Summary
Micro-CT هي أداة غير مدمرة يمكنها تحليل الهياكل النباتية في ثلاثة أبعاد. يصف هذا البروتوكول تحضير العينة للاستفادة من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتحليل بنية النبات الطفيلي ووظيفته. يتم استخدام أنواع مختلفة لتسليط الضوء على مزايا هذه الطريقة عندما تقترن باستعدادات محددة.
Abstract
أصبح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق أداة راسخة في التحقيق في بنية النبات ووظيفته. سمحت طبيعتها غير المدمرة ، جنبا إلى جنب مع إمكانية التصور ثلاثي الأبعاد والتقسيم الافتراضي ، بتحليل جديد ومفصل بشكل متزايد للأعضاء النباتية المعقدة. يمكن أيضا استكشاف التفاعلات بين النباتات ، بما في ذلك بين النباتات الطفيلية ومضيفيها. ومع ذلك ، يصبح تحضير العينة قبل المسح أمرا بالغ الأهمية بسبب التفاعل بين هذه النباتات ، والتي غالبا ما تختلف في تنظيم الأنسجة وتكوينها. علاوة على ذلك ، يجب مراعاة التنوع الواسع للنباتات المزهرة الطفيلية ، بدءا من الأجسام النباتية شديدة الانخفاض إلى الأشجار والأعشاب والشجيرات ، أثناء أخذ العينات ومعالجتها وتحضير المواد المضيفة للطفيليات. هنا يتم وصف نهجين مختلفين لإدخال حلول التباين في الطفيلي و / أو النباتات المضيفة ، مع التركيز على تحليل haustorium. يعزز هذا العضو الاتصال والتواصل بين النباتين. باتباع نهج بسيط ، يمكن استكشاف تفاصيل تنظيم أنسجة haustorium ثلاثية الأبعاد ، كما هو موضح هنا للأنواع الطفيلية euphytoid والكرمة والهدال. كما يسمح اختيار عوامل التباين المحددة ونهج التطبيق بمراقبة مفصلة لانتشار الطفيليات الداخلية داخل الجسم المضيف والكشف عن الاتصال المباشر من سفينة إلى أخرى بين الطفيلي والمضيف ، كما هو موضح هنا لطفيلي جذر ملزم. وبالتالي ، يمكن تطبيق البروتوكول الذي تمت مناقشته هنا على التنوع الواسع للنباتات المزهرة الطفيلية لتعزيز فهم تطورها وهيكلها وعملها.
Introduction
التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية عالي الدقة (micro-CT) هو طريقة تصوير يتم فيها تسجيل صور شعاعية متعددة (إسقاطات) لعينة من زوايا مشاهدة مختلفة وتستخدم لاحقا لتوفير إعادة بناء افتراضية للعينة1. يمكن بعد ذلك تحليل هذا الكائن الافتراضي ومعالجته وتجزئته ، مما يسمح بالاستكشاف غير المدمر في ثلاثة أبعاد2. تم تصميم التصوير المقطعي المحوسب الدقيق في البداية للتحليلات الطبية وبعد ذلك للتطبيقات الصناعية ، كما يوفر ميزة تصور الأعضاء والأنسجة الداخلية دون الحاجة إلى إجراءات جراحية3. مثل أشكال التصوير الأخرى ، يعمل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع المفاضلة بين مجال الرؤية وحجم البكسل ، مما يعني أن التصوير عالي الدقة للعينات الكبيرة يكاد يكون بعيد المنال4. يتم باستمرار إحراز تقدم في استخدام مصادر الأشعة السينية عالية الطاقة (أي السنكروترون) والتكبير البصري الثانوي ، مما يسمح لأصغر دقة بالوصول إلى أقل من 100 نانومتر 5,6. ومع ذلك ، فإن أوقات المسح الأطول ضرورية للعينات الكبيرة ، مما يزيد من فرصة القطع الأثرية بسبب حركة العينة أو تشوهها داخل الماسح الضوئي. علاوة على ذلك ، فإن التصوير المقطعي المحوسب الدقيق محدود بشكل عام بسبب اختلافات الكثافة الطبيعية داخل العينة وكيفية تفاعل العينة مع الأشعة السينية. في حين أن جرعة الأشعة السينية الأعلى هي الأفضل لاختراق العينات الأكثر كثافة ، إلا أنها أقل كفاءة في التقاط الاختلافات في الكثافة داخل العينة وبين الوسط المحيط بها7. من ناحية أخرى ، توفر جرعة الأشعة السينية المنخفضة قوة اختراق أقل وغالبا ما تتطلب أوقات مسح أطول ولكن حساسية أكبر في اكتشاف الكثافة7.
لطالما أعاقت هذه القيود استخدام التصوير المقطعي المجهري لعلوم النبات ، بالنظر إلى أن معظم الأنسجة النباتية تتكون من أنسجة خفيفة (غير كثيفة) ذات امتصاص منخفض للأشعة السينية8. ركزت التطبيقات الأولى للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق على رسم خرائط لشبكات الجذر داخل مصفوفة التربة 9,10. في وقت لاحق ، بدأ استكشاف الهياكل النباتية ذات الاختلافات الأكثر أهمية في كثافة الأنسجة ، مثل الخشب. وقد سمح ذلك بفحص وظائف نسيج الخشب 11،12 ، وتطوير منظمات الأنسجة المعقدة 13،14 ، والتفاعلات بين النباتات15،16،17. أصبح تحليل الأنسجة الرخوة والمتجانسة واسع الانتشار بسبب عوامل التباين ، والتي أصبحت الآن إجراء قياسيا في الاستعدادات للمسح المقطعي المحوسب الدقيق لعينات النبات. ومع ذلك ، يمكن أن يكون لبروتوكولات إدخال التباين نتائج مختلفة اعتمادا على حجم العينة والخصائص الهيكلية ونوع الحل المستخدم8. من الناحية المثالية ، يجب أن يعزز عامل التباين التمييز بين الأنسجة المختلفة ، وتمكين تقييم وظائف الأنسجة / الأعضاء ، و / أو توفير معلومات كيميائية حيوية حول الأنسجة18. لذلك ، تصبح معالجة العينات المناسبة وإعدادها وتركيبها قبل المسح أمرا بالغ الأهمية لأي تحليل مقطعي محوسب دقيق.
Micro-CT من haustorium النبات الطفيلي
تمثل النباتات المزهرة الطفيلية مجموعة وظيفية متميزة من كاسيات البذور تتميز بعضو يعرف باسم haustorium19. يعمل هذا العضو متعدد الخلايا ، وهو هجين تنموي بين جذع معدل وجذر ، على ارتباط المضيف واختراقه واتصاله بواسطة طفيلي20. لهذا السبب ، يعتبر haustorium "يجسد فكرة التطفل بين النباتات"21. يعد الفهم التفصيلي لتطور هذا العضو وهيكله وعمله أمرا بالغ الأهمية لعلم البيئة النباتية الطفيلية والتطور ودراسات الإدارة. ومع ذلك ، فإن التعقيد العام للنباتات الطفيلية والبنية المعدلة للغاية و haustoria غالبا ما يعيقان التحليل التفصيلي والمقارنة. عادة ما تكون وصلات Haustorium واسعة النطاق وغير متجانسة في توزيع الأنسجة والخلايا (الشكل 1). في هذا السياق ، في حين أن العمل مع شظايا الأنسجة الصغيرة يسمح بمعالجة أسهل ودقة أعلى ، يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات خاطئة حول البنية ثلاثية الأبعاد للهياكل المعقدة ، مثل نبات haustorium الطفيلي.
على الرغم من وجود أدبيات واسعة حول تشريح haustorium والبنية التحتية لمعظم أنواع النباتات الطفيلية ، إلا أن التنظيم ثلاثي الأبعاد والعلاقة المكانية بين أنسجة الطفيليات والمضيف لا تزال غير مستكشفةبشكل جيد 17. في عمل حديث قام به Masumoto et al.22 ، تم تصوير أكثر من 300 مقطع ميكروتومي شبه رقيق متسلسل وإعادة بنائه في كائن افتراضي ثلاثي الأبعاد يمثل haustorium لنوعين من الطفيليات. يوفر المستوى الممتاز من التفاصيل لهذه الطريقة رؤى غير مسبوقة في بنية 3-D الخلوية والتشريحية في haustorium. ومع ذلك ، فإن مثل هذه التقنية التي تستغرق وقتا طويلا ستمنع إجراء تحليل مماثل في الطفيليات ذات وصلات haustorium أكثر شمولا. يظهر استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق كأداة ممتازة للتحليل ثلاثي الأبعاد للنباتات الطفيلية المعقدة والضخمة في كثير من الأحيان. على الرغم من أنها ليست بديلا عن التقسيم التشريحي التفصيلي والأشكال التكميلية الأخرى لتحليلات الفحص المجهري17,23 ، إلا أن النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، خاصة بالنسبة للعينات الكبيرة ، يمكن أيضا أن تكون بمثابة دليل لتوجيه أخذ العينات الفرعية للأجزاء الأصغر ، والتي يمكن تحليلها بعد ذلك باستخدام أدوات أخرى ، مثل المجهر البؤري والإلكتروني ، أو إعادة تحليلها باستخدام أنظمة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة عالية الدقة.
الشكل 1: النباتات الطفيلية ذات المجموعات الوظيفية المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول. الطفيلي Euphytoid Pyrularia pubera (A) ، الطفيلي الداخلي Viscum الحد الأدنى (B) مع الفواكه الخضراء (دائرة سوداء متقطعة) ، الكرمة الطفيلية Cuscuta americana (C) ، الهدال Struthanthus martianus (D) ، يلزم طفيلي الجذر Scybalium fungiforme (E). تسهل أجزاء الجذر المضيف (Hr) أو الساق (Hs) تطبيق التباين في الطفيلي haustorium (P). يسمح وجود جذر / ساق الأم الطفيلية (الأسهم) في العينة بتحليل تنظيم وعاء haustorium. تشير المستطيلات إلى أجزاء من العينة المستخدمة للتحليل. أشرطة المقياس = 2 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
نظرا لأن التصوير المقطعي المحوسب الدقيق أصبح تقنية شائعة بشكل متزايد في علوم النبات ، فهناك أدلة وبروتوكولات وأدبيات تتعامل مع مسح العينات وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد والتجزئة والتحليل3،10،24. وبالتالي ، لن تتم مناقشة هذه الخطوات هنا. كما هو الحال مع أي تقنية تخيل ، يعد العلاج المناسب وتركيب العينات أمرا أساسيا ، وإن كان غالبا ما يتم تجاهله. لهذا السبب ، يركز هذا البروتوكول على إعداد عينات haustorium للمسح المقطعي المحوسب الدقيق. وبشكل أكثر تحديدا ، يصف هذا البروتوكول طريقتين لإدخال عوامل التباين في عينات haustorium لتحسين تصور الأنسجة وأنواع الخلايا المختلفة في haustorium ، لتسهيل الكشف عن الأنسجة الطفيلية داخل جذر / ساق المضيف ، وتحليل الروابط الوعائية بين الطفيلي والمضيف في ثلاثة أبعاد. يمكن أيضا تكييف المستحضرات الموصوفة هنا مع تحليل الهياكل النباتية الأخرى.
تم استخدام خمسة أنواع لتوضيح راحة البروتوكول الموصوف هنا بشكل أفضل. يمثل كل نوع واحدة من المجموعات الوظيفية الخمس للنباتات المزهرة الطفيلية ، وبالتالي يعالج نقاطا محددة تتعلق بوظيفة كل مجموعة. تم اختيار Pyrularia pubera (Santalaceae) لتمثيل الطفيليات euphytoid ، التي تنبت في الأرض وتشكل العديد من haustoria التي تربط الطفيلي بجذور مضيفيه25. غالبا ما تكون الهوستريا التي أنشأتها هذه النباتات ضعيفة ويمكن تمزيقها بسهولة عن المضيف26 (الشكل 1 أ) ، مما يتطلب عملية معالجة أكثر دقة. يتم تمثيل الطفيليات الداخلية هنا بواسطة الحد الأدنى من اللزوجة (Viscaceae). لا يمكن رؤية الأنواع في هذه المجموعة الوظيفية إلا خارج جسم مضيفيها لفترات قصيرة (الشكل 1 ب) وتعيش معظم دورات حياتها كخيوط خلايا مختزلة بشكل كبير وشبيهة بالفطريات مدمجة داخل أنسجة المضيف25. تتكون المجموعة الوظيفية الثالثة من الكروم الطفيلية ، التي تنبت على الأرض ولكنها تشكل جذورا بدائية فقط ، وتعتمد على العديد من haustoria التي ترتبط بسيقان النباتات المضيفة25 (الشكل 1C). هنا ، يتم تمثيل هذه المجموعة الوظيفية بواسطة Cuscuta americana (Convolvulaceae). على عكس الكروم الطفيلية ، ينبت الهدال مباشرة على أغصان النباتات المضيفة ويتطور إما هاوستريا متعددة أو انفرادية25. الأنواع المختارة لتوضيح هذه المجموعة الوظيفية هي Struthanthus martianus (Loranthaceae) ، والتي تشكل روابط مختلفة مع الفرع المضيف (الشكل 1D). يمكن العثور على تحليل الهدال الانفرادي باستخدام مزيج من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق والمجهر الضوئي في Teixeira-Costa و Ceccantini17. أخيرا ، تشتمل طفيليات الجذور الملزمة على الأنواع التي تنبت على الأرض وتخترق جذور النباتات المضيفة ، والتي تعتمد عليها كليا منذ مراحل النمو المبكرة25. يتم تمثيل هذه النباتات هنا بواسطة Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) ، والتي تنتج هاوستوريا كبيرة تشبه الدرنات (الشكل 1E).
تم تثبيت جميع العينات النباتية المستخدمة في هذا البروتوكول في كحول حمض الخليك الفورمالين بنسبة 70٪ (FAA 70). يعد التثبيت عند أخذ العينات أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الأنسجة النباتية ، خاصة إذا كانت هناك حاجة إلى تحليلات تشريحية لاحقة. في حالة نبات haustorium الطفيلي ، يكون التثبيت ضروريا أيضا ، لأن هذا العضو غالبا ما يتكون بشكل أساسي من خلايا الحمة غير الخشنة20. يمكن العثور على بروتوكولات مفصلة لتثبيت الأنسجة النباتية ، بما في ذلك إعداد المحاليل المثبتة ، في مكان آخر27. من ناحية أخرى ، بدرجة أكبر أو أقل ، يمكن أن تسبب المثبتات تغيرات في الخصائص الفيزيائية والكيميائية للعينة ، مما يجعلها غير مناسبة لتحليلات ميكانيكية حيوية وكيميائية محددة. وبالتالي ، يمكن أيضا استخدام عينات جديدة ، أي المواد غير المثبتة التي تم جمعها مباشرة قبل التحضير ، مع هذا البروتوكول. يتم توفير تفاصيل حول كيفية التعامل مع العينات الجديدة واقتراحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمواد المثبتة في قسم المناقشة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اختيار عينة النبات الطفيلي
- جمع كامل haustorium النبات الطفيلي ، بما في ذلك الجذع / الجذر المضيف المرفق وأجزاء من كل من الأطراف القريبة والبعيدة للعضو المضيف المتطفل ؛ الطول المثالي لكل قطعة يعادل ضعف قطر Haustorium.
ملاحظة: بالنسبة إلى haustoria الجانبية ، قم بتضمين جزء من جذع / جذر الأم الطفيلية التي تشكلت منها haustorium (الشكل 1A ، B ، D). بالنسبة للطفيليات الداخلية ، اجمع جزءا من جذع / جذر المضيف تظهر فيه علامات الطفيلي (الشكل 1 ب). في حالة التوصيلات الطرفية ، يجب جمع المصنع بالكامل (الشكل 1E). - اغمر العينة بأكملها في محلول مثبت (على سبيل المثال ، FAA) بنسبة حجمية تبلغ 1:10 (العينة: مثبتة). اترك العينات في المثبت لمدة 1 يوم على الأقل ، اعتمادا على حجم العينة27.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في مادة مثبتة قبل المسح أو نقلها إلى محلول حفظ (على سبيل المثال ، الإيثانول 70٪). يمكن أيضا استخدام عينات جديدة إذا لم يكن هناك ما يبرر التحليل التشريحي اللاحق (انظر قسم المناقشة). إذا كنت تعمل مع مواد جديدة ، فقم بإعداد الجهاز لنضح محلول التباين ، ثم اجمع العينة. لا ينبغي ترك العينة تجف.
2. تطبيق الحلول المتناقضة
- اختر طريقة التطبيق المراد استخدامها. استخدم طريقة الفراغ (الخطوة 2.3) للعينات الصغيرة (الشكل 1 أ) أو غير الخشبية (الشكل 1 ب). استخدم طريقة التروية للعينات الأكبر ، بشرط أن تتضمن جزءا من جذع / جذر المضيف (الشكل 1A ، C-E).
- ارتد قفازات مطاطية وغيرها من معدات الحماية الشخصية المناسبة (مثل معطف المختبر) عند التعامل مع العينة بغض النظر عن النهج المختار في الخطوات التالية.
تنبيه: تشتمل جميع المحاليل المتناقضة على أملاح معدنية ثقيلة في تركيبتها ، وبالتالي لا ينبغي التعامل معها بدون معدات حماية شخصية كافية وتحت غطاء دخان. - بالنسبة لطريقة الفراغ ، اتبع الخطوات المذكورة أدناه.
- اختر قارورة مناسبة وقم بتسميتها. يجب أن تكون القارورة كبيرة بما يكفي لاستيعاب العينة والمحلول المتباين ، عادة بنسبة 1:10. تحقق من التعليمات من الشركة المصنعة للتأكد من أن القارورة يمكنها تحمل الفراغ المنخفض إلى المتوسط.
ملاحظة: لا تملأ القارورة حتى أسنانها ، لأن الضغط السلبي (الفراغ) يمكن أن يتسبب في انسكاب السائل. - ضع العينة في القارورة مع المحلول المتباين (1٪ يود أو 3٪ فوسفوتونجستات ، انظر جدول المواد). ثم ضع القارورة في غرفة مفرغة أو مجفف متصل بمضخة تفريغ. قم بإزالة الغطاء من القارورة ، ثم أغلق غرفة التفريغ أو المجفف.
- تأكد من عدم وجود شقوق في غرفة التفريغ / المجفف وأن مضخة التفريغ بها زيت كاف.
- أغلق صمام استنفاد المضخة لمنع الهواء من الهروب وافتح صمام استنفاد الحجرة / المجفف لإجبار الهواء على الخروج.
- قم بتشغيل المضخة وانتظر حتى يصل الضغط إلى حوالي 20 بوصة زئبق.
تنبيه: عادة ما تكون هذه العملية سريعة ، لذلك لا تترك نظام التفريغ دون مراقبة.
ملاحظة: في حين أن وحدة النظام المتري للضغط هي باسكال (باسكال) ، فإن مقاييس الضغط في معظم مضخات التفريغ المختبرية تعرض الضغط بالبوصة من الزئبق ("Hg) أو رطل لكل بوصة مربعة (psi) أو القضبان. 20 بوصة زئبق يساوي حوالي 67.7 باسكال أو 10 رطل لكل بوصة مربعة أو 0.7 بار. - أغلق الحجرة / صمام العادم المجفف لمنع الهواء من الدخول مرة أخرى ، ثم قم بإيقاف تشغيل المضخة بسرعة.
- اترك العينة تحت فراغ لمدة 2 ساعة على الأقل ؛ تتطلب العينات الأكبر وقتا أطول حتى يخترقها المحلول المتناقض.
- بعد الفترة المطلوبة ، قم بإزالة العينة من المحلول المتباين لإعدادها للمسح الضوئي.
- افتح ببطء الحجرة / صمام استنفاد المجفف للسماح للهواء بالدخول إليه.
- انتظر حتى يتم استنفاد الضغط في الغرفة / المجفف بالكامل (على سبيل المثال ، يصل مقياس الضغط إلى ما يقرب من 0) ، ثم افتحه بعناية لاسترداد العينة.
- تخلص من محلول التباين بشكل مناسب واحتفظ بالعينة استعدادا للمسح الضوئي.
- اختر قارورة مناسبة وقم بتسميتها. يجب أن تكون القارورة كبيرة بما يكفي لاستيعاب العينة والمحلول المتباين ، عادة بنسبة 1:10. تحقق من التعليمات من الشركة المصنعة للتأكد من أن القارورة يمكنها تحمل الفراغ المنخفض إلى المتوسط.
- بالنسبة لطريقة التروية ، اتبع الخطوات المذكورة أدناه.
- حدد خزان إمداد للمحلول المتباين وفقا لحجم العينة. استخدم حقنة سعة 50 مل (بدون إبرة أو مكبس) للعينات الصغيرة (الشكل 2 أ) أو مجموعة طبية وريدية سعة 1 لتر للعينات الكبيرة (الشكل 2 ب).
- قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب البلاستيكي الشفاف (انظر جدول المواد) بخزان الإمداد ، ثم قم بتوصيل الطرف الآخر بصمام ثنائي الاتجاه أو ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل أنبوب ثان بمخرج مختلف في الصمام (الشكل 2 أ ، ب).
- قم بتأمين خزان الإمداد في موضع مرتفع دون تفكيك الجهاز الذي تم إعداده في الخطوة السابقة.
ملاحظة: ستحدد المسافة الرأسية بين الخزان والعينة ضغط نضح المحلول (الشكل 2 ب). مسافة 20-50 سم كافية للعينات الصغيرة. بالنسبة للعينات الكبيرة ، تكون مسافة 1 متر أكثر ملاءمة. - أغلق الصمام ثلاثي الاتجاهات (الشكل 2C) أو ثنائي الاتجاه (الشكل 2D) لمنع السائل من الخروج من نظام الأنابيب ، ثم صب المحلول المتباين في خزان الإمداد. في حالة استخدام مجموعة طبية عن طريق الوريد ، املأ الكيس بالمحلول وأغلق الصمام قبل تثبيت الجهاز في وضع مرتفع.
- تأكد من عدم تشكيل فقاعات هواء كبيرة على طول نظام الأنابيب (الشكل 2E). إذا لزم الأمر ، اترك محلول التباين يتدفق خارج الأنبوب حتى تتم إزالة الفقاعة. أغلق الصمام مرة أخرى واترك الجهاز في مكانه.
- لتحضير العينة لتروية محلول التباين ، احتفظ بها مغمورة في سائل (ماء أو إيثانول أو مثبت) واقطع طرف الطرف القريب من جذع / جذر المضيف في العينة (الشكل 2F).
- أخرج العينة من السائل الذي تم تخزينها فيه ولفها في فيلم بارافين لتجنب الجفاف. احتفظ بالعينة في مكان قريب وجاهزة للتوصيل بالجهاز.
- افتح الصمام بعناية للسماح للمحلول المتباين بالتدفق ببطء وملء الأنبوب البلاستيكي المتصل بالخزان مع تثبيت الطرف المفتوح للنظام في وضع مرتفع قليلا لمنع انسكاب المحلول المباين. مرة أخرى ، تأكد من عدم تشكل فقاعات هواء كبيرة على طول الأنبوب.
- قم بتوصيل الطرف القريب من جذع / جذر المضيف في العينة بالطرف المفتوح لنظام الأنابيب (الشكل 2 ب ، المنطقة المكبرة). تجنب إدخال فقاعات الهواء في النظام أثناء هذه الخطوة. إذا لزم الأمر ، افصل العينة عن الجهاز وقم بإزالة فقاعات الهواء من النظام عن طريق السماح للمحلول بالتدفق.
- مع إبقاء العينة متصلة بالجهاز ، ضعها داخل حاوية لتجنب تسرب المحلول المتباين إلى المنطقة التي تم إعداد التجربة فيها. استخدم أنابيب بأقطار مختلفة ، وأربطة مضغوطة بلاستيكية ، ومحولات صمامات (الشكل 2G) للتأكد من أن جميع التوصيلات في الجهاز مناسبة تماما ، وتستوعب الفروع المضيفة ذات الأحجام المختلفة ، وأن المحلول لا يتسرب من نظام الأنابيب (الشكل 2 ب ، المنطقة المكبرة).
- دع المحلول يتسرب العينة لمدة 2 ساعة على الأقل ، أو حتى يتراكم المحلول داخل الحاوية.
- أغلق الصمام وافصل العينة بعناية عن الجهاز. صفي ما تبقى من المحلول في الحاوية وتخلص منه بشكل مناسب.
- قم بإزالة فيلم البارافين من العينة استعدادا للمسح الضوئي.
الشكل 2: نهج التروية لتطبيق التباين. تشتمل الإصدارات الصغيرة (A) والكبيرة (B) من جهاز التروية على خزان إمداد (st) وأنبوبين بلاستيكيين (t1 و t2) متصلين بصمام (va). يتم توصيل الطرف القريب من الجذع المضيف (H) الذي يحمل طفيليا (P) متصلا به عبر haustorium (ha) بالطرف المفتوح للنظام (B ، موسع). يستخدم صمام ثلاثي الاتجاهات (C) أو ثنائي الاتجاه (D) للمساعدة في منع تكون فقاعات الهواء داخل نظام الأنابيب ، والتي تمنع مرور المحلول المتباين (E). يتم قطع طرف الطرف القريب من جذع المضيف (H) تحت الماء للسماح بمرور محلول التباين (F). تساعد الروابط المضغوطة ومحولات الصمامات والأنابيب بأقطار مختلفة على تأمين توصيلات أكثر إحكاما وتجنب التسرب في النظام (G). تم إنشاء الأشكال 2B و D و F باستخدام BioRender. أشرطة المقياس = 2 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. إعداد العينة والتركيب
- اغسل العينة عن طريق غمرها في الماء لمدة 2 دقيقة.
تنبيه: لا تغسل العينات في الحوض ، لأن جميع المحاليل المتناقضة تحتوي على أملاح المعادن الثقيلة في تركيبتها. ضع في اعتبارك الماء المستخدم للغسيل كمحلول متباين مخفف وتخلص منه بشكل مناسب. - ضع العينة في منشفة ورقية في درجة حرارة الغرفة للسماح للماء الزائد بالتبخر لمدة 2-5 دقائق حسب حجم العينة. بدلا من ذلك ، جفف العينة قليلا بمساعدة منشفة ورقية. لا تدع العينة تجف تماما.
- لف العينة في فيلم البارافين عن طريق تمديدها إلى طبقة رقيقة. تجنب طي طبقة البارافين فوق العينة.
- ركب العينة المغلفة على حامل عينة، مع الحفاظ على ثباتها وفي موضعها أثناء تدويرها أثناء المسح. استخدم شريطا لاصقا و / أو رغوة منخفضة الكثافة و / أو أطراف ماصة و / أو حاويات بلاستيكية شفافة لتأمين العينة في مكانها.
- امسح العينة وحلل الصور باتباع البروتوكولات والإرشادات المحددة الموضوعة لنظام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق المتاح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
haustorium من النباتات الطفيلية هو عضو معقد يضم الأنسجة المختلفة وأنواع الخلايا التي تتشابك وتتواصل مع أنسجة نبات آخر ، وتستخدم كمضيف20. يمكن الاستفادة من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لفهم هذا الهيكل المعقد بشكل أفضل بطريقة غير مدمرة وثلاثية الأبعاد عند تحليل كل من الهوستريا الصغيرة (الشكل 1A-C) والكبيرة (الشكل 1D ، E). للقيام بذلك ، يمكن تطبيق الحلول المتناقضة في واجهة الطفيلي المضيف ، مما يجعل من الممكن تحليل العينات التي من شأنها أن يكون لها امتصاص منخفض ومتجانس للأشعة السينية. يعتمد النهجان البسيطان الموصوفان في هذا البروتوكول على الضغط على الحل المتباين لتسريع الاختراق عبر العينة. كما هو متوقع ، تعمل البروتوكولات الموضحة هنا مع أنظمة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة المختلفة. ومع ذلك ، تختلف إعدادات المسح والمعلمات اعتمادا على النظام والعينة التي تم تحليلها (الجدول 1).
| مجموعة وظيفية | طفيلي يوفيتويد | الطفيليات الداخلية | كرمة طفيلية | الهدال (قبل / بعد التباين) | إلزام طفيلي الجذر |
| الأنواع (العائلة) | بيرولاريا بوبيرا | الحد الأدنى من اللزوجة | كوسكوتا أمريكانا | ستروثانثوس مارتيانوس | سيباليوم فطريات |
| أسرة | سانتالاسيا | فيسكاسيا | اللبلاب | لورانثاسيا | بالانوفوراسيا |
| حل التباين | 3٪ فوسفوتونجستات | 1٪ يود | 1٪ يود | 1٪ يود | 0.2٪ نترات الرصاص |
| طريقة التطبيق | مِكْنَسَة كَهْرَبَائِيَّة | مِكْنَسَة كَهْرَبَائِيَّة | التروية | التروية | التروية |
| نظام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق | زايس فيرسا 620 | نيكون اكس تيك HMXST225 | بروكر سكاي سكان 1176 | بروكر سكاي سكان 1176 | بروكر سكاي سكان 1176 |
| الاسقاطات | 4500 | 3140 | 610 | 1200 / 2400 | 5300 |
| اطارات | 1 | 1 | 3 (متوسط) | 3 / 3 (متوسط) | 3 (متوسط) |
| التعرض (مللي ثانية) | 5000 | 1000 | 680 | 1600 / 830 | 750 |
| فلتر (مم) | اي | آل 0.25 | آل 1.0 | Al 1.0 / Al 1.0 | اي |
| الجهد (كيلو فولت) | 60 | 85 | 35 | 90 / 45 | 40 |
| التيار (μA) | 108 | 80 | 375 | 180 / 390 | 600 |
الجدول 1: إعدادات المسح والمعلمات للعينات التي تم تحليلها.
باتباع النهج الأول لتطبيق التباين (الخطوة 2.3) ، تم استخدام الفراغ لتعطير haustorium من الطفيلي euphytoid P. pubera مع محلول phosphotungstate 3 ٪ لمدة ساعتين. ثم تم مسح العينة في نظام مجهر الأشعة السينية ثلاثي الأبعاد (XRM) (انظر جدول المواد) ، مما حقق دقة صورة عالية عبر التكبير البصري الثانوي4. لوحظ أن صور XRM فعالة مثل المقاطع التشريحية التي تم تحليلها تحت المجهر الضوئي لتحليل تنظيم الأنسجة والطوبولوجيا في واجهة الطفيلي المضيف (الشكل 3). يسلط استخدام phosphotungstate الضوء على وفرة أنسجة الحمة ، والتي تظهر بنبرة بيضاء زاهية بسبب الامتصاص العالي للعامل المتناقض. تظهر الأوعية بلون رمادي غامق بسبب انخفاض امتصاص التباين. بناء على هذا الاختلاف في اللون ، من الممكن ملاحظة وفرة الحمة المحيطة بالنواة الوعائية لل haustorium (الشكل 3). كما لوحظت الأوعية المعقدة وخيوط الحمة الرفيعة في قلب الأوعية الدموية نفسها ، خاصة في المقاطع الطولية (الأشكال 3A-C). في المقاطع العرضية ، يمكن ملاحظة قلب الأوعية الدموية بسهولة كشريطين وعائيين مفصولين بحمة (الأشكال 3D ، E).
الشكل 3: الطفيلي Euphytoid haustorium. لوحظت المقاطع الطولية (A-C) والمستعرضة (D-E) من خلال haustorium تحت المجهر الضوئي (A ، E) وعبر المجهر بالأشعة السينية ثلاثية الأبعاد بعد تطبيق محلول phosphotungstate بنسبة 3٪ باستخدام الفراغ (B-D). تشير الخطوط العريضة الحمراء إلى نسيج النسيج البرنشيمي (par) ، وتشير الخطوط العريضة الزرقاء إلى قلب الأوعية الدموية (vc). Hx: نسيج الخشب المضيف. Hb: لحاء المضيف. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر (A ، E) و 2.5 سم (B-D ؛ حجم الفوكسل = 2.8382 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم استخدام نفس النهج لإدخال التباين في جذع نبات مضيف عصاري (الفربيون polygona ، Cactaceae) تطفل بواسطة V. الحد الأدنى. هنا ، تم اختيار محلول اليود بنسبة 1 ٪ كعامل متباين بناء على التحليل الكيميائي النسيجي الأولي ، والذي أظهر أن خلايا الحمة في الطفيليات الداخلية تخزن الكربوهيدرات في شكل نشا (الشكل 4 أ). في الوقت نفسه ، لا تخزن الخلايا الموجودة في القشرة المضيفة كمية يمكن اكتشافها من النشا (الشكل 4B-D). بعد تطبيق التباين، تم فحص العينة باستخدام نظام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق من نيكون X-Tek (انظر جدول المواد). سمح الاختلاف في امتصاص اليود بالكشف عن الشبكة المعقدة للخيوط القشرية التي شكلها الطفيلي الداخلي داخل الجسم المضيف (الشكل 4E). باتباع هذه المنهجية ، لوحظ أن الخيوط القشرية تتركز حول مركز الأوعية الدموية المضيفة وتتفرع في النهاية نحو محيط جذع المضيف عندما ترتبط بانبعاث زهرة طفيلية (الأشكال 4F ، G).
الشكل 4: شبكة أنسجة الطفيليات الداخلية. تظهر المقاطع التشريحية (A) والكلية (B-D) تفاعلا مع محلول اليود بنسبة 1٪ مما يشير إلى وجود النشا (الملون باللون الأسود) في الحمة (par) المرتبطة بأوعية (ve) للطفيلي. نظرا لأن النشا غائب في القشرة المضيفة (Hc) ونسيج الخشب (Hx) ، فقد تم استخدام محاليل اليود بنسبة 1٪ بشكل انتقائي لتعزيز تباين أنسجة الشريط القشري الطفيلي (الخطوط العريضة الأرجواني ، E-G) ، والتي تظهر على خلفية المضيف (H). يؤكد وجود زهرة (Pf) أن الأنسجة الملطخة هي جزء من بنية الطفيليات الداخلية (A ، F ، G). أشرطة المقياس = 0.25 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
في الطريقة الثانية الموصوفة هنا (الخطوة 2.4) ، يتم رفع خزان الإمداد الذي يحتوي على المحلول المتباين من المستوى الذي يتم وضع العينة فيه ، وبالتالي استخدام الجاذبية لدفع مرور المحلول عبر العينة. بعد التروية المتباينة ، تم إجراء المسح باستخدام نظام Bruker Skycan micro-CT (انظر جدول المواد). تساعد النتائج التي تم الحصول عليها ل C. americana (الشكلان 5A و B) و S. martianus (الشكلان 5C-G) في توضيح مدى ملاءمة هذا النهج لكل من العينات الصغيرة والكبيرة ، على التوالي. تؤكد مقارنة العينات الممسوحة ضوئيا قبل (الشكل 5C ، E) وبعد (الشكل 5D ، F) نضح محلول اليود بنسبة 1٪ على أهمية تطبيق التباين حتى في عينات haustorium الخشبية. من الجدير بالذكر أنه في الارتباطات بين كل من C. americana و S. martianus (الشكل 5) ومضيفيها ، تحتوي الطفيليات على القليل من محتوى النشا في أنسجتها. هذا ما يفسر النتائج المختلفة الموصوفة للطفيلي الداخلي V. الحد الأدنى (الشكل 4) ، حيث تم استخدام نفس الطريقة ونوع محلول التباين.
الشكل 5: الكرمة الطفيلية والهال haustorium. المقاطع الطولية من خلال haustorium من كرمة طفيلية (A ، B) والهدال (C-G). تظهر المقارنة بين المسح والقسم الكلي للمواد الطازجة أن بنية haustorium المعقدة يتم التقاطها جيدا في فحوصات التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة (A ، B). تظهر المقارنة بين العينات المثبتة قبل (C ، E) وبعد (D ، F) أن نضح محلول اليود بنسبة 1٪ يظهر أن التباين يتعزز حتى في العينات الخشنة ، مما يسهل مراقبة هياكل الطفيليات (P) مثل الأوعية في الجذر فوق القشري (رؤوس الأسهم الوردية) ، وخيوط الأوعية الدموية (رؤوس الأسهم الزرقاء) ، والغطاس (رأس السهم الأصفر). كما يمكن ملاحظة الأوعية والحلقات السنوية لنسيج الخشب المضيف (Hx) والنشا في لحاء المضيف (Hb) بسهولة أكبر. أشرطة المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
النتيجة النهائية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول التروية الموصوف هنا هي إمكانية اكتشاف الروابط الوعائية بين الطفيليات والنباتات المضيفة. تم تحقيق ذلك عن طريق تعطير محلول نترات الرصاص بنسبة 0.2٪ من خلال جزء من الجذر المضيف الذي تطورت حوله درنة طفيلي الجذر الملزم S. fungiforme. بعد تطبيق التباين ، تم إجراء المسح أيضا باستخدام نظام Bruker Skyscan micro-CT (انظر جدول المواد). تظهر الإسقاطات المتسلسلة أن الأوعية الموجودة في جذر المضيف تتشعب إلى درنة الطفيلي (الشكل 6A-C). بعد تحليل هذه النتائج ، تم تقطيع نفس العينة إلى عينة فرعية أصغر ، تم إعدادها للدراسة التشريحية ، وتحليلها باستخدام المجهر الضوئي. يؤكد التقسيم التسلسلي لهذه العينة الفرعية أن استمرارية نسيج الخشب بين النباتين تتشكل عن طريق الاتصال من وعاء إلى وعاء عبر ألواح التثقيب (الشكل 6D-F).
الشكل 6: إلزام الطفيلي الجذري haustorium. المقاطع الطولية عبر haustorium كما لوحظ عن طريق التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (A-C) والمقاطع التشريحية التي لوحظت تحت المجهر الضوئي (D-F). يسمح تراكم محلول نترات الرصاص بنسبة 0.2٪ داخل الجهاز الوعائي لجذر المضيف (HR ، المخطط الوردي) بمراقبة الأوعية المضيفة المتفرعة داخل أنبوب الطفيلي (Pt) والكشف عن اتصال الأوعية الدموية المباشر بين النباتين (مخطط أبيض متقطع). قضبان المقياس = 1 سم (A-C) و 500 ميكرومتر (D-F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبح استخدام محاليل المعادن الثقيلة لتحسين تباين الأنسجة النباتية خطوة حاسمة في تحضير العينات لتحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. تم اختبار العديد من المركبات المتوفرة بشكل شائع في مختبرات التشكل الدقيق للنبات من قبل Staedler et al. ، الذين يوصون باستخدام phosphotungstate كعامل أكثر فعالية في اختراق العينات وزيادة مؤشر التباين8. النتائج التي تم الحصول عليها هنا في تحليل haustorium من P. pubera تؤكد هذه التوصية. من حيث تطبيق التباين ، يصف Steadler et al. أن محلول التباين قد تم اختراقه بشكل سلبي من خلال المواد التي تم تحليلها (الزهور وبراعم الزهور التي تتراوح من 1 مم إلى 10 مم) خلال 1 إلى 8 أيام8. استخدم مؤلفون آخرون نفس بروتوكول التسلل السلبي على مدى فترات طويلة (1-4 أسابيع) عند تحليل عينات أكبر ، مثل الزهور التي يبلغ عرضها 30 سم من أنواع Rafflesiaceae الطفيليةالداخلية 28. في حين أثبتت هذه العملية نجاحها ، تظهر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول الموصوف هنا أنه يمكن تسريع عملية التسلل بشكل كبير في ظل الفراغ ، وبالتالي تحسين الطريقة المحددة مسبقا. تجبر غرفة التفريغ أو المضخة الهواء على الهروب من أنسجة النبات ، مما يسمح بتسلل أسهل لمحلول التباين. يمكن تطبيق الفراغ حتى على الهياكل الهشة ، كما هو موضح هنا بالنسبة ل haustorium من P. pubera والأنسجة الرخوة للنبات المضيف العصاري E. polygona المتطفل بواسطة V. الحد الأدنى. علاوة على ذلك ، فإن استخدام مضخات التفريغ هو إجراء شائع لتسلل المثبتات أو تضمين المواد في العديد من مختبرات التشكل الدقيق للنبات ، مما يجعل هذا البروتوكول أكثر سهولة.
تم استخدام نفس النهج هنا مع عامل متباين يقوم بتلطيخ العينات بشكل انتقائي في حالة وجود مركبات تخزين محددة. عند تطبيقه من خلال الفراغ أو التسلل السلبي ، قد يوفر التلوين الانتقائي تحسينا أكثر فقرا للتباين لعينة كاملة عند مقارنته بالفوسفوتونجستات ، على سبيل المثال. من ناحية أخرى ، من المفيد تسليط الضوء على هياكل أو أنسجة نباتية معينة. كما ورد هنا ، عند دمجه مع التحليل التشريحي أو الكيميائي النسيجي السابق ، يمكن أن يساعد استخدام عوامل التباين الانتقائية مثل اليود في تمايز الأنسجة النباتية الطفيلية داخل جسم المضيف بشرط أن يظهر الطفيلي أو المضيف (ولكن ليس كلاهما) احتياطيات نشا وفيرة. تبين أن زيادة امتصاص الأشعة السينية بشكل انتقائي لأنسجة الطفيليات مفيدة بشكل خاص لاستكشاف ، لأول مرة ، الشبكة المعقدة ثلاثية الأبعاد التي شكلها نبات طفيلي داخلي مثل V. الحد الأدنى داخل جذع النبات المضيف. علاوة على ذلك ، من الجدير بالذكر أن النباتات الطفيلية الداخلية وبعض الفطريات تظهر تقاربا تطوريا مثيرا للاهتمام ، وكلاهما ينمو "متخفيا" داخل مضيفيهما لمعظم دورات حياتهما ، ولا يظهر إلا خلال فترات وجيزة29. وبالتالي ، فإن التطبيق الجديد المحتمل للبروتوكول الموصوف هنا هو استخدام الفلوكسين B ، وهي بقعة تحتوي على البروم30 ، للكشف عن الفطريات الداخلية داخل الأنسجة النباتية. وقد ثبت أن Eosin ، وهو محلول تلطيخ آخر قائم على البروم نادرا ما يستخدم فقط للأنسجة النباتية ، يعزز التباين في عينات الكلى للفئران التي تم تحليلها باستخدام نظام محدد للتصوير المقطعي المحوسب31.
هناك طريقة أخرى موصوفة في هذا البروتوكول وهي نضح العوامل المتناقضة من خلال الأنسجة الوعائية لجذع أو جذر المضيف. يعتمد هذا النهج ، الذي يختلف اختلافا كبيرا عن الطرق المبلغ عنها سابقا ، على عمل Sperry et al. ، الذي قام برش عينات الخشب بصبغة السافرانين لتحليل الموصلية الهيدروليكية32. كما ناقش المؤلفون وأبرزوا هنا ، فإن الخطوة الحاسمة في البروتوكول هي إعداد جهاز ثقب البقع لتجنب إدخال فقاعات الهواء في النظام32. يمكن للصمامات ثلاثية الاتجاهات أن تتباعد مؤقتا عن تدفق المحلول وتزيل الفقاعات من السائل32. ومع ذلك ، يمكن أن يكون الصمات موجودا داخل أوعية النبات المضيف ، إما بشكل مصطنع أثناء أخذ العينات أو بشكل طبيعي بسبب معدلات النتح العالية بشكل عام للنباتات الطفيلية33,34. يمكن أن يقلل هذا بشدة من كفاءة التروية ، مما يؤدي إلى عدم تحسين التباين في العينة. من الضروري تطبيق فراغ منخفض إلى معتدل عند تثبيت العينة بعد أخذ العينات لمنع هذه المشكلة. بشكل تكميلي ، يمكن مسح العينة المثبتة تحت ضغط عال باستخدام المحلول المثبت الذي يتم تخزين العينة فيه. يمكن أن يساعد التنظيف في استعادة الموصلية في العينة عن طريق إزالة فقاعات الهواء32 ، وبالتالي تمهيد الطريق لتروية محلول التباين. في حالة العمل مع مواد جديدة ، يمكن تجنب إدخال فقاعات الهواء في المصنع عن طريق غمر العينة في الماء مباشرة بعد أخذ العينات ، ثم قطعها مرة أخرى تحت الماء ، وتنعيم السطح النهائي بشفرات حادة35.
بعد هذا النهج ، تم استخدام محلول اليود بنسبة 1٪ من خلال haustorium من C. americana و S. martianus لتعزيز تباين واجهة الطفيلي المضيف ككل. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها لهذه الأنواع أن بروتوكول التروية الموصوف هنا يعمل بشكل جيد لكل من العينات الطازجة والمثبتة ، وأن إدخال محاليل التباين يحسن التصور حتى في العينات الخشبية. تتفق هذه الملاحظات مع النتائج التي أبلغ عنها Teixeira-Costa و Ceccantinti17 ، الذين استخدموا نفس النهج لتطبيق محلول نترات الرصاص بنسبة 0.2٪ لتصور جوانب محددة من هيكل haustorium. عند ملامسة ثاني أكسيد الكربون ، تتفاعل نترات الرصاص لتشكيل راسب غير قابل للذوبان بدرجة عالية يتكون من بلورات كربونات الرصاص ، والتي تمتص الأشعة السينية بكفاءة 8,36. بمجرد أن يتخلل هذا الراسب في عينة الأنسجة الوعائية ، فإنه يسد وصلات حفرة الأوعية الدموية ، مما يسمح للمحلول بالتدفق فقط من خلال الوصلات المباشرة من وعاء إلى وعاء عبر ألواح التثقيب. باتباع هذا النهج، يظهر هنا وجود وصلات نسيج الخشب الطفيلية المضيفة المباشرة من خلال ألواح التثقيب ل S. fungiforme ويتم تأكيدها بتحليل تشريحي مفصل. تسلط هذه النتائج الضوء على تطبيق إضافي لهذا النهج لاختبار وظائف haustorium. بالنظر إلى أن بدء haustorium قد لا يتوج بتطوير عضو يعمل بكامل طاقته إما بسبب عدم توافق الطفيلي والمضيف أو مقاومة المضيف ضد الطفيلي ، يمكن استخدام النهج الموصوف هنا لاختبار ما إذا كانت الروابط الوعائية تتشكل بين النباتين مما يؤدي إلى حدوث تطفل فعال. بالنظر إلى قيمة استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق للتحقيق في انسدادات نسيج الخشب على نطاق أوسع12،37 ، يمكن للبروتوكول المقدم هنا أيضا تحسين التصور والتحليل الكمي لانسداد نسيج الخشب في أنواع النباتات غير الطفيلية الأخرى.
في الختام ، يقترب هذا البروتوكول من أحد التطورات الحاسمة المتوقعة في التصوير المقطعي المجهري للنبات ، وهو تطبيق عوامل متناقضة للمساعدة في التمييز بين الهياكل ذات الامتصاص المنخفض للأشعة السينية24. كما هو موضح هنا ، يمكن لحلول التباين أن تحسن بشكل كبير من تصور هياكل haustorium في الواجهة بين النباتات الطفيلية ومضيفيها. يمكن اختيار مركبات مختلفة وفقا لخصوصيتها في التفاعل مع المركبات الاحتياطية ، مثل النشا ، والتي غالبا ما يتم توزيعها بشكل مختلف بين أنسجة الطفيليات والمضيف. يمكن أيضا اختيار نهج التطبيق المتباين في عينات haustorium للتحقيق في ميزات محددة للواجهة الطفيلية المضيفة ، مثل الاتصال المباشر من سفينة إلى سفينة. علاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضا على الأنواع غير الطفيلية، مما قد يحسن الكشف عن الفطريات الداخلية والقياس الكمي لانسداد نسيج الخشب. في أي تطبيق ، يمكن دمج البروتوكول الموصوف هنا لتحسين تحليل التصوير المقطعي المجهري مع أدوات أخرى ، مثل التصوير المقطعي للإسقاط البصري والتجزئة الافتراضية الآلية ، لتوفير رؤى جديدة ومثيرة حول التطور ثلاثي الأبعاد للاتصال بين هذه النباتات ومضيفيها38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.
Acknowledgments
أود أن أشكر الدكتور سيمون غوميز فيريرا (مختبر التصوير المقطعي المجهري ، جامعة ساو باولو ، البرازيل) والدكتور جريج لين (مركز أنظمة النانو ، جامعة هارفارد ، الولايات المتحدة الأمريكية) على مساعدتهم القصوى وتدريب المستخدم الذي لا غنى عنه لأنظمة التصوير المقطعي المجهري المختلفة وبرامج تحليل البيانات. كما أشكر الموظفين في EEB Greenhouse في جامعة كونيتيكت (الولايات المتحدة الأمريكية) ، وخاصة كلينتون مورس وماثيو أوبل لتوفير عينات من الحد الأدنى من Viscum. قدم الدكتور جون وينزل الفرصة والمساعدة الكبيرة لأخذ عينات من Pyrularia pubera. ماجستير كارولينا باستوس ، ماجستير ياسمين هيراو ، وطاليثا موتا ساعدت بشكل كبير في أخذ عينات من فطريات Scybalium. قدم ماجستير أريادن فورتادو والدكتور فرناندا أوليفيرا وماريا ألين نيفيس المرجع لاستخدام الفلوكسين ب لتحليل الفطريات الداخلية. أصبح تسجيل الفيديو في جامعة بروكسل الحرة ممكنا بمساعدة الدكتور فيليب كلايس والدكتور كريستوف سنويك وماجستير جيك جريفيث والدكتور بارابارا فيسيلكا والدكتور هاري أولد فينترينك. تم توفير التمويل من قبل هيئة التنسيق لتحسين موظفي التعليم العالي (CAPES ، البرازيل) وجامعة هارفارد هيرباريا (الولايات المتحدة الأمريكية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems - ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR - USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR - USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR - USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR - USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
References
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
- Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
- Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
- Sakdinawat, A., Attwood, D.
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
- Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
- Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
- Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
- da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
- Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
- Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
- Lusic, H., Grinstaff, M. W.
- Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
- Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
- Kuijt, J. The Biology of Parasitic Flowering Plants. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).
- Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
- Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
- Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
- Simpson, B. B.
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).
- Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
- Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
- Largent, D., Johnson, D., Watling, R. How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
- Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
- Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
- Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).
