Summary
Micro-CT är ett icke-destruktivt verktyg som kan analysera växtstrukturer i tre dimensioner. Det nuvarande protokollet beskriver provberedningen för att utnyttja mikro-CT för att analysera parasitisk växtstruktur och funktion. Olika arter används för att lyfta fram fördelarna med denna metod när de kombineras med specifika preparat.
Abstract
Mikro-CT-skanning har blivit ett etablerat verktyg för att undersöka växters struktur och funktion. Dess icke-destruktiva natur, i kombination med möjligheten till tredimensionell visualisering och virtuell sektionering, har möjliggjort ny och alltmer detaljerad analys av komplexa växtorgan. Interaktioner mellan växter, inklusive mellan parasitiska växter och deras värdar, kan också utforskas. Provberedning före skanning blir dock avgörande på grund av interaktionen mellan dessa växter, som ofta skiljer sig åt i vävnadsorganisation och sammansättning. Dessutom måste den breda mångfalden av parasitiska blommande växter, allt från starkt reducerade vegetativa kroppar till träd, örter och buskar, beaktas vid provtagning, behandling och beredning av parasitvärdmaterial. Här beskrivs två olika tillvägagångssätt för att införa kontrastlösningar i parasiten och/eller värdväxterna, med fokus på att analysera haustorium. Detta organ främjar anslutning och kommunikation mellan de två växterna. Efter ett enkelt tillvägagångssätt kan detaljer om haustoriumvävnadsorganisation utforskas tredimensionellt, som visas här för euphytoid-, vinstock- och mistelparasitiska arter. Val av specifika kontrastmedel och appliceringsmetoder möjliggör också detaljerad observation av endoparasitspridning inom värdkroppen och detektering av direkt kärl-till-kärlanslutning mellan parasit och värd, som visas här för en obligatorisk rotparasit. Således kan protokollet som diskuteras här tillämpas på den stora mångfalden av parasitiska blommande växter för att främja förståelsen för deras utveckling, struktur och funktion.
Introduction
Högupplöst röntgenmikrodatortomografi (mikro-CT) är en avbildningsmetod där flera röntgenbilder (projektioner) av ett prov registreras från olika betraktningsvinklar och senare används för att ge en virtuell rekonstruktion av provet1. Detta virtuella objekt kan sedan analyseras, manipuleras och segmenteras, vilket möjliggör icke-destruktiv utforskning i tre dimensioner2. Ursprungligen utformad för medicinska analyser och senare för industriella applikationer, erbjuder mikro-CT också fördelen att visualisera inre organ och vävnader utan behov av invasiva procedurer3. Liksom andra former av avbildning arbetar mikro-CT med en avvägning mellan synfältet och pixelstorleken, vilket innebär att högupplöst avbildning av stora prover är nästan ouppnåelig4. Framsteg görs ständigt när det gäller användning av högenergetiska röntgenkällor (dvs. synkrotron) och sekundär optisk förstoring, vilket gör att den minsta upplösningen kan nå under100 nm 5,6. Ändå är längre skanningstider nödvändiga för stora prover, vilket ökar risken för artefakter på grund av provrörelse eller deformation inuti skannern. Dessutom begränsas mikro-CT generellt av naturliga densitetsvariationer inom provet och hur provet interagerar med röntgenstrålar. Medan en högre röntgendos är bäst för att penetrera tätare prover, är den mindre effektiv för att fånga variationer i densitet inom och mellan provet och dess omgivande medium7. Å andra sidan ger en lägre röntgendos mindre penetrationskraft och kräver ofta längre skanningstider men mer känslighet vid densitetsdetektering7.
Dessa begränsningar har länge hindrat användningen av mikrotomografi för växtvetenskap, med tanke på att de flesta växtvävnader består av lätt (icke-tät) vävnad med låg röntgenabsorption8. De första tillämpningarna av mikro-CT var inriktade på att kartlägga rotnätverk inom jordmatrisen 9,10. Senare började växtstrukturer med mer signifikanta skillnader i vävnadsdensitet, såsom trä, utforskas. Detta har möjliggjort undersökningar av xylemfunktionalitet 11,12, utveckling av komplexa vävnadsorganisationer13,14 och interaktioner mellan växter15,16,17. Analysen av mjuk och homogen vävnad blir utbredd på grund av kontrastmedel, som nu är standardprocedur vid preparat för mikro-CT-skanning av växtprover. Protokoll för kontrastintroduktion kan dock ha olika resultat beroende på provvolym, strukturella egenskaper och vilken typ av lösning som används8. Helst bör kontrastmedlet förbättra skillnaden mellan olika vävnader, möjliggöra utvärdering av vävnad / organfunktionalitet och / eller ge biokemisk information om en vävnad18. Därför blir adekvat provbehandling, förberedelse och montering före skanning avgörande för varje mikro-CT-analys.
Mikro-CT av parasitväxten haustorium
Parasitiska blommande växter representerar en distinkt funktionell grupp av angiospermer som kännetecknas av ett organ som kallas haustorium19. Detta flercelliga organ, en utvecklingshybrid mellan en modifierad stam och en rot, verkar på värdens fastsättning, penetration och kontakt med en parasit20. Av denna anledning anses haustorium "förkroppsliga själva idén om parasitism bland växter"21. En detaljerad förståelse av detta organs utveckling, struktur och funktion är avgörande för parasitisk växtekologi, evolution och hanteringsstudier. Ändå hindrar parasitiska växters övergripande komplexitet och mycket modifierade struktur och haustoria ofta detaljerad analys och jämförelse. Haustoriumanslutningar är också vanligtvis omfattande och inte homogena i vävnads- och celldistribution (figur 1). I detta sammanhang, medan arbetet med små vävnadsfragment möjliggör enklare manipulation och högre upplösning, kan det leda till felaktiga slutsatser om den tredimensionella arkitekturen hos komplexa strukturer, såsom parasitväxten haustorium.
Även om det finns en omfattande litteratur om haustoriumanatomi och ultrastruktur för de flesta parasitiska växtarter, är den tredimensionella organisationen och det rumsliga förhållandet mellan parasit och värdvävnader fortfarande dåligt utforskat17. I ett nyligen utfört arbete av Masumoto et al.22 avbildades över 300 seriella halvtunna mikrotomsektioner och rekonstruerades till ett tredimensionellt virtuellt objekt som representerar haustorium av två parasitarter. Denna metods utmärkta detaljnivå ger oöverträffade insikter i haustoriums cellulära och anatomiska 3D-struktur. En sådan tidskrävande teknik skulle emellertid förbjuda en liknande analys i parasiter med mer omfattande haustoriumanslutningar. Användningen av mikro-CT framträder som ett utmärkt verktyg för tredimensionell analys av komplexa och ofta skrymmande haustoria av parasitiska växter. Även om det inte ersätter detaljerad anatomisk snittning och andra kompletterande former av mikroskopianalyser17,23, kan resultat erhållna via mikro-CT-skanning, särskilt för stora prover, också fungera som en guide för att styra delprovtagningen av mindre segment, som sedan kan analyseras med andra verktyg, såsom konfokal- och elektronmikroskopi, eller analyseras igen med högupplösta mikro-CT-system.
Figur 1: Parasitväxter av olika funktionella grupper som används i detta protokoll. Euphytoid parasit Pyrularia pubera (A), endoparasit Viscum minimum (B) med gröna frukter (streckad svart cirkel), parasitisk vinstock Cuscuta americana (C), mistel Struthanthus martianus (D), obligatorisk rotparasit Scybalium fungiforme (E). Segment av värdroten (Hr) eller stammen (Hs) underlättar appliceringen av kontrast i parasithaustorium (P). Närvaron av parasitens moderrot/stam (pilar) i provet möjliggör analys av haustoriumkärlets organisation. Rektanglar anger segment av provet som används för analys. Skalstreck = 2 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Eftersom mikro-CT blir en alltmer populär teknik inom växtvetenskap finns det guider, protokoll och litteratur som behandlar provskanning, tredimensionell rekonstruktion, segmentering och analys 3,10,24. Således kommer dessa steg inte att diskuteras här. Som med alla fantasitekniker är lämplig behandling och montering av prover en grundläggande, om än ofta förbisedd procedur. Av denna anledning fokuserar detta protokoll på beredning av haustoriumprover för mikro-CT-skanning. Mer specifikt beskriver detta protokoll två tillvägagångssätt för att införa kontrastmedel i haustoriumprover för att förbättra visualiseringen av olika vävnader och celltyper i haustorium, för att underlätta detektering av parasitvävnad inom värdroten / stammen och för att analysera parasit-värdvaskulära anslutningar i tre dimensioner. De preparat som beskrivs här kan också anpassas till analysen av andra växtstrukturer.
Fem arter användes för att bättre illustrera bekvämligheten med det protokoll som beskrivs här. Varje art representerar en av de fem funktionella grupperna av parasitiska blommande växter, vilket adresserar specifika punkter relaterade till funktionaliteten hos varje grupp. Pyrularia pubera (Santalaceae) valdes för att representera euphytoidparasiter, som gror i marken och bildar flera haustoria som förbinder parasiten med rötterna hos dessvärdar 25. Haustoria som skapas av dessa växter är ofta svaga och lätt sönderrivna från värden26 (figur 1A), vilket kräver en mer känslig hanteringsprocess. Endoparasiter representeras här av Viscum minimum (Viscaceae). Arter i denna funktionella grupp är endast synliga utanför sina värdars kropp under korta perioder (figur 1B) och lever större delen av sina livscykler som signifikant reducerade och mycelliknande cellsträngar inbäddade i värdvävnader25. En tredje funktionell grupp består av parasitiska vinstockar, som gror på marken men bara bildar rudimentära rötter, beroende av flera haustoria som fäster vid stjälkarna på värdväxter25 (figur 1C). Här representeras denna funktionella grupp av Cuscuta americana (Convolvulaceae). I motsats till parasitiska vinstockar gror misteln direkt på grenarna på sina värdväxter och utvecklar antingen flera eller ensamma haustoria25. Den art som valts för att illustrera denna funktionella grupp är Struthanthus martianus (Loranthaceae), som bildar olika förbindelser med värdgrenen (figur 1D). Analys av ensam mistel haustoria med en kombination av mikro-CT och ljusmikroskopi finns i Teixeira-Costa &; Ceccantini17. Slutligen omfattar obligatoriska rotparasiter arter som gror på marken och tränger in i värdväxternas rötter, som de är helt beroende av från de tidigaste tillväxtstadierna25. Dessa växter representeras här av Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), som producerar stora knölliknande haustoria (figur 1E).
Alla växtprover som användes i detta protokoll fixerades i en 70% formalinättiksyraalkohol (FAA 70). Fixeringen vid provtagning är avgörande för att bevara växtvävnader, särskilt om efterföljande anatomiska analyser behövs. När det gäller parasitisk växt haustorium är fixering också nödvändig, eftersom detta organ ofta huvudsakligen består av icke-lignifierade parenkymceller20. Detaljerade protokoll för fixering av växtvävnad, inklusive beredning av fixeringslösningar, finns på annan plats27. Å andra sidan kan fixeringsmedel i större eller mindre grad orsaka förändringar av ett provs fysikaliska och kemiska egenskaper, vilket gör det olämpligt för specifika biomekaniska och histokemiska analyser. Således kan färska prover, dvs icke-fixerat material som samlats in omedelbart före beredningen, också användas med detta protokoll. Information om hur du hanterar färska prover och felsökningsförslag för fixerat material finns i diskussionsavsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Urval av parasitiska växtprover
- Samla hela parasitväxten haustorium, inklusive den bifogade värdstammen / roten och segment av både proximala och distala ändar av det parasiterade värdorganet; Den ideala längden på varje segment motsvarar dubbelt så stor diameter som haustorium.
OBS: För lateral haustoria, inkludera en del av parasitens moderstam / rot från vilken haustorium bildades (figur 1A, B, D). För endoparasiter, samla in ett segment av värdstammen/roten där tecken på parasiten är synliga (figur 1B). Vid terminalanslutningar bör hela anläggningen samlas in (figur 1E). - Sänk ner hela provet i fixativ lösning (t.ex. FAA) i en volymetrisk andel av 1:10 (prov: fixativ). Lämna proverna i fixativ i minst 1 dag, beroende på provetsstorlek 27.
OBS: Prover kan förvaras i fixeringsmedel före skanning eller överföras till en konserveringslösning (t.ex. etanol 70%). Färska prover kan också användas om den efterföljande anatomiska analysen inte är motiverad (se diskussionsavsnittet). Om du arbetar med färskt material, ställ in apparaten för perfusion av kontrastlösningen och samla sedan provet. Provet får inte torka ut.
2. Tillämpning av kontrasterande lösningar
- Välj den appliceringsmetod som ska användas. Använd vakuummetoden (steg 2.3) för små (figur 1A) eller icke-träartade (figur 1B) prover. Använd perfusionsmetoden för större prover, förutsatt att den innehåller ett segment av värdstammen/roten (figur 1A,C-E).
- Använd gummihandskar och annan lämplig personlig skyddsutrustning (t.ex. laboratorierock) när du manipulerar provet oavsett vilken metod som valts i följande steg.
VARNING: Alla kontrasterande lösningar innehåller tungmetallsalter i sin sammansättning och bör därför inte hanteras utan tillräcklig personlig skyddsutrustning och under dragskåp. - För vakuummetoden, följ stegen som nämns nedan.
- Välj en lämplig injektionsflaska och märk den. Injektionsflaskan måste vara tillräckligt stor för att rymma provet och den kontrasterande lösningen, vanligtvis i en andel av 1:10. Kontrollera instruktionerna från tillverkaren för att säkerställa att injektionsflaskan tål lågt till måttligt vakuum.
OBS: Fyll inte injektionsflaskan till brädden, eftersom undertrycket (vakuumet) kan orsaka att vätskan spills. - Placera provet i injektionsflaskan med den kontrasterande lösningen (1% jod eller 3% fosfotungstat, se Materialförteckning). Placera sedan injektionsflaskan i en vakuumkammare eller exsickator ansluten till en vakuumpump. Ta bort locket från injektionsflaskan och stäng sedan vakuumkammaren eller exsickatorn.
- Kontrollera att det inte finns några sprickor på vakuumkammaren/exsickatorn och att vakuumpumpen har tillräckligt med olja.
- Stäng pumpens utsugningsventil för att förhindra att luft kommer ut och öppna kammarens/exsickatorns utsugningsventil för att tvinga ut luften.
- Slå på pumpen och vänta tills trycket når cirka 20 "Hg.
VARNING: Denna process är vanligtvis snabb, så lämna inte vakuumsystemet utan uppsikt.
OBS: Medan den metriska systemenheten för tryck är Pascal (Pa), visar tryckmätare i de flesta laboratorievakuumpumpar tryck i tum kvicksilver ("Hg"), pund per kvadrattum (psi) eller barer. 20" Hg motsvarar ca. 67,7 Pa, 10 psi eller 0,7 bar. - Stäng kammarens/exsickatorns avgasventil för att förhindra att luft tränger in igen och stäng sedan snabbt av pumpen.
- Låt provet stå under vakuum i minst 2 timmar. Större prover kräver längre tid för att den kontrasterande lösningen ska tränga igenom den.
- Efter önskad period, ta bort provet från kontrastlösningen för att förbereda det för skanning.
- Öppna långsamt kammarens/exsickatorns utmattningsventil så att luft kan komma in i den.
- Vänta tills trycket i kammaren/exsickatorn är helt uttömt (dvs. manometern når nära 0) och öppna den sedan försiktigt för att hämta provet.
- Kassera kontrastlösningen på lämpligt sätt och behåll provet som förberedelse för skanning.
- Välj en lämplig injektionsflaska och märk den. Injektionsflaskan måste vara tillräckligt stor för att rymma provet och den kontrasterande lösningen, vanligtvis i en andel av 1:10. Kontrollera instruktionerna från tillverkaren för att säkerställa att injektionsflaskan tål lågt till måttligt vakuum.
- För perfusionsmetoden, följ stegen som nämns nedan.
- Välj en matningstank för den kontrasterande lösningen enligt provets storlek. Använd en 50 ml spruta (utan nål eller kolv) för små prover (figur 2A) eller en 1 l intravenös medicinsk sats för stora prover (figur 2B).
- Anslut ena änden av ett transparent plaströr (se materialförteckning) till matningstanken och anslut sedan den andra änden till en tvåvägs- eller trevägsventil. Anslut en andra slang till ett annat utlopp i ventilen (figur 2A,B).
- Säkra matningstanken i ett upphöjt läge utan att demontera apparaten som ställts in i föregående steg.
OBS: Det vertikala avståndet mellan tanken och provet dikterar lösningens perfusionstryck (figur 2B). Ett avstånd på 20-50 cm räcker för små prover. För stora prover är ett avstånd på 1 m mer adekvat. - Stäng trevägsventilen (figur 2C) eller tvåvägsventilen (figur 2D) för att förhindra att vätska lämnar slangsystemet och häll sedan den kontrasterande lösningen i matningstanken. Om du använder ett intravenöst medicinskt kit, fyll påsen med lösningen och stäng ventilen innan du säkrar apparaten i ett förhöjt läge.
- Se till att inga stora luftbubblor bildas längs slangsystemet (figur 2E). Låt vid behov kontrastlösningen rinna ut ur slangen tills bubblan har tagits bort. Stäng ventilen igen och lämna apparaten på plats.
- För att bereda provet för perfusion av kontrastlösningen, håll det nedsänkt i vätska (vatten, etanol eller fixeringsmedel) och skär av spetsen på den proximala änden av värdstammen/roten i provet (figur 2F).
- Ta provet från vätskan där det förvarades och linda in det i en paraffinfilm för att undvika uttorkning. Förvara provet i närheten och förbered att anslutas till apparaten.
- Öppna försiktigt ventilen så att kontrastlösningen kan flöda långsamt och fyll plaströret som är anslutet till tanken medan du håller systemets öppna ände i ett något upphöjt läge för att förhindra att den kontrasterande lösningen spills. Återigen, se till att inga stora luftbubblor bildas längs röret.
- Anslut den proximala änden av värdstammen/roten i provet till slangsystemets öppna ände (figur 2B, förstorat område). Undvik att införa luftbubblor i systemet under detta steg. Koppla vid behov bort provet från apparaten och avlägsna luftbubblor från systemet genom att låta lösningen flöda.
- Medan provet hålls anslutet till apparaten, placera det i en behållare för att undvika läckage av den kontrasterande lösningen till det område där experimentet inrättades. Använd rör med olika diametrar, dragkedjor av plast och ventiladaptrar (figur 2G) för att säkerställa att alla anslutningar i apparaten är väl passade, rymmer värdgrenar av olika storlekar och att lösningen inte läcker ut ur slangsystemet (figur 2B, förstorat område).
- Låt lösningen perfusera provet i minst 2 timmar, eller tills lösningen ackumuleras inuti behållaren.
- Stäng ventilen och koppla försiktigt bort provet från apparaten. Töm resten av lösningen i behållaren och kassera den på lämpligt sätt.
- Ta bort paraffinfilmen från provet som förberedelse för skanning.
Figur 2: Perfusionsmetod för kontrastapplikation. Små (A) och stora (B) versioner av perfusionsapparaten inkluderar en matningstank (st) och två plaströr (t1 och t2) anslutna med en ventil (va). Den proximala änden av värdstammen (H) som bär en parasit (P) fäst vid den via haustorium (ha) är ansluten till systemets öppna ände (B, expanderad). En trevägs (C) eller en tvåvägs (D) ventil används för att förhindra bildandet av luftbubblor inuti slangsystemet, vilket blockerar passagen av kontrasterande lösning (E). Spetsen på värdstammens proximala ände (H) skärs under vattnet för att tillåta passage av kontrastlösningen (F). Dragkedjor, ventiladaptrar och slangar med olika diametrar hjälper till att säkra tätare anslutningar och undvika läckage i systemet (G). Figurerna 2B, D och F skapades med BioRender. Skalstreck = 2 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Provberedning och montering
- Tvätta provet genom att sänka ner det i vatten i 2 minuter.
VARNING: Tvätta inte prover i diskbänken, eftersom alla kontrasterande lösningar innehåller tungmetallsalter i deras sammansättning. Tänk på vattnet som används för tvätt som en utspädd kontrastlösning och kassera det på lämpligt sätt. - Placera provet i en pappershandduk vid rumstemperatur så att överflödigt vatten kan avdunsta i 2-5 minuter beroende på provets storlek. Alternativt kan du torka provet något med hjälp av en pappershandduk. Låt inte provet torka ut helt.
- Vik in provet i en paraffinfilm genom att sträcka det till ett tunt lager. Undvik att vika paraffinfilmen ovanpå provet.
- Montera det inslagna provet på en provhållare och håll det stabilt och på plats medan det roterar under skanningen. Använd tejp, skum med låg densitet, pipettspetsar och / eller klara plastbehållare för att säkra provet på plats.
- Skanna provet och analysera bilderna enligt specifika protokoll och riktlinjer som fastställts för det tillgängliga mikro-CT-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Haustorium av parasitiska växter är ett komplext organ som består av olika vävnader och celltyper som sammanflätas och förbinder med vävnaderna hos en annan växt, som används som värd20. Mikro-CT-skanning kan utnyttjas för att bättre förstå denna komplexa struktur på ett icke-destruktivt och tredimensionellt sätt vid analys av både små (figur 1A-C) och stora (figur 1D, E) haustoria. För att göra detta kan kontrasterande lösningar appliceras i parasit-värdgränssnittet, vilket gör det möjligt att analysera prover som annars skulle ha låg och homogen röntgenabsorption. De två enkla tillvägagångssätten som beskrivs i detta protokoll förlitar sig på trycksättning av den kontrasterande lösningen för att påskynda penetrationen genom provet. Som förväntat fungerar protokollen som beskrivs här för olika mikro-CT-system. Skanningsinställningar och parametrar varierar dock beroende på systemet och det analyserade provet (tabell 1).
| Funktionell grupp | Euphytoid parasit | Endoparasit | Parasitisk vinstock | Misteln (före/efter kontrast) | Obligatorisk rotparasit |
| Arter (familj) | Pyrularia pubera | Minsta möjliga viscum | Cuscuta americana | Struthanthus martianus | Scybalium fungiforme |
| Familj | Santalaceae | Viscaceae | Convolvulaceae | Loranthaceae | Balanophoraceae |
| Kontrastlösning | 3% fosfotungstat | 1% jod | 1% jod | 1% jod | 0,2% blynitrat |
| Appliceringsmetod | vakuum | vakuum | Perfusion | Perfusion | Perfusion |
| Mikro-CT-system | Zeiss Versa 620 | Nikon X-Tek HMXST225 | Bruker Skyscan 1176 | Bruker Skyscan 1176 | Bruker Skyscan 1176 |
| Prognoser | 4500 | 3140 | 610 | 1200 / 2400 | 5300 |
| Ramar | 1 | 1 | 3 (genomsnitt) | 3 / 3 (genomsnitt) | 3 (genomsnitt) |
| Exponering (ms) | 5000 | 1000 | 680 | 1600 / 830 | 750 |
| Filter (mm) | ingen | Al 0,25 | Al 1.0 | Al 1.0 / Al 1.0 | ingen |
| Spänning (kV) | 60 | 85 | 35 | 90 / 45 | 40 |
| Ström (μA) | 108 | 80 | 375 | 180 / 390 | 600 |
Tabell 1: Skanningsinställningar och parametrar för de analyserade proverna.
Efter den första metoden för kontrastapplicering (steg 2.3) användes vakuum för att perfusera haustorium av euphytoidparasiten P. pubera med en 3% fosfotungstatslösning i två timmar. Provet skannades sedan i ett 3D-röntgenmikroskopsystem (XRM) (se materialförteckning) och uppnådde hög bildupplösning via sekundär optisk förstoring4. XRM-bilder observerades vara lika effektiva som anatomiska sektioner analyserade under ett ljusmikroskop för att analysera vävnadsorganisation och topologi vid parasit-värdgränssnittet (figur 3). Användningen av fosfotungstat belyser överflöd av parenkymvävnad, som framträder i en ljus vit ton på grund av den höga absorptionen av kontrastmedlet. Fartyg förekommer i en mörkgrå ton på grund av låg absorption av kontrast. Baserat på denna färgskillnad är det möjligt att observera överflöd av parenkym som omger haustoriumets vaskulära kärna (Figur 3). De invecklade kärlen och tunna parenkymsträngarna i själva kärlkärnan observeras också, särskilt i längsgående sektioner (figur 3A-C). I tvärsnitt observeras kärlkärnan lätt som två vaskulära strängar åtskilda av parenkym (figur 3D, E).
Figur 3: Euphytoid parasit haustorium. Längsgående (A-C) och tvärgående (D-E) sektioner genom haustorium observerades under ett ljusmikroskop (A,E) och via 3D-röntgenmikroskopi efter applicering av 3% fosfotungstatslösning med vakuum (B-D). Röda konturer indikerar parenkymvävnad (par) och blå konturer indikerar kärlkärnan (vc). Hx: värd xylem. Hb: värdbark. Skalstänger = 500 μm (A, E) och 2,5 cm (B-D; voxelstorlek = 2,8382 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Samma tillvägagångssätt användes för att införa kontrast i stammen av en saftig värdväxt (Euphorbia polygona, Cactaceae) parasiterad av V. minimum. Här valdes 1% jodlösning som kontrastmedel baserat på preliminär histokemisk analys, vilket visade att parenkymceller i endoparasiten lagrar kolhydrater i form av stärkelse (Figur 4A). Samtidigt lagrar celler i värdcortex inte en detekterbar mängd stärkelse (figur 4B-D). Efter kontrastapplicering skannades provet sedan med ett Nikon X-Tek mikro-CT-system (se materialförteckning). Skillnaden i jodabsorption möjliggjorde detektering av den invecklade banan av kortikala strängar bildade av endoparasiten i värdkroppen (figur 4E). Efter denna metod observerades kortikala strängar att koncentrera sig runt värdens vaskulära centrum och så småningom förgrena sig mot värdstammens periferi när de associeras med avsmältningen av en parasitblomma (figur 4F, G).
Figur 4: Endoparasitvävnadsnätverk. Anatomiska (A) och makro (B-D) sektioner visar reaktion med 1% jodlösning, vilket indikerar att stärkelse (färgad i svart) är närvarande i parenkymet (par) associerat med parasitens kärl (ve). Eftersom stärkelse saknas i värdbarken (Hc) och xylem (Hx), användes 1% jodlösningar selektivt för att förbättra kontrasten hos parasitkortikala strängvävnader (lila konturer, E-G), sett mot värdbakgrunden (H). Närvaron av en blomma (Pf) bekräftar att den färgade vävnaden är en del av endoparasitstrukturen (A, F, G). Skalstänger = 0,25 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I det andra tillvägagångssättet som beskrivs här (steg 2.4) höjs en tillförseltank som innehåller den kontrasterande lösningen från den nivå där provet placeras, vilket använder tyngdkraften för att driva lösningens passage genom provet. Efter kontrastperfusion utfördes skanning med hjälp av ett Bruker Skycan mikro-CT-system (se materialförteckning). Resultaten för C. americana (figur 5A, B) och S. martianus (figur 5C-G) hjälper till att illustrera bekvämligheten med detta tillvägagångssätt för både små respektive stora prover. Jämförelse av prover som skannats före (figur 5C, E) och efter (figur 5D, F) perfusion av 1% jodlösning betonar vikten av kontrastapplikation även i träiga haustoriumprover. Det är anmärkningsvärt att i föreningarna mellan både C. americana och S. martianus (figur 5) och deras respektive värdar har parasiter lite eller inget stärkelseinnehåll i sina vävnader. Detta förklarar de olika resultaten som beskrivs för endoparasit V. minimum (figur 4), där samma metod och typ av kontrastlösning användes.
Figur 5: Parasitiska vinstockar och mistel haustorium. Längsgående snitt genom haustorium av en parasitisk vinstock (A,B) och en mistel (C-G). Jämförelse mellan skanning och makrosektion av färskt material visar att den invecklade haustoriumstrukturen fångas väl i mikro-CT-skanningar (A, B). Jämförelse mellan fixerade prover före (C,E) och efter (D,F) perfusionen av 1% jodlösning visar att kontrasten förbättras även i lignifierade prover, vilket underlättar observationen av parasiter (P) strukturer såsom kärl i epikortikal rot (rosa pilspetsar), vaskulära strängar (blå pilspetsar) och sänke (gul pilspets). Kärl och årsringar av värdxylem (Hx) och stärkelse i värdbarken (Hb) observeras också lättare. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Ett slutresultat som erhållits med perfusionsprotokollet som beskrivs här är möjligheten att detektera vaskulära förbindelser mellan parasiter och värdväxter. Detta uppnåddes genom att perfusera en 0,2% blynitratlösning genom ett segment av värdroten runt vilken knölen av den obligatoriska rotparasiten S. fungiforme hade utvecklats. Efter kontrastapplicering utfördes skanning också med hjälp av ett Bruker Skyscan-mikro-CT-system (se materialförteckning). Sekventiella projektioner visar att kärl i värdroten delar sig i parasitknölen (figur 6A-C). Efter analysen av dessa resultat skars samma prov i ett mindre delprov, förbereddes för anatomisk studie och analyserades med hjälp av ljusmikroskopi. Seriell snittning av detta delprov bekräftar att xylemkontinuiteten mellan de två plantorna bildas genom kärl-till-kärl-anslutning via perforeringsplattor (figur 6D-F).
Figur 6: Obligatorisk rotparasit haustorium. Längsgående snitt genom haustorium observerat via mikro-CT-skanning (A-C) och anatomiska sektioner observerade under ljusmikroskopet (D-F). Uppsamlingen av 0,2% blynitratlösning inom värdrotens kärlsystem (Hr, rosa kontur) möjliggör observation av värdkärl som förgrenar sig i parasitröret (Pt) och detektering av direkt vaskulär förbindelse mellan de två växterna (streckad vit kontur). Skalstänger = 1 cm (A-C) och 500 μm (D-F). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av tungmetalllösningar för att förbättra växtvävnadskontrasten har blivit ett avgörande steg i provberedningen för mikro-CT-analys. Flera föreningar som vanligtvis finns i växtmikromorfologiska laboratorier har testats av Staedler et al., som rekommenderar att man använder fosfotungstat som det mest effektiva medlet för att penetrera prover och öka kontrastindex8. Resultat som erhållits här i analysen av haustorium av P. pubera bekräftar denna rekommendation. När det gäller kontrastapplikation beskriver Steadler et al. att kontrastlösningen passivt infiltrerades genom det analyserade materialet (blommor och blomknoppar från 1 mm till 10 mm) under 1 till 8 dagar8. Andra författare har använt samma protokoll för passiv infiltration under längre perioder (1-4 veckor) vid analys av större prover, såsom de 30 cm breda blommorna av endoparasitiska Rafflesiaceae-arter28. Även om denna process har visat sig vara framgångsrik, visar resultat som erhållits med det protokoll som beskrivs här att infiltrationsprocessen kan accelereras avsevärt under vakuum, vilket förbättrar den tidigare etablerade metoden. En vakuumkammare eller pump tvingar luft att fly från växtvävnaderna, vilket möjliggör enklare infiltration av kontrastlösningen. Vakuum kan appliceras även på bräckliga strukturer, som visas här för haustorium av P. pubera och mjuka vävnader av den saftiga värdväxten E. polygona parasiterad av V. minimum. Dessutom är användningen av vakuumpumpar ett vanligt förfarande för infiltration av fixeringsmedel eller inbäddning av ämnen i många laboratorier för växtmikromorfologi, vilket gör detta protokoll mer tillgängligt.
Samma tillvägagångssätt användes här med ett kontrastmedel som selektivt fläckar prover om specifika lagringsföreningar är närvarande. När den appliceras genom vakuum eller passiv infiltration kan selektiv färgning ge sämre kontrastförbättring till ett helt prov jämfört med fosfotungstat, till exempel. Å andra sidan är det fördelaktigt för att markera specifika växtstrukturer eller vävnader. Som rapporterats här, i kombination med tidigare anatomisk eller histokemisk analys, kan användningen av selektiva kontrastmedel såsom jod hjälpa till vid differentiering av parasitisk växtvävnad i värdens kropp förutsatt att antingen parasit eller värd (men inte båda) visar rikliga stärkelsereserver. Selektivt ökande röntgenabsorption av parasitvävnader har visat sig vara särskilt användbart för att för första gången utforska det komplexa tredimensionella nätverket som bildas av en endoparasitisk växt såsom V. minimum inom stammen av dess värdväxt. Dessutom är det anmärkningsvärt att endoparasitiska växter och vissa svampar visar en intressant evolutionär konvergens, båda växer "inkognito" inuti sina värdar under mycket av deras livscykler, som endast uppstår under korta perioder29. Således skulle en potentiell ny tillämpning av protokollet som beskrivs här vara att använda floxin B, en fläck innehållande brom30, för att detektera endofytiska svampar i växtvävnader. Eosin, en annan brombaserad färgningslösning som endast sällan används för växtvävnader, har visat sig förbättra kontrasten i musnjurprover analyserade med ett specifikt mikro-CT-system31.
Ett annat tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll är perfusion av kontrastmedel genom kärlvävnaden hos värdstammen eller roten. Detta tillvägagångssätt, som skiljer sig avsevärt från tidigare rapporterade metoder, är baserat på Sperry et al., som perfuserade träprover med safraninfärg för att analysera hydraulisk ledningsförmåga32. Som diskuterats av författarna och belysts här är ett kritiskt steg i protokollet att ställa in fläckfixeringsapparaten för att undvika att införa luftbubblor i systemet32. Trevägsventiler kan tillfälligt avleda lösningsflödet och eliminera bubblor från vätskekomlumn32. Ändå kan emboli vara närvarande inuti värdväxtens kärl, orsakad antingen artificiellt under provtagning eller naturligt på grund av parasitväxternas generellt höga transpirationshastigheter33,34. Detta kan allvarligt minska perfusionseffektiviteten, vilket leder till att kontrasten inte förbättras i provet. Det är viktigt att applicera lågt till måttligt vakuum vid fixering av provet efter provtagning för att förhindra detta problem. Komplementärt kan det fixerade provet spolas under högt tryck med hjälp av fixeringslösningen i vilken provet förvaras. Spolning kan hjälpa till att återställa konduktiviteten i provet genom att avlägsna luftbubblor32, vilket rensar vägen för perfusion av kontrastlösningen. Om man arbetar med färskt material kan införande av luftbubblor i växten undvikas genom att nedsänka provet i vatten omedelbart efter provtagningen, sedan klippa det igen under vattnet och jämna ut ändytan med skarpa blad35.
Efter detta tillvägagångssätt, 1% jodlösning perfuserades genom haustorium av C. americana och S. martianus för att förbättra kontrasten av värd-parasit gränssnittet som helhet. Resultat erhållna för dessa arter visar att perfusionsprotokollet som beskrivs här fungerar bra för både färska och fixerade prover, och att införande av kontrastlösningar förbättrar visualiseringen även i lignifierade prover. Dessa observationer överensstämmer med resultaten som rapporterats av Teixeira-Costa &; Ceccantinti17, som använde samma tillvägagångssätt för att applicera en 0,2% blynitratlösning för att visualisera specifika aspekter av haustoriumstruktur. I kontakt med koldioxid reagerar blynitrat för att bilda en mycket olöslig fällning bestående av blykarbonatkristaller, som effektivt absorberar röntgenstrålar 8,36. När den väl har perfuserats i provkärlvävnaden täpper denna fällning upp vaskulära gropanslutningar, vilket gör att lösningen endast kan flöda genom direkta, kärl-till-kärlanslutningar via perforeringsplattor. Efter detta tillvägagångssätt visas närvaron av direkta parasit-värdxylemanslutningar genom perforeringsplattor här för S. fungiforme och bekräftas med detaljerad anatomisk analys. Dessa resultat belyser en ytterligare tillämpning av detta tillvägagångssätt för att testa haustoriumfunktionalitet. Med tanke på att haustoriuminitiering kanske inte kulminerar i utvecklingen av ett fullt fungerande organ på grund av antingen parasit-värdkompatibilitet eller värdresistens mot parasiten, kan metoden som beskrivs här användas för att testa om vaskulära förbindelser bildas mellan de två växterna som leder till förekomsten av effektiv parasitism. Med tanke på värdet av att använda mikro-CT-skanning för att undersöka xylembolier mer allmänt12,37, kan protokollet som presenteras här också förbättra visualiseringen och kvantitativ analys av xylememboli hos andra icke-parasitiska växtarter.
Sammanfattningsvis närmar sig detta protokoll ett av de kritiska framsteg som förväntas inom växtmikrotomografi, vilket är att applicera kontrastmedel för att hjälpa till att differentiera strukturer med låg röntgenabsorpion24. Som visas här kan kontrastlösningar avsevärt förbättra visualiseringen av haustoriumstrukturer vid gränssnittet mellan parasitiska växter och deras värdar. Olika föreningar kan väljas utifrån deras specificitet vid reaktion med reservföreningar, såsom stärkelse, som ofta är olika fördelade mellan parasit- och värdvävnader. Tillvägagångssättet för kontrastapplikation i haustoriumprover kan också väljas för att undersöka specifika egenskaper hos parasit-värdgränssnittet, såsom direkt kärl-till-kärl-anslutning. Dessutom kan detta protokoll också tillämpas på icke-parasitiska arter, vilket potentiellt förbättrar detekteringen av endofytiska svampar och kvantifiering av xylememboli. I alla tillämpningar kan protokollet som beskrivs här för att förbättra mikrotomografianalys kombineras med andra verktyg, såsom optisk projektionstomografi och automatiserad virtuell segmentering, för att ge nya och spännande insikter i den tredimensionella utvecklingen av sambandet mellan dessa växter och deras värdar38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Jag vill tacka Dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, University of Sao Paulo, Brasilien) och Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) för deras avgörande hjälp och oumbärliga användarutbildning för olika mikrotomografisystem och dataanalysprogram. Jag tackar också personalen vid EEB Greenhouse vid University of Connecticut (USA), särskilt Clinton Morse och Matthew Opel för att ha tillhandahållit proverna av Viscum minimum. Dr John Wenzel gav möjlighet och stor hjälp för provtagning av Pyrularia pubera. Carolina Bastos, Yasmin Hira och Talitha Motta hjälpte till med provtagningen av Scybalium fungiforme. MSc. Ariadne Furtado och Drs. Fernanda Oliveira och Maria Aline Neves gav referensen för användningen av floxin B för analys av endofytiska svampar. Videoinspelning vid Vrije Universiteit Brussel möjliggjordes med hjälp av Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka och Dr. Harry Olde Venterink. Finansiering tillhandahölls av Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brasilien) och Harvard University Herbaria (USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
| 3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
| CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
| CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Dragonfly software | Object Research Systems - ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
| Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
| Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR - USA |
| Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
| Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
| Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
| NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
| Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR - USA |
| Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR - USA |
| Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR - USA |
| Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
| Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
| Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
| Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
| Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
| Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes |
| VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
References
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
- Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
- Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
- Sakdinawat, A., Attwood, D.
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
- Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
- Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
- Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
- da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
- Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
- Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
- Lusic, H., Grinstaff, M. W.
- Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
- Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
- Kuijt, J. The Biology of Parasitic Flowering Plants. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).
- Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
- Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
- Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
- Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
- Simpson, B. B.
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).
- Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
- Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
- Largent, D., Johnson, D., Watling, R. How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
- Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
- Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
- Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
- Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).
