux ne se produira. Inversement, si le porte-à-faux est trop mou par rapport à l’échantillon, le porte-à-faux se pliera excessivement avec une indentation minimale. Dans les deux cas, E sera erroné dans l’analyse subséquente.

Pour l’étalonnage de la sonde, la sonde doit être mouillée avant d’être insérée dans le boîtier d’étalonnage afin de minimiser la tension superficielle lorsqu’elle rencontre le liquide de la boîte d’étalonnage. Ne pas le faire peut provoquer le piégeage des bulles d’air ou pousser le porte-à-faux contre la fibre optique. Cela peut également endommager la sonde.

L’utilisation d’une boîte de Petri en verre épais est recommandée pour l’étalonnage. Le verre est infiniment rigide par rapport au porte-à-faux, ce qui permet un étalonnage précis du k du porte-à-faux tout en indentant le verre. De plus, le poids du verre assure un substrat stable et plus résistant au bruit (par exemple, le flux d’air et les vibrations acoustiques) par rapport à une boîte de Petri en plastique plus légère. L’étalonnage effectue une procédure de linéarisation du signal interférométrique mesuré au niveau du détecteur (V/t), ce qui signifie que le signal sera converti en flexion linéaire en porte-à-faux (μm/t) en utilisant le cercle unité (cercle de démodulation) comme outil de linéarisation18. La sensibilité de déflexion (μm/V) est réglée par défaut dans l’interféromètre et utilisée pour convertir V en μm. Au cours de cette procédure, le facteur d’étalonnage est également déterminé, qui provient de l’inadéquation de la position entre la pointe sphérique et la position de la fibre où la lecture du signal se produit (Figure 3A). En indentant sur un verre rigide semblable à un substrat, la déviation mesurée par la fibre est approximativement la même que la distance déplacée par le piézo, ce qui signifie que la profondeur d’indentation est approximativement nulle. En prenant leur ratio, on obtient le facteur d’étalonnage. Il est important que l’étalonnage de l’instrument soit effectué correctement et que toutes les vérifications soient effectuées avant de continuer à acquérir des données F-z .

Lors de la configuration d’un profil d’indentation, il est utile de garder à l’esprit les hypothèses du modèle Hertz, qui seront utilisées ultérieurement pour analyser les données. Le modèle de Hertz est dérivé en supposant que l’échantillon est un demi-espace LEHI infiniment étendu, ce qui entraîne les conséquences pratiques suivantes: i) les déformations appliquées ne doivent pas dépasser 20% (en règle générale, δ ne doivent pas dépasser 10% du R de la pointe) et ii) δ doivent être inférieures à 10% de l’épaisseur de l’échantillon et petites par rapport aux dimensions de l’autre échantillon13.

Le déplacement maximal (ou la profondeur/force d’indentation selon le mode de fonctionnement) peut être ajusté en fonction de la δ résultante et si des propriétés mécaniques de surface ou de masse sont souhaitées. Si l’échantillon a été mis en retrait à un δ légèrement plus grand, le modèle Hertz peut toujours être ajusté jusqu’à un δ maximal qui se trouve dans ses hypothèses dans le logiciel NanoAnalysis, et le SE moyen utilisé pour estimer cette plage (voir Résultats représentatifs).

Pour les expériences de nanoindentation cellulaire, il est difficile d’effectuer plusieurs balayages matriciels sur la même cellule. Cependant, si la cellule est suffisamment grande, il peut être possible de trouver une autre région appropriée et de répéter la procédure sur la même cellule, par exemple, une expérience où l’utilisateur veut détecter des différences dans les propriétés mécaniques d’une certaine région de la cellule par rapport à une autre. Habituellement, une carte par cellule est effectuée, et un minimum de cinq cellules sont indentées par condition biologique. Il est conseillé de répéter l’expérience au moins trois fois afin d’obtenir suffisamment de données sur chaque échantillon (c.-à-d. trois répétitions pour chaque condition biologique).

De manière critique, les courbes acquises devraient présenter une ligne de base plate, une région de transition et une région inclinée. Les courbes qui ne présentent pas de référence ne peuvent pas être analysées ultérieurement en raison de l’incertitude quant à l’emplacement de la PC. Si les courbes s’écartent de la forme illustrée à la figure 4A, le seuil de contact doit être optimisé avant de poursuivre l’expérience (voir dépannage de la méthode ci-dessous).

Des données suffisantes doivent être acquises pour garantir des résultats statistiquement robustes, compte tenu de la nature de la technique, qui sonde localement les propriétés mécaniques.

Analyse des données

Le logiciel décrit dans ce protocole est couramment adopté pour analyser les données de nanoindentation et il a été utilisé pour obtenir des résultats publiés dans plusieurs revues à comité de lecture (par exemple, nanoindentation d’hydrogels8,21, nanoindentation de cellules24,42). L’analyse des données de nanoindentation n’est pas triviale. Il est suggéré d’accorder une attention particulière aux parties suivantes:

Criblage de l’ensemble de données : L’ensemble de données doit être soigneusement examiné dans le logiciel NanoPrepare et toutes les courbes infructueuses doivent être supprimées avant d’enregistrer l’ensemble de données nettoyé en tant que fichier JSON. Les courbes peuvent toujours être exclues de l’analyse dans le logiciel NanoAnalysis, mais le fichier JSON ne peut pas être modifié. En tant que tel, pour assurer la cohérence entre l’ensemble de données nettoyé et analysé, il est suggéré d’effectuer soigneusement le processus de criblage dans le logiciel NanoReady.

Filtrage des données : L’utilisation de filtres est utile lorsque les données sont bruyantes et recommandée lors de l’exécution de l’analyse SE. Trois filtres principaux sont utilisés comme décrit ci-dessous.

Proéminence: Ce filtre supprime les pics proéminents dans l’espace de Fourier, afin d’éliminer les oscillations instrumentales typiques des nanopénétrateurs à tige de virole disponibles dans le commerce. Le filtre est basé sur trois paramètres: Proéminence (a.u.): la proéminence maximale dans l’espace de Fourier; Fréquence minimale (canaux): la fréquence minimale à filtrer; Bande (% de la position du pic): largeur autour de la fréquence filtrée en pourcentage de la position du pic. Activez ce filtre pour les données provenant de nanopénétrateurs de virole disponibles dans le commerce en cochant la case et en laissant les paramètres par défaut.

Savitzky Golay (SAVGOL), algorithme de la bibliothèque SciPy34 (scipy.signal.savgol_filter): Ce filtre lisse les données sur la base d’une approximation polynomiale locale des moindres carrés. Activez ce filtre si les données sont particulièrement bruyantes. Modifiez l’ordre du polynôme et la longueur de la fenêtre de filtre dans l’interface graphique en fonction du niveau de bruit des données. Pour plus de détails, voir les références30,31. Activez ce filtre pour l’analyse SE.

Filtre médian, algorithme de la bibliothèque SciPy34 (scipy.signal.medfilt) : Ce filtre lisse les données en remplaçant chaque point par la médiane calculée autour de ce point dans une fenêtre donnée. Modifiez la longueur de la fenêtre dans l’interface graphique en fonction du niveau de bruit des données. Ce filtre est utilisé comme alternative au filtre SAVGOL.

L’activation du filtre de proéminence permet d’éliminer le bruit instrumental (oscillations à basse fréquence) typique des nanopénétrateurs commerciaux à dessus de virole. En général, il n’est pas nécessaire d’activer d’autres filtres tels que le SAVGOL34 lors de l’analyse Hertz simple. Lors du calcul de l’ES, il est recommandé d’activer à la fois le filtre de proéminence et le filtre SAVGOL34, avec une fenêtre de lissage en fonction du niveau de bruit présent dans les données. En effet, l’ES contient un terme dérivé (équation 2), qui est très sensible au bruit. Par exemple, les résultats de la figure 7 ont été obtenus en utilisant le filtre de proéminence associé à un filtre SAVGOL34 avec fenêtre 80 nm et ordre polynomial 3. Cependant, il est important de ne pas trop lisser les données, car cela pourrait masquer les différences présentes entre les ensembles de données.

Identification CP: La partie la plus importante de l’analyse est l’identification de la CP, qui influence fortement à la fois la valeur absolue de E et sa distribution32,33. Quatre algorithmes basés sur des procédures de recherche automatique qui localisent le CP afin d’éliminer les biais humains ont été implémentés dans le logiciel NanoAnalysis. Tous les algorithmes ont été documentés dans la littérature32,33. En général, chaque point d’une région d’intérêt est testé en tant que CP d’essai pendant qu’un paramètre spécifique à l’algorithme est calculé. Le point qui renvoie le paramètre optimisé, qui peut être sa valeur maximale ou minimale selon l’algorithme, est pris comme CP32. Ces procédures ont été mises en œuvre pour éliminer les préjugés humains et adopter une approche statistique du problème. Étant donné que chaque algorithme calcule le CP en fonction de l’optimisation d’un paramètre donné, le CP identifié sera légèrement différent pour chaque algorithme. En tant que tel, il est primordial de maintenir le même algorithme CP et des paramètres spécifiques (par exemple, la longueur de la fenêtre pour l’algorithme RoV) entre les ensembles de données que l’on veut comparer, car les différences relatives dans E seront préservées. Les différents algorithmes CP et leurs paramètres sont résumés ci-dessous.

Goodness of Fit (GoF): Une approche basée sur l’ajustement d’un modèle de mécanique de contact (Hertz) de chaque paire (z, F) dans une région d’intérêt et la sélection de l’ajustement ayant la valeur R2 la plus élevée. Cela fonctionne bien lorsque la transition entre le non-contact et le contact est évidente, ce qui se produit avec des matériaux rigides tels que les hydrogels hautement réticulés. L’algorithme est coûteux en calcul, et généralement le plus lent. Ici, il a été mis en œuvre de manière à ce que le modèle Hertz ne soit monté qu’à un δ maximum d’environ 10% de R, car il a été démontré que cela donnait des résultats plus précis32.

Rapport des variances (RoV): Une approche basée sur le calcul du rapport de la variance du signal de déviation (force) dans la région sans contact et la région de contact32.

Deuxième dérivée: Une approche basée sur la dérivée seconde du signal de déviation (force)33. Cela fonctionne bien lorsque le signal est propre. Si le signal est trop bruyant, cette approche n’est pas recommandée.

Seuil: Une approche basée sur la déviation moyenne (force) dans la région sans contact33. En bref, à partir d’une valeur de force sélectionnée par l’utilisateur près de la région de contact, l’algorithme itére à travers chaque point vers la ligne de base, jusqu’à trouver le premier point dont la valeur de force est supérieure à la moyenne de la ligne de base. Ce point est sélectionné comme CP. Cet algorithme est très robuste et est celui recommandé à utiliser.

Les détails sur la façon d’utiliser chaque algorithme sont donnés ci-dessous. Les algorithmes CP impliquent des constantes numériques qui doivent être modifiées dans l’interface graphique pour s’adapter à l’ensemble de données spécifique. Plus précisément, les paramètres suivants sont communs au GdF, au RoV et à la méthode de la dérivée seconde, ce qui permet de sélectionner une sous-région des courbes (région d’intérêt ou ROI) où le CP sera recherché :

Seuil de sécurité (nN): Il définit la force maximale en nN (et le point z correspondant) à partir de laquelle le CP sera recherché. Il s’agit de la limite droite du ROI, dont la valeur par défaut est de 10 nN. Toutes les courbes dont la force maximale est inférieure à ce seuil seront automatiquement déplacées vers l’ensemble ayant échoué. Remplacez cette valeur par une valeur de force légèrement supérieure à la transition de non-contact à contact.

Plage X (nm) : Elle définit la plage en nm à partir du point z correspondant au seuil de sécurité. C’est la limite gauche du ROI. La valeur par défaut de 1 000 nm est un bon point de départ, mais si le CP est trouvé trop tard dans la courbe (c’est-à-dire dans la région inclinée), augmentez cette valeur. Inversement, si la PC est détectée trop tôt (c.-à-d. dans la ligne de base), diminuez cette valeur.

Les paramètres spécifiques à chaque algorithme sont résumés ici. Pour le GoF, le Window Fit (nm) représente la fenêtre en nm à partir du CP d’essai auquel le modèle Hertz est installé. Celle-ci est plafonnée à une valeur de 10 % de R. Pour le RoV, le RoV fenêtre (nm) représente la fenêtre en nm à gauche et à droite de la CP d’essai sur laquelle la variance du signal de déviation (force) est calculée. Pour la deuxième dérivée, la fenêtre P (nm) représente la fenêtre passée au filtre SAVGOL34 utilisé pour calculer la dérivée seconde du signal de déviation (force). Les valeurs par défaut ont été définies à partir du test des différents algorithmes et il n’est généralement pas nécessaire de les modifier.

Pour l’algorithme de seuil, les paramètres suivants peuvent être modifiés :

Seuil d’alignement (nN) : Force (F0) à partir de laquelle le CP sera recherché à partir de ce point et se déplaçant vers la ligne de base. Toutes les courbes dont la force maximale est inférieure à ce seuil seront automatiquement déplacées vers l’ensemble défaillant. Sa valeur par défaut est 10 nN ; Toutefois, remplacez cette valeur par une valeur de force légèrement supérieure à la transition de non-contact à contact. Le point z correspondant (z0) est stocké pour une utilisation ultérieure dans l’algorithme (voir ci-dessous).

Aligner l’étape gauche (nm) : Ce paramètre définit le décalage à ajouter à gauche de z 0 (valeur par défaut 2 000 nm), ce qui entraîne le calcul d’un point défini par (z 0 - aligner l’étape à gauche). Ce point est le point autour duquel la moyenne de la ligne de base sera calculée (voir ci-dessous).

Surface moyenne (nm) : Ce paramètre définit la surface moyenne à gauche et à droite de (z0 - aligner l’étape gauche), sur laquelle la moyenne de la ligne de base sera calculée. Sa valeur par défaut est 100 nm et il n’est pas nécessaire de la modifier.

En itérant à partir de F0, le CP est considéré comme le premier point dont la valeur est supérieure à la force définie par la moyenne de la ligne de base.

Note sur le SE et le bruit: Le ES moyen peut sembler bruyant au début avec des oscillations sinusoïdales proéminentes, et par conséquent l’équation (3) peut ne pas s’adapter correctement. Si tel est le cas, augmenter la fenêtre du filtre de lissage SAVGOL34 résout généralement ce problème.

Modifications et dépannage de la méthode

Dépannage de la méthode

Résolution des problèmes liés à l’analyse de longueur d’onde
Si un message d’erreur apparaît sur l’écran de l’interféromètre après avoir effectué le balayage de longueur d’onde, les problèmes suivants peuvent en être la cause: i) L’environnement peut être contaminé par le bruit. Débarrassez-vous de toutes les sources de bruit, y compris le flux d’air, les bruits forts et les vibrations mécaniques; ii) La sonde peut ne pas être correctement connectée. Débranchez et rebranchez le connecteur de fibre optique vert; iii) Le porte-à-faux peut être sale. Nettoyez-le en immergeant la sonde dans une boîte de Petri contenant de l’isopropanol pendant quelques minutes, puis arrosez; iv) Une bulle d’air peut être présente sur le porte-à-faux. Immerger la sonde dans une boîte de Petri contenant de l’isopropanol et créer un écoulement en pipetant le liquide de haut en bas; v) Le porte-à-faux peut être plié / collé à la fibre, ce qui peut être vu au microscope. Relâchez-le en touchant doucement le porte-à-faux avec une lingette en tissu. Prenez des précautions supplémentaires lorsque vous touchez le porte-à-faux, car l’application d’une force excessive peut le briser; vi) Le porte-à-faux est absent de la sonde, qui peut être vue au microscope. La seule solution est d’utiliser une nouvelle sonde. Essayez à nouveau le balayage de longueur d’onde, qui devrait maintenant réussir.

Dépannage de l’étalonnage
Si l’étalonnage échoue et que le nouveau facteur est NaN ou n’est pas dans la plage attendue, les problèmes suivants peuvent en être la cause: i) La pointe n’est pas complètement en contact avec le substrat. Assurez-vous que l’embout est en contact avec le substrat en suivant les étapes indiquées dans le protocole; ii) Les forces d’attraction entre la pointe et la surface du verre (comportement encliquetable) entraînent l’étalonnage du porte-à-faux surplié. Nettoyez la sonde en la pressant d’isopropanol pendant 5 minutes, puis arrosez. Nettoyez la vaisselle avec de l’isopropanol; iii) La pointe / boîte peut être contaminée: Nettoyez la sonde en la subordonnant dans de l’isopropanol pendant 5 minutes, puis arrosez. Nettoyez la vaisselle avec de l’isopropanol; iv) Le porte-à-faux peut être plié/collé à la fibre. Relâchez-le en le touchant doucement avec une lingette en tissu. Répétez le balayage de longueur d’onde et l’étalonnage après le dépannage.

Dépannage des contacts
Si les courbes s’écartent de la forme illustrée à la figure 4A, les paramètres expérimentaux doivent être ajustés avant de poursuivre l’expérience. Deux des problèmes les plus courants sont:

Courbe d’approche où la pointe n’entre jamais en contact avec l’échantillon (figure 4B). Cela se produit lorsque le seuil de contact est défini sur une valeur trop basse et que le bruit fait plier le porte-à-faux d’une quantité correspondant au seuil donné. Pour résoudre ce problème, accédez au menu Options et augmentez lentement le seuil aux pas de 0,01 et effectuez une indentation jusqu’à ce que la courbe ressemble à celle illustrée à la figure 4A. Diminuer la vitesse dans le même menu peut également aider à résoudre ce problème.

Courbe d’approche où la pointe a commencé au contact de l’échantillon (figure 4C). Cela se produit lorsque le seuil de contact est défini sur une valeur trop élevée et que le porte-à-faux ne se plie pas de la quantité correspondant au seuil donné lors du premier contact avec l’échantillon. Pour résoudre ce problème, diminuez lentement le seuil dans le menu Options à des pas de 0,01 et effectuez une indentation jusqu’à ce que la courbe ressemble à celle illustrée à la figure 4A. Cette question est particulièrement problématique parce que l’absence d’une base de référence empêche le calcul correct de la CP, ce qui conduit finalement à une erreur de calcul de E.

Modifications de la méthode
Le protocole peut être étendu pour quantifier le E de différents types d’hydrogels. Les hydrogels PAAm ont été choisis pour ce protocole car ce sont les hydrogels les plus couramment utilisés dans le domaine de la mécanobiologie. Cependant, le protocole est également applicable à tout type d’hydrogelélastique 25, à la fois synthétique, par exemple, le polyéthylène-glycol (PEG)43 et la gélatine méthacryloyl (GelMA)44,45; et naturel, comme le collagène46. De plus, il n’y a pas de contraintes sur les dimensions de l’échantillon à tester, dans des limites raisonnables. Par exemple, ce protocole a été utilisé pour quantifier le E des hydrogels de PEG synthétiques qui ont ensuite été testés à l’aide d’un rhéomètre en vrac et devaient avoir ~15 mm de diamètre et ~2 mm d’épaisseur8. Le protocole a également été mis en œuvre pour caractériser le E des membranes PDMS qui ont été polymérisées dans une boîte de Petri (résultats non publiés).

Outre l’indentation standard de cellules individuelles réalisée à l’aide d’un microscope conventionnel à contraste de phase inversé, les nanopénétreurs à feuilles de virole sont compatibles avec les systèmes d’imagerie complexes et ont été utilisés pour sonder les structures subcellulaires d’élasticité locale, telles que le noyau et le cytoplasme de la cellule47. Alors que les étapes devront être ajustées en fonction du système optique spécifique, ce protocole est d’application générale en ce qui concerne la réalisation d’expériences de nanoindentation et l’analyse des données résultantes.

En outre, le protocole ne se limite pas à la mesure des propriétés mécaniques des cellules et des hydrogels et peut être adapté pour mesurer les propriétés élastiques locales de systèmes plus complexes, y compris les organoïdes48, les sphéroïdes49 et les tissus entiers tels que les reins, le foie, la rate et l’utérus23. Le lecteur est dirigé vers les références 23,48,49 pour les spécificités sur la réalisation d’expériences de nanoindentation sur de tels échantillons. Un aspect à prendre en compte est que le contrôle de déplacement fonctionne en mode boucle ouverte et ne reçoit pas de retour de l’échantillon. En tant que tel, la contrainte / déformation et la vitesse constantes ne sont pas assurées, et les parties plus molles de l’échantillon seront indentées plus et plus rapidement par rapport aux régions plus rigides. Ceci est pertinent pour les échantillons mécaniquement hétérogènes tels que les tissus, où il est plus approprié de choisir soit le contrôle de l’indentation (mode I) ou le contrôle de la charge (mode P), garantissant une contrainte/déformation et une vitesse constantes dans les régions mécaniquement hétérogènes de l’échantillon.

Limites de la méthode
Il existe de plus en plus de preuves que la viscoélasticité, en plus de l’élasticité, joue un rôle important dans la régulation des processus physiologiquement et pathologiquement pertinents. En effet, les cellules, l’ECM et les tissus sont viscoélastiques et que l’élasticité ne représente qu’une composante de leur comportement mécanique50,51,52,53. Alors que les nanopénétrateurs à sommet de virole fournissent des fonctionnalités pour caractériser la viscoélasticité, y compris la relaxation des contraintes, la conformité au fluage et l’analyse mécanique dynamique pour extraire à la fois le module de stockage et de perte sur différents régimes de fréquence (temps), ce protocole se concentre uniquement sur l’élasticité, qui reste la variable mécanique la plus étudiée dans le contexte de la mécanobiologie et de l’ingénierie tissulaire (par exemple, voir référence3).

L’hypothèse sous-jacente avec des conséquences à la fois sur les expériences et l’analyse des données est que le substrat indenté se comporte comme un solide LEHI. Cela signifie que la réponse contrainte-déformation est linéaire, qu’il n’y a pas de comportements dépendants du temps et que l’échantillon est mécaniquement homogène et isotrope. Sur la base de ces hypothèses, les propriétés mécaniques du substrat sont quantifiées par le module de Young suivant un modèle de mécanique de contact spécifique, dans ce cas, le modèle de Hertz (équation 1). Pour les petites forces/déformations quasi statiques, les hydrogels chimiquement réticulés tels que les gels PAAm utilisés dans ce protocole35 se comportent presque comme les solides élastiques et les effets viscoélastiques sont minimes et négligeables53. D’autre part, les cellules ne sont pas des solides LEHI et présentent un comportement mécanique complexe9. Le module de Young des cellules dépend fortement de la vitesse de déformation (c’est-à-dire la vitesse) de la procédure d’indentation, cependant, aucune tendance claire n’est établie et des variables supplémentaires telles que la taille de la pointe et la profondeur d’indentation maximale influencent cette relation9. Néanmoins, pour les déformations quasi-statiques, telles que celles utilisées dans ce protocole (v = 5 μm/s), les cellules présentent une réponse élastique marquée et les effets dissipatifs sont minimes9. La dépendance au taux de déformation peut être saisie par des modèles plus complexes tenant compte des variables dépendantes du temps, auxquelles le lecteur est renvoyé54.

De plus, en suivant la même hypothèse sous-jacente, le ratio de Poisson (ν) est considéré comme 0,5 à la fois dans l’analyse de Hertz et de ES. Lors de la comparaison entre les échantillons, cela n’a d’incidence que sur les résultats en tant que coefficient; Cependant, il a été démontré que ν est une quantité dépendante de la fréquence pour les cellules55 et qu’elle s’écarte de 0,5 pour les hydrogels56.

Une autre limitation du protocole réside dans le fait que le logiciel ne fournit pas de quantification de E par des modèles de mécanique de contact plus sophistiqués. Le modèle Hertz est le modèle de mécanique de contact le plus utilisé dans les expériences AFM et il est extrêmement efficace13,15; Cependant, il ne tient pas compte d’événements plus complexes tels que les forces d’attraction à courte ou à longue portée entre la pointe et l’échantillon. Des modèles plus complexes tels que le modèle Johnson-Kendall-Roberts peuvent capturer ces comportements13, mais ne sont pas implémentés dans le logiciel. Pour un aperçu des différents modèles de mécanique de contact de complexité variable, le lecteur est dirigé vers la référence13.

Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes/alternatives
L’approche la plus courante pour quantifier les propriétés élastiques locales des biomatériaux et des cellules individuelles à l’échelle microscopique est AFM13,14,15,16. Bien qu’il s’agisse d’un instrument puissant et polyvalent, l’AFM nécessite une formation approfondie en raison de sa configuration complexe avant que les utilisateurs puissent effectuer des expériences de manière robuste. Les nanopénétreurs à virole offrent une solution plug-and-play tout en permettant d’appliquer des forces nN avec une résolution en μm pour sonder les propriétés mécaniques locales des biomatériaux (par exemple, références 8,19,20,21). Alors qu’il existe des protocoles normalisés pour l’utilisation de l’AFM dans le contexte de la mécanobiologie16 et de l’ingénierie tissulaire14, il n’existe aucun protocole détaillant le fonctionnement des dispositifs de nanopénétrateur à dessus de la virole. Ce protocole permet à un utilisateur inexpérimenté d’effectuer des expériences de nanoindentation sur des hydrogels et des cellules, en suivant des directives destinées à normaliser le flux de travail expérimental au sein de la communauté. De plus, l’analyse des données des expériences de nanoindentation n’est pas triviale et resterait largement inaccessible pour les utilisateurs sans expérience en programmation. Des instructions sont fournies pour l’utilisation d’un logiciel intuitif qui permet de nettoyer et de sauvegarder l’ensemble de données acquis dans un format léger et standard et d’effectuer à la fois l’analyse Hertz standard ainsi que l’analyse ES24 en quelques clics et de manière reproductible.

En suivant ce protocole, on obtient des résultats comparables à ceux obtenus à l’aide de l’AFM, tant pour l’E des hydrogels (résultats de la figure 6 par rapport à ceux de la référence 35) que pour les propriétés mécaniques des cellules (résultats de la figure 7 par rapport à ceux de la référence24) à une fraction de la complexité. La méthode est d’application générale et peut être adaptée à différents types de nanopénétrateurs à condition que certaines étapes soient modifiées en fonction du dispositif spécifique.

Importance et applications potentielles de la méthode dans des domaines de recherche spécifiques
La caractérisation des propriétés élastiques des cellules, des hydrogels et des tissus est une pratique courante dans de nombreux laboratoires de recherche axés sur la mécanobiologie, l’ingénierie tissulaire / médecine régénérative et au-delà3. Ce protocole peut être utilisé pour quantifier les propriétés élastiques de cellules individuelles, d’hydrogels, et adapté aux tissus et aux biomatériaux plus complexes dans le contexte de processus physiologiquement pertinents marqués par une modification des propriétés mécaniques. Par exemple, pour imiter la dynamique de l’ECM natif, il a été démontré que les hydrogels 3D PEG-laminine dégradables permettent aux cellules de remodeler leur environnement, entraînant une diminution du E des gels de ~50% sur une période de 9 jours par rapport aux mêmes gels sans cellules21. Le protocole est d’application générale et n’est pas limité aux échantillons et à la configuration optique décrits dans le présent document. Il est prévu que ce protocole facilitera l’utilisation de nanopénétrateurs dans les laboratoires de recherche axés sur l’étude des propriétés mécaniques en physiologie et en maladie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le CG et le MAGO reconnaissent tous les membres du CeMi. MSS reconnaît son soutien par le biais d’une subvention de programme EPSRC (EP/P001114/1).

GC : logiciel (contribution au développement de logiciels et d’algorithmes), analyse formelle (analyse des données de nanoindentation), validation, investigation (expériences de nanoindentation sur gels de polyacrylamide), curation de données, rédaction (ébauche originale, révision et édition), visualisation (figures et graphiques). MAGO: investigation (préparation d’échantillons de gels et de cellules, expériences de nanoindentation sur cellules), rédaction (ébauche originale, révision et édition), visualisation (figures et graphiques). NA : validation, rédaction (révision et édition). IL: logiciel (contribution au développement de logiciels et d’algorithmes), validation, rédaction (révision et édition); MV : conceptualisation, logiciel (conception et développement de logiciels et d’algorithmes originaux), validation, ressources, rédaction (ébauche originale, révision et révision), supervision, administration de projet, acquisition de financement MSS: ressources, rédaction (révision et révision), supervision, administration de projet, acquisition de financement. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm coverslips VWR 631-1577P
35 mm cell treated culture dishes Greiner CELLSTAR 627160
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
Acrylsilane Alfa Aesar L16400
Ammonium Persulfate Merk 7727-54-0
Bisacrylamide Merk 110-26-9
Chiaro nanoindenter Optics 11 Life  no catologue number
Ethanol general
Fetal bovine serum Gibco 16140071
High glucose DMEM Gibco 11995065
Isopropanol general
Kimwipe Kimberly Clark 21905-026
Microscope glass slides VWR 631-1550P
MilliQ system Merk Millipore ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer Optics11 Life no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um) Optics 11 Life no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um) Optics 11 Life no catologue number
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
RainX rain repellent RainX 26012
Standard petri dishes (90 mm) Thermo Scientific 101RTIRR
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich 110-18-9
Vaccum dessicator Thermo Scientific 531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1) Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional) Microsoft
Python 3 Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional) Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  3. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature. Reviews. Materials. 5, 351-370 (2020).
  4. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: Principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary. Reviews. Systems. Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
  5. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: Forcing tumour progression. Nature Reviews Cancer. 9 (2), 108-122 (2009).
  6. Kubánková, M., et al. Physical phenotype of blood cells is altered in COVID-19. Biophysical Journal. 120 (14), 2838-2847 (2021).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  8. Ciccone, G., et al. What caging force cells feel in 3D hydrogels: A rheological perspective. Advanced Healthcare Materials. 9 (17), 2000517 (2020).
  9. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  10. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering B Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  11. Humphrey, J. D., Delange, S. L. An Introduction to Biomechanics Solids and Fluids, Analysis and Design. , Springer-Verlag. New York. 271-371 (2004).
  12. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  13. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1, 41-57 (2019).
  14. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  15. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  16. Whitehead, A. J., Kirkland, N. J., Engler, A. J. Atomic force microscopy for live-cell and hydrogel measurement. Methods in Molecular Biology. 2299, Clifton, N.J. 217-226 (2021).
  17. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: An optomechanical fiber sensor for nanoindentation. The Review of Scientific Instruments. 83 (11), 115110 (2012).
  18. Van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink Ac, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12 (12), 3066-3073 (2016).
  19. Baldini, F., et al. Biomechanics of cultured hepatic cells during different steatogenic hits. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 97, 296-305 (2019).
  20. Emig, R., et al. Piezo1 channels contribute to the regulation of human atrial fibroblast mechanical properties and matrix stiffness sensing. Cells. 10 (3), 663 (2021).
  21. Dobre, O., et al. A hydrogel platform that incorporates laminin isoforms for efficient presentation of growth factors - Neural growth and osteogenesis. Advanced Functional Materials. 31 (21), 2010225 (2021).
  22. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Scientific Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  23. Wu, G., Gotthardt, M., Gollasch, M. Assessment of nanoindentation in stiffness measurement of soft biomaterials: kidney, liver, spleen and uterus. Scientific Reports. 10 (1), 18784 (2020).
  24. Lüchtefeld, I., et al. Elasticity spectra as a tool to investigate actin cortex mechanics. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 147 (2020).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Blumlein, A., Williams, N., McManus, J. J. The mechanical properties of individual cell spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 7346 (2017).
  27. Mirsandi, H., et al. Influence of wetting conditions on bubble formation from a submerged orifice. Experiments in Fluids. 61, 83 (2020).
  28. Vassalli, M., Ciccone, G. CellMechLab/NanoPrepare: v0.1.1. Zendo. , (2021).
  29. Vassalli, M., Ciccone, G., Lüchtefeld, I. CellMechLab/nanoindentation: v1.0.0. Zendo. , (2021).
  30. Savitzky, A., Golay, M. J. E. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Analytical Chemistry. 36 (8), 1627-1639 (1964).
  31. Schafer, R. W. What is a savitzky-golay filter. IEEE Signal Processing Magazine. 28 (4), 111-117 (2011).
  32. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  33. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis-I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  34. Virtanen, P., et al. SciPy 1.0: fundamental algorithms for scientific computing in Python. Nature Methods. 17 (3), 261-272 (2020).
  35. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 (2010).
  36. Pharr, G. M., Oliver, W. C., Brotzen, F. R. On the generality of the relationship among contact stiffness, contact area, and elastic modulus during indentation. Journal of Materials Research. 7 (3), 613-617 (1992).
  37. Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
  38. Kunda, P., Pelling, A. E., Liu, T., Baum, B. Moesin controls cortical rigidity, cell rounding, and spindle morphogenesis during mitosis. Current Biology: CB. 18 (2), 91-101 (2008).
  39. Allen, M., Poggiali, D., Whitaker, K., Marshall, T. R., Kievit, R. A. Raincloud plots: a multi-platform tool for robust data visualization. Wellcome Open Research. 4, 63 (2019).
  40. Clark, A. G., Paluch, E. Mechanics and regulation of cell shape during the cell cycle. Results and Problems in Cell Differentiation. 53, 31-73 (2011).
  41. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 1524, Clifton, N.J. 97-105 (2017).
  42. Hodgkinson, T., et al. The use of nanovibration to discover specific and potent bioactive metabolites that stimulate osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells. Science Advances. 7 (9), 7921 (2021).
  43. Kloxin, A. M., Kloxin, C. J., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla). 22 (31), 3484-3494 (2010).
  44. Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  45. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  46. Sarrigiannidis, S. O., et al. A tough act to follow: collagen hydrogel modifications to improve mechanical and growth factor loading capabilities. Materials Today. Bio. 10, 100098 (2021).
  47. Karoutas, A., et al. The NSL complex maintains nuclear architecture stability via lamin A/C acetylation. Nature Cell Biology. 21 (10), 1248-1260 (2019).
  48. Ryu, H., et al. Transparent, compliant 3D mesostructures for precise evaluation of mechanical characteristics of organoids. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla). 33 (25), 2100026 (2021).
  49. Carvalho, D. T. O., Feijão, T., Neves, M. I., Da Silva, R. M. P., Barrias, C. C. Directed self-assembly of spheroids into modular vascular beds for engineering large tissue constructs Biofabrication Directed self-assembly of spheroids into modular vascular beds for engineering large tissue constructs. Biofabrication. 13 (3), 035008 (2021).
  50. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  51. Cantini, M., Donnelly, H., Dalby, M. J., Salmeron-Sanchez, M. The plot thickens: The emerging role of matrix viscosity in cell mechanotransduction. Advanced Healthcare Materials. 9 (8), 1901259 (2020).
  52. Elosegui-Artola, A. The extracellular matrix viscoelasticity as a regulator of cell and tissue dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 72, 10-18 (2021).
  53. Chaudhuri, O. Viscoelastic hydrogels for 3D cell culture. Biomaterials Science. 5 (8), 1480-1490 (2017).
  54. Nguyen, T. D., Gu, Y. Determination of strain-rate-dependent mechanical behavior of living and fixed osteocytes and chondrocytes using atomic force microscopy and inverse finite element analysis. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (10), 101004 (2014).
  55. Mokbel, M., Hosseini, K., Aland, S., Fischer-Friedrich, E. The Poisson Ratio of the Cellular Actin Cortex Is Frequency Dependent. Biophysical Journal. 118 (8), 1968-1976 (2020).
  56. Javanmardi, Y., Colin-York, H., Szita, N., Fritzsche, M., Moeendarbary, E. Quantifying cell-generated forces: Poisson's ratio matters. Communications Physics. 4, 237 (2021).

Tags

Bioengineering numéro 179 nanoindentation propriétés mécaniques mécanobiologie mécanique cellulaire élasticité hydrogels matière molle analyse de données
Flux de travail expérimental et d’analyse de données pour la nanoindentation de matière molle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ciccone, G., Azevedo Gonzalez Oliva, … More

Ciccone, G., Azevedo Gonzalez Oliva, M., Antonovaite, N., Lüchtefeld, I., Salmeron-Sanchez, M., Vassalli, M. Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation. J. Vis. Exp. (179), e63401, doi:10.3791/63401 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter