Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Udnyttelse af mikro-CT-scanning til at analysere parasitære plante-værtsinteraktioner

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63423
Automatic Translation
1,2
1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Summary

Micro-CT er et ikke-destruktivt værktøj, der kan analysere plantestrukturer i tre dimensioner. Denne protokol beskriver prøveforberedelsen for at udnytte mikro-CT til at analysere parasitisk plantestruktur og funktion. Forskellige arter bruges til at fremhæve fordelene ved denne metode, når de kombineres med specifikke præparater.

Abstract

Micro-CT-scanning er blevet et etableret værktøj til at undersøge planters struktur og funktion. Dens ikke-destruktive karakter kombineret med muligheden for tredimensionel visualisering og virtuel sektionering har muliggjort ny og stadig mere detaljeret analyse af komplekse planteorganer. Interaktioner mellem planter, herunder mellem parasitære planter og deres værter, kan også udforskes. Imidlertid bliver prøveforberedelse før scanning afgørende på grund af interaktionen mellem disse planter, som ofte adskiller sig i vævsorganisation og sammensætning. Desuden skal den brede mangfoldighed af parasitiske blomstrende planter, der spænder fra stærkt reducerede vegetative kroppe til træer, urter og buske, overvejes under prøveudtagning, behandling og forberedelse af parasitværtsmateriale. Her beskrives to forskellige tilgange til introduktion af kontrastopløsninger i parasitten og/eller værtsplanterne med fokus på analyse af haustorium. Dette organ fremmer forbindelse og kommunikation mellem de to planter. Efter en simpel tilgang kan detaljer om haustoriumvævsorganisation udforskes tredimensionelt, som vist her for euphytoid-, vin- og misteltenparasitære arter. Valg af specifikke kontrastmidler og anvendelsesmetoder muliggør også detaljeret observation af endoparasitspredning i værtskroppen og påvisning af direkte fartøj-til-fartøj-forbindelse mellem parasit og vært, som vist her for en obligatorisk rodparasit. Således kan protokollen, der diskuteres her, anvendes på den brede mangfoldighed af parasitære blomstrende planter for at fremme forståelsen af deres udvikling, struktur og funktion.

Introduction

Højopløselig røntgenmikrocomputertomografi (mikro-CT) er en billeddannelsesmetode, hvor flere røntgenbilleder (fremskrivninger) af en prøve registreres fra forskellige synsvinkler og senere bruges til at tilvejebringe en virtuel rekonstruktion af prøven1. Dette virtuelle objekt kan derefter analyseres, manipuleres og segmenteres, hvilket tillader ikke-destruktiv udforskning i tre dimensioner2. Oprindeligt designet til medicinske analyser og senere til industrielle applikationer, giver mikro-CT også fordelen ved at visualisere indre organer og væv uden behov for invasive procedurer3. Ligesom andre former for billeddannelse arbejder mikro-CT med en afvejning mellem synsfeltet og pixelstørrelsen, hvilket betyder, at billeddannelse i høj opløsning af store prøver er næsten uopnåelig4. Der gøres konstant fremskridt inden for brug af røntgenkilder med høj energi (dvs. synkrotron) og sekundær optisk forstørrelse, hvilket gør det muligt for den mindste opløsning at nå under 100 nm 5,6. Ikke desto mindre er længere scanningstider nødvendige for store prøver, hvilket øger chancen for artefakter på grund af prøvebevægelse eller deformation inde i scanneren. Desuden er mikro-CT generelt begrænset af naturlige densitetsvariationer i prøven, og hvordan prøven interagerer med røntgenstråler. Mens en højere røntgendosis er bedst til at trænge ind i tættere prøver, er den mindre effektiv til at fange variationer i densitet inden for og mellem prøven og dens omgivende medium7. På den anden side giver en lavere røntgendosis mindre penetrationskraft og kræver ofte længere scanningstider, men mere følsomhed i densitetsdetektion7.

Disse begrænsninger har længe hæmmet brugen af mikrotomografi til plantevidenskab, da de fleste plantevæv består af let (ikke-tæt) væv med lav røntgenabsorption8. De første anvendelser af mikro-CT var fokuseret på kortlægning af rodnetværk inden for jordmatrixen 9,10. Senere begyndte plantestrukturer med mere signifikante forskelle i vævstæthed, såsom træ, at blive udforsket. Dette har muliggjort undersøgelser af xylemfunktionalitet11,12, udvikling af komplekse vævsorganisationer 13,14 og interaktioner mellem planter15,16,17. Analysen af blødt og homogent væv bliver udbredt på grund af kontrastmidler, som nu er standardprocedure i forberedelser til mikro-CT-scanning af planteprøver. Protokoller til kontrastintroduktion kan dog have forskellige resultater afhængigt af prøvevolumen, strukturelle egenskaber og den anvendte opløsningstype8. Ideelt set bør kontrastmidlet øge sondringen mellem forskellige væv, muliggøre evaluering af vævs-/organfunktionalitet og/eller give biokemisk information om et væv18. Derfor bliver tilstrækkelig prøvebehandling, forberedelse og montering før scanning afgørende for enhver mikro-CT-analyse.

Micro-CT af den parasitære plante haustorium
Parasitiske blomstrende planter repræsenterer en særskilt funktionel gruppe af angiospermer karakteriseret ved et organ kendt som haustorium19. Dette flercellede organ, en udviklingshybrid mellem en modificeret stamme og en rod, virker på værtens fastgørelse, penetration og kontakt med en parasit20. Af denne grund anses haustoriet for at "legemliggøre selve ideen om parasitisme blandt planter"21. En detaljeret forståelse af dette organs udvikling, struktur og funktion er afgørende for parasitisk planteøkologi, evolution og ledelsesstudier. Ikke desto mindre hindrer parasitiske planters overordnede kompleksitet og stærkt modificerede struktur og haustoria ofte detaljeret analyse og sammenligning. Haustoriumforbindelser er normalt også omfattende og ikke homogene i vævs- og cellefordeling (figur 1). I denne sammenhæng, mens arbejde med små vævsfragmenter tillader lettere manipulation og højere opløsning, kan det føre til fejlagtige konklusioner om den tredimensionale arkitektur af komplekse strukturer, såsom det parasitære plantehaustorium.

Selvom der findes en omfattende litteratur om haustoriumanatomi og ultrastruktur for de fleste parasitære plantearter, er den tredimensionelle organisation og det rumlige forhold mellem parasit og værtsvæv stadig dårligt udforsket17. I et nyligt arbejde af Masumoto et al.22 blev over 300 serielle halvtynde mikrotomsektioner afbildet og rekonstrueret til et tredimensionelt virtuelt objekt, der repræsenterer haustorium af to parasitarter. Denne metodes fremragende detaljeringsgrad giver hidtil uset indsigt i haustoriets cellulære og anatomiske 3D-struktur. En sådan tidskrævende teknik ville imidlertid forbyde en lignende analyse i parasitter med mere omfattende haustoriumforbindelser. Anvendelsen af mikro-CT fremstår som et glimrende værktøj til tredimensionel analyse af komplekse og ofte omfangsrige haustoria af parasitære planter. Selvom det ikke er en erstatning for detaljeret anatomisk sektionering og andre komplementære former for mikroskopianalyser17,23, kan resultater opnået via mikro-CT-scanning, især for store prøver, også tjene som vejledning til at styre delprøveudtagningen af mindre segmenter, som derefter kan analyseres ved hjælp af andre værktøjer, såsom konfokal og elektronmikroskopi, eller genanalyseres med mikro-CT-systemer med høj opløsning.

Figure 1
Figur 1: Parasitære planter af forskellige funktionelle grupper, der anvendes i denne protokol. Euphytoid parasit Pyrularia pubera (A), endoparasit Viscum minimum (B) med grønne frugter (stiplet sort cirkel), parasitisk vin Cuscuta americana (C), mistelten Struthanthus martianus (D), obligatorisk rodparasit Scybalium fungiforme (E). Segmenter af værtsroten (Hr) eller stammen (Hs) letter anvendelsen af kontrast i parasithaustorium (P). Tilstedeværelsen af parasitmoderrod/-stamme (pile) i prøven muliggør analyse af haustoriumbeholdernes organisation. Rektangler angiver segmenter af prøven, der anvendes til analyse. Vægtstænger = 2 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Da mikro-CT bliver en stadig mere populær teknik inden for plantevidenskab, er der vejledninger, protokoller og litteratur, der beskæftiger sig med prøvescanning, tredimensionel rekonstruktion, segmentering og analyse 3,10,24. Således vil disse trin ikke blive diskuteret her. Som med enhver fantasiteknik er passende behandling og montering af prøver en grundlæggende, omend ofte en overset procedure. Af denne grund fokuserer denne protokol på forberedelse af haustoriumprøver til mikro-CT-scanning. Mere specifikt beskriver denne protokol to tilgange til introduktion af kontrastmidler i haustoriumprøver for at forbedre visualiseringen af forskellige væv og celletyper i haustorium, for at lette påvisningen af parasitisk væv i værtsroden/stammen og for at analysere parasit-vært vaskulære forbindelser i tre dimensioner. De her beskrevne præparater kan også tilpasses analysen af andre plantestrukturer.

Fem arter blev brugt til bedre at illustrere bekvemmeligheden ved den her beskrevne protokol. Hver art repræsenterer en af de fem funktionelle grupper af parasitære blomstrende planter og adresserer således specifikke punkter relateret til hver gruppes funktionalitet. Pyrularia pubera (Santalaceae) blev valgt til at repræsentere euphytoide parasitter, som spirer i jorden og danner flere haustoria, der forbinder parasitten med rødderne af sine værter25. Haustoria skabt af disse planter er ofte spinkle og let revet fra hinanden fra værten26 (figur 1A), hvilket kræver en mere delikat håndteringsproces. Endoparasitter er repræsenteret her af Viscum minimum (Viscaceae). Arter i denne funktionelle gruppe er kun synlige uden for deres værters krop i korte perioder (figur 1B) og lever det meste af deres livscyklus som signifikant reducerede og mycellignende cellestrenge indlejret i værtsvæv25. En tredje funktionel gruppe omfatter parasitære vinstokke, der spirer på jorden, men kun danner rudimentære rødder, der er afhængige af flere haustoria, der fastgøres til stænglerne af værtsplanter25 (figur 1C). Her er denne funktionelle gruppe repræsenteret af Cuscuta americana (Convolvulaceae). I modsætning til parasitære vinstokke spirer mistelten direkte på grenene på deres værtsplanter og udvikler enten flere eller ensomme haustoria25. Den art, der er valgt til at illustrere denne funktionelle gruppe, er Struthanthus martianus (Loranthaceae), som danner forskellige forbindelser med værtsgrenen (figur 1D). Analyse af ensom mistelten haustoria ved hjælp af en kombination af mikro-CT og lysmikroskopi findes i Teixeira-Costa & Ceccantini17. Endelig omfatter obligatoriske rodparasitter arter, der spirer på jorden og trænger ind i værtsplanternes rødder, som de er helt afhængige af fra de tidligste vækststadier25. Disse planter er her repræsenteret af Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), som producerer store knoldlignende haustoria (figur 1E).

Alle planteprøver, der blev anvendt i denne protokol, blev fastgjort i en 70% formalin eddikesyrealkohol (FAA 70). Fiksering ved prøvetagning er afgørende for at bevare plantevæv, især hvis der er behov for efterfølgende anatomiske analyser. I tilfælde af parasitisk plantehaustorium er fiksering også afgørende, da dette organ ofte primært består af ikke-lignificerede parenkymceller20. Detaljerede protokoller for fiksering af plantevæv, herunder fremstilling af fikseringsopløsninger, findes andetsteds27. På den anden side kan fikseringsmidler i større eller mindre grad forårsage ændringer i en prøves fysiske og kemiske egenskaber, hvilket gør den uegnet til specifikke biomekaniske og histokemiske analyser. Således kan friske prøver, dvs. ikke-fikseret materiale indsamlet umiddelbart før tilberedning, også anvendes med denne protokol. Detaljer om, hvordan man håndterer nye prøver og fejlfindingsforslag til fikseret materiale, findes i diskussionsafsnittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Valg af parasitisk planteprøve

  1. Saml hele parasitplanten haustorium, inklusive den vedhæftede værtsstamme / rod og segmenter af både proksimale og distale ender af det parasiterede værtsorgan; Den ideelle længde af hvert segment svarer til dobbelt diameter af haustorium.
    BEMÆRK: For lateral haustoria skal du inkludere en del af parasitmoderstammen / roden, hvorfra haustoriet blev dannet (figur 1A, B, D). For endoparasitter indsamles et segment af værtsstammen/roden, hvor tegn på parasitten er synlige (figur 1B). I tilfælde af terminalforbindelser skal hele anlægget indsamles (figur 1E).
  2. Nedsænk hele prøven i fiksativ opløsning (f.eks. FAA) i et volumetrisk forhold på 1:10 (prøve: fiksativ). Lad prøverne ligge i fikseringsmiddel i mindst 1 dag, afhængigt af prøvens størrelse27.
    BEMÆRK: Prøver kan opbevares i fikseringsmiddel før scanning eller overføres til en konserveringsopløsning (f.eks. ethanol 70%). Friske prøver kan også anvendes, hvis den efterfølgende anatomiske analyse ikke er berettiget (se afsnittet Diskussion). Hvis du arbejder med frisk materiale, skal du indstille apparatet til perfusion af kontrastopløsningen og derefter samle prøven. Prøven må ikke tørre ud.

2. Anvendelse af kontrasterende løsninger

  1. Vælg den påføringsmetode, der skal bruges. Brug vakuummetoden (trin 2.3) til små prøver (figur 1A) eller ikke-træagtige prøver (figur 1B). Brug perfusionsmetoden til større prøver, forudsat at den omfatter et segment af værtsstammen/roden er (figur 1A, C-E).
  2. Brug gummihandsker og andet passende personligt beskyttelsesudstyr (f.eks. laboratoriebelægning), når du manipulerer prøven, uanset hvilken fremgangsmåde der er valgt i de følgende trin.
    FORSIGTIG: Alle kontrastopløsninger indeholder tungmetalsalte i deres sammensætning og bør derfor ikke håndteres uden tilstrækkeligt personligt beskyttelsesudstyr og under en damphætte.
  3. Følg nedenstående trin for vakuummetoden.
    1. Vælg et passende hætteglas og mærk det. Hætteglasset skal være stort nok til at rumme prøven og den kontrasterende opløsning, normalt i forholdet 1:10. Kontroller producentens anvisninger for at sikre, at hætteglasset kan modstå lavt til moderat vakuum.
      BEMÆRK: Fyld ikke hætteglasset til randen, da undertrykket (vakuum) kan medføre, at væsken spildes.
    2. Anbring prøven i hætteglasset med den kontrasterende opløsning (1% jod eller 3% phosphotungstat, se materialetabel). Anbring derefter hætteglasset i et vakuumkammer eller ekssikkator, der er forbundet med en vakuumpumpe. Fjern låget fra hætteglasset, og luk derefter vakuumkammeret eller ekssikkatoren.
    3. Kontroller, at der ikke er revner i vakuumkammeret/ekssikkatoren, og at vakuumpumpen har nok olie.
    4. Luk pumpens udsugningsventil for at forhindre luft i at slippe ud, og åbn udsugningsventilen i kammeret/ekssikkatoren for at tvinge luften ud.
    5. Tænd pumpen, og vent, indtil trykket når ca. 20" Hg.
      FORSIGTIG: Denne proces er normalt hurtig, så lad ikke vakuumsystemet være uden opsyn.
      BEMÆRK: Mens den metriske systemenhed for tryk er Pascal (Pa), viser manometre i de fleste laboratorievakuumpumper tryk i tommer kviksølv ("Hg"), pund pr. kvadrattomme (psi) eller bar. 20" Hg svarer til ca. 67,7 Pa, 10 psi eller 0,7 bar.
    6. Luk kammerets/ekssikkatorens udstødningsventil for at forhindre luft i at trænge ind igen, og sluk derefter hurtigt for pumpen.
    7. Prøven lades vakuum stå i mindst 2 timer. Større prøver kræver længere tid for kontrastopløsningen at trænge ind i den.
    8. Efter den ønskede periode fjernes prøven fra kontrastopløsningen for at forberede den til scanning.
    9. Åbn langsomt kammerets/ekssikkatorens udsugningsventil for at lade luft trænge ind i den.
    10. Vent på, at trykket i kammeret/ekssikkatoren er helt opbrugt (dvs. manometeret når tæt på 0), og åbn det derefter forsigtigt for at hente prøven.
    11. Kassér kontrastopløsningen korrekt, og opbevar prøven som forberedelse til scanning.
  4. Følg nedenstående trin for perfusionsmetoden.
    1. Vælg en forsyningstank til kontrastopløsningen i henhold til prøvens størrelse. Brug en 50 ml sprøjte (uden nål eller stempel) til små prøver (figur 2A) eller et 1 L intravenøst medicinsk kit til store prøver (figur 2B).
    2. Tilslut den ene ende af en gennemsigtig plastslange (se materialetabel) til forsyningstanken, og tilslut derefter den anden ende til en tovejs- eller trevejsventil. Tilslut en anden slange til en anden udgang i ventilen (figur 2A, B).
    3. Fastgør forsyningstanken i en forhøjet position uden at adskille apparatet, der er oprettet i det foregående trin.
      BEMÆRK: Den lodrette afstand mellem tanken og prøven dikterer opløsningens perfusionstryk (figur 2B). En afstand på 20-50 cm er nok til små prøver. For store prøver er en afstand på 1 m mere passende.
    4. Luk trevejsventilen (figur 2C) eller tovejsventilen (figur 2D) for at forhindre væske i at komme ud af slangesystemet, og hæld derefter kontrastopløsningen i forsyningstanken. Hvis du bruger et intravenøst medicinsk kit, skal du fylde posen med opløsningen og lukke ventilen, inden apparatet fastgøres i en forhøjet position.
    5. Sørg for, at der ikke dannes store luftbobler langs slangesystemet (figur 2E). Lad om nødvendigt kontrastopløsningen strømme ud af slangen, indtil boblen er fjernet. Luk ventilen igen, og lad apparatet være på plads.
    6. For at forberede prøven til perfusion af kontrastopløsningen skal den holdes nedsænket i væske (vand, ethanol eller fikseringsmiddel) og afskære spidsen af den proksimale ende af værtsstammen / roden i prøven (figur 2F).
    7. Prøven fjernes fra væsken, hvori den blev opbevaret, og pakk den ind i en paraffinfilm for at undgå udtørring. Opbevar prøven i nærheden og klar til at blive tilsluttet apparatet.
    8. Åbn forsigtigt ventilen for at lade kontrastopløsningen flyde langsomt, og fyld plastslangen, der er forbundet med tanken, mens du holder den åbne ende af systemet i en let forhøjet position for at forhindre, at kontrastopløsningen spildes. Sørg igen for, at der ikke dannes store luftbobler langs røret.
    9. Forbind den proksimale ende af værtsstammen/roden i prøven til den åbne ende af slangesystemet (figur 2B, forstørret område). Undgå at indføre luftbobler i systemet under dette trin. Afbryd om nødvendigt prøven fra apparatet, og fjern luftbobler fra systemet ved at lade opløsningen strømme.
    10. Mens prøven holdes forbundet med apparatet, anbringes den i en beholder for at undgå lækage af kontrastopløsningen i det område, hvor forsøget blev oprettet. Brug rør med forskellige diametre, plastik lynlåse og ventiladaptere (figur 2G) for at sikre, at alle forbindelser i apparatet er velegnede, rumme værtsgrene i forskellige størrelser, og at opløsningen ikke lækker ud af slangesystemet (figur 2B, forstørret område).
    11. Opløsningen lader prøven perfusere i mindst 2 timer, eller indtil opløsningen akkumuleres inde i beholderen.
    12. Luk ventilen, og frakobl forsigtigt prøven fra apparatet. Hæld resten af opløsningen i beholderen og bortskaf den på passende vis.
    13. Paraffinfilmen fjernes fra prøven som forberedelse til scanning.

Figure 2
Figur 2: Perfusionsmetode til kontrastanvendelse. Små (A) og store (B) versioner af perfusionsapparatet inkluderer en forsyningstank (st) og to plastrør (t1 og t2) forbundet med en ventil (va). Den proksimale ende af værtsstammen (H), der bærer en parasit (P), der er fastgjort til den via haustorium (ha), er forbundet med systemets åbne ende (B, ekspanderet). En trevejs (C) eller en tovejs (D) ventil bruges til at forhindre dannelse af luftbobler inde i rørsystemet, som blokerer passagen af kontrastopløsning (E). Spidsen af den proksimale ende af værtsstammen (H) skæres under vand for at tillade passage af kontrastopløsningen (F). Lynlåse, ventiladaptere og slanger med forskellige diametre hjælper med at sikre tættere forbindelser og undgå lækage i systemet (G). Figur 2B, D og F blev oprettet med BioRender. Vægtstænger = 2 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Prøveforberedelse og montering

  1. Vask prøven ved at nedsænke den i vand i 2 min.
    FORSIGTIG: Vask ikke prøver i vasken, da alle kontrastopløsninger indeholder tungmetalsalte i deres sammensætning. Overvej vandet, der bruges til vask, som en fortyndet kontrastopløsning, og bortskaf det korrekt.
  2. Anbring prøven i et køkkenrulle ved stuetemperatur for at lade overskydende vand fordampe i 2-5 minutter afhængigt af prøvens størrelse. Alternativt tørres prøven lidt ved hjælp af et køkkenrulle. Lad ikke prøven tørre helt ud.
  3. Pak prøven ind i en paraffinfilm ved at strække den til et tyndt lag. Undgå at folde paraffinfilmen oven på prøven.
  4. Monter den indpakkede prøve på en prøveholder, og hold den stabil og på plads, mens den roterer under scanningen. Brug tape, skum med lav densitet, pipettespidser og/eller klare plastbeholdere til at fastgøre prøven på plads.
  5. Scan prøven og analyser billederne efter specifikke protokoller og retningslinjer, der er fastlagt for det tilgængelige mikro-CT-system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Haustorium af parasitære planter er et komplekst organ, der omfatter forskellige væv og celletyper, der fletter sig sammen og forbinder med væv fra en anden plante, der anvendes som vært20. Micro-CT-scanning kan udnyttes til bedre at forstå denne komplekse struktur på en ikke-destruktiv og tredimensionel måde, når man analyserer både små (figur 1A-C) og store (figur 1D, E) haustoria. For at gøre dette kan kontrasterende løsninger anvendes i parasit-værtsgrænsefladen, hvilket gør det muligt at analysere prøver, der ellers ville have lav og homogen røntgenabsorption. De to enkle tilgange, der er beskrevet i denne protokol, er afhængige af at sætte den kontrasterende opløsning under tryk for at fremskynde penetration gennem prøven. Som forventet fungerer protokollerne beskrevet her for forskellige mikro-CT-systemer. Scanningsindstillinger og parametre varierer dog afhængigt af systemet og den analyserede prøve (tabel 1).

Funktionel gruppe Euphytoid parasit Endoparasit Parasitisk vinstok Mistelten (før/efter kontrast) Obligatorisk rodparasit
Art (familie) Pyrularia pubera Viscum minimum Cuscuta americana Struthanthus martianus Scybalium fungiforme
Familie Santalaceae Viscaceae Convolvulaceae Loranthaceae Balanophoraceae
Kontrast løsning 3% phosphotungstat 1% jod 1% jod 1% jod 0,2% blynitrat
Ansøgningsmetode vakuum vakuum perfusion perfusion perfusion
Mikro-CT-system Zeiss Versa 620 Nikon X-Tek HMXST225 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176
Fremskrivninger 4500 3140 610 1200 / 2400 5300
Rammer 1 1 3 (gennemsnit) 3 / 3 (gennemsnit) 3 (gennemsnit)
Eksponering (ms) 5000 1000 680 1600 / 830 750
Filter (mm) ingen Al 0,25 Al 1,0 Al 1.0 / Al 1.0 ingen
Spænding (kV) 60 85 35 90 / 45 40
Strøm (μA) 108 80 375 180 / 390 600

Tabel 1: Scanningsindstillinger og parametre for de analyserede prøver.

Efter den første fremgangsmåde til kontrastpåføring (trin 2.3) blev vakuum anvendt til at perfusere haustorium af euphytoidparasitten P. pubera med en 3% phosphotungstateopløsning i to timer. Prøven blev derefter scannet i et 3D røntgenmikroskopsystem (XRM) (se materialetabel) og opnåede høj billedopløsning via sekundær optisk forstørrelse4. XRM-billeder blev observeret at være lige så effektive som anatomiske sektioner analyseret under et lysmikroskop for at analysere vævsorganisation og topologi ved parasit-værtsgrænsefladen (figur 3). Anvendelsen af phosphotungstate fremhæver overflod af parenchymvæv, som fremstår i en lys hvid tone på grund af den høje absorption af kontrastmidlet. Fartøjer vises i en mørkegrå tone på grund af lav absorption af kontrast. Baseret på denne farveforskel er det muligt at observere overflod af parenchyma, der omgiver haustoriets vaskulære kerne (figur 3). De indviklede kar og tynde parenchymstrenge i selve vaskulærkernen observeres også, især i langsgående sektioner (figur 3A-C). I tværsnit observeres den vaskulære kerne let som to vaskulære tråde adskilt af parenchyma (figur 3D, E).

Figure 3
Figur 3: Euphytoid parasit haustorium. Longitudinale (A-C) og tværgående (D-E) sektioner gennem haustorium blev observeret under et lysmikroskop (A,E) og via 3D røntgenmikroskopi efter påføring af 3% phosphotungstate opløsning ved hjælp af vakuum (B-D). Røde konturer angiver parenkymvæv (par), og blå konturer angiver den vaskulære kerne (vc). Hx: vært xylem. Hb: værtsbark. Skalastænger = 500 μm (A, E) og 2,5 cm (B-D; voxelstørrelse = 2,8382 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Den samme tilgang blev brugt til at indføre kontrast i stammen af en saftig værtsplante (Euphorbia polygona, Cactaceae) parasiteret af V. minimum. Her blev 1% iodopløsning valgt som et kontrastmiddel baseret på foreløbig histokemisk analyse, som viste, at parenchymceller i endoparasitten opbevarer kulhydrater i form af stivelse (figur 4A). Samtidig opbevarer celler i værtscortex ikke en påviselig mængde stivelse (figur 4B-D). Efter kontrastpåføring blev prøven derefter scannet ved hjælp af et Nikon X-Tek mikro-CT-system (se materialetabellen). Forskellen i jodabsorption tillod påvisning af den indviklede bane af kortikale tråde dannet af endoparasitten i værtslegemet (figur 4E). Efter denne metode blev kortikale tråde observeret at koncentrere sig omkring værtsvaskulærcentret og til sidst forgrene sig mod værtsstammens periferi, når de var forbundet med emersionen af en parasitblomst (figur 4F, G).

Figure 4
Figur 4: Endoparasitvævsnetværk. Anatomiske (A) og makro (B-D) sektioner viser reaktion med 1% iodopløsning, hvilket indikerer, at stivelse (farvet i sort) er til stede i parenchymen (par) forbundet med parasitens kar (ve). Fordi stivelse er fraværende i værtscortex (Hc) og xylem (Hx), blev 1% iodopløsninger selektivt anvendt til at forbedre kontrasten mellem parasitkortikale strengvæv (lilla konturer, E-G), set mod værtsbaggrunden (H). Tilstedeværelsen af en blomst (Pf) bekræfter, at det farvede væv er en del af endoparasitstrukturen (A, F, G). Vægtstænger = 0,25 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

I den anden fremgangsmåde, der er beskrevet her (trin 2.4), hæves en forsyningstank indeholdende kontrastopløsningen fra det niveau, hvori prøven anbringes, hvorved tyngdekraften anvendes til at drive opløsningens passage gennem prøven. Efter kontrastperfusion blev scanningen udført ved hjælp af et Bruker Skycan mikro-CT-system (se materialetabel). Resultaterne opnået for C. americana (figur 5A, B) og S. martianus (figur 5C-G) hjælper med at illustrere bekvemmeligheden ved denne fremgangsmåde for henholdsvis små og store prøver. Sammenligning af prøver scannet før (figur 5C, E) og efter (figur 5D, F) perfusion af 1% iodopløsning understreger vigtigheden af kontrastapplikation selv i træagtige haustoriumprøver. Det er bemærkelsesværdigt, at parasitter i foreningerne mellem både C. americana og S. martianus (figur 5) og deres respektive værter har ringe eller intet stivelsesindhold i deres væv. Dette forklarer de forskellige resultater, der er beskrevet for endoparasitten V. minimum (figur 4), hvor den samme metode og type kontrastopløsning blev anvendt.

Figure 5
Figur 5: Parasitisk vinstok og mistelten haustorium. Langsgående sektioner gennem haustorium af en parasitisk vinstok (A, B) og en mistelten (C-G). Sammenligning mellem scanning og makrosektion af frisk materiale viser, at den indviklede haustoriumstruktur er godt fanget i mikro-CT-scanninger (A, B). Sammenligning mellem fikserede prøver før (C,E) og efter (D,F) perfusionen af 1% iodopløsning viser, at kontrasten forbedres selv i lignificerede prøver, hvilket letter observationen af parasitter (P) strukturer såsom kar i epikortikalen (lyserøde pilespidser), vaskulære tråde (blå pilespidser) og sinker (gul pilespids). Kar og årlige ringe af værtsxylem (Hx) og stivelse i værtsbarken (Hb) observeres også lettere. Vægtstænger = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Et endeligt resultat opnået med perfusionsprotokollen beskrevet her er muligheden for at detektere vaskulære forbindelser mellem parasitter og værtsplanter. Dette blev opnået ved perfusering af en 0,2% blynitratopløsning gennem et segment af værtsroden, omkring hvilken knolden af den obligatoriske rodparasit S. fungiforme havde udviklet sig. Efter kontrastapplikation blev scanning også udført ved hjælp af et Bruker Skyscan mikro-CT-system (se materialetabel). Sekventielle fremskrivninger viser, at fartøjer i værtsroden forgrener sig i parasitknolden (figur 6A-C). Efter analysen af disse resultater blev den samme prøve skåret i en mindre delprøve, forberedt til anatomisk undersøgelse og analyseret ved hjælp af lysmikroskopi. Seriel sektionering af denne delprøve bekræfter, at xylemkontinuiteten mellem de to anlæg dannes ved fartøj-til-beholder-forbindelse via perforeringsplader (figur 6D-F).

Figure 6
Figur 6: Obligatorisk rodparasit haustorium. Langsgående sektioner gennem haustorium observeret via mikro-CT-scanning (A-C) og anatomiske sektioner observeret under lysmikroskopet (D-F). Akkumuleringen af 0,2% blynitratopløsning i værtsrotens vaskulære system (Hr, lyserød kontur) tillader observation af værtsfartøjer, der forgrener sig inden for parasitrøret (Pt) og påvisning af direkte vaskulær forbindelse mellem de to planter (stiplede hvide kontur). Skalastænger = 1 cm (A-C) og 500 μm (D-F). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Brugen af tungmetalopløsninger til forbedring af plantevævskontrast er blevet et afgørende skridt i prøveforberedelse til mikro-CT-analyse. Flere forbindelser, der almindeligvis er tilgængelige i plantemikromorfologilaboratorier, er blevet testet af Staedler et al., Der anbefaler at bruge phosphotungstate som det mest effektive middel til penetrerende prøver og øge kontrastindeks8. Resultater opnået her i analysen af haustorium af P. pubera bekræfter denne anbefaling. Med hensyn til kontrastanvendelse beskriver Steadler et al., at kontrastopløsningen passivt blev infiltreret gennem det analyserede materiale (blomster og blomsterknopper fra 1 mm til 10 mm) i løbet af 1 til 8 dage8. Andre forfattere har brugt den samme protokol for passiv infiltration over længere perioder (1-4 uger) ved analyse af større prøver, såsom de 30 cm brede blomster af endoparasitiske Rafflesiaceae-arter28. Selvom denne proces har vist sig at være vellykket, viser resultater opnået med den her beskrevne protokol, at infiltrationsprocessen kan accelereres betydeligt under vakuum og dermed forbedre den tidligere etablerede metode. Et vakuumkammer eller en pumpe tvinger luft til at flygte fra plantevævene, hvilket muliggør lettere infiltration af kontrastopløsningen. Vakuum kan påføres selv på skrøbelige strukturer, som vist her for haustorium af P. pubera og blødt væv af den saftige værtsplante E. polygona parasiteret af V. minimum. Desuden er brugen af vakuumpumper en almindelig procedure til infiltration af fikseringsmidler eller indlejring af stoffer i mange laboratorier inden for plantemikromorfologi, hvilket gør denne protokol mere tilgængelig.

Den samme fremgangsmåde blev anvendt her med et kontrastmiddel, der selektivt pletter prøver, hvis specifikke opbevaringsforbindelser er til stede. Når det påføres gennem vakuum eller passiv infiltration, kan selektiv farvning give dårligere kontrastforbedring til en hel prøve sammenlignet med phosphotungstat, for eksempel. På den anden side er det gavnligt at fremhæve specifikke plantestrukturer eller væv. Som rapporteret her, når det kombineres med tidligere anatomisk eller histokemisk analyse, kan brugen af selektive kontrastmidler såsom jod hjælpe med differentieringen af parasitisk plantevæv i værtskroppen, forudsat at enten parasit eller vært (men ikke begge) viser rigelige stivelsesreserver. Selektivt stigende røntgenabsorption af parasitvæv har vist sig at være særlig nyttig til for første gang at udforske det komplekse tredimensionelle netværk dannet af en endoparasitisk plante som V. minimum inden for stammen af sin værtsplante. Desuden er det bemærkelsesværdigt, at endoparasitiske planter og visse svampe viser en interessant evolutionær konvergens, der begge vokser "inkognito" inde i deres værter i meget af deres livscyklus og kun dukker op i korte perioder29. Således ville en potentiel ny anvendelse af protokollen beskrevet her være at bruge phloxin B, en plet indeholdende brom30, til at detektere endofytiske svampe i plantevæv. Eosin, en anden brombaseret farvningsopløsning, der kun sjældent anvendes til plantevæv, har vist sig at forbedre kontrasten i musenyreprøver analyseret ved hjælp af et specifikt mikro-CT-system31.

En anden tilgang beskrevet i denne protokol er perfusionen af kontrasterende midler gennem værtsstammens eller rodens vaskulære væv. Denne tilgang, som adskiller sig væsentligt fra tidligere rapporterede metoder, er baseret på Sperry et al.'s arbejde, der perfuserede træprøver med safraninfarvestof for at analysere hydraulisk ledningsevne32. Som diskuteret af forfatterne og fremhævet her, er et kritisk trin i protokollen opsætning af pletperfuseringsapparatet for at undgå at indføre luftbobler i systemet32. Trevejsventiler kan midlertidigt afvige opløsningsfluxen og eliminere bobler fra væskencomlumn 32. Ikke desto mindre kan emboli være til stede inde i værtsplantens kar, forårsaget enten kunstigt under prøveudtagning eller naturligt på grund af de generelt høje transpirationshastigheder for parasitære planter33,34. Dette kan alvorligt reducere perfusionseffektiviteten, hvilket fører til, at kontrasten ikke forbedres i prøven. Det er vigtigt at anvende lavt til moderat vakuum, når prøven fikseres efter prøveudtagning for at forhindre dette problem. Komplementært kan den fikserede prøve skylles under højt tryk under anvendelse af den fikseringsopløsning, hvori prøven opbevares. Skylning kan hjælpe med at genoprette ledningsevnen i prøven ved at fjerne luftbobler32 og dermed rydde vejen for perfusion af kontrastopløsningen. Hvis der arbejdes med frisk materiale, kan indføring af luftbobler i planten undgås ved at nedsænke prøven i vand umiddelbart efter prøveudtagning, derefter skære den igen under vand og udjævne endefladen med skarpe knive35.

Efter denne fremgangsmåde blev 1% iodopløsning perfuseret gennem haustorium af C. americana og S. martianus for at forbedre kontrasten mellem værtsparasitgrænsefladen som helhed. Resultater opnået for disse arter viser, at perfusionsprotokollen, der er beskrevet her, fungerer godt for både friske og fikserede prøver, og at introduktion af kontrastopløsninger forbedrer visualiseringen selv i lignificerede prøver. Disse observationer stemmer overens med resultater rapporteret af Teixeira-Costa & Ceccantinti17, der brugte samme tilgang til at anvende en 0,2% blynitratopløsning til at visualisere specifikke aspekter af haustoriumstrukturen. Ved kontakt med kuldioxid reagerer blynitrat og danner et meget uopløseligt bundfald bestående af blycarbonatkrystaller, som effektivt absorberer røntgenstråler 8,36. Når det er perfuseret i prøvens vaskulære væv, tilstopper dette bundfald vaskulære pitforbindelser, hvilket gør det muligt for opløsningen kun at strømme gennem direkte fartøj-til-beholder-forbindelser via perforeringsplader. Efter denne fremgangsmåde vises tilstedeværelsen af direkte parasit-vært xylemforbindelser gennem perforeringsplader her for S. fungiforme og bekræftes med detaljeret anatomisk analyse. Disse resultater fremhæver en yderligere anvendelse af denne tilgang til test af haustoriumfunktionalitet. I betragtning af at haustoriuminitiering muligvis ikke kulminerer i udviklingen af et fuldt funktionelt organ på grund af enten parasit-vært inkompatibilitet eller værtsresistens mod parasitten, kan den her beskrevne tilgang bruges til at teste, om der dannes vaskulære forbindelser mellem de to planter, hvilket fører til forekomsten af effektiv parasitisme. I betragtning af værdien af at bruge mikro-CT-scanning til at undersøge xylememboli mere bredt12,37, kan protokollen, der præsenteres her, også forbedre visualiseringen og den kvantitative analyse af xylememboli i andre ikke-parasitære plantearter.

Afslutningsvis nærmer denne protokol sig et af de kritiske fremskridt, der forventes inden for plantemikrotomografi, som anvender kontrastmidler til at hjælpe med at differentiere strukturer med lav røntgenabsorpion24. Som vist her kan kontrastløsninger forbedre visualiseringen af haustoriumstrukturer betydeligt ved grænsefladen mellem parasitære planter og deres værter. Forskellige forbindelser kan vælges efter deres specificitet ved reaktion med reserveforbindelser, såsom stivelse, som ofte fordeles forskelligt blandt parasit- og værtsvæv. Tilgangen til kontrastanvendelse i haustoriumprøver kan også vælges til at undersøge specifikke egenskaber ved parasit-værtsgrænsefladen, såsom direkte fartøj-til-fartøj-forbindelse. Desuden kan denne protokol også anvendes på ikke-parasitære arter, hvilket potentielt forbedrer påvisningen af endofytiske svampe og kvantificeringen af xylememboli. I enhver applikation kan protokollen beskrevet her for at forbedre mikrotomografianalyse kombineres med andre værktøjer, såsom optisk projektionstomografi og automatiseret virtuel segmentering, for at give ny og spændende indsigt i den tredimensionelle udvikling af forbindelsen mellem disse planter og deres værter38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at afsløre.

Acknowledgments

Jeg vil gerne takke Dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, University of Sao Paulo, Brasilien) og Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) for deres altoverskyggende hjælp og uundværlige brugeruddannelse til forskellige mikrotomografisystemer og dataanalysesoftware. Jeg takker også personalet på EEB Greenhouse ved University of Connecticut (USA), især Clinton Morse og Matthew Opel for at levere eksemplarerne af Viscum minimum. Dr. John Wenzel gav mulighed for og stor hjælp til prøveudtagning af Pyrularia pubera. MSc. Carolina Bastos, MSc. Yasmin Hirao og Talitha Motta hjalp meget med prøveudtagning af Scybalium fungiforme. Ariadne Furtado og Dr. Fernanda Oliveira og Maria Aline Neves leverede referencen for brugen af phloxin B til analyse af endofytiske svampe. Videooptagelse på Vrije Universiteit Brussel blev muliggjort ved hjælp af Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka og Dr. Harry Olde Venterink. Finansieringen blev ydet af koordineringen til forbedring af personalet på de videregående uddannelser (CAPES, Brasilien) og Harvard University Herbaria (USA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D X-ray microscope (XRM) system Zeiss Versa 620 used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22 Zeiss Versa 620 Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software Nikon version XT 3.1.11 Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software Bruker version 3.3.1 Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software Object Research Systems - ORS version Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials Glass Vials Inc. SE V2708C-FM-SP Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X Zeiss version XT 3.1.11 Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N WR Chemicals BDH BDH7422-1 Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g Vetec 361.08 Sold by SPLab
Microtomography scanner Bruker Skyscan1176 Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner Nikon X-Tek HMXST225 Used for scanning the species V. minimum
NRecon software Bruker version 1.0.0 Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution Electron Microscopy Sciences 101410-756 Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm) Heathrow Scientific PM996 Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL Taylor 3478 Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4'' Nalge Nunc International SC63013-164 Sold by VWR - USA
Scanning system Nikon X-Tek HMXST225 used to scan Viscum minimum
Scanning system Bruker Skyscan 1176 used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software Zeiss version 16 Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve ToToT DMTWVS-5 Sold by Amazon USA
Two-part syringe HSW Henke-Ject 4850001000 Used without the plunger
Vacuum chamber Binder 80080-434 Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software Volume Graphics version 3.0 Used for analyses and acquisition of images and videos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. The Biology of Parasitic Flowering Plants. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 179 Mikrotomografi haustorium holoparasit endoparasit Cuscuta mistelten cytokemi
Udnyttelse af mikro-CT-scanning til at analysere parasitære plante-værtsinteraktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teixeira-Costa, L. Leveraging… More

Teixeira-Costa, L. Leveraging Micro-CT Scanning to Analyze Parasitic Plant-Host Interactions. J. Vis. Exp. (179), e63423, doi:10.3791/63423 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter