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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Experimenteller und Datenanalyse-Workflow für die Nanoindentation weicher Materie

Published: January 18, 2022 doi: 10.3791/63401
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

Summary

Das Protokoll stellt einen vollständigen Workflow für Experimente zur Nanoindentation weicher Materialien dar, einschließlich Hydrogele und Zellen. Zunächst werden die experimentellen Schritte zur Erfassung von Kraftspektroskopiedaten detailliert beschrieben. Dann wird die Analyse solcher Daten durch eine neu entwickelte Open-Source-Python-Software detailliert, die kostenlos von GitHub heruntergeladen werden kann.

Abstract

Nanoindentation bezieht sich auf eine Klasse von experimentellen Techniken, bei denen eine mikrometrische Kraftsonde verwendet wird, um die lokalen mechanischen Eigenschaften von weichen Biomaterialien und Zellen zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat eine zentrale Rolle in den Bereichen Mechanobiologie, Biomaterialdesign und Tissue Engineering eingenommen, um eine korrekte mechanische Charakterisierung weicher Materialien mit einer Auflösung zu erhalten, die mit der Größe einzelner Zellen (μm) vergleichbar ist. Die beliebteste Strategie, um solche experimentellen Daten zu gewinnen, ist die Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (AFM); Während dieses Instrument eine beispiellose Auflösung in Kraft (bis hin zu pN) und Raum (Sub-nm) bietet, ist seine Verwendbarkeit oft durch seine Komplexität eingeschränkt, die Routinemessungen von integralen Indikatoren mechanischer Eigenschaften wie dem Elastizitätsmodul (E) verhindert. Eine neue Generation von Nanoindentern, wie sie auf der optischen Fasersensortechnologie basieren, hat in letzter Zeit an Popularität gewonnen, da sie sich leicht integrieren lässt und gleichzeitig sub-nN-Kräfte mit μm-Ortsauflösung aufbringen kann, wodurch sie zur Untersuchung lokaler mechanischer Eigenschaften von Hydrogelen und Zellen geeignet sind.

In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung vorgestellt, die das experimentelle Verfahren zur Erfassung von Nanoindentationsdaten auf Hydrogelen und Zellen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanofaser-Sensor-Nanoindenters beschreibt. Während einige Schritte spezifisch für das hier verwendete Instrument sind, kann das vorgeschlagene Protokoll als Leitfaden für andere Nanoindentationsvorrichtungen verwendet werden, vorausgesetzt, einige Schritte werden gemäß den Richtlinien des Herstellers angepasst. Darüber hinaus wird eine neue Open-Source-Python-Software vorgestellt, die mit einer benutzerfreundlichen grafischen Benutzeroberfläche für die Analyse von Nanoindentationsdaten ausgestattet ist, die das Screening von falsch erfassten Kurven, die Datenfilterung, die Berechnung des Kontaktpunkts durch verschiedene numerische Verfahren, die konventionelle Berechnung von E sowie eine erweiterte Analyse ermöglicht, die sich besonders für einzellige Nanoindentationsdaten eignet.

Introduction

Die grundlegende Rolle der Mechanik in der Biologie ist heute etabliert 1,2. Von ganzen Geweben bis hin zu einzelnen Zellen können mechanische Eigenschaften über den pathophysiologischen Zustand des untersuchten Biomaterials 3,4 informieren. Zum Beispiel ist Brustgewebe, das von Krebs betroffen ist, steifer als gesundes Gewebe, ein Konzept, das die Grundlage des beliebten Palpationstests5 ist. Insbesondere wurde kürzlich gezeigt, dass die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, durch Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Blutzellen unterstrichen wird, einschließlich einer verminderten Verformbarkeit der Erythrozyten und einer verminderten Lymphozyten- und Neutrophilensteifigkeit im Vergleich zu Blutzellen von SARS-CoV-2-naiven Personen6.

Im Allgemeinen ist die Mechanik von Zellen und Geweben inhärent miteinander verflochten: Jedes Gewebe hat spezifische mechanische Eigenschaften, die gleichzeitig die Eigenschaften der konstituierenden Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) beeinflussen und von ihnen abhängen5. Aus diesem Grund beinhalten Strategien zur Untersuchung der Mechanik in der Biologie oft technische Substrate mit physiologisch relevanten mechanischen Reizen, um das Zellverhalten als Reaktion auf diese Reize aufzuklären. Zum Beispiel zeigten die bahnbrechenden Arbeiten von Engler und Kollegen, dass die Verpflichtung der mesenchymalen Stammzelllinie durch die Matrixelastizität gesteuert wird, wie an weichen und steifen zweidimensionalen Polyacrylamid (PAAm) -Hydrogelen untersucht7.

Es gibt viele Strategien zur mechanischen Charakterisierung des untersuchten Biomaterials, die in der räumlichen Skala (d.h. lokal bis zur Masse) und in der Art der Verformung (z. B. axial vs. Scherung) variieren und folglich unterschiedliche Informationen liefern, die einer sorgfältigen Interpretation bedürfen 3,8,9,10. Die Mechanik weicher Biomaterialien wird üblicherweise in Form von Steifigkeit ausgedrückt. Die Steifigkeit hängt jedoch sowohl von den Materialeigenschaften als auch von der Geometrie ab, während elastische Module grundlegende Eigenschaften eines Materials sind und unabhängig von der Geometrie des Materialssind 11. Daher beziehen sich verschiedene Elastizitätsmodule auf die Steifigkeit einer bestimmten Probe, und jeder Elastizitätsmodul umfasst den Widerstand des Materials gegen eine bestimmte Verformungsart (z. B. axial vs. Scherung) unter verschiedenen Randbedingungen (z. B. freie Expansion vs. Einschluss)11,12. Nanoindentationsexperimente ermöglichen die Quantifizierung mechanischer Eigenschaften durch das E, das mit einer einachsigen Verformung (Indentation) verbunden ist, wenn das Biomaterial nicht seitlich begrenzt ist10,11,12.

Die beliebteste Methode zur Quantifizierung von E von biologischen Systemen auf der Mikroskala ist AFM13,14,15,16. AFM ist ein extrem leistungsfähiges Werkzeug mit Kraftauflösung bis auf pN-Ebene und räumlicher Auflösung bis in die Sub-nm-Skala. Darüber hinaus bietet AFM extreme Flexibilität in Bezug auf die Kopplung mit komplementären optischen und mechanischen Werkzeugen und erweitert seine Fähigkeiten, eine Fülle von Informationen aus dem untersuchten Biomaterial zu extrahieren13. Diese attraktiven Merkmale sind jedoch mit einer Eintrittsbarriere verbunden, die durch die Komplexität des Versuchsaufbaus dargestellt wird. AFM erfordert umfangreiche Schulungen, bevor Benutzer robuste Daten erfassen können, und seine Verwendung für die tägliche mechanische Charakterisierung biologischer Materialien ist oft ungerechtfertigt, insbesondere wenn seine einzigartige Kraft und räumliche Auflösung nicht erforderlich sind.

Aus diesem Grund hat eine neue Klasse von Nanoindentern in letzter Zeit aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit an Popularität gewonnen, während sie immer noch AFM-vergleichbare Daten mit Sub-nN-Kraftauflösung und μm räumlicher Auflösung bieten, die Kräfte widerspiegeln, die von Zellen über relevante Längenskalen ausgeübt und wahrgenommenwerden 2. Insbesondere Ferrule-Top-Nanoindentationsgeräte, die auf der optischen Fasersensortechnologie17,18 basieren, haben bei Forschern, die auf dem Gebiet der Mechanobiologie und darüber hinaus tätig sind, an Popularität gewonnen; Und eine Fülle von Arbeiten, die über die mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien unter Verwendung dieser Geräte berichten, einschließlich Zellen19,20, Hydrogele8,21 und Gewebe22,23 wurden veröffentlicht. Trotz der Fähigkeit dieser Systeme, lokale dynamisch-mechanische Eigenschaften (d.h. Speicher- und Verlustmodul) zu untersuchen, bleiben quasistatische Experimente mit E die beliebteste Wahl 8,19,20,21. Kurz gesagt, quasistatische Nanoindentationsexperimente bestehen darin, die Probe mit einer konstanten Geschwindigkeit bis zu einem Sollwert einzudrücken, der entweder durch eine maximale Verschiebung, Kraft oder Eindringtiefe definiert ist, und sowohl die Kraft als auch die vertikale Position des Cantilever in sogenannten Kraft-Weg-Kurven (F-z) aufzuzeichnen. F-z-Kurven werden dann durch die Identifizierung des Kontaktpunkts (CP) in Krafteindringkurven (F-δ) umgewandelt und mit einem geeigneten Kontaktmechanikmodell (normalerweise dem Hertz-Modell13) ausgestattet, um E zu berechnen.

Während der Betrieb von Ferrule-Top-Nanoindentern AFM-Messungen ähnelt, gibt es Besonderheiten, die es wert sind, berücksichtigt zu werden. In dieser Arbeit wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur robusten Erfassung von F-z-Kurven aus Zellen und gewebenachahmenden Hydrogelen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanoindenters bereitgestellt, um die Standardisierung experimenteller Verfahren zwischen Forschungsgruppen zu fördern, die dieses und andere ähnliche Geräte verwenden. Darüber hinaus werden Ratschläge gegeben, wie Hydrogelproben und -zellen am besten für die Durchführung von Nanoindentationsexperimenten vorbereitet werden können, zusammen mit Tipps zur Fehlerbehebung entlang des experimentellen Weges.

Darüber hinaus hängt ein Großteil der Variabilität der Nanoindentationsergebnisse (d. H. E und seine Verteilung) von dem spezifischen Verfahren ab, das zur Analyse von Daten verwendet wird, was nicht trivial ist. Um dieses Problem zu lösen, werden Anleitungen zur Verwendung einer neu entwickelten, in Python programmierten Open-Source-Software bereitgestellt, die mit einer benutzerfreundlichen grafischen Benutzeroberfläche (GUI) für die Batch-Analyse von F-z-Kurven ausgestattet ist. Die Software ermöglicht ein schnelles Datenscreening, das Filtern von Daten, die Berechnung des CP durch verschiedene numerische Verfahren, die konventionelle Berechnung von E sowie eine erweiterte Analyse namens Elastizitätsspektren24, die es ermöglicht, den Elastizitätsmodul der Zelle, den Elastizitätsmodul des Aktincortex und die Dicke des Aktinkortex zu schätzen. Die Software kann kostenlos von GitHub heruntergeladen werden und kann leicht angepasst werden, um Daten aus anderen Systemen zu analysieren, indem ein geeigneter Datenparser hinzugefügt wird. Es wird betont, dass dieses Protokoll für andere Ferrule-Top-Nanoindentationsvorrichtungen und andere Nanoindentationsgeräte im Allgemeinen verwendet werden kann, vorausgesetzt, einige Schritte werden gemäß den Richtlinien des spezifischen Instruments angepasst. Das Protokoll ist in Abbildung 1 schematisch zusammengefasst.

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Protocol

1. Vorbereitung von Substraten/Zellen für Nanoindentationsmessungen

  1. Befolgen Sie die im Zusatzprotokoll angegebenen Schritte zur Vorbereitung von PAAm-Hydrogelen/-Zellen für Nanoindentationsexperimente. Das Verfahren ist in Abbildung 2 zusammengefasst.
    HINWEIS: PAAm-Hydrogele wurden ausgewählt, da sie die am häufigsten verwendeten Hydrogele im Bereich der Mechanobiologie sind. Das Protokoll ist jedoch gleichermaßen auf jede Art von Hydrogel25 anwendbar (siehe Diskussion, Änderungen des Verfahrens).

2. Inbetriebnahme des Geräts, Sondenauswahl und Sondenkalibrierung

  1. Befolgen Sie die im Zusatzprotokoll angegebenen Schritte zum Starten des Geräts. Technische Details zum Betrieb von optischen Faser-Ferrule-Top-Nanoindentern finden Sie in diesen Referenzen17,18.
  2. Wählen Sie die Nanoeindringsonde wie unten beschrieben aus.
    HINWEIS: Alle handelsüblichen Sonden, wie sie in diesem Protokoll verwendet werden, sind mit einer kugelförmigen Spitze ausgestattet (Abbildung 3A). Daher beschränkt sich die Auswahl auf zwei Variablen: die Steifigkeit des Auslegers und den Spitzenradius (Abbildung 3B).
    1. Wählen Sie die Steifigkeit eines Auslegers (k in N/m), die der erwarteten Probensteifigkeit entspricht, um beste Ergebnissezu erzielen 15 (siehe Abbildung 3C und Diskussion, kritische Schritte im Protokoll). Wählen Sie für Zellen eine Sonde mit k im Bereich 0,01-0,09 N/m. Wählen Sie für Hydrogele eine Sonde mit k im Bereich von 0,1-0,9 N/m, die optimale Ergebnisse für Gele mit erwartetem E zwischen einigen kPa und 100 kPa liefert (siehe Repräsentative Ergebnisse).
    2. Wählen Sie den Spitzenradius (R in μm) entsprechend der gewünschten räumlichen Auflösung des Eindringvorgangs. Für kleine Zellen wie Human Embryonic Kidney 293T (HEK293T) Zellen (durchschnittlicher Durchmesser von ~10-15 μm26) wählen Sie eine Kugel mit R = 3 μm. Wählen Sie für Hydrogele eine Kugel mit R = 10-250 μm, um die mechanischen Eigenschaften des Biomaterials über eine große Kontaktfläche zu untersuchen und lokale Heterogenitäten zu vermeiden.
    3. Konsultieren Sie Abbildung 3C und alle zusätzlichen Herstellerrichtlinien, um die geeignete Sonde auszuwählen.
  3. Sobald die Sonde ausgewählt wurde, befolgen Sie die Schritte im Zusatzprotokoll , um sie auf dem Nanoindenter zu montieren.

3. Sondenkalibrierung

HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten speziell für Ferrule-Top-Nanoindentationsgeräte, die auf der optischen Fasersensortechnologie basieren, und sind für die Softwareversion 3.4.1 detailliert. Befolgen Sie bei anderen Nanoindentationsgeräten die vom Gerätehersteller empfohlenen Schritte.

  1. Klicken Sie im Hauptfenster der Software auf Initialisieren. Ein Kalibrierungsmenü wird angezeigt. Geben Sie die Sondendetails ein (zu finden auf der Seite der Sondenbox; k in N/m, R in μm und der Kalibrierfaktor in Luft) in den Eingabefeldern.
  2. Bereiten Sie die Kalibrierschale vor: eine dicke Glas-Petrischale mit flachem Boden (siehe Diskussion, kritische Schritte im Protokoll). Füllen Sie die Schale mit dem gleichen Medium wie die Probenschale (dies kann auch Luft sein). Passen Sie die Temperatur des Mediums an die der Probe an.
  3. Legen Sie die Kalibrierschale unter die Sonde. Ziehen Sie die Sonde bei Bedarf aus dem Armhalter des Nanoindringers heraus und halten Sie sie in einer Hand, um Platz für die Platzierung der Kalibrierschale zu schaffen. Schieben Sie die Sonde wieder in Position.
  4. Führen Sie die nächsten beiden Schritte zur Kalibrierung in Flüssigkeit durch. Wenn Sie in Luft messen, verwenden Sie das mitgelieferte Polytetrafluorethylensubstrat für die Kalibrierung und fahren Sie mit Schritt 5 fort.
    1. Befeuchten Sie die Sonde mit einem Tropfen 70% Ethanol unter Verwendung einer Pasteur-Pipette mit dem Ende der Pipette in leichtem Kontakt mit der Glasferrule, damit der Tropfen über den Ausleger und die kugelförmige Spitze27 gleitet (siehe Diskussion, kritische Schritte im Protokoll).
    2. Schieben Sie den Arm des Nanoindringers manuell nach unten, bis die Sonde vollständig eingetaucht ist, aber immer noch weit weg vom Boden der Petrischale. Geben Sie bei Bedarf mehr Medium in die Kalibrierschale. Warten Sie 5 Minuten, bis Gleichgewichtsbedingungen in der Flüssigkeit erreicht sind.
  5. Klicken Sie im Menü Initialisieren der Software auf Scan-Wellenlänge. Der Bildschirm des Interferometers zeigt einen Fortschrittsbalken und das Live-Signal-Fenster der Computersoftware zeigt das in Abbildung S1A links gezeigte Muster an. Um zu überprüfen, ob der optische Scan erfolgreich war, navigieren Sie zum Bereich Wellenlängen-Scan in der Interferometerbox. Bei Erfolg sollte eine Sinuswelle sichtbar sein (Abbildung 1A, rechts). Siehe Diskussion (Fehlerbehebung der Methode), wenn ein Fehler angezeigt wird.
  6. Klicken Sie im Menü Initialisieren auf Oberfläche suchen, wodurch die Sonde schrittweise abgesenkt wird, bis ein eingestellter Schwellenwert in der Biegung des Auslegers erreicht ist. Die Sonde hört auf, sich zu bewegen, wenn Kontakt mit der Glas-Petrischale hergestellt wird.
  7. Prüfen Sie, ob die Sonde mit der Oberfläche in Berührung kommt. Bewegen Sie die Sonde um 1 μm nach unten, indem Sie die Pfeiltaste y nach unten im Hauptfenster der Software verwenden. Beobachten Sie das grüne Signal (Auslenkung des Auslegers) im Live-Fenster der Software für Änderungen der Basislinie bei jedem Schritt, wenn der Ausleger mit dem Substrat in Kontakt kommt (Abbildung S1B). Wenn es keine Änderung gibt, ist der Ausleger nicht in Kontakt (siehe nächster Schritt).
  8. Erhöhen Sie den Schwellenwert im Menü Optionen auf der Registerkarte Oberfläche suchen von seinem Standardwert 0,01 um jeweils 0,01, und wiederholen Sie den Schritt Oberfläche suchen , bis er in Kontakt kommt. Alternativ können Sie die Sonde in kleinen Schritten von 1 μm zum Kontakt bringen, bis sich die grüne Grundlinie bei jedem Schritt nach unten zu verschieben beginnt.
    Hinweis: Erhöhen Sie für die weichsten Ausleger (k = 0,025 Nm-1) den Schwellenwert im Menü Optionen auf der Registerkarte Oberfläche suchen a priori nach dem Ausführen von Schritt 6. Beginnen Sie mit einem Schwellenwert von 0,06 oder 0,07 und erhöhen Sie ihn bei Bedarf auf 0,1. Dies liegt daran, dass Umgebungslärm wahrscheinlich dazu führt, dass sich der Ausleger vor dem Kontakt über den Schwellenwert beugt. Bei weichen Sonden verbessert die Verringerung der Annäherungsgeschwindigkeit (μm/s) im selben Menü ebenfalls das Verfahren.
  9. Klicken Sie im Menü Initialisieren auf Kalibrieren.
  10. Überprüfen Sie das Live-Signal-Fenster der Software und stellen Sie sicher, dass sich sowohl die Verschiebung des Piezos als auch die Auslenkungssignale des Auslegers gleichzeitig nach oben bewegen (Abbildung S1C).
    1. Wenn die Zeit nicht übereinstimmt, ist die Sonde nicht vollständig mit dem Glas in Kontakt. Bewegen Sie die Sonde in Schritten von 1 μm nach unten, bis sich die Grundlinie des Cantilever-Signals ändert (siehe Schritt 7), und wiederholen Sie Schritt 9.
    2. Wenn sich das Cantilever-Signal während des Kalibrierungsschritts überhaupt nicht ändert, ist die Sonde weit von der Oberfläche entfernt. Erhöhen Sie die Kontaktschwelle iterativ (siehe Schritt 8), bis die Oberfläche korrekt gefunden wird, und wiederholen Sie die Kalibrierung von Anfang an, beginnend mit dem Wellenlängenscan.
  11. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die alten und neuen Kalibrierungsfaktoren im angezeigten Popup-Fenster. Wenn der neue Kalibrierfaktor im richtigen Bereich liegt, klicken Sie auf Neuen Faktor verwenden. Wenn die Kalibrierung fehlschlägt und der neue Faktor entweder NaN ist oder nicht im erwarteten Bereich liegt, finden Sie eine Lösung unter Diskussion (Fehlerbehebung der Methode).
    HINWEIS: Der neue Faktor sollte ~n mal niedriger sein als der auf der Sondenverpackung angegebene Faktor, wenn die Kalibrierung in einem flüssigen Medium mit Brechungsindex n ( n = 1,33 für Wasser) durchgeführt wurde. Wenn die Kalibrierung in Luft durchgeführt wurde, sollten die neuen und alten Kalibrierfaktoren ungefähr gleich sein.
  12. Überprüfen Sie, ob der Demodulationskreis wie folgt korrekt kalibriert wurde. Navigieren Sie zur Registerkarte Demodulation auf dem Interferometer-Desktop. Klopfen Sie vorsichtig auf den optischen Tisch oder auf den Nanoindenter, um genügend Rauschen zu erzeugen. Ein weißer Kreis, der aus diskreten Datenpunkten besteht, sollte den roten Kreis ungefähr abdecken (Abbildung S1D).
  13. Wenn sich der weiße Kreis nicht mit dem roten Kreis überschneidet oder eine Warnung auf dem Display des Interferometers angezeigt wird, muss der Demodulationskreis neu kalibriert werden. Dies kann auf zwei Arten erfolgen, wie unten beschrieben.
    1. Tippen Sie kontinuierlich auf den Körper des Nanoindenters, um einen vollständigen Rauschkreis zu induzieren, und drücken Sie die Taste Calibrate (Kalibrieren ) am Interferometer.
    2. Geben Sie Kontakt mit dem Glassubstrat ein und drücken Sie Kalibrieren aus dem Menü Initialisieren des Hauptfensters der Software. Speichern Sie den Kalibrierungsfaktor nicht. Überprüfen Sie an dieser Stelle erneut, und stellen Sie sicher, dass sich der weiße Kreis mit dem roten Kreis überlappt.
      HINWEIS: Wenn das Signal nicht nur leicht vom Demodulationskreis verschoben wird, sondern sehr klein geworden ist oder überhaupt nicht sichtbar ist, bedeutet dies, dass der Cantilever an der optischen Faser haftet. Befolgen Sie die Hinweise zur Fehlerbehebung für dieses Problem (siehe Diskussion, Fehlerbehebung der Methode), und wiederholen Sie entweder die Schritte 13.1 oder 13.2. Sobald der Ausleger wieder in seine horizontale Position zurückkehrt (Abbildung 3A), kehrt das Signal zum Demodulationskreis zurück.
  14. Überprüfen Sie die Kalibrierung, indem Sie direkt nach der Kalibrierung wie unten beschrieben einen Einzug auf dem Glassubstrat durchführen.
    1. Laden oder erstellen Sie eine Testdatei, indem Sie auf Experiment konfigurieren klicken und einen Schritt "Oberfläche suchen " und einen Schritt " Einzug " hinzufügen. Verwenden Sie für den Eindringschritt die Standardeinstellungen für den Verdrängungsmodus und ändern Sie die maximale Verschiebung auf den Kalibrierabstand (3.000 nm), um die Sonde gegen das steife Substrat zu verschieben.
    2. Klicken Sie auf Experiment ausführen und überprüfen Sie den Demodulationskreis im Interferometerfenster. Überprüfen Sie das weiße Signal und stellen Sie sicher, dass es sich während des Einrückens über dem roten Kreis befindet.
    3. Überprüfen Sie die Ergebnisse im Hauptfenster der Software im Zeitdatendiagramm und stellen Sie sicher, dass die Verschiebung des Piezos (blaue Linie) gleich der Auslenkung des Auslegers (grüne Linie) ist, da die Vertiefung in Kontakt beginnt und keine Materialverformung erwartet wird. Wenn die Signale nicht parallel sind, finden Sie weitere Informationen unter Diskussion (Fehlerbehebung bei der Methode).
  15. Ändern Sie den lokalen Pfad im Kalibrierungsmenü, indem Sie den Kalibrierungsspeicherpfad auf ein entsprechendes Verzeichnis setzen.
  16. Wenn die Sonde erfolgreich kalibriert wurde, bewegen Sie den Piezo um 500 μm nach oben.

4. Messung des Elastizitätsmoduls weicher Materialien

  1. Nanoindentation von Hydrogelen
    1. Laden Sie die Petrischale mit der Probe(n) auf den Mikroskoptisch und bewegen Sie die Sonde des Nanoindenters manuell in eine gewünschte x-y-Position über der Probe.
    2. Schieben Sie die Sonde manuell in Lösung, wobei Sie darauf achten, dass in diesem Stadium 1-2 mm zwischen der Sonde und der Probenoberfläche verbleiben. Warten Sie 5 Minuten, bis die Sonde im Medium ausgeglichen ist.
    3. Fokussieren Sie die z-Ebene des Lichtmikroskops so, dass die Sonde deutlich sichtbar ist.
    4. Führen Sie einen einzelnen Einzug durch, um die experimentellen Parameter wie unten beschrieben abzustimmen.
      1. Konfigurieren Sie ein neues Experiment im Hauptfenster der Software. Klicken Sie auf Experiment konfigurieren, um ein neues Fenster zu öffnen. Fügen Sie einen Schritt "Oberfläche suchen " hinzu. Alle Parameter des Schritts Oberfläche suchen können bei Bedarf im Menü Optionen der Software geändert werden.
        HINWEIS: Die Suchfläche senkt die Sonde ab, bis die Oberfläche gefunden wird, und zieht die Sonde dann auf einen Abstand zurück, der durch Z über der Oberfläche (μm) über der Probenoberfläche definiert ist. Wenn der ausgewählte Cantilever zu steif für die Probe ist oder die Probe klebrig ist, ist es wahrscheinlich, dass die Sonde nach dem Schritt immer noch in Kontakt mit der Probe ist, was zu einer Kurve ohne Basislinie führt (Abbildung 4C). Um dieses Problem zu lösen, erhöhen Sie das Z über der Oberfläche (μm).
      2. Fügen Sie einen Einzugsschritt hinzu. Wählen Sie die Registerkarte Profil und klicken Sie auf Verschiebungssteuerung. Behalten Sie das Standardeinzugsprofil bei.
      3. Klicken Sie im Hauptfenster der Software auf Experiment ausführen . Dadurch wird die Oberfläche gefunden und ein einzelner Einzug ausgeführt. Wenn der einzelne Einzug nicht wie erwartet aussieht, passen Sie die experimentellen Parameter wie in Abbildung 4 und Diskussion (Fehlerbehebung der Methode) beschrieben an.
    5. Sobald der Einzug wie gewünscht aussieht, konfigurieren Sie den Matrixscan so, dass ein ausreichender Bereich der Probe eingerückt wird. Klicken Sie auf Experiment konfigurieren, fügen Sie einen Schritt Oberfläche suchen mit den zuvor ermittelten experimentellen Parametern hinzu und fügen Sie einen Matrix Scan-Schritt hinzu.
    6. Konfigurieren Sie für flache Hydrogele einen Matrixscan mit 50-100 Punkten (d. h. 5 x 10 oder 10 x 10 in x und y) im Abstand von 10-100 μm (d. h . dx = dy = 10-100 μm). Klicken Sie auf Bühnenposition verwenden , um den Matrixscan von der aktuellen Bühnenposition aus zu starten. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Oberfläche automatisch suchen aktiviert ist, um die Oberfläche bei jedem Einzug mithilfe der festgelegten experimentellen Parameter zu finden.
      1. Um eine Überabtastung zu vermeiden, stellen Sie die Schrittweite auf mindestens den doppelten Kontaktradius ein (Equation 1, wobei δ die Einzugstiefe ist).
      2. Richten Sie das Matrix-Scan-Profil in der Verschiebungssteuerung ein. Stellen Sie sicher, dass das Profil nicht gegen die Annahmen des Hertz-Modells verstößt (siehe Diskussion, kritische Schritte im Protokoll).
      3. Behalten Sie die Anzahl der Segmente auf 5 (Standardwert) bei, und verwenden Sie das Standardverschiebungsprofil. Ändern Sie ggf. das Verdrängungsprofil in Bezug auf maximale Verschiebung und Zeit für jedes geneigte Segment, was sich auf die maximale Eindringtiefe bzw. die Dehnungsrate auswirkt. Dehnungsraten > 10 μm/s nicht überschreiten (siehe Diskussion, Einschränkungen der Methode).
      4. Geben Sie einen Wert für die Annäherungsgeschwindigkeit ein, der bestimmt, wie schnell die Sonde vor dem Kontakt in Richtung der Probe verschoben wird. Passen Sie die Rückzugsgeschwindigkeit an die Anfahrgeschwindigkeit an (siehe Hinweis unten).
        HINWEIS: Für weiche Ausleger und laute Umgebungen wird eine Annäherungsgeschwindigkeit von 1.000-2.000 nm/s empfohlen. Für steifere Ausleger und kontrollierte Umgebungen kann dieser erhöht werden.
      5. Speichern Sie das konfigurierte Experiment im gewünschten Experimentpfad, und wählen Sie im Fenster Test konfigurieren auf der Registerkarte Speicherpfad auf der Registerkarte Allgemein ein Verzeichnis aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen. Klicken Sie auf Test ausführen.
    7. Sobald der Matrixscan abgeschlossen ist, heben Sie die Sonde um 200-500 μm an und bewegen Sie die Sonde in einen anderen Bereich der Probe, der ausreichend weit vom ersten Bereich entfernt ist.
    8. Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal, damit genügend Daten zu jeder Probe erfasst werden (d. h. mindestens zwei Matrixscans pro Probe mit jeweils 50-100 Kurven).
  2. Nanoindentation von Zellen
    1. Laden Sie die Probe wie oben beschrieben auf das Mikroskop.
    2. Für den Einzelzelleinzug fokussieren Sie die z-Ebene so, dass sowohl die Zellen als auch die Sonde je nach Zellgröße und -verteilung bei 20- oder 40-facher Vergrößerung sichtbar sind.
    3. Bewegen Sie die Sonde über die einzurückende Zelle.
    4. Konfigurieren Sie ein neues Experiment im Hauptfenster der Software. Klicken Sie auf Experiment konfigurieren, um ein neues Fenster zu öffnen. Fügen Sie einen Schritt "Fläche suchen " und " Einzug " mit Standardparametern im Verschiebungsmodus hinzu.
    5. Klicken Sie auf Run Experiment, um die Oberfläche zu finden und einen einzelnen Einzug durchzuführen. Überprüfen Sie, ob der Einzug erfolgreich war. Wenn die Kurve nicht wie erwartet aussieht, passen Sie die experimentellen Parameter an (siehe Abbildung 4 und Diskussion, Fehlerbehebung der Methode).
    6. Wenn der Einzug erfolgreich war, fügen Sie dem Experiment einen Matrixscan hinzu. Befolgen Sie die Schritte für die Nanoindentationsexperimente von Hydrogelen. Konfigurieren Sie den Matrix-Scan so, dass die Schrittweite es ermöglicht, einen kleinen Bereich der Zelle einzurücken. 25 Punkte im Abstand von 0,5-5 μm für HEK293T-Zellen.
      1. Passen Sie je nach Zellengröße den Matrixscan an, um sicherzustellen, dass die Spitze nicht außerhalb der Zellengrenze einrückt, d. H. Führen Sie eine andere Kartengeometrie durch oder tasten Sie weniger Punkte ab.
    7. Klicken Sie auf Experiment ausführen und warten Sie, bis es abgeschlossen ist.
    8. Sobald der Matrix-Scan abgeschlossen ist, heben Sie die Sonde außer Kontakt (50 μm in der z-Ebene ).
    9. Bewegen Sie die Sonde über eine neue Zelle, und wiederholen Sie den Vorgang (siehe Diskussion, kritische Schritte im Protokoll).
  3. Sonde reinigen und Gerät ausschalten
    1. Befolgen Sie die im Zusatzprotokoll angegebenen Schritte, um die Sonde zu reinigen und die Nanoindentationsvorrichtung auszuschalten.

5. Datenanalyse

  1. Herunterladen und Installieren der Software
    1. Folgen Sie den Schritten im Zusatzprotokoll, um die Software für die Datenanalyse28,29 herunterzuladen und zu installieren.
  2. Screening von F-z-Kurven und Erstellung von bereinigten Datensätzen im JSON-Format
    1. Starten Sie prepare.py über die Befehlszeile auf dem Laborcomputer, wie in den Schritten 2 bis 3 beschrieben.
    2. Wenn Sie einen Windows-Computer verwenden, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, während Sie mit der rechten Maustaste auf den Ordner NanoPrepare klicken, und klicken Sie auf PowerShell-Fenster hier öffnen. Geben Sie den Befehl python prepare.py ein und drücken Sie die Eingabetaste . Eine grafische Benutzeroberfläche wird auf Ihrem Bildschirm angezeigt (Abbildung S2).
    3. Wenn Sie einen MacOS-Computer verwenden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Ordner NanoPrepare und klicken Sie auf Neues Terminal unter Ordner. Geben Sie den Befehl python3 prepare.py ein und drücken Sie die Eingabetaste , um die GUI zu starten (Abbildung S2).
    4. Wählen Sie das Datenformat O11NEW aus der Dropdown-Liste aus. Wenn die Daten nicht korrekt geladen werden, starten Sie die GUI neu und wählen Sie O11OLD.
      HINWEIS: Das O11NEW-Format funktioniert für Daten, die mit Ferrule-Top-Nanoindentationsgeräten mit Glasfasererkennung und Softwareversion 3.4.1 erhalten wurden. Dieses Format funktioniert auch für frühere Softwareversionen, zumindest für Nanoindenter, die in den Jahren 2019-2020 installiert wurden.
    5. Klicken Sie auf Ordner laden. Wählen Sie einen Ordner aus, der die zu analysierenden Daten enthält - einzelner Matrix-Scan oder mehrere Matrix-Scans. Das obere Diagramm (Rohkurven) wird mit dem hochgeladenen Datensatz gefüllt. Um eine bestimmte Kurve zu visualisieren, klicken Sie darauf. Dadurch wird es grün hervorgehoben und in der unteren Grafik (Current Curve) angezeigt.
    6. Bereinigen Sie den Datensatz mithilfe der Registerkarten im rechten Teil der GUI, wie unten beschrieben.
      1. Verwenden Sie die Schaltfläche Segment, um das richtige zu analysierende Segment auszuwählen, bei dem es sich um das Vorwärtssegment der F-z-Kurven handelt. Die genaue Anzahl hängt von der Anzahl der Segmente ab, die in der Nanoindentationssoftware bei der Durchführung von Experimenten ausgewählt werden.
      2. Verwenden Sie die Schaltfläche 50 nm zuschneiden, um die Kurven ganz links (wenn L angekreuzt ist), rechts (wenn R angekreuzt ist) oder beidseitig (wenn sowohl R als auch L angekreuzt sind) um 50 nm zuzuschneiden. Klicken Sie mehrmals auf diese Schaltfläche, um so viel wie nötig zuzuschneiden. Verwenden Sie diese Option, um Artefakte am Anfang/Ende von F-z-Kurven zu entfernen.
      3. Überprüfen Sie die Auslegerlasche auf Federkonstante, Spitzengeometrie und Spitzenradius. Überprüfen Sie die Registerkarte, um sicherzustellen, dass die Metadaten korrekt gelesen wurden.
      4. Verwenden Sie die Registerkarte Raster, um einen Kraftschwellenwert festzulegen, der alle Kurven verwirft, die die angegebene Kraft nicht erreicht haben. Verworfene Kurven werden rot hervorgehoben.
      5. Verwenden Sie die Schaltfläche Manueller Umschalter , um Kurven, die nicht korrekt erfasst wurden, manuell zu entfernen. Entfernen Sie alle Kurven, indem Sie auf die spezifische Kurve klicken und OUT auswählen, wodurch die Kurve rot hervorgehoben wird.
    7. Klicken Sie auf JSON speichern. Geben Sie einen geeigneten Namen für das bereinigte Dataset ein, bei dem es sich um eine einzelne JSON-Datei handelt. Senden Sie die JSON-Datei an den Computer, auf dem die NanoAnalysis-Software installiert wurde.

6. Formale Datenanalyse

  1. Starten Sie die nano.py Datei über die Befehlszeile, indem Sie zum Ordner NanoAnalysis navigieren und wie zuvor beschrieben ein Terminal starten. Geben Sie den Befehl python nano.py oder python3 nano.py ein (je nach Betriebssystem) und drücken Sie die Eingabetaste . Eine grafische Benutzeroberfläche wird auf Ihrem Bildschirm angezeigt (Abbildung S3).
  2. Klicken Sie oben links in der GUI auf Load Experiment und wählen Sie die JSON-Datei aus. Dadurch werden die Dateiliste und das Diagramm Rohkurven gefüllt, das den Datensatz in Form von F-z-Kurven anzeigt. Sowohl die F- als auch die z-Achse werden relativ zu den CP-Koordinaten angezeigt, die beim Laden des Datensatzes im Hintergrund berechnet werden (siehe folgende Anmerkung). Aktivieren Sie im Feld Statistiken die Werte der drei Parameter: Naktiviert, N fehlgeschlagen und Nausgeschlossen.
    HINWEIS:N aktiviert stellt die Anzahl der Kurven dar, die in der nachfolgenden Hertz-/Elastizitätsspektrenanalyse analysiert werden und im Diagramm Rohkurven schwarz angezeigt werden. Nfehlgeschlagen stellt die Anzahl der Kurven dar, auf denen kein zuverlässiger CP gefunden werden konnte, und wird im Diagramm blau dargestellt. Diese Kurven werden in der nachfolgenden Analyse automatisch verworfen. Beim Öffnen der Software werden einige Kurven möglicherweise automatisch in den fehlerhaften Satz verschoben. Dies liegt daran, dass der CP beim Öffnen der Software mit dem Standard-Schwellenwertalgorithmus berechnet wird (siehe unten). N ausgeschlossen stellt die Kurven dar, die manuell ausgewählt wurden, um aus der Analyseausgeschlossen zu werden, und wird im Diagramm rot angezeigt (siehe unten).
  3. Überprüfen Sie, ob die Anzahl der fehlgeschlagenen, ausgeschlossenen und aktivierten Kurven angemessen ist. Überprüfen Sie das Diagramm "Rohkurven ", um die Kurven zu visualisieren.
  4. Um eine bestimmte Kurve genauer zu visualisieren, klicken Sie darauf. Dadurch wird es grün hervorgehoben und im Diagramm der aktuellen Kurve angezeigt. Sobald eine einzelne Kurve ausgewählt wurde, werden die R - und k-Parameter (die für alle Kurven gleich sein müssen) im Feld Statistik der GUI ausgefüllt.
  5. Ändern Sie den Status einer bestimmten Kurve mithilfe des Felds Umschalten . Klicken Sie auf die spezifische Kurve, deren Status Sie ändern möchten, und klicken Sie dann entweder auf Aktiviert, Fehlgeschlagen oder Ausgeschlossen. Die Anzahl im Feld Statistiken wird automatisch aktualisiert.
    HINWEIS: Um die Ansicht des Datensatzes im Diagramm Rohkurven zu ändern, verwenden Sie das Feld Ansicht. Klicken Sie auf Alle, um alle Kurven (d.h. aktiviert, fehlgeschlagen und ausgeschlossen) in den jeweiligen Farben anzuzeigen. Klicken Sie auf Fehlgeschlagen, um die aktivierten und die fehlgeschlagenen Kurven anzuzeigen, und klicken Sie auf Aktiviert, um nur die aktivierten Kurven anzuzeigen. Um den Status aller Kurven zwischen aktiviert und ausgeschlossen zurückzusetzen, klicken Sie im Feld Zurücksetzen auf Aktiviert oder Ausgeschlossen.
  6. Nachdem das Dataset weiter bereinigt wurde, folgen Sie der unten beschriebenen Datenanalyse-Pipeline.
    1. Filtern Sie alle in den Kurven vorhandenen Geräusche mit den in der GUI (Filterbox) implementierten Filtern, nämlich einem benutzerdefinierten Filter namens Prominenzfilter, dem Savitzky Golay30,31 (SAVGOL) -Filter und einem Glättungsfilter, der auf der Berechnung des Medians der Daten in einem bestimmten Fenster basiert (Medianfilter). Weitere Informationen zu Filtern finden Sie unter Diskussion (kritische Schritte im Protokoll).
    2. Überprüfen Sie die gefilterten Kurven im Diagramm Aktuelle Kurve . Die gefilterte Kurve wird schwarz dargestellt, während die nicht gefilterte Version der Kurve grün dargestellt wird.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Daten so wenig wie möglich zu filtern, um die Merkmale des Originalsignals zu erhalten. Übermäßiges Filtern kann Unterschiede in den Daten ausgleichen. Für die Hertz-Analyse von Nanoindentationsdaten reicht das Arbeiten mit aktiviertem Prominenzfilter aus. Wenn die Daten besonders verrauscht sind, kann zusätzlich ein SAVGOL- oder Medianfilter angewendet werden.
    3. Wählen Sie einen Algorithmus aus, um den CP zu finden. Wählen Sie im Feld Kontaktpunkt eines aus einer Reihe von numerischen Verfahren aus, die in der Software implementiert wurden, nämlich die Anpassungsgüte (GoF)32, das Varianzverhältnis (RoV)32, die zweite Ableitung 33 oder den Schwellenwert 33. Weitere Informationen zu den Algorithmen finden Sie unter Diskussion, kritische Schritte im Protokoll.
      HINWEIS: Der CP ist der Punkt, an dem die Sonde mit dem Material in Kontakt kommt und identifiziert werden muss, um F-z-Daten in F-δ-Daten umzuwandeln (bei weichen Materialien ist δ endlich und muss berechnet werden). Der ausgewählte Algorithmus wird auf alle aktiven Kurven des Datensatzes angewendet, und Kurven, bei denen der Algorithmus den CP nicht robust lokalisieren kann, werden in den fehlerhaften Satz verschoben.
    4. Passen Sie die Parameter des Algorithmus an Ihren Datensatz an, so dass der CP korrekt lokalisiert wird, wie in der Diskussion, kritische Schritte im Protokoll beschrieben. Um zu sehen, wo der CP auf einer einzelnen Kurve gefunden wurde, wählen Sie die Kurve aus, indem Sie darauf klicken und auf Prüfen klicken. Überprüfen Sie das angezeigte Popup-Fenster, um festzustellen, wo sich der CP befindet.
    5. Überprüfen Sie, ob die angezeigte rote Linie, d. h. der Parameter, den der Algorithmus in der ausgewählten Region von Interesse berechnet hat, einen Maximal- oder Minimalwert hat, der der Position des CP entspricht (z. B. für die GoF ist der Parameter R2). Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf für alle Kurven.
      HINWEIS: Die Achsen des Pop-ups sind in absoluten Koordinaten, so dass die Position des CP angezeigt werden kann. Umgekehrt werden die Achsen des Diagramms Rohkurven und Stromkurve relativ zum CP angezeigt, d.h. die Position des CP ist (0,0).
    6. Klicken Sie auf Hertz-Analyse. Dadurch werden drei Diagramme generiert, die unten beschrieben werden.
      1. Überprüfen Sie einzelne F-δ-Kurven im Datensatz zusammen mit der durchschnittlichen Hertz-Anpassung (rote gestrichelte Linie). Passen Sie den Einzug in nm, bis zu dem das Hertz-Modell angepasst ist, im Feld Ergebnisse unter Max. Einzug (nm) an. Setzen Sie es auf maximal ~10% von R , damit das Hertz-Modell gültig ist (siehe Diskussion, kritische Schritte im Protokoll).
      2. Überprüfen Sie die durchschnittliche F-δ-Kurve mit Fehlerband, das eine Standardabweichung (SD) zusammen mit der durchschnittlichen Hertz-Anpassung (rote gestrichelte Linie) anzeigt. Visualisieren Sie die durchschnittliche Hertz-Anpassung im Rohkurvendiagramm als Referenz und die Hertz-Anpassung für jede Kurve auf der aktuellen Kurve.
      3. Überprüfen Sie das Punktdiagramm von E , das sich aus der Anpassung des Hertz-Modells an jede einzelne Kurve ergibt.
    7. Klicken Sie entweder auf den Dateinamen, die F-z-Kurve , die F-δ-Kurve oder einen Punkt im Punktdiagramm, um die Kurve in jedem Diagramm hervorzuheben. Wenn ein Datenpunkt im Punktdiagramm außerhalb der Verteilung der Daten zu liegen scheint, klicken Sie darauf, und überprüfen Sie die Kurve, zu der er gehört. Überprüfen Sie, ob der CP korrekt gefunden wurde, indem Sie auf die Schaltfläche Prüfen klicken. Schließen Sie die Kurve ggf. aus der Analyse aus.
    8. Überprüfen Sie das Feld Ergebnisse auf den berechneten Mittelwert E und seinen SD (Eγ ± σ) und stellen Sie sicher, dass sie für das gegebene Experiment angemessen sind.
    9. Klicken Sie im Feld Speichern auf Hertz. Geben Sie im Popup-Fenster den Dateinamen und das Verzeichnis ein. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Speichern. Eine TSV-Datei wird erstellt. Öffnen Sie die .tsv-Datei in einer weiteren Software Ihrer Wahl und verwenden Sie die Werte für statistische Analysen und weitere Darstellungen.
      HINWEIS: Die Datei enthält das aus jeder Kurve erhaltene E sowie den Mittelwert E und seine SD. Darüber hinaus enthält die Datei Metadaten, die der Analyse zugeordnet sind, einschließlich der Anzahl der analysierten Kurven, R, k und des maximalen Einzugs, der für das Hertz-Modell verwendet wird.
    10. Dieser Schritt ist optional. Klicken Sie auf Durchschnittliche F-Ind , um die durchschnittliche Kraft und den durchschnittlichen Einzug zusammen mit einem SD in der Kraft zu exportieren.
    11. Für Zellnanoindentationsdaten klicken Sie auf Elastizitätsspektrenanalyse (siehe Repräsentative Ergebnisse und Diskussion). Untersuchen Sie die beiden erzeugten Diagramme, nämlich E als Funktion der Eindringtiefe (E(δ)) für jede Kurve und das durchschnittliche E(δ) mit Fehlerband, das einen SD (durchgezogene rote Linie und schattierte Fläche) zeigt, der von einem Modell angepasst wird (schwarze gestrichelte Linie), das es ermöglicht, den Elastizitätsmodul des Aktincortex der Zelle, den Young-Modul der Zelle zu schätzen. und die Dicke des Aktinkortex. Überprüfen Sie außerdem den Durchschnitt E(δ) im oberen Diagramm in rot.
    12. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Interpolieren aktiviert ist, um sicherzustellen, dass die für die Elastizitätsspektrenanalyse erforderliche Ableitung für das interpolierte Signal berechnet wird (siehe Repräsentative Ergebnisse).
    13. Untersuchen Sie das Feld Ergebnisse und melden Sie den Elastizitätsmodul des Kortex (E 0 ± σ), den Bulk-Elastizitätsmodul der Zelle (Eb ± σ) und die Kortexdicke (d0 ± σ).
      HINWEIS: Die durchschnittlichen Elastizitätsspektren können auf den ersten Blick verrauscht erscheinen, mit deutlichen sinusförmigen Schwingungen. Dies hat zur Folge, dass Gleichung (3) möglicherweise nicht korrekt angepasst wird. Wenn dies der Fall ist, löst eine iterative Erhöhung der Fensterlänge des glättenden SAVGOL-Filters34 dieses Problem.
    14. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf ES im Feld Speichern . Dadurch wird eine TSV-Datei in das angegebene Verzeichnis exportiert, die die durchschnittliche Elastizität als Funktion der durchschnittlichen Eindringtiefe und des Kontaktradius, die dem Experiment zugeordneten Metadaten (siehe oben) und die oben erläuterten geschätzten Modellparameter enthält. Schließlich wird auch die durchschnittliche Elastizität ohne Berücksichtigung der Abhängigkeit von δ und ihrer SD berichtet.
    15. Schließen Sie die Software und geben Sie die gespeicherten Ergebnisse in eine andere Software Ihrer Wahl ein, um die Daten weiter zu zeichnen und statistische Analysen durchzuführen.
    16. Dieser Schritt ist optional: Exportieren Sie Diagramme aus der GUI, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm klicken und Exportieren auswählen. Exportieren Sie das Diagramm in .svg, so dass Parameter wie Schriftart, Schriftgröße, Linienstil usw. kann in einer anderen Software Ihrer Wahl bearbeitet werden.
      HINWEIS:Benutzerdefinierte CP-Algorithmen und Filter können programmiert und zu den bereits vorhandenen hinzugefügt werden. Einzelheiten siehe Ergänzende Anmerkung 1 .

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Representative Results

Nach dem Protokoll wird ein Satz von F-z-Kurven erhalten. Das Dataset enthält höchstwahrscheinlich gute Kurven und Kurven, die verworfen werden müssen, bevor mit der Analyse fortgefahren wird. Im Allgemeinen sollten Kurven verworfen werden, wenn sich ihre Form von der in Abbildung 4A gezeigten unterscheidet. Abbildung 5AI zeigt einen Datensatz von ~100 Kurven, die auf einem weichen PAAm-Hydrogel von erwartetem E 0,8 KPa35 erhalten wurden, das in die NanoPrepare GUI hochgeladen wurde. Die meisten Kurven weisen eine klare, flache Grundlinie, einen Übergangsbereich und einen geneigten Bereich auf, der proportional zur scheinbaren Steifigkeit des Materialsist 13. Eine Minderheit von Kurven zeigt jedoch Abweichungen von der in Abbildung 4A gezeigten Form, z. B. das Fehlen einer Basislinie, einen fehlenden Kontakt oder eine geneigte Grundlinie. Diese Kurven können mithilfe von NanoPrepare (Abbildung 5AII, rote Kurven) und einem sauberen Datensatz, der im JSON-Standardformat gespeichert wird, einfach aus dem Datensatz entfernt werden (Abbildung 5AIII). Der saubere Datensatz wird in NanoAnalysis hochgeladen (Abbildung 5BIV), das so konzipiert wurde, dass es alle Kurven stapelweise verarbeitet. Dies bedeutet, dass jeder Schritt des Workflows auf das gesamte Dataset angewendet wird. Nach dem Hochladen können Kurven gefiltert werden, um zufälliges Rauschen zu entfernen, indem ein oder mehrere Filter verwendet werden, die in der Diskussion beschrieben sind, kritische Schritte im Protokoll (Abbildung 5BV). Der CP wird dann mit einem der in der Software implementierten Algorithmen lokalisiert und in der Diskussion, kritischen Schritten im Protokoll detailliert beschrieben (Abbildung 5BVI). Sobald der CP identifiziert wurde, werden F-z-Daten in F-δ-Daten umgewandelt. Da die Software in erster Linie für die Analyse von Daten von Ferrule-Top-Nanoindentationsgeräten auf der Grundlage von optischen Fasersensoren entwickelt wurde, die Sonden mit einer sphärischen Spitze verwenden, basiert die Hertz-Analyse auf dem Hertz-Modell, das den Kontakt zwischen einer Kugel mit dem Radius R und einem unendlich ausgedehnten linearen elastischen homogenen isotropen (LEHI) Halbraum approximiert13:

Equation 2

wobei F die Kraft, δ die Vertiefung, E der Elastizitätsmodul und ν das Poisson-Verhältnis ist, wobei 0,5 unter Annahme der Inkompressibilität angenommen wird. Durch Anpassung von F-δ-Kurven an Gleichung (1) kann E daher geschätzt werden (siehe Diskussionskritische Schritte im Protokoll - für Annahmen des Hertz-Modells) (Abbildung 5BVII).

Zusätzlich zur Hertz-Analyse kann die Software eine erweiterte Analyse durchführen, nämlich die Elastizitätsspektren, die besonders für Zellnanoindentationsdaten nützlich sind; und kann auch als Werkzeug verwendet werden, um den Einfluss des darunter liegenden Substrats auf die mit dem Hertz-Modell erhaltenen mechanischen Eigenschaften abzuschätzen. Im Folgenden wird der Ansatz kurz zusammengefasst. Ausführliche Informationen finden Sie in der Originalpublikation24.

Ausgehend vom Oliver-Pharr-Modell36, das die Einkerbung eines achsensymmetrischen Stempels beliebiger Geometrie und eines elastischen Halbraums beschreibt, kann man E(δ) für den speziellen Fall eines kugelförmigen Eindringkörpers ableiten. Nimmt man ν als 0,5, so hat E(δ) die Form24:

Equation 3

Die Berechnung von E(δ) für jede F-δ-Kurve unter Verwendung von Gleichung (2) ergibt eine Reihe von Kurven, nämlich die Elastizitätsspektren (ES). Nimmt man den Mittelwert aller Kurven im Datensatz, erhält man den Mittelwert ES (Abbildung 5BVIII, rote durchgezogene Linie). Der durchschnittliche ES ist ein nützliches Werkzeug, da er Informationen darüber liefert, wie E mit δ im Datensatz variiert. Im speziellen Fall von Zell-Nanoindentationsexperimenten ist die Dicke der Zelle a priori nicht bekannt, was bedeutet, dass die Wahl eines geeigneten Fitting-Bereichs für die Hertz-Analyse etwas willkürlich ist. Durch die Verwendung des durchschnittlichen ES werden Substrateffekte auf das scheinbare E(δ) deutlich, was bedeutet, dass das Werkzeug verwendet werden kann, um einen geeigneten Anpassungsbereich auszuwählen, der dem Punkt entspricht, an dem E(δ) nach seinem Zerfall zunimmt. Darüber hinaus wurde bereits gezeigt und rechnerisch und experimentell validiert, dass ein einfaches Doppelschichtmodell bei der Schätzung der Dicke des Aktinkortex (d 0), des Elastizitätsmoduls des Aktinkortex (E 0) und des Elastizitätsmoduls der Zelle (Eb) wirksam ist24. Das Modell beschreibt die Zelle als Doppelschicht mit einer äußersten Schicht der Dicke d 0 und des Moduls E 0 und einer inneren Schicht unendlicher Dicke mit Elastizitätsmodul E b 0:

Equation 4

wobei R der Radius der Spitze und Λ ein phänomenologischer Parameter ist, der aus Finite-Elemente-Analysesimulationen24 als 1,74 bestimmt wurde. Dieses Verfahren wurde in der NanoAnalyse-Software implementiert, die es ermöglicht, den Durchschnitt ES mit Gleichung (3) anzupassen, um eine Schätzung von E 0, Eb und d0 zu erhalten (Abbildung 5BVIII, schwarze gestrichelte Linie). Ausführliche methodische Einzelheiten sind der Originalveröffentlichung24 zu entnehmen.

Um die Durchführbarkeit des Protokolls nachzuweisen, wurde die Elastizität von PAAm-Hydrogelen bekannter E (gemessen mit AFM)35 hergestellt und unter Verwendung des in Teil 1 des Protokolls vorgeschlagenen Verfahrens getestet. Für jedes Gel wurden zwei Steifigkeitskarten in zwei verschiedenen Bereichen der Probe mit einem handelsüblichen Ferrule-Top-Nanoindenter mit einer Spitze mit R = 52 μm und k = 0,46 N/m aufgenommen. Jede Karte bestand aus 50 Vertiefungen, die in der Verschiebungssteuerung durchgeführt wurden, und die Schrittweite in x und y wurde auf 20 μm eingestellt, um eine Überabtastung zu vermeiden. Abbildung 6A zeigt die durchschnittliche F-δ-Kurve zusammen mit dem durchschnittlichen Hertz-Modell für ein weiches PAAm-Hydrogel (erwartet E 0,8 kPa) und ein steifes PAAm-Hydrogel (erwartet E 8 kPa)35. Durch die Durchführung der Hertz-Analyse durch die NanoAnalyse-Software und die Darstellung einzelner Werte von E wurde das erwartete E für beide Hydrogele abgerufen (Abbildung 6B).

Weiterhin wurden Nanoindentationsexperimente an HEK293T-Zellen durchgeführt. Sechs einzelne Zellen wurden eingerückt, indem ein Matrixscan mit einer x- und y-Schrittweite von 0,5 μm auf jeder Zelle durchgeführt und mindestens 25 Kurven auf jeder Zelle erfasst wurden. Dies führte dazu, dass der analysierte Datensatz ~200 Kurven enthielt. Die ausgewählte Sonde hatte R = 3,5 μm und k = 0,02 N/m.

Abbildung 7A zeigt die mittlere Hertz-Kurve und das entsprechende durchschnittliche Hertz-Modell, aufgetragen unter Verwendung des Mittelwerts E , der aus der Anpassung von Gleichung (1) an jede einzelne Kurve in der NanoAnalysis bis zu einem Eindruck von 200 nm erhalten wurde. Es wurde festgestellt, dass E 915 ± 633 Pa (Mittelwert ± SD) beträgt, was den in der Literatur angegebenen Werten entspricht24. Trotz seiner breiten Anwendung erfasst das Hertz-Modell die Entwicklung der Kraft mit zunehmender Eindringtiefe für Zellnanoindentationsexperimente nicht vollständig (Abbildung 7A). Aus diesem Grund ist der ES ein besonders geeignetes Werkzeug, um die mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen zu untersuchen.

Abbildung 7B zeigt den Mittelwert ES zusammen mit Gleichung (3) bis zu einem Eindruck von 200 nm. Der durchschnittliche ES beginnt bei einer Eindringtiefe von ~200 nm zu steigen, was den Beitrag des Substrats zum untersuchten scheinbaren E anzeigt (Abbildung S4). Aus diesem Grund wurde 200 nm als Anpassungsbereich sowohl für das Hertz-Modell (Abbildung 7A) als auch für das Doppelschichtmodell (Abbildung 7B) gewählt. Die Anpassung von Gleichung (3) an den durchschnittlichen ES erlaubte es, wichtige Informationen zu extrahieren, die sonst aus einfachen Nanoindentationsexperimenten, die mit dem Hertz-Modell analysiert wurden, unzugänglich blieben. Insbesondere wurde der Modul E 0 des Aktinkortex auf 5,794 ± 0,095 kPa geschätzt, die Dicke des Aktinkortex d 0 wurde auf 311 ± 3 nm und der Bulk-Modul Eb auf 0,539 ± 0,002 kPa (Mittelwert ± SD) geschätzt. Alle Werte stimmen mit früheren Experimenten überein, die mit AFM am gleichen Zelltyp24 durchgeführt wurden, und mit Werten, die in der Literatur37,38 angegeben wurden. Insbesondere wird erwartet, dass der Aktinkortex zwischen 300-400 nm für adhärente Zellen37 und bis zu 10-mal steifer ist als die Masse der Zelle38.

Unabhängig vom Doppelschichtmodell ist ein direkter Vergleich zwischen den Ergebnissen des Hertz-Standardmodells und dem ES-Ansatz in Abbildung 7C dargestellt, der überlappende Verteilungen mit vergleichbaren Mittelwerten zeigt.

Figure 1
Abbildung 1: Protokollübersicht. Das Protokoll besteht aus folgenden Teilen: (A) Teil 1: Vorbereitung der Probe (entweder Hydrogele oder Zellen) für Nanoindentationsexperimente. (B) Teil 2: Auswahl der richtigen Sonde und Kalibrierung der Sonde. (C) Teil 3: Durchführung von Nanoindentationsexperimenten durch Erfassung von Steifigkeitskarten an der Probe. (D) Teil 4: Analyse der Daten, bestehend aus i) Bereinigung des erfassten Datensatzes über die erste GUI (NanoPrepare) und Speichern des bereinigten Datensatzes und der zugehörigen Metadaten als Standard-JSON-Datei; und ii) Analyse des bereinigten Datensatzes in der zweiten GUI (NanoAnalyse), die aus Datenfilterung, CP-Identifizierung und Modellanpassung zur Schätzung des Elastizitätsmoduls E der Probe besteht. Die Ergebnisse werden für weitere Darstellungen und statistische Analysen gespeichert, die in jeder Software Ihrer Wahl durchgeführt werden können. Erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Probenvorbereitung . (A) Vorgeschlagene Schritte zur Herstellung flacher PAAm-Hydrogele für Nanoindentationsexperimente. Diese sind: I) Gießen der Hydrogellösung auf einen hydrophoben Glasobjektträger und Abdecken mit einem silanisierten Deckglas; II) 20 min auf die Polymerisation warten und das Deckglas-Gel-Komposit vom Glasobjektträger ablösen; und III) Anbringen des Deckglas-Gel-Komposits an eine Petrischale und Zugabe geeigneter Lösung (gereinigtes Wasser im Rahmen dieses Protokolls) für Nanoindentationsexperimente. Die gleiche Logik kann an jede andere Art von Hydrogel angepasst und angewendet werden. (B) Vorgeschlagene Schritte zur Vorbereitung von Zellen für Nanoindentationsexperimente. Diese sind: I) Zellen säen und auf Zelladhäsion warten; II) Serumhungern der Zellen, um die Zellpopulation in Bezug auf den Zellzyklus zu synchronisieren (optional); und III) warten, bis sich die Zellen bei gewünschter Konfluenz in einem anhaftenden Zustand befinden, bevor sie mit Nanoindentationsexperimenten beginnen. Erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Überblick und Auswahl der Nanoindentationssonde. (A) Schematische Darstellung der Ferrule-Top-Sonde (links) und Bild einer Ferrule-Top-Sonde mit der kugelförmigen Spitze mit einem Radius von 250 μm (rechts). Alle Komponenten sind auf dem Foto beschriftet. (B) Vergrößertes Schema des Auslegers und der kugelförmigen Spitze. Der Ausleger wird als Hakesche Feder der elastischen Konstante k behandelt (zu Darstellungszwecken schräg dargestellt). Die Spitze wird durch ihren Radius R definiert. Wenn die Probe eingerückt ist, wird die Sonde um einen Betrag z von ihrer Referenzposition z 0 verschoben, was dazu führt, dass der Cantilever d von seiner Referenzbiegung d 0 biegt. Auf die Probe wird eine Kraft von F = k (d - d 0) ausgeübt, was zu einer Einkerbung δ = (z - z 0) - (d - d0) führt. (C) Die Steifigkeit von Cantilever k sollte entsprechend der erwarteten Elastizität des Substrats gewählt werden. Das Diagramm wurde unter Berücksichtigung des Hertzschen Kontakts mit einer Vertiefung von 1 μm erhalten, unter der Annahme, dass die Energie gleichmäßig zwischen der Biegung des Auslegers und der Vertiefung des Substrats aufgeteilt ist (dh d = δ). Je größer der Spitzenradius, desto steifer sollte der Ausleger sein, um die gleiche Vertiefung für ein Substrat mit einem gegebenen E zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Morphologische Merkmale von F-z-Kurven. (A) Ein erfolgreiches Experiment führt dazu, dass das Annäherungssegment einer F-z-Kurve eine klare Basislinie aufweist (Spitze nähert sich der Probe, ist aber nicht in Kontakt); ein Übergangsbereich, in dem die Spitze zuerst mit der Probe in Berührung kommt; und ein Bereich, in dem die Kraft mit der Verschiebung zunimmt, wo die Spitze die Probe progressiv eindrückt. Die Steigung dieser Region ist proportional zur scheinbaren Steifigkeit des Materials13, was bedeutet, dass Kurven, die zu steifen Biomaterialien (z. B. stark vernetzten Gelen) gehören, steiler sind als Kurven weicherer Biomaterialien (z. B. schwach vernetzte Gele und Zellen). (B) Eine Annäherungskurve, bei der die Spitze nie mit der Probe in Berührung kam. Informationen zur Lösung finden Sie unter Problembehandlung der Methode in der Diskussion. (C) Eine Annäherungskurve, bei der die Spitze mit der Probe in Berührung kam. Informationen zur Lösung finden Sie unter Problembehandlung der Methode in der Diskussion. Die gezeigten Daten stammen aus einem Experiment, das an einem weichen PAAm-Hydrogel mit erwartetem E 0,8 kPa35 durchgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Datenanalyse-Workflow mit den Python-GUIs . (A) Ein Beispieldatensatz von F-z-Kurven , der mit einem kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanoindenter auf einem weichen PAAm-Hydrogel (erwartet E 0,8 kPa35) aufgenommen wurde, wurde in NanoPrepare hochgeladen. Kurven, die nicht der in Abbildung 4A beschriebenen Form folgen, werden aus dem Dataset ausgeschlossen, und das bereinigte Dataset und die zugehörigen Metadaten werden als JSON-Standarddatei gespeichert. (B) Der saubere Datensatz wird in die zweite GUI (NanoAnalyse) hochgeladen, wo Kurven gefiltert werden können, indem ein oder mehrere Filter angewendet werden, um Rauschen zu entfernen (siehe Diskussion, kritische Schritte im Protokoll). Weiterhin wird ein CP-Algorithmus ausgewählt, um den CP automatisch für alle Kurven zu lokalisieren (siehe Diskussion, kritische Schritte im Protokoll). Anschließend wird die Hertz-Analyse durchgeführt, die für jeden Einzug eine F-δ-Kurve ergibt, die mit dem Hertz-Modell ausgestattet ist, um ein Streudiagramm von E zu erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse können für das weitere Plotten gespeichert werden. Für Zellen kann eine zusätzliche Analyse, die Elastizitätsspektren24 , durchgeführt werden. Alle gezeigten Grafiken wurden direkt aus den GUIs von NanoPrepare und NanoAnalysis exportiert. Details zu jedem Schritt des Workflows sind im Haupttext angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Elastizität von PAAm-Hydrogelen. (A) Durchschnittliche F-δ-Kurve aus einem Satz von ~100 Kurven, die auf einem weichen PAAm-Hydrogel (erwartet E 0,8 kPa 35) und einem steifen PAAm-Hydrogel (erwartet E 8 kPa35) aufgenommen wurden. Durchgezogene Linien zeigen den Mittelwert und das schattierte Band zeigt einen SD. Die gestrichelte Linie zeigt das Hertz-Modell, das mit dem durchschnittlichen E aus der NanoAnalyse-Software gezeichnet wurde, das durch Anpassung des Hertz-Modells an jede Kurve bis zu einem maximalen Eindruck von 2.000 nm (~4% von R, R = 52 μm, k = 0,46 N/m) erhalten wurde. Kurven wurden mit dem Prominancy-Filter mit Standardparametern geglättet, und der CP wurde mit dem RoV-Algorithmus32 identifiziert. (B) Einzelwerte von E, die aus der Analyse der NanoAnalysis für statistische Vergleiche gewonnen wurden. Das Regenwolkendiagramm wurde mit dem in Referenz39 beschriebenen Python-Modul erhalten. p < 0,0001, zweiseitiger ungepaarter t-Test, α=0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Elastizität von HEK293T-Zellen. (A) Durchschnittliche F-δ-Kurve aus einem Satz von ~200 Kurven, die an sechs einzelnen HEK293T-Zellen erfasst wurden. Die durchgezogene blaue Linie zeigt den Mittelwert und das schattierte Band zeigt einen SD. Die gestrichelte Linie zeigt das Hertz-Modell, das mit dem mit der NanoAnalyse-Software berechneten Mittelwert E gezeichnet wurde, der durch Anpassung des Hertz-Modells an jede Kurve bis zu einer maximalen Einkerbung von 200 nm (~6% von R, R = 3,5 μm, k = 0,02 N / m) erhalten wurde. Kurven wurden unter Verwendung des Prominecy-Filters mit Standardparametern und eines SAVGOL-Filters34 mit Ordnung 3 und Fensterlänge 80 nm geglättet, und der CP wurde mit dem Threshold-Algorithmus33 identifiziert. Mit dem Hertz-Modell wird die Zelle als homogene Kugel mit Elastizitätsmodul E behandelt, wie schematisch im Einschub dargestellt (der Kern ist zu Bildzwecken dargestellt). (B) Durchschnittliche Elastizitätsspektren, die anhand desselben unter Buchstabe A beschriebenen Datensatzes berechnet wurden. Die durchgezogene rote Linie zeigt den Mittelwert und das schattierte Band zeigt einen SD. Durch Anpassung eines Doppelschichtmodells an die mittleren Elastizitätsspektren werden Schätzungen von E 0, Eb und d0 berechnet. Für den gezeigten Datensatz: E 0= 5,79 ± 0,09 kPa, Eb= 0,539 ± 0,002 kPa und d0 = 311 ± 3 nm (Mittelwert ± SD). (C) Vergleich zwischen dem Hertz-Modell und dem Elastizitätsspektrenansatz in Bezug auf die E-Verteilung. Für die Elastizitätsspektren stellt die Verteilung die Werte von E aus den mittleren Elastizitätsspektren dar, unabhängig von der Eindringtiefe (bis zu einer maximalen Eindringtiefe von 200 nm). Die kontinuierlichen Linien, die den Histogrammen überlagert sind, sind Gaußsche Kerndichteschätzungen der zugrunde liegenden Verteilungen. E = 915 ± 633 Pa (Hertz) und E = 890 ± 297 Pa (Elastizitätsspektren) (Mittelwert ± SD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.  

Abbildung S1: Kalibrierverfahren. (A) Erfolgreicher Wellenlängenscan. Die Auslenkung des Auslegers und die Verschiebungssignale des Piezos während des Wellenlängenscans (links). Die sinusförmige Welle auf dem Bildschirm des Interferometers am Ende des Wellenlängenscans (rechts). (B) Oberflächenverfahren finden. Die Auslenkung von Cantilever und die Verschiebung von Piezo signalisieren, wenn die Sonde nach Kontakt mit einem steifen Substrat in 1-μm-Schritten abgesenkt wird. (C) Kalibrierung des geometrischen Faktors. Während des Eindrückens eines steifen Substrats folgt die Auslenkung des Auslegers der Verschiebung des Auslegers (grüne bzw. blaue Linien). Der Einzug sollte ungefähr Null sein (rote Linie). Wenn die Auslenkung der Verschiebung zeitlich hinterherhinkt (grüne gestrichelte Linie), ist die Sonde nicht vollständig in Kontakt mit dem steifen Substrat. (D) Demodulationssignal. Das Demodulationssignal auf dem Bildschirm des Interferometers am Ende des Kalibriervorgangs (links) und beim Tippen auf den Nanoindenter (rechts). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S2: NanoPrepare GUI. Screenshots der NanoPrepare GUI. Details zur Funktionalität jedes Widgets sind im Hauptprotokoll und in der Diskussion angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S3: NanoAnalysis GUI. Screenshots der NanoAnalysis GUI. Details zur Funktionalität jedes Widgets sind im Hauptprotokoll und in der Diskussion angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Anmerkung 1: Hinzufügen von benutzerdefinierten Filtern und CP-Algorithmen zur NanoAnalyse-Software. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzprotokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S4: Tiefenabhängigkeit von mittleren Elastizitätsspektren. Das Diagramm zeigt die durchschnittlichen Elastizitätsspektren (durchgezogene rote Linie) zusammen mit einem SD (σ(E(δ)). Nach einem anfänglichen Zerfall beginnen die durchschnittlichen Elastizitätsspektren zu steigen, was hauptsächlich mit den Auswirkungen des steifen darunter liegenden Substrats auf den untersuchten scheinbaren Elastizitätsmodul zusammenhängt. Die maximale Eindringtiefe, die verwendet wird, um das Hertz-Modell an F-δ-Kurven anzupassen, und das Zerfallsmodell an die durchschnittlichen Elastizitätsspektren sollte so gewählt werden, dass das darunter liegende Substrat die Ergebnisse nicht beeinflusst (Fit-Bereich). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Dieses Protokoll zeigt, wie Kraftspektroskopie-Nanoindentationsdaten mit einem kommerziell erhältlichen Ferrule-Top-Nanoindenter sowohl auf Hydrogelen als auch auf einzelnen Zellen robust erfasst werden können. Darüber hinaus werden Anleitungen zur Verwendung einer in Python programmierten Open-Source-Software bereitgestellt, die einen präzisen Workflow für die Analyse von Nanoindentationsdaten umfasst.

Kritische Schritte im Protokoll
Die folgenden Schritte haben sich bei der Einhaltung dieses Protokolls als besonders wichtig erwiesen.

Probenvorbereitung

Es ist entscheidend, dass die Probe vor Beginn der Messungen unter Berücksichtigung der Einschränkungen der Messung vorbereitet wird. Das heißt, die Probe muss auf einer Oberfläche haften und so flach wie möglich sein. Dies ist besonders wichtig bei der Vorbereitung von Proben, die nicht auf natürliche Weise an Oberflächen haften, wie es Zellen tun, wie z. B. Hydrogele. Erstens darf die Probe nicht in Lösung schwimmen, da dies die Messungen stört und die Sonde möglicherweise beschädigt. Dazu empfiehlt sich die chemische Funktionalisierung eines Deckglases, damit das Hydrogel auf einer Oberfläche polymerisiert werden kann, die später unter Wasser auf eine Petrischale geklebt werden kann. Darüber hinaus muss die Oberfläche der Probe so flach wie möglich sein, um eine kohärente Oberflächenerkennung durch die Sonde zu gewährleisten und eine Beschädigung der Sonde beim Bewegen in x und y während eines Matrixscans zu vermeiden. Die Hydrogellösung kann auf einem hydrophoben Glasobjektträger polymerisiert werden, wodurch das resultierende Hydrogel flach wird, ohne daran zu haften. Wenn diese Überlegungen nicht befolgt werden, wird es schwierig sein, saubere F-z-Daten zu erhalten.

Im Falle der Zellvorbereitung ist es am besten, Zellen mit ähnlicher Morphologie einzudrücken, um die Datenhomogenität zu verbessern. Für den Fall, dass Zellen in einer heterogenen Population wachsen, kann ein Serumhungerschritt vor der Messung eingeleitet werden, um die Zellzyklussynchronisation zu unterstützen und somit potenzielle experimentelle Störfaktoren zu entfernen40,41. Im Falle von nicht adhärenten Zellen oder Organoidkulturen müssen zusätzliche Schritte durchgeführt werden, um die Stabilität und Haftung der biologischen Probe während der Messungen sicherzustellen. Zusätzliche Schritte können die chemische Bindung von Zellen an Kulturplatten oder die Verwendung von Gewebeklebstoffen umfassen, die jetzt weit verbreitet kommerziell verfügbar sind.

Nanoindentationsexperimente

Es ist wichtig, dass ein Ausleger mit dem richtigen k in Abhängigkeit vom erwarteten E 15 der Probe gewählt wird. Dies liegt daran, dass, wenn der Ausleger zu steif ist, die Probe eingerückt wird, aber keine signifikante Cantileverbiegung auftritt. Umgekehrt, wenn der Cantilever in Bezug auf die Probe zu weich ist, biegt sich der Cantilever mit minimaler Vertiefung übermäßig. Beide Instanzen führen zu einer Fehlberechnung von E in der nachfolgenden Analyse.

Für die Sondenkalibrierung muss die Sonde vor dem Einführen in die Kalibrierschale nass sein, um die Oberflächenspannung zu minimieren, wenn sie auf die Flüssigkeit der Kalibrierschale trifft. Andernfalls können Luftblasen eingeschlossen werden oder der Ausleger gegen die optische Faser gedrückt werden. Dies kann auch dazu führen, dass die Sonde beschädigt wird.

Die Verwendung einer dicken Glas-Petrischale wird für die Kalibrierung empfohlen. Glas ist im Vergleich zum Ausleger unendlich steif, was eine genaue Kalibrierung des k-Auslegers beim Einrücken des Glases ermöglicht. Darüber hinaus sorgt das Gewicht des Glases für ein stabiles Substrat, das im Vergleich zu einer leichteren Petrischale aus Kunststoff robuster gegen Lärm (z. B. Luftstrom und akustische Vibrationen) ist. Die Kalibrierung führt ein Linearisierungsverfahren des am Detektor gemessenen interferometrischen Signals (V/t) durch, was bedeutet, dass das Signal in eine lineare Cantileverbiegung (μm/t) umgewandelt wird, wobei der Einheitskreis (Demodulationskreis) als Linearisierungswerkzeug18 verwendet wird. Die Auslenkungsempfindlichkeit (μm/V) wird standardmäßig im Interferometer eingestellt und zur Umwandlung von V in μm verwendet. Während dieses Verfahrens wird auch der Kalibrierfaktor bestimmt, der aus der Fehlanpassung der Position zwischen der sphärischen Spitze und der Faserposition stammt, an der das Signal ausgelesen wird (Abbildung 3A). Durch das Einrücken auf einem steifen substratartigen Glas entspricht die von der Faser gemessene Auslenkung ungefähr dem vom Piezo verschobenen Abstand, was bedeutet, dass die Eindringtiefe ungefähr Null ist. Nimmt man ihr Verhältnis, erhält man den Kalibrierungsfaktor. Es ist wichtig, dass die Kalibrierung des Instruments korrekt durchgeführt wird und dass alle Prüfungen erfüllt sind, bevor mit der Erfassung der F-z-Daten fortgefahren wird.

Bei der Konfiguration eines Einrückungsprofils ist es sinnvoll, die Annahmen des Hertz-Modells zu berücksichtigen, die später zur Analyse der Daten verwendet werden. Das Hertz-Modell wird unter der Annahme abgeleitet, dass die Probe ein LEHI-unendlich erweiterter Halbraum ist, was zu folgenden praktischen Konsequenzen führt: i) die angewendeten Stämme sollten 20% nicht überschreiten (als Faustregel gilt, dass δ 10% der Spitze R nicht überschreiten sollten) und ii) δ sollte weniger als 10% der Probendicke und klein im Vergleich zu den Abmessungen der anderen Probesein 13.

Die maximale Verschiebung (oder Eindringtiefe/-kraft je nach Betriebsart) kann in Abhängigkeit von den resultierenden δ und davon, ob Oberflächen- oder Schüttguteigenschaften gewünscht sind, eingestellt werden. Wenn die Probe auf eine etwas größere δ eingerückt wurde, kann das Hertz-Modell immer noch bis zu einem maximalen δ angepasst werden, der innerhalb seiner Annahmen in der NanoAnalyse-Software liegt, und der durchschnittliche ES, der zur Schätzung dieses Bereichs verwendet wird (siehe Repräsentative Ergebnisse).

Für Zell-Nanoindentationsexperimente ist es schwierig, mehrere Matrix-Scans an derselben Zelle durchzuführen. Wenn die Zelle jedoch groß genug ist, kann es möglich sein, einen anderen geeigneten Bereich zu finden und den Vorgang an derselben Zelle zu wiederholen, z. B. ein Experiment, bei dem der Benutzer Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften einer bestimmten Region der Zelle im Vergleich zu einer anderen feststellen möchte. Normalerweise wird eine Karte pro Zelle durchgeführt, und mindestens fünf Zellen werden pro biologischem Zustand eingerückt. Es ist ratsam, das Experiment mindestens dreimal zu wiederholen, damit genügend Daten zu jeder Probe gesammelt werden (d.h. drei Replikate für jeden biologischen Zustand).

Kritisch ist, dass erfasste Kurven eine flache Basislinie, einen Übergangsbereich und einen geneigten Bereich darstellen sollten. Kurven, die keine Basislinie darstellen, können später aufgrund der Unsicherheit über die Position des CP nicht analysiert werden. Wenn Kurven von der in Abbildung 4A gezeigten Form abweichen, sollte die Kontaktschwelle optimiert werden, bevor mit dem Experiment fortgefahren wird (siehe Fehlerbehebung bei der Methode unten).

Es sollten ausreichende Daten gewonnen werden, um statistisch robuste Ergebnisse zu gewährleisten, da die Technik die mechanischen Eigenschaften lokal untersucht.

Datenanalyse

Die in diesem Protokoll beschriebene Software wird routinemäßig zur Analyse von Nanoindentationsdaten eingesetzt und wurde verwendet, um Ergebnisse zu erhalten, die in mehreren Peer-Review-Zeitschriften veröffentlicht wurden (z. B. Nanoindentation von Hydrogelen 8,21, Nanoindentation von Zellen24,42). Die Analyse von Nanoindentationsdaten ist nicht trivial. Es wird empfohlen, besonders auf die folgenden Teile zu achten:

Screening des Datensatzes: Der Datensatz sollte in der NanoPrepare-Software gründlich überprüft werden, und alle erfolglosen Kurven sollten entfernt werden, bevor der bereinigte Datensatz als JSON-Datei gespeichert wird. Kurven können weiterhin von der Analyse in der NanoAnalysis Software ausgeschlossen werden, aber die JSON-Datei kann nicht geändert werden. Um die Konsistenz zwischen dem bereinigten und dem analysierten Datensatz zu gewährleisten, wird daher empfohlen, den Screening-Prozess sorgfältig in der NanoPrepare-Software durchzuführen.

Filtern von Daten: Die Verwendung von Filtern ist nützlich, wenn die Daten verrauscht sind, und wird bei der Durchführung der ES-Analyse empfohlen. Es werden drei Hauptfilter verwendet, wie unten beschrieben.

Prominenz: Dieser Filter entfernt markante Spitzen im Fourierraum, um instrumentelle Schwingungen zu eliminieren, die typisch für kommerziell erhältliche Ferrule-Top-Nanoindenter sind. Der Filter basiert auf drei Parametern: Prominenz (a.u.): die Spitzenprominenz im Fourierraum; Mindestfrequenz (Kanäle): die zu filternde Mindestfrequenz; Band (% der Spitzenposition): die Breite um die gefilterte Frequenz in Prozent der Spitzenposition. Aktivieren Sie diesen Filter für Daten, die von handelsüblichen Ferrule-Top-Nanoindentern stammen, indem Sie auf das Kontrollkästchen klicken und die Standardparameter beibehalten.

Savitzky Golay (SAVGOL), Algorithmus aus der SciPy-Bibliothek34 (scipy.signal.savgol_filter): Dieser Filter glättet die Daten basierend auf einer lokalen Polynomapproximation der kleinsten Quadrate. Aktivieren Sie diesen Filter, wenn die Daten besonders verrauscht sind. Ändern Sie die Reihenfolge des Polynoms und die Länge des Filterfensters in der GUI, je nachdem, wie verrauscht die Daten sind. Weitere Einzelheiten finden Sie unter den Referenzen30,31. Aktivieren Sie diesen Filter für die ES-Analyse.

Medianfilter, Algorithmus aus der SciPy-Bibliothek34 (scipy.signal.medfilt): Dieser Filter glättet die Daten, indem jeder Punkt durch den Median ersetzt wird, der um diesen Punkt in einem bestimmten Fenster berechnet wird. Ändern Sie die Fensterlänge in der GUI, je nachdem, wie verrauscht die Daten sind. Dieser Filter wird als Alternative zum SAVGOL-Filter verwendet.

Die Aktivierung des Prominenzfilters hilft, instrumentelles Rauschen (niederfrequente Schwingungen) zu entfernen, das für kommerzielle Ferrule-Top-Nanoindenter typisch ist. In der Regel ist die Aktivierung anderer Filter wie dem SAVGOL34 bei der einfachen Hertz-Analyse nicht notwendig. Bei der Berechnung des ES wird empfohlen, sowohl den Prominenzfilter als auch den SAVGOL-Filter34 zu aktivieren, wobei je nach Rauschpegel in den Daten ein Glättungsfenster angezeigt wird. Dies liegt daran, dass der ES einen abgeleiteten Term (Gleichung 2) enthält, der sehr empfindlich auf Rauschen reagiert. Zum Beispiel wurden die Ergebnisse in Abbildung 7 unter Verwendung des Prominenzfilters zusammen mit einem SAVGOL-Filter34 mit Fenster 80 nm und Polynomordnung 3 erhalten. Es ist jedoch wichtig, die Daten nicht zu glätten, da dies Unterschiede zwischen den Datensätzen verbergen kann.

CP-Identifikation: Der wichtigste Teil der Analyse ist die Identifizierung der CP, die sowohl den absoluten Wert von E als auch seine Verteilungstark beeinflusst 32,33. Vier Algorithmen, die auf automatischen Suchverfahren basieren, die den CP lokalisieren, um menschliche Verzerrungen zu beseitigen, wurden in der NanoAnalyse-Software implementiert. Alle Algorithmen sind in der Literatur32,33 dokumentiert. Im Allgemeinen wird jeder Punkt in einer Region von Interesse als Versuchs-CP getestet, während ein algorithmusspezifischer Parameter berechnet wird. Der Punkt, der den optimierten Parameter zurückgibt, der je nach Algorithmus sein Maximal- oder Minimalwert sein kann, wird als CP32 genommen. Diese Verfahren wurden implementiert, um menschliche Vorurteile zu beseitigen und einen statistischen Ansatz für das Problem zu verfolgen. Da jeder Algorithmus den CP basierend auf der Optimierung eines bestimmten Parameters berechnet, unterscheidet sich der identifizierte CP für jeden Algorithmus geringfügig. Daher ist es von größter Bedeutung, den gleichen CP-Algorithmus und spezifische Parameter (z. B. Fensterlänge für den RoV-Algorithmus) zwischen den Datensätzen beizubehalten, die man vergleichen möchte, da relative Unterschiede in E erhalten bleiben. Die verschiedenen CP-Algorithmen und ihre Parameter sind im Folgenden zusammengefasst.

Güte der Anpassung (GoF): Ein Ansatz, der auf der Anpassung eines Kontaktmechanikmodells (Hertz) aus jedem (z, F) Paar in einer Region von Interesse und der Auswahl der Anpassung mit dem höchsten R2-Wert basiert. Es funktioniert gut dort, wo der Übergang zwischen berührungslos und kontaktbehaftet ist, was bei steifen Materialien wie hochvernetzten Hydrogelen der Fall ist. Der Algorithmus ist rechenintensiv und im Allgemeinen der langsamste. Hier wurde es so implementiert, dass das Hertz-Modell nur bis zu einer maximalen δ von etwa 10% von R bestückt wird, da dies nachweislich genauere Ergebnisse liefert32.

Varianzverhältnis (RoV): Ein Ansatz, der auf der Berechnung des Verhältnisses der Varianz des Ablenkungssignals (Kraftsignals) im berührungslosen und Kontaktbereich32 basiert.

Zweite Ableitung: Ein Ansatz, der auf der zweiten Ableitung des Ablenkungssignals33 basiert. Es funktioniert gut, wenn das Signal sauber ist. Wenn das Signal zu laut ist, wird dieser Ansatz nicht empfohlen.

Schwellenwert: Ein Ansatz, der auf der mittleren Durchbiegung (Kraft) im berührungslosen Bereich33 basiert. Kurz gesagt, ausgehend von einem vom Benutzer ausgewählten Kraftwert in der Nähe des Kontaktbereichs iteriert der Algorithmus durch jeden Punkt in Richtung Basislinie, bis er den ersten Punkt findet, dessen Kraftwert größer als der Durchschnitt der Basislinie ist. Dieser Punkt wird als CP ausgewählt. Dieser Algorithmus ist sehr robust und wird empfohlen.

Details zur Verwendung der einzelnen Algorithmen finden Sie unten. Die CP-Algorithmen beinhalten numerische Konstanten, die in der GUI geändert werden müssen, um sie an den spezifischen Datensatz anzupassen. Insbesondere sind die folgenden Parameter für die GoF-, die RoV- und die zweite Ableitungsmethode gemeinsam, so dass ein Teilbereich der Kurven (Region of Interest oder ROI) ausgewählt werden kann, nach dem der CP gesucht wird:

Sicherer Schwellenwert (nN): Definiert die maximale Kraft in nN (und den entsprechenden z-Punkt ), von der aus der CP gesucht wird. Dies ist die rechte Grenze des ROI, dessen Standardwert 10 nN ist. Alle Kurven, deren maximale Kraft unter diesem Schwellenwert liegt, werden automatisch auf den fehlgeschlagenen Satz verschoben. Ändern Sie diesen Wert in einen Kraftwert, der leicht über dem Übergang von berührungslos zu kontaktlos liegt.

X-Bereich (nm): Definiert den Bereich in nm vom z-Punkt , der dem sicheren Schwellenwert entspricht. Dies ist die linke Grenze des ROI. Der Standardwert von 1.000 nm ist ein guter Ausgangspunkt, aber wenn der CP zu spät in der Kurve (d. h. im geneigten Bereich) gefunden wird, erhöhen Sie diesen Wert. Umgekehrt, wenn der CP zu früh (d. h. in der Baseline) gefunden wird, verringern Sie diesen Wert.

Die für jeden Algorithmus spezifischen Parameter sind hier zusammengefasst. Für die GoF stellt der Window Fit (nm) das Fenster in nm vom Versuchs-CP dar, an das das Hertz-Modell angepasst ist. Dieser ist auf einen Wert von 10% von R begrenzt. Für den RoV stellt der Fenster-RoV (nm) das Fenster in nm links und rechts des Versuchs-CP dar, über das die Varianz des Ablenksignals berechnet wird. Für die zweite Ableitung stellt das Fenster P (nm) das Fenster dar, das an den SAVGOL-Filter34 übergeben wird, der zur Berechnung der zweiten Ableitung des Ablenkungssignals (Kraftsignals) verwendet wird. Standardwerte wurden durch Testen der verschiedenen Algorithmen festgelegt und es ist im Allgemeinen nicht erforderlich, sie zu ändern.

Für den Schwellenwertalgorithmus können die folgenden Parameter geändert werden:

Ausrichtungsschwelle (nN): Die Kraft (F0), von der aus der CP von diesem Punkt aus gesucht wird und sich in Richtung der Basislinie bewegt. Alle Kurven, deren maximale Kraft unter diesem Schwellenwert liegt, werden automatisch auf den fehlgeschlagenen Satz verschoben. Der Standardwert ist 10 nN; Ändern Sie diesen Wert jedoch in einen Kraftwert, der etwas über dem Übergang von berührungslos zu kontaktbehaftet ist. Der entsprechende z-Punkt (z0) wird zur späteren Verwendung im Algorithmus gespeichert (siehe unten).

Align left step (nm): Dieser Parameter definiert die Verschiebung, die links von z 0 (Standardwert 2.000 nm) hinzugefügt werden soll, was zur Berechnung eines Punktes führt, der durch (z 0 - align left step) definiert ist. Dieser Punkt ist der Punkt, um den herum der Durchschnitt der Basislinie berechnet wird (siehe unten).

Durchschnittliche Fläche (nm): Dieser Parameter definiert die durchschnittliche Fläche links und rechts von (z0 - linken Schritt ausrichten), über die der Durchschnitt der Basislinie berechnet wird. Der Standardwert ist 100 nm und muss nicht geändert werden.

Iteriert man von F0 nach unten, wird der CP als erster Punkt genommen, dessen Wert über der Kraft liegt, die durch den Mittelwert der Basislinie definiert ist.

Anmerkung zu ES und Rauschen: Der durchschnittliche ES kann zunächst verrauscht mit markanten sinusförmigen Schwingungen erscheinen, so dass Gleichung (3) möglicherweise nicht richtig passt. Wenn dies der Fall ist, löst das Vergrößern des Fensters des glättenden SAVGOL-Filters34 dieses Problem normalerweise.

Änderungen und Fehlerbehebung der Methode

Fehlerbehebung der Methode

Fehlerbehebung bei Wellenlängenscans
Wenn nach dem Wellenlängenscan eine Fehlermeldung auf dem Display des Interferometers angezeigt wird, können folgende Probleme die Ursache sein: i) Die Umgebung kann durch Lärm kontaminiert sein. Entfernen Sie alle Geräuschquellen, einschließlich Luftstrom, laute Geräusche und mechanische Vibrationen. ii) Die Sonde ist möglicherweise nicht richtig angeschlossen. Trennen Sie den grünen Glasfaseranschluss und stecken Sie ihn wieder ein. iii) Der Ausleger kann schmutzig sein. Reinigen Sie es, indem Sie die Sonde für einige Minuten in eine Petrischale tauchen, die Isopropanol enthält, und dann Wasser; iv) Auf dem Ausleger kann eine Luftblase vorhanden sein. Tauchen Sie die Sonde in eine Petrischale, die Isopropanol enthält, und erzeugen Sie eine gewisse Strömung, indem Sie die Flüssigkeit auf und ab pipettieren. v) Der Ausleger kann an der Faser gebogen / haften, was unter dem Mikroskop zu sehen ist. Lassen Sie es los, indem Sie den Ausleger vorsichtig mit einem Taschentuchtuch berühren. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie den Ausleger berühren, da die Anwendung übermäßiger Kraft ihn brechen kann. vi) Der Ausleger fehlt in der Sonde, der unter dem Mikroskop zu sehen ist. Die einzige Lösung ist die Verwendung einer neuen Sonde. Versuchen Sie den Wellenlängenscan erneut, der nun erfolgreich sein sollte.

Fehlerbehebung bei der Kalibrierung
Wenn die Kalibrierung fehlschlägt und der neue Faktor entweder NaN ist oder nicht im erwarteten Bereich liegt, können folgende Probleme die Ursache sein: i) Die Spitze ist nicht vollständig mit dem Substrat in Kontakt. Stellen Sie sicher, dass die Spitze mit dem Substrat in Kontakt kommt, indem Sie die im Protokoll angegebenen Schritte befolgen. ii) Anziehungskräfte zwischen der Spitze und der Glasoberfläche (Schnappverhalten) führen zur Kalibrierung des übergebogenen Auslegers. Reinigen Sie die Sonde, indem Sie sie 5 Minuten lang in Isopropanol suberieren und dann gießen. Reinigen Sie die Schale mit Isopropanol; iii) Die Kippe/Schale kann kontaminiert sein: Reinigen Sie die Sonde, indem Sie sie 5 min lang in Isopropanol und dann in Wasser subertieren. Reinigen Sie die Schale mit Isopropanol; iv) Der Ausleger kann an der Faser gebogen/haften. Lassen Sie es los, indem Sie es sanft mit einem Taschentuchtuch berühren. Wiederholen Sie nach der Fehlerbehebung sowohl den Wellenlängenscan als auch die Kalibrierung.

Fehlerbehebung bei Kontakten
Wenn Kurven von der in Abbildung 4A gezeigten Form abweichen, müssen die experimentellen Parameter angepasst werden, bevor mit dem Experiment fortgefahren werden kann. Zwei der häufigsten Probleme sind:

Eine Annäherungskurve, bei der die Spitze niemals mit der Probe in Berührung kommt (Abbildung 4B). Dies tritt auf, wenn die Kontaktschwelle auf einen zu niedrigen Wert eingestellt wird und das Geräusch dazu führt, dass sich der Ausleger um einen Betrag biegt, der dem angegebenen Schwellenwert entspricht. Um dieses Problem zu beheben, navigieren Sie zum Menü Optionen , erhöhen Sie den Schwellenwert langsam bei Schritten von 0,01, und führen Sie einen Einzug durch, bis die Kurve der in Abbildung 4A gezeigten ähnelt. Das Verringern der Geschwindigkeit im selben Menü kann ebenfalls zur Lösung dieses Problems beitragen.

Eine Annäherungskurve, bei der die Spitze in Kontakt mit der Probe begann (Abbildung 4C). Dies geschieht, wenn die Kontaktschwelle auf einen zu hohen Wert eingestellt ist und sich der Cantilever beim ersten Berühren der Probe nicht um den Betrag biegt, der dem angegebenen Schwellenwert entspricht. Um dieses Problem zu beheben, verringern Sie langsam den Schwellenwert im Menü Optionen bei Schritten von 0,01, und führen Sie einen Einzug durch, bis die Kurve der in Abbildung 4A gezeigten ähnelt. Dieses Problem ist besonders problematisch, da das Fehlen einer Basislinie die korrekte Berechnung der CP verhindert, was schließlich zu einer Fehlberechnung von E führt.

Änderungen der Methode
Das Protokoll kann erweitert werden, um das E verschiedener Arten von Hydrogelen zu quantifizieren. PAAm-Hydrogele wurden für dieses Protokoll ausgewählt, da sie die am häufigsten verwendeten Hydrogele im Bereich der Mechanobiologie sind. Das Protokoll ist jedoch gleichermaßen auf jede Art von elastischem Hydrogel25 anwendbar, sowohl synthetisch, beispielsweise Polyethylenglykol (PEG)43 als auch Gelatinemethacryloyl (GelMA)44,45; und natürlich, wie Kollagen46. Darüber hinaus gibt es innerhalb angemessener Grenzen keine Einschränkungen hinsichtlich der Abmessungen der zu prüfenden Probe. Zum Beispiel wurde dieses Protokoll verwendet, um das E von synthetischen PEG-Hydrogelen zu quantifizieren, die später mit einem Bulk-Rheometer getestet wurden und ~ 15 mm im Durchmesser und ~ 2 mm in der Dicke8 haben mussten. Das Protokoll wurde auch implementiert, um das E von PDMS-Membranen zu charakterisieren, die in einer Petrischale polymerisiert wurden (Ergebnisse nicht veröffentlicht).

Neben der Standardeindringung einzelner Zellen mit einem herkömmlichen inversen Phasenkontrastmikroskop sind Ferrule-Top-Nanoindenter mit komplexen Bildgebungssystemen kompatibel und wurden verwendet, um die lokale Elastizität subzellulärer Strukturen wie Zellkern und Zytoplasmazu untersuchen 47. Während die Schritte je nach optischem System angepasst werden müssen, ist dieses Protokoll von allgemeiner Anwendbarkeit in Bezug auf die Durchführung von Nanoindentationsexperimenten und die Analyse der resultierenden Daten.

Darüber hinaus ist das Protokoll nicht auf die Messung der mechanischen Eigenschaften von Zellen und Hydrogelen beschränkt und kann angepasst werden, um die lokalen elastischen Eigenschaften komplexerer Systeme zu messen, einschließlich Organoide48, Sphäroide49 und ganze Gewebe wie Nieren, Leber, Milz und Gebärmutter23. Der Leser wird zu den Referenzen 23,48,49 für Besonderheiten bei der Durchführung von Nanoindentationsexperimenten an solchen Proben geleitet. Ein zu berücksichtigender Aspekt ist, dass die Wegregelung im Open-Loop-Modus arbeitet und keine Rückmeldung von der Probe erhält. Daher sind konstante Spannungen/Dehnungen und Geschwindigkeiten nicht gewährleistet, und weichere Teile der Probe werden im Vergleich zu steiferen Bereichen mehr und schneller eingerückt. Dies ist relevant für mechanisch heterogene Proben wie Gewebe, bei denen es angemessener ist, entweder die Eindringkontrolle (I-Modus) oder die Lastkontrolle (P-Modus) zu wählen, um eine konsistente Spannung/Dehnung und Geschwindigkeit über mechanisch heterogene Bereiche der Probe hinweg zu gewährleisten.

Einschränkungen der Methode
Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Viskoelastizität neben der Elastizität eine wichtige Rolle bei der Regulierung physiologisch und pathologisch relevanter Prozesse spielt. Dies liegt daran, dass Zellen, die EZM und Gewebe viskoelastisch sind und die Elastizität nur eine Komponente ihres mechanischen Verhaltens darstellt50,51,52,53. Während Ferrule-Top-Nanoindenter Funktionen zur Charakterisierung der Viskoelastizität bieten, einschließlich Spannungsrelaxation, Kriechkonformität und dynamisch-mechanischer Analyse, um sowohl den Speicher- als auch den Verlustmodul über verschiedene Frequenz- (Zeit-) Regime zu extrahieren, konzentriert sich dieses Protokoll nur auf die Elastizität, die im Kontext der Mechanobiologie und des Tissue Engineering die am besten untersuchte mechanische Variable bleibt (siehe z. B. Referenz3).

Die zugrunde liegende Annahme mit Konsequenzen sowohl für Experimente als auch für die Datenanalyse ist, dass sich das eingerückte Substrat wie ein LEHI-Feststoff verhält. Dies bedeutet, dass die Spannungs-Dehnungs-Reaktion linear ist, es keine zeitabhängigen Verhaltensweisen gibt und die Probe mechanisch homogen und isotrop ist. Basierend auf diesen Annahmen werden die mechanischen Eigenschaften des Substrats durch den Elastizitätsmodul nach einem spezifischen kontaktmechanischen Modell, in diesem Fall dem Hertz-Modell (Gleichung 1), quantifiziert. Für kleine quasistatische Kräfte/Verformungen verhalten sich chemisch vernetzte Hydrogele wie PAAm-Gele, die in diesem Protokoll35 verwendet werden, fast so elastische Feststoffe und viskoelastische Effekte sind minimal und vernachlässigbar53. Auf der anderen Seite sind Zellen keine LEHI-Festkörper und zeigen komplexes mechanisches Verhalten9. Der Elastizitätsmodul der Zellen hängt stark von der Dehnungsrate (d.h. Geschwindigkeit) des Eindringvorgangs ab, es ist jedoch kein klarer Trend festzustellen, und zusätzliche Variablen wie Spitzengröße und maximale Eindringtiefe beeinflussen diese Beziehung9. Bei quasistatischen Verformungen, wie sie in diesem Protokoll verwendet werden (v = 5 μm/s), zeigen die Zellen jedoch eine ausgeprägte elastische Reaktion und die dissipativen Effekte sind minimal9. Die Dehnungsratenabhängigkeit kann durch komplexere Modelle unter Berücksichtigung zeitabhängiger Variablen erfasst werden, auf die sich der Leser bezieht54.

Nach derselben zugrunde liegenden Annahme wird das Poisson-Verhältnis (ν) sowohl in der Hertz- als auch in der ES-Analyse als 0,5 angenommen. Beim Vergleich zwischen Stichproben wirkt sich dies nur als Koeffizient auf die Ergebnisse aus. Es hat sich jedoch gezeigt, dass ν eine frequenzabhängige Größe für Zellen55 ist und von 0,5 für Hydrogele56 abweicht.

Eine weitere Einschränkung des Protokolls besteht darin, dass die Software keine Quantifizierung von E durch ausgefeiltere kontaktmechanische Modelle bietet. Das Hertz-Modell ist das am häufigsten verwendete Kontaktmechanikmodell in AFM-Experimenten und es ist äußerst effektiv13,15; Komplexere Ereignisse wie kurz- oder langreichweitige Anziehungskräfte zwischen Spitze und Probe werden jedoch nicht berücksichtigt. Komplexere Modelle wie das Johnson-Kendall-Roberts-Modell können diese Verhaltensweisen erfassen13, sind aber nicht in der Software implementiert. Für einen Überblick über verschiedene kontaktmechanische Modelle unterschiedlicher Komplexität wird der Leser auf Referenz13 verwiesen.

Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/alternative Methoden
Der gebräuchlichste Ansatz zur Quantifizierung der lokalen elastischen Eigenschaften von Biomaterialien und einzelnen Zellen auf der Mikroskala ist AFM13,14,15,16. Obwohl das AFM ein leistungsstarkes und vielseitiges Instrument ist, erfordert es aufgrund seines komplexen Aufbaus eine umfangreiche Schulung, bevor Benutzer Experimente robust durchführen können. Ferrule-Top-Nanoindenter bieten eine Plug-and-Play-Lösung und ermöglichen gleichzeitig die Anwendung von nN-Kräften mit μm-Auflösung, um die lokalen mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien zu untersuchen (z. B. Referenzen 8,19,20,21). Während standardisierte Protokolle für die Verwendung des AFM im Kontext der Mechanobiologie16 und des Tissue Engineering14 existieren, gibt es keine Protokolle, die den Betrieb von Ferrule-Top-Nanoindenter-Geräten detailliert beschreiben. Dieses Protokoll ermöglicht es einem unerfahrenen Benutzer, Nanoindentationsexperimente sowohl an Hydrogelen als auch an Zellen durchzuführen, indem Richtlinien befolgt werden, die den experimentellen Arbeitsablauf innerhalb der Gemeinschaft standardisieren sollen. Darüber hinaus ist die Datenanalyse von Nanoindentationsexperimenten nicht trivial und würde für Benutzer ohne Programmiererfahrung weitgehend unzugänglich bleiben. Es werden Anweisungen für die Verwendung einer intuitiven Software bereitgestellt, die es ermöglicht, den erfassten Datensatz im Light- und Standardformat zu bereinigen und zu speichern und sowohl die Standard-Hertz-Analyse als auch die ES-Analyse24 mit wenigen Klicks und reproduzierbar durchzuführen.

Durch die Befolgung dieses Protokolls erhält man Ergebnisse, die mit denen vergleichbar sind, die mit dem AFM erzielt wurden, sowohl für Hydrogele E (Ergebnisse in Abbildung 6 im Vergleich zu denen in Referenz35) als auch für die mechanischen Eigenschaften der Zellen (Ergebnisse in Abbildung 7 im Vergleich zu denen in Referenz24) bei einem Bruchteil der Komplexität. Die Methode ist allgemein anwendbar und kann an verschiedene Arten von Nanoindentern angepasst werden, sofern einige Schritte basierend auf dem spezifischen Gerät modifiziert werden.

Bedeutung und Einsatzmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen
Die Charakterisierung der elastischen Eigenschaften von Zellen, Hydrogelen und Geweben ist in vielen Forschungslabors mit Schwerpunkt auf Mechanobiologie, Tissue Engineering / regenerativer Medizin und darüber hinaus üblich3. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die elastischen Eigenschaften einzelner Zellen, Hydrogele zu quantifizieren und für Gewebe und komplexere Biomaterialien im Kontext physiologisch relevanter Prozesse angepasst zu werden, die durch eine Änderung der mechanischen Eigenschaften gekennzeichnet sind. Um beispielsweise die Dynamik der nativen ECM nachzuahmen, wurde gezeigt, dass abbaubare 3D-PEG-Laminin-Hydrogele es den Zellen ermöglichen, ihre Umgebung umzugestalten, was zu einer Abnahme des E der Gele um ~ 50% über einen Zeitraum von 9 Tagen im Vergleich zu den gleichen Gelen ohne Zellenführt 21. Das Protokoll ist von allgemeiner Anwendbarkeit und ist nicht auf die hierin beschriebenen Proben und den optischen Aufbau beschränkt. Es ist vorgesehen, dass dieses Protokoll die Verwendung von Nanoindentern in Forschungslabors erleichtern wird, die sich auf die Untersuchung mechanischer Eigenschaften in Physiologie und Krankheit konzentrieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

GC und MAGO erkennen alle Mitglieder des CeMi an. MSS würdigt die Unterstützung durch einen EPSRC-Programmzuschuss (EP/P001114/1).

GC: Software (Beitrag zur Softwareentwicklung und Algorithmen), formale Analyse (Analyse von Nanoindentationsdaten), Validierung, Untersuchung (Nanoindentationsexperimente an Polyacrylamidgelen), Datenkuration, Schreiben (Originalentwurf, Review und Bearbeitung), Visualisierung (Abbildungen und Grafiken). MAGO: Untersuchung (Vorbereitung von Gel- und Zellproben, Nanoindentationsexperimente an Zellen), Schreiben (Originalentwurf, Review und Editierung), Visualisierung (Abbildungen und Grafiken). NA: Validierung, Schreiben (Review und Editierung). IL: Software (Beitrag zur Softwareentwicklung und Algorithmen), Validierung, Schreiben (Review und Editing); MV: Konzeptualisierung, Software (Design und Entwicklung von Originalsoftware und Algorithmen), Validierung, Ressourcen, Schreiben (Originalentwurf, Review und Redaktion), Supervision, Projektadministration, Mittelakquise MSS: Ressourcen, Schreiben (Review und Editing), Supervision, Projektadministration, Mittelakquise. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm coverslips VWR 631-1577P
35 mm cell treated culture dishes Greiner CELLSTAR 627160
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
Acrylsilane Alfa Aesar L16400
Ammonium Persulfate Merk 7727-54-0
Bisacrylamide Merk 110-26-9
Chiaro nanoindenter Optics 11 Life  no catologue number
Ethanol general
Fetal bovine serum Gibco 16140071
High glucose DMEM Gibco 11995065
Isopropanol general
Kimwipe Kimberly Clark 21905-026
Microscope glass slides VWR 631-1550P
MilliQ system Merk Millipore ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer Optics11 Life no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um) Optics 11 Life no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um) Optics 11 Life no catologue number
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
RainX rain repellent RainX 26012
Standard petri dishes (90 mm) Thermo Scientific 101RTIRR
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich 110-18-9
Vaccum dessicator Thermo Scientific 531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1) Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional) Microsoft
Python 3 Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional) Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ciccone, G., Azevedo Gonzalez Oliva, M., Antonovaite, N., Lüchtefeld, I., Salmeron-Sanchez, M., Vassalli, M. Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation. J. Vis. Exp. (179), e63401, doi:10.3791/63401 (2022).

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