Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Gebruik maken van micro-CT-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63423
Automatic Translation
1,2
1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Summary

Micro-CT is een niet-destructief hulpmiddel dat plantstructuren in drie dimensies kan analyseren. Het huidige protocol beschrijft de monstervoorbereiding om micro-CT te gebruiken om de parasitaire plantstructuur en -functie te analyseren. Verschillende soorten worden gebruikt om de voordelen van deze methode te benadrukken in combinatie met specifieke preparaten.

Abstract

Micro-CT-scanning is een ingeburgerd hulpmiddel geworden bij het onderzoeken van de structuur en functie van planten. De niet-destructieve aard, gecombineerd met de mogelijkheid van driedimensionale visualisatie en virtuele secties, heeft nieuwe en steeds gedetailleerdere analyse van complexe plantenorganen mogelijk gemaakt. Interacties tussen planten, inclusief tussen parasitaire planten en hun gastheren, kunnen ook worden onderzocht. Monstervoorbereiding voor het scannen wordt echter cruciaal vanwege de interactie tussen deze planten, die vaak verschillen in weefselorganisatie en samenstelling. Bovendien moet rekening worden gehouden met de grote diversiteit van parasitaire bloeiende planten, variërend van sterk gereduceerde vegetatieve lichamen tot bomen, kruiden en struiken, tijdens de bemonstering, behandeling en bereiding van parasiet-gastheermateriaal. Hier worden twee verschillende benaderingen beschreven voor het introduceren van contrastoplossingen in de parasiet en / of waardplanten, met de nadruk op het analyseren van het haustorium. Dit orgaan bevordert de verbinding en communicatie tussen de twee planten. Volgens een eenvoudige benadering kunnen details van haustoriumweefselorganisatie driedimensionaal worden onderzocht, zoals hier wordt getoond voor eufytoïde, wijnstok- en maretakparasitaire soorten. Het selecteren van specifieke contrasterende middelen en toepassingsbenaderingen maakt ook gedetailleerde observatie van endoparasietverspreiding in het gastheerlichaam mogelijk en detectie van directe vaat-tot-vatverbinding tussen parasiet en gastheer, zoals hier getoond voor een obligate wortelparasiet. Het hier besproken protocol kan dus worden toegepast op de brede diversiteit van parasitaire bloeiende planten om het begrip van hun ontwikkeling, structuur en functioneren te bevorderen.

Introduction

Hoge resolutie X-ray microcomputed tomography (micro-CT) is een beeldvormingsmethode waarbij meerdere röntgenfoto's (projecties) van een monster worden opgenomen vanuit verschillende kijkhoeken en later worden gebruikt om een virtuele reconstructie van het monsterte bieden 1. Dit virtuele object kan vervolgens worden geanalyseerd, gemanipuleerd en gesegmenteerd, waardoor niet-destructieve verkenning in drie dimensiesmogelijk is 2. Oorspronkelijk ontworpen voor medische analyses en later voor industriële toepassingen, biedt micro-CT ook het voordeel van het visualiseren van inwendige organen en weefsels zonder de noodzaak van invasieve procedures3. Net als andere vormen van beeldvorming werkt micro-CT met een afweging tussen het gezichtsveld en de pixelgrootte, wat betekent dat beeldvorming met hoge resolutie van grote monsters bijna onbereikbaar is4. Er wordt voortdurend vooruitgang geboekt in het gebruik van hoogenergetische röntgenbronnen (d.w.z. synchrotron) en secundaire optische vergroting, waardoor de kleinste resolutie minder dan 100 nm 5,6 kan bereiken. Niettemin zijn langere scantijden nodig voor grote monsters, waardoor de kans op artefacten als gevolg van monsterbeweging of vervorming in de scanner toeneemt. Bovendien wordt micro-CT over het algemeen beperkt door natuurlijke dichtheidsvariaties in het monster en hoe het monster interageert met röntgenstralen. Hoewel een hogere röntgendosis het beste is voor het penetreren van dichtere monsters, is het minder efficiënt in het vastleggen van variaties in dichtheid binnen en tussen het monster en het omringende medium7. Aan de andere kant biedt een lagere röntgendosis minder penetratievermogen en vereist het vaak langere scantijden maar meer gevoeligheid bij dichtheidsdetectie7.

Deze beperkingen hebben het gebruik van microtomografie voor plantenwetenschappen lang belemmerd, aangezien de meeste plantenweefsels zijn samengesteld uit licht (niet-dicht) weefsel met een lage röntgenabsorptie8. De eerste toepassingen van micro-CT waren gericht op het in kaart brengen van wortelnetwerken binnen de bodemmatrix 9,10. Later begonnen plantenstructuren met meer significante verschillen in weefseldichtheid, zoals hout, te worden onderzocht. Dit heeft onderzoek mogelijk gemaakt naar xyleemfunctionaliteit 11,12, ontwikkeling van complexe weefselorganisaties 13,14 en interacties tussen planten 15,16,17. De analyse van zacht en homogeen weefsel wordt wijdverspreid als gevolg van contrastmiddelen, die nu standaardprocedure zijn in preparaten voor micro-CT-scans van plantenmonsters. Protocollen voor contrastintroductie kunnen echter verschillende resultaten hebben, afhankelijk van het monstervolume, de structurele eigenschappen en het type oplossing dat wordt gebruikt8. Idealiter zou het contrastmiddel het onderscheid tussen verschillende weefsels moeten verbeteren, evaluatie van de weefsel- / orgaanfunctionaliteit mogelijk moeten maken en / of biochemische informatie over een weefsel moeten verstrekken18. Daarom worden adequate monsterbehandeling, voorbereiding en montage vóór het scannen cruciaal voor elke micro-CT-analyse.

Micro-CT van de parasitaire plant haustorium
Parasitaire bloeiende planten vertegenwoordigen een afzonderlijke functionele groep angiospermen die worden gekenmerkt door een orgaan dat bekend staat als haustorium19. Dit meercellige orgaan, een ontwikkelingshybride tussen een gemodificeerde stengel en een wortel, werkt in op de hechting, penetratie en het contact van de gastheer door een parasiet20. Om deze reden wordt het haustorium beschouwd als "de belichaming van het idee van parasitisme onder planten"21. Een gedetailleerd begrip van de ontwikkeling, structuur en werking van dit orgaan is cruciaal voor parasitaire plantenecologie, evolutie en managementstudies. Niettemin belemmeren de algehele complexiteit van parasitaire planten en de sterk gewijzigde structuur en haustoria vaak een gedetailleerde analyse en vergelijking. Haustoriumverbindingen zijn meestal ook uitgebreid en niet homogeen in weefsel- en celverdeling (figuur 1). In deze context, terwijl het werken met kleine weefselfragmenten eenvoudigere manipulatie en een hogere resolutie mogelijk maakt, kan dit leiden tot onjuiste conclusies over de driedimensionale architectuur van complexe structuren, zoals het parasitaire plantenhaustorium.

Hoewel er een uitgebreide literatuur bestaat over de anatomie en ultrastructuur van haustorium voor de meeste parasitaire plantensoorten, blijft de driedimensionale organisatie en de ruimtelijke relatie tussen parasiet en gastheerweefsel slecht onderzocht17. In een recent werk van Masumoto et al.22 werden meer dan 300 seriële halfdunne microtoomsecties in beeld gebracht en gereconstrueerd tot een driedimensionaal virtueel object dat het haustorium van twee parasietsoorten vertegenwoordigt. Het uitstekende detailniveau van deze methode biedt ongekende inzichten in de cellulaire en anatomische 3D-structuur van het haustorium. Een dergelijke tijdrovende techniek zou echter een soortgelijke analyse bij parasieten met uitgebreidere haustoriumverbindingen verbieden. Het gebruik van micro-CT komt naar voren als een uitstekend hulpmiddel voor driedimensionale analyse van complexe en vaak omvangrijke haustoria van parasitaire planten. Hoewel het geen vervanging is voor gedetailleerde anatomische secties en andere complementaire vormen van microscopieanalyses17,23, kunnen resultaten verkregen via micro-CT-scanning, vooral voor grote monsters, ook dienen als een gids voor het sturen van de subbemonstering van kleinere segmenten, die vervolgens kunnen worden geanalyseerd met behulp van andere hulpmiddelen, zoals confocale en elektronenmicroscopie, of opnieuw geanalyseerd met micro-CT-systemen met hoge resolutie.

Figure 1
Figuur 1: Parasitaire planten van verschillende functionele groepen die in dit protocol worden gebruikt. Eufytoïde parasiet Pyrularia pubera (A), endoparasiet Viscum minimum (B) met groene vruchten (onderbroken zwarte cirkel), parasitaire wijnstok Cuscuta americana (C), maretak Struthanthus martianus (D), obligate wortelparasiet Scybalium fungiforme (E). Segmenten van de gastheerwortel (Hr) of stengel (Hs) vergemakkelijken de toepassing van contrast in de parasiet haustorium (P). De aanwezigheid van parasiet moeder wortel / stengel (pijlen) in het monster maakt analyse van haustorium vat organisatie mogelijk. Rechthoeken geven segmenten van het monster aan die voor de analyse worden gebruikt. Schaalstaven = 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naarmate micro-CT een steeds populairdere techniek wordt in de plantenwetenschappen, zijn er handleidingen, protocollen en literatuur over het scannen van monsters, driedimensionale reconstructie, segmentatie en analyse 3,10,24. Deze stappen zullen hier dus niet worden besproken. Zoals met elke verbeeldingstechniek, zijn de juiste behandeling en montage van monsters een fundamentele, hoewel het vaak een over het hoofd geziene procedure is. Om deze reden richt dit protocol zich op de voorbereiding van haustoriummonsters voor micro-CT-scanning. Meer specifiek beschrijft dit protocol twee benaderingen voor het introduceren van contrastmiddelen in haustoriummonsters om de visualisatie van verschillende weefsels en celtypen in het haustorium te verbeteren, om de detectie van parasitair weefsel in de gastheerwortel / stam te vergemakkelijken en om parasiet-gastheer vasculaire verbindingen in drie dimensies te analyseren. De hier beschreven preparaten kunnen ook worden aangepast aan de analyse van andere plantstructuren.

Vijf soorten werden gebruikt om het gemak van het hier beschreven protocol beter te illustreren. Elke soort vertegenwoordigt een van de vijf functionele groepen van parasitaire bloeiende planten, waardoor specifieke punten met betrekking tot de functionaliteit van elke groep worden aangepakt. Pyrularia pubera (Santalaceae) werd gekozen om eufytoïde parasieten te vertegenwoordigen, die in de grond ontkiemen en meerdere haustoria vormen die de parasiet verbinden met de wortels van zijn gastheren25. De haustoria die door deze planten worden gecreëerd, zijn vaak ijl en gemakkelijk los te scheuren van de gastheer26 (figuur 1A), waardoor een delicater behandelingsproces nodig is. Endoparasieten worden hier vertegenwoordigd door Viscum minimum (Viscaceae). Soorten in deze functionele groep zijn slechts gedurende korte perioden zichtbaar buiten het lichaam van hun gastheren (figuur 1B) en leven het grootste deel van hun levenscyclus als aanzienlijk gereduceerde en myceliale strengen cellen ingebed in gastheerweefsels25. Een derde functionele groep bestaat uit parasitaire wijnstokken, die op de grond ontkiemen maar slechts rudimentaire wortels vormen, afhankelijk van meerdere haustoria die zich hechten aan de stengels van waardplanten25 (figuur 1C). Hier wordt deze functionele groep vertegenwoordigd door Cuscuta americana (Convolvulaceae). In tegenstelling tot parasitaire wijnstokken ontkiemen maretak direct op de takken van hun waardplanten en ontwikkelen ze meerdere of solitaire haustoria25. De soort die is gekozen om deze functionele groep te illustreren is Struthanthus martianus (Loranthaceae), die verschillende verbindingen vormt met de gastheertak (figuur 1D). Analyse van solitaire maretak haustoria met behulp van een combinatie van micro-CT en lichtmicroscopie is te vinden in Teixeira-Costa &; Ceccantini17. Ten slotte omvatten obligate wortelparasieten soorten die op de grond ontkiemen en de wortels van waardplanten binnendringen, waarvan ze volledig afhankelijk zijn vanaf de vroegste groeistadia25. Deze planten worden hier vertegenwoordigd door Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), die grote knolachtige haustoria produceren (figuur 1E).

Alle plantenmonsters die in dit protocol werden gebruikt, werden gefixeerd in een 70% formaline-azijnzuuralcohol (FAA 70). De fixatie op bemonstering is cruciaal voor het behoud van plantenweefsels, vooral als latere anatomische analyses nodig zijn. In het geval van parasitaire plantenhaustorium is fixatie ook essentieel, omdat dit orgaan vaak voornamelijk bestaat uit niet-gelignificeerde parenchymcellen20. Gedetailleerde protocollen voor de fixatie van plantenweefsel, inclusief de bereiding van fixatieve oplossingen, zijn elders te vinden27. Aan de andere kant kunnen fixatieven in meer of mindere mate veranderingen in de fysische en chemische eigenschappen van een monster veroorzaken, waardoor het ongeschikt wordt voor specifieke biomechanische en histochemische analyses. Zo kunnen verse monsters, d.w.z. niet-gefixeerd materiaal dat onmiddellijk voor de bereiding wordt verzameld, ook met dit protocol worden gebruikt. Details over het omgaan met nieuwe monsters en suggesties voor het oplossen van problemen met gefixeerd materiaal vindt u in de discussiesectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Selectie van parasitaire plantenmonsters

  1. Verzamel het volledige parasitaire plantenhaustorium, inclusief de aangehechte gastheerstam / wortel en segmenten van zowel proximale als distale uiteinden van het geparasiteerde gastheerorgaan; De ideale lengte van elk segment is gelijk aan het dubbele van de diameter van het Haustorium.
    OPMERKING: Neem voor laterale haustoria een deel van de parasietmoederstam/-wortel op waaruit het haustorium is gevormd (figuur 1A,B,D). Verzamel voor endoparasieten een segment van de gastheerstam/wortel waarin tekenen van de parasiet zichtbaar zijn (figuur 1B). In het geval van aansluitklemmen moet de hele installatie worden verzameld (figuur 1E).
  2. Dompel het hele monster onder in een fixatieve oplossing (bv. FAA) in een volumetrische verhouding van 1:10 (monster: fixatief). Laat de monsters ten minste 1 dag in fixatief staan, afhankelijk van de grootte van het monster27.
    OPMERKING: Monsters kunnen voor het scannen in fixatief worden opgeslagen of worden overgebracht naar een conserveringsoplossing (bijv. ethanol 70%). Verse monsters kunnen ook worden gebruikt als de daaropvolgende anatomische analyse niet gerechtvaardigd is (zie het gedeelte Discussie). Als u met vers materiaal werkt, stelt u het apparaat in voor perfusie van de contrastoplossing en verzamelt u vervolgens het monster. Het monster mag niet uitdrogen.

2. Toepassing van contrasterende oplossingen

  1. Kies de toepassingsmethode die u wilt gebruiken. Gebruik de vacuümmethode (stap 2.3) voor kleine (figuur 1A) of niet-houtachtige (figuur 1B) monsters. Gebruik de perfusiemethode voor grotere monsters, op voorwaarde dat deze een segment van de gastheerstam/wortel bevat (figuur 1A,C-E).
  2. Draag rubberen handschoenen en andere geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. laboratoriumjas) bij het manipuleren van het monster, ongeacht de aanpak die in de volgende stappen is gekozen.
    LET OP: Alle contrasterende oplossingen bevatten zware metaalzouten in hun samenstelling en mogen daarom niet worden gehanteerd zonder adequate persoonlijke beschermingsmiddelen en onder een zuurkast.
  3. Volg voor de vacuümmethode de onderstaande stappen.
    1. Kies een geschikte injectieflacon en label deze. De injectieflacon moet groot genoeg zijn om plaats te bieden aan het monster en de contrasterende oplossing, meestal in een verhouding van 1:10. Controleer de instructies van de fabrikant om ervoor te zorgen dat de injectieflacon bestand is tegen een laag tot matig vacuüm.
      OPMERKING: Vul de injectieflacon niet tot de rand, omdat de negatieve druk (vacuüm) ervoor kan zorgen dat de vloeistof morst.
    2. Plaats het monster in de injectieflacon met de contrasterende oplossing (1% jodium of 3% fosfotungstaat, zie tabel met materialen). Plaats de injectieflacon vervolgens in een vacuümkamer of exsiccator die is aangesloten op een vacuümpomp. Verwijder het deksel van de injectieflacon en sluit vervolgens de vacuümkamer of exsiccator.
    3. Controleer of er geen scheuren in de vacuümkamer/exsiccator zitten en of de vacuümpomp voldoende olie bevat.
    4. Sluit de uitlaatklep van de pomp om te voorkomen dat lucht afsluit en open de uitlaatklep van de kamer/exsiccator om de lucht naar buiten te persen.
    5. Zet de pomp aan en wacht tot de druk ongeveer 20" Hg bereikt.
      LET OP: Dit proces is meestal snel, dus laat het vacuümsysteem niet onbeheerd achter.
      OPMERKING: Hoewel de metrische systeemeenheid voor druk Pascal (Pa) is, geven manometers in de meeste laboratoriumvacuümpompen de druk weer in inches kwik ("Hg), pond per vierkante inch (psi) of staven. 20" Hg is gelijk aan ca. 67,7 Pa, 10 psi of 0,7 bar.
    6. Sluit de uitlaatklep van de kamer/exsiccator om te voorkomen dat er weer lucht binnenkomt en schakel de pomp snel uit.
    7. Laat het monster ten minste 2 uur onder vacuüm staan; grotere monsters hebben langer nodig om de contrasterende oplossing te laten doordringen.
    8. Verwijder na de gewenste periode het monster uit de contrasterende oplossing om het voor te bereiden op het scannen.
    9. Open langzaam de uitlaatklep van de kamer/exsiccator om er lucht in te laten.
    10. Wacht tot de druk in de kamer/exsiccator volledig is uitgeput (d.w.z. de manometer bereikt bijna 0) en open deze vervolgens voorzichtig om het monster op te halen.
    11. Gooi de contrasterende oplossing op de juiste manier weg en bewaar het monster ter voorbereiding op het scannen.
  4. Volg voor de perfusiemethode de onderstaande stappen.
    1. Selecteer een toevoertank voor de contrasterende oplossing op basis van de grootte van het monster. Gebruik een spuit van 50 ml (zonder naald of zuiger) voor kleine monsters (figuur 2A) of een intraveneuze medische kit van 1 l voor grote monsters (figuur 2B).
    2. Sluit het ene uiteinde van een transparante plastic buis (zie materiaaltabel) aan op de toevoertank en sluit het andere uiteinde vervolgens aan op een tweeweg- of driewegklep. Sluit een tweede slang aan op een andere uitlaat in de klep (figuur 2A,B).
    3. Bevestig de toevoertank op een verhoogde positie zonder het apparaat dat in de vorige stap is ingesteld, te demonteren.
      OPMERKING: De verticale afstand tussen de tank en het monster bepaalt de perfusiedruk van de oplossing (figuur 2B). Een afstand van 20-50 cm is voldoende voor kleine monsters. Voor grote monsters is een afstand van 1 m adequater.
    4. Sluit de driewegklep (figuur 2C) of tweewegklep (figuur 2D) om te voorkomen dat vloeistof het slangsysteem verlaat en giet vervolgens de contrasterende oplossing in de toevoertank. Als u een intraveneuze medische kit gebruikt, vult u de zak met de oplossing en sluit u de klep voordat u het apparaat op een verhoogde positie vastzet.
    5. Zorg ervoor dat er geen grote luchtbellen worden gevormd langs het buizensysteem (figuur 2E). Laat indien nodig de contrastoplossing uit de buis stromen totdat de bel is verwijderd. Sluit de klep weer en laat het apparaat op zijn plaats.
    6. Om het monster voor te bereiden op perfusie van de contrastoplossing, houdt u het ondergedompeld in vloeistof (water, ethanol of fixeermiddel) en snijdt u de punt van het proximale uiteinde van de gastheerstam/-wortel in het monster af (figuur 2F).
    7. Verwijder het monster uit de vloeistof waarin het is opgeslagen en wikkel het in een paraffinefilm om uitdroging te voorkomen. Houd het monster in de buurt en klaar om op het apparaat te worden aangesloten.
    8. Open de klep voorzichtig om de contrasterende oplossing langzaam te laten stromen en vul de plastic slang die op de tank is aangesloten terwijl u het open uiteinde van het systeem op een iets verhoogde positie houdt om te voorkomen dat de contrasterende oplossing morst. Nogmaals, zorg ervoor dat er geen grote luchtbellen langs de buis ontstaan.
    9. Verbind het proximale uiteinde van de gastheerstam/wortel in het monster met het open uiteinde van het buizensysteem (figuur 2B, vergroot gebied). Vermijd het introduceren van luchtbellen in het systeem tijdens deze stap. Koppel indien nodig het monster los van het apparaat en verwijder luchtbellen uit het systeem door de oplossing te laten stromen.
    10. Terwijl u het monster verbonden houdt met het apparaat, plaatst u het in een container om lekkage van de contrasterende oplossing in het gebied waar het experiment is opgezet te voorkomen. Gebruik buizen van verschillende diameters, plastic ritssluitingen en klepadapters (figuur 2G) om ervoor te zorgen dat alle verbindingen in het apparaat goed passen, geschikt zijn voor gastheertakken van verschillende groottes en dat de oplossing niet uit het buizensysteem lekt (figuur 2B, vergroot gebied).
    11. Laat de oplossing het monster gedurende ten minste 2 uur doordrenken, of totdat de oplossing zich in de container ophoopt.
    12. Sluit de klep en koppel het monster voorzichtig los van het apparaat. Giet de rest van de oplossing af in de container en gooi deze op de juiste manier weg.
    13. Verwijder de paraffinefilm uit het monster ter voorbereiding op het scannen.

Figure 2
Figuur 2: Perfusiebenadering voor contrasttoepassing. Kleine (A) en grote (B) versies van het perfusieapparaat omvatten een toevoertank (st) en twee plastic buizen (t1 en t2) verbonden door een klep (va). Het proximale uiteinde van de gastheerstam (H) met een parasiet (P) die eraan is bevestigd via het haustorium (ha) is verbonden met het open uiteinde van het systeem (B, uitgebreid). Een drieweg (C) of een tweeweg (D) klep wordt gebruikt om de vorming van luchtbellen in het buizensysteem te helpen voorkomen, die de doorgang van contrasterende oplossing (E) blokkeren. De punt van het proximale uiteinde van de gastheerstengel (H) wordt onder water gesneden om de contrastoplossing (F) te kunnen passeren. Ritssluitingen, klepadapters en slangen van verschillende diameters helpen nauwere verbindingen te beveiligen en lekkage in het systeem te voorkomen (G). Figuren 2B, D en F zijn gemaakt met BioRender. Schaalstaven = 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Monstervoorbereiding en montage

  1. Was het monster door het gedurende 2 minuten onder te dompelen in water.
    LET OP: Was geen monsters in de gootsteen, omdat alle contrasterende oplossingen zware metaalzouten in hun samenstelling bevatten. Beschouw het water dat wordt gebruikt voor het wassen als een verdunde contrasterende oplossing en gooi het op de juiste manier weg.
  2. Plaats het monster in een papieren handdoek bij kamertemperatuur om overtollig water gedurende 2-5 minuten te laten verdampen, afhankelijk van de grootte van het monster. U kunt het monster ook lichtjes drogen met behulp van een papieren handdoek. Laat het monster niet volledig uitdrogen.
  3. Wikkel het monster in een paraffinefilm door het uit te rekken tot een dunne laag. Vouw de paraffinefilm niet bovenop het monster.
  4. Monteer het ingepakte monster op een monsterhouder, zodat het stabiel en op zijn plaats blijft terwijl het tijdens het scannen draait. Gebruik plakband, schuim met lage dichtheid, pipetpunten en/of doorzichtige plastic containers om het monster op zijn plaats te houden.
  5. Scan het monster en analyseer de beelden volgens specifieke protocollen en richtlijnen die zijn vastgesteld voor het beschikbare micro-CT-systeem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het haustorium van parasitaire planten is een complex orgaan dat bestaat uit verschillende weefsels en celtypen die zich verstrengelen en verbinden met de weefsels van een andere plant, gebruikt als gastheer20. Micro-CT-scanning kan worden gebruikt om deze complexe structuur op een niet-destructieve en driedimensionale manier beter te begrijpen bij het analyseren van zowel kleine (Figuur 1A-C) als grote (Figuur 1D, E) haustoria. Om dit te doen, kunnen contrasterende oplossingen worden toegepast in de parasiet-gastheerinterface, waardoor het mogelijk wordt om monsters te analyseren die anders een lage en homogene röntgenabsorptie zouden hebben. De twee eenvoudige benaderingen die in dit protocol worden beschreven, zijn gebaseerd op het onder druk zetten van de contrasterende oplossing om de penetratie door het monster te versnellen. Zoals verwacht werken de hier beschreven protocollen voor verschillende micro-CT-systemen. Scaninstellingen en -parameters verschillen echter afhankelijk van het systeem en het geanalyseerde monster (tabel 1).

Functionele groep Eufytoïde parasiet Endoparasiet Parasitaire wijnstok Maretak (voor/na contrast) Obligate wortelparasiet
Soort (Familie) Pyrularia pubera Viscum minimaal Cuscuta americana Struthanthus martianus Scybalium fungiforme
Familie Santalaceae Vergezichten Convolvulaceae Loranthaceae Balanophoraceae
Contrastoplossing 3% fosfotungstaat 1% jodium 1% jodium 1% jodium 0,2% loodnitraat
Toepassingsmethode vacuüm vacuüm perfusie perfusie perfusie
Micro-CT-systeem Zeiss Versa 620 Nikon X-Tek HMXST225 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176 Bruker Skyscan 1176
Projecties 4500 3140 610 1200 / 2400 5300
Frames 1 1 3 (gemiddeld) 3 / 3 (gemiddeld) 3 (gemiddeld)
Blootstelling (ms) 5000 1000 680 1600 / 830 750
Filter (mm) geen Al 0,25 Al 1,0 Al 1,0 / Al 1,0 geen
Spanning (kV) 60 85 35 90 / 45 40
Stroom (μA) 108 80 375 180 / 390 600

Tabel 1: Scaninstellingen en parameters voor de geanalyseerde monsters.

Na de eerste benadering voor contrasttoepassing (stap 2.3) werd vacuüm gebruikt om het haustorium van de eufytoïde parasiet P. pubera gedurende twee uur te perfuseren met een 3% fosfotungstaatoplossing. Het monster werd vervolgens gescand in een 3D-röntgenmicroscoopsysteem (XRM) (zie materiaaltabel), waarbij een hoge beeldresolutie werd bereikt via secundaire optische vergroting4. XRM-beelden bleken even effectief te zijn als anatomische secties die onder een lichtmicroscoop werden geanalyseerd om weefselorganisatie en topologie op de parasiet-gastheerinterface te analyseren (figuur 3). Het gebruik van fosfotungstaat benadrukt de overvloed aan parenchymweefsel, dat in een heldere witte toon verschijnt vanwege de hoge absorptie van het contrasterende middel. Vaten verschijnen in een donkergrijze tint als gevolg van lage absorptie van contrast. Op basis van dit kleurverschil is het mogelijk om de overvloed aan parenchym rond de vasculaire kern van het haustorium waar te nemen (figuur 3). De ingewikkelde vaten en dunne parenchymstrengen van de vaatkern zelf worden ook waargenomen, vooral in longitudinale secties (figuren 3A-C). In doorsneden wordt de vasculaire kern gemakkelijk waargenomen als twee vasculaire strengen gescheiden door parenchym (figuren 3D, E).

Figure 3
Figuur 3: Eufytoïde parasiet haustorium. Longitudinale (A-C) en transversale (D-E) secties door het haustorium werden waargenomen onder een lichtmicroscoop (A,E) en via 3D röntgenmicroscopie na toepassing van 3% fosfotungstaatoplossing met behulp van vacuüm (B-D). Rode contouren geven parenchymweefsel (par) aan en blauwe contouren geven de vasculaire kern (vc) aan. Hx: host xyleem. Hb: gastheerschors. Schaalstaven = 500 μm (A, E) en 2,5 cm (B-D; voxelgrootte = 2,8382 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dezelfde aanpak werd gebruikt om contrast te introduceren in de stengel van een vetplant (Euphorbia polygona, Cactaceae) geparasiteerd door V. minimum. Hier werd 1% jodiumoplossing gekozen als contrastmiddel op basis van voorlopige histochemische analyse, waaruit bleek dat parenchymcellen van de endoparasiet koolhydraten opslaan in de vorm van zetmeel (figuur 4A). Tegelijkertijd slaan cellen in de gastheercortex geen detecteerbare hoeveelheid zetmeel op (figuur 4B-D). Na het aanbrengen van het contrast werd het monster vervolgens gescand met behulp van een Nikon X-Tek micro-CT-systeem (zie Materiaaltabel). Het verschil in jodiumabsorptie maakte de detectie mogelijk van het ingewikkelde web van corticale strengen gevormd door de endoparasiet in het gastheerlichaam (figuur 4E). Volgens deze methodologie werden corticale strengen waargenomen die zich concentreren rond het vasculaire centrum van de gastheer en zich uiteindelijk vertakken naar de periferie van de gastheerstengel wanneer ze geassocieerd zijn met de emersie van een parasietbloem (figuren 4F, G).

Figure 4
Figuur 4: Endoparasiet weefselnetwerk. Anatomische (A) en macro (B-D) secties vertonen reactie met 1% jodiumoplossing die aangeeft dat zetmeel (zwart gekleurd) aanwezig is in het parenchym (par) geassocieerd met de vaten (ve) van de parasiet. Omdat zetmeel afwezig is in de gastheercortex (Hc) en xyleem (Hx), werden 1% jodiumoplossingen selectief gebruikt om het contrast van parasietcorticale strengweefsels (paarse contouren, E-G), gezien tegen de achtergrond van de gastheer (H) te verbeteren. De aanwezigheid van een bloem (Pf) bevestigt dat het gekleurde weefsel deel uitmaakt van de endoparasietstructuur (A,F,G). Schaalstaven = 0,25 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bij de tweede benadering die hier wordt beschreven (stap 2.4), wordt een toevoertank met de contrasterende oplossing verhoogd ten opzichte van het niveau waarin het monster is geplaatst, waardoor de zwaartekracht wordt gebruikt om de passage van de oplossing door het monster te drijven. Na contrastperfusie werd het scannen uitgevoerd met behulp van een Bruker Skycan micro-CT-systeem (zie Materiaaltabel). De resultaten verkregen voor C. americana (figuren 5A,B) en S. martianus (figuren 5C-G) illustreren het gemak van deze aanpak voor respectievelijk kleine en grote monsters. Het vergelijken van monsters die zijn gescand vóór (figuur 5C,E) en na (figuur 5D,F) perfusie van 1% jodiumoplossing benadrukt het belang van contrasttoepassing, zelfs in houtachtige haustoriummonsters. Het is opmerkelijk dat in de associaties tussen zowel C. americana als S. martianus (figuur 5) en hun respectieve gastheren, parasieten weinig tot geen zetmeelgehalte in hun weefsels hebben. Dit verklaart de verschillende resultaten beschreven voor het endoparasiet V. minimum (figuur 4), waarbij dezelfde methode en hetzelfde type contrastoplossing werden gebruikt.

Figure 5
Figuur 5: Parasitaire wijnstok en maretak haustorium. Langsdoorsneden door het haustorium van een parasitaire wijnstok (A,B) en een maretak (C-G). Vergelijking tussen scan en macrosectie van vers materiaal laat zien dat de ingewikkelde haustoriumstructuur goed is vastgelegd in micro-CT-scans (A,B). Vergelijking tussen gefixeerde monsters vóór (C,E) en na (D,F) de perfusie van 1% jodiumoplossing laat zien dat het contrast zelfs in lignified monsters wordt versterkt, waardoor de waarneming van parasieten (P) structuren zoals vaten in de epicorticale wortel (roze pijlpunten), vasculaire strengen (blauwe pijlpunten) en zinker (gele pijlpunt) wordt vergemakkelijkt. Vaten en jaarringen van het gastheerxyleem (Hx) en zetmeel in de gastheerschors (Hb) worden ook gemakkelijker waargenomen. Schaalstaven = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een eindresultaat verkregen met het hier beschreven perfusieprotocol is de mogelijkheid om vasculaire verbindingen tussen parasieten en waardplanten te detecteren. Dit werd bereikt door een 0,2% loodnitraatoplossing door een segment van de gastheerwortel te perfuseren waaromheen de knol van de obligate wortelparasiet S. fungiforme zich had ontwikkeld. Na contrasttoepassing werd ook gescand met behulp van een Bruker Skyscan micro-CT-systeem (zie Materiaaltabel). Sequentiële projecties laten zien dat vaten in de gastheerwortel zich splitsen in de parasietknol (figuur 6A-C). Na de analyse van deze resultaten werd hetzelfde monster in een kleiner submonster gesneden, voorbereid voor anatomisch onderzoek en geanalyseerd met behulp van lichtmicroscopie. Serie-sectie van dit submonster bevestigt dat de xyleemcontinuïteit tussen de twee planten wordt gevormd door verbinding tussen vat en vat via perforatieplaten (figuur 6D-F).

Figure 6
Figuur 6: Obligate wortelparasiet haustorium. Longitudinale secties door het haustorium zoals waargenomen via micro-CT-scanning (A-C) en anatomische secties waargenomen onder de lichtmicroscoop (D-F). De accumulatie van 0,2% loodnitraatoplossing in het vasculaire systeem van de gastheerwortel (Hr, roze omtrek) maakt observatie van gastheervaten die zich vertakken in de parasietbuis (Pt) en de detectie van directe vasculaire verbinding tussen de twee planten (onderbroken witte omtrek). Schaalstaven = 1 cm (A-C) en 500 μm (D-F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gebruik van oplossingen voor zware metalen om het contrast van plantenweefsel te verbeteren, is een cruciale stap geworden in de monstervoorbereiding voor micro-CT-analyse. Verschillende verbindingen die algemeen beschikbaar zijn in laboratoria voor micromorfologie van planten zijn getest door Staedler et al., die aanbevelen fosfotungstaat te gebruiken als het meest effectieve middel in penetrerende monsters en de contrastindex8 te verhogen. De resultaten die hier zijn verkregen bij de analyse van het haustorium van P. pubera bevestigen deze aanbeveling. In termen van contrasttoepassing beschrijven Steadler et al. dat de contrastoplossing passief werd geïnfiltreerd door het geanalyseerde materiaal (bloemen en bloemknoppen variërend van 1 mm tot 10 mm) gedurende 1 tot 8 dagen8. Andere auteurs hebben hetzelfde protocol van passieve infiltratie gedurende langere perioden (1-4 weken) gebruikt bij het analyseren van grotere monsters, zoals de 30 cm brede bloemen van endoparasitaire Rafflesiaceae-soorten28. Hoewel dit proces succesvol is gebleken, tonen de resultaten verkregen met het hier beschreven protocol aan dat het infiltratieproces onder vacuüm aanzienlijk kan worden versneld, waardoor de eerder vastgestelde methode wordt verbeterd. Een vacuümkamer of pomp dwingt lucht om uit de plantenweefsels te ontsnappen, waardoor de contrastoplossing gemakkelijker kan worden geïnfiltreerd. Vacuüm kan zelfs worden toegepast op fragiele structuren, zoals hier getoond voor het haustorium van P. pubera en de zachte weefsels van de succulente waardplant E. polygona geparasiteerd door V. minimum. Bovendien is het gebruik van vacuümpompen een veel voorkomende procedure voor de infiltratie van fixeermiddelen of inbeddingsstoffen in veel laboratoria van plantenmicromorfologie, waardoor dit protocol toegankelijker wordt.

Dezelfde aanpak werd hier gebruikt met een contrasterend middel dat selectief monsters kleurt als er specifieke opslagverbindingen aanwezig zijn. Wanneer toegepast door middel van vacuüm of passieve infiltratie, kan selectieve kleuring een slechtere contrastverbetering bieden aan een heel monster in vergelijking met bijvoorbeeld fosfotungstaat. Aan de andere kant is het gunstig voor het benadrukken van specifieke plantenstructuren of weefsels. Zoals hier gemeld, kan het gebruik van selectieve contrastmiddelen zoals jodium, in combinatie met eerdere anatomische of histochemische analyse, helpen bij de differentiatie van parasitair plantenweefsel in het lichaam van de gastheer, op voorwaarde dat parasiet of gastheer (maar niet beide) overvloedige zetmeelreserves vertonen. Het selectief verhogen van de röntgenabsorptie van parasietweefsels blijkt vooral nuttig te zijn voor het verkennen, voor de eerste keer, van het complexe driedimensionale netwerk gevormd door een endoparasitaire plant zoals V. minimum in de stengel van zijn waardplant. Bovendien is het opmerkelijk dat endoparasitaire planten en bepaalde schimmels een interessante evolutionaire convergentie vertonen, beide groeien "incognito" in hun gastheren voor een groot deel van hun levenscyclus en komen alleen tijdens korte periodentevoorschijn 29. Een mogelijke nieuwe toepassing van het hier beschreven protocol zou dus zijn om phloxine B te gebruiken, een vlek die broom30 bevat, om endofytische schimmels in plantenweefsels te detecteren. Van eosine, een andere op broom gebaseerde kleuringsoplossing die slechts zelden wordt gebruikt voor plantenweefsels, is aangetoond dat het het contrast verbetert in niermonsters van muizen die zijn geanalyseerd met behulp van een specifiek micro-CT-systeem31.

Een andere benadering die in dit protocol wordt beschreven, is de perfusie van contrasterende middelen door het vaatweefsel van de gastheerstam of wortel. Deze benadering, die aanzienlijk verschilt van eerder gerapporteerde methoden, is gebaseerd op het werk van Sperry et al., die houtmonsters doordrenkten met safraninekleurstof om hydraulische geleidbaarheid te analyseren32. Zoals besproken door de auteurs en hier benadrukt, is een cruciale stap in het protocol het instellen van het vlekdoorlatende apparaat om te voorkomen dat luchtbellen in het systeemworden geïntroduceerd 32. Driewegkleppen kunnen de oplossingsflux tijdelijk divergeren en bellen uit de vloeistofcomlumn 32 verwijderen. Niettemin kunnen embolieën aanwezig zijn in de vaten van de waardplant, hetzij kunstmatig veroorzaakt tijdens de bemonstering, hetzij van nature als gevolg van de over het algemeen hoge transpiratiesnelheden van parasitaire planten33,34. Dit kan de perfusie-efficiëntie ernstig verminderen, wat ertoe leidt dat het contrast in het monster niet wordt verbeterd. Het is essentieel om een laag tot matig vacuüm toe te passen bij het fixeren van het monster na bemonstering om dit probleem te voorkomen. Bovendien kan het gefixeerde monster onder hoge druk worden gespoeld met behulp van de fixatieve oplossing waarin het monster wordt opgeslagen. Spoelen kan helpen de geleidbaarheid in het monster te herstellen door luchtbellen32 te verwijderen, waardoor het pad vrijkomt voor perfusie van de contrastoplossing. Als met vers materiaal wordt gewerkt, kan het inbrengen van luchtbellen in de plant worden vermeden door het monster onmiddellijk na de bemonstering in water onder te dompelen, het vervolgens opnieuw onder water te snijden en het eindoppervlak glad te maken met scherpe messen35.

Volgens deze benadering werd 1% jodiumoplossing door het haustorium van C. americana en S. martianus geperfuseerd om het contrast van de gastheer-parasiet interface als geheel te verbeteren. De resultaten die voor deze soorten zijn verkregen, tonen aan dat het hier beschreven perfusieprotocol goed werkt voor zowel verse als gefixeerde monsters, en dat de introductie van contrastoplossingen de visualisatie verbetert, zelfs in vergeligneerde monsters. Deze waarnemingen komen overeen met de resultaten gerapporteerd door Teixeira-Costa &; Ceccantinti17, die dezelfde benadering gebruikten om een 0,2% loodnitraatoplossing toe te passen om specifieke aspecten van de haustoriumstructuur te visualiseren. In contact met koolstofdioxide reageert loodnitraat tot een zeer onoplosbaar neerslag dat bestaat uit loodcarbonaatkristallen, die röntgenstralen efficiënt absorberen 8,36. Eenmaal doordrenkt in het vaatweefsel van het monster, verstopt dit neerslag vasculaire putverbindingen, waardoor de oplossing alleen door directe, vaat-tot-vatverbindingen via perforatieplaten kan stromen. Volgens deze benadering wordt de aanwezigheid van directe parasiet-gastheer xyleemverbindingen door perforatieplaten hier getoond voor S. fungiforme en bevestigd met gedetailleerde anatomische analyse. Deze resultaten benadrukken een verdere toepassing van deze aanpak om de functionaliteit van haustorium te testen. Aangezien haustoriuminitiatie mogelijk niet culmineert in de ontwikkeling van een volledig functioneel orgaan als gevolg van parasitaire incompatibiliteit met gastheer of gastheerresistentie tegen de parasiet, kan de hier beschreven aanpak worden gebruikt om te testen of vasculaire verbindingen worden gevormd tussen de twee planten die leiden tot het optreden van effectief parasitisme. Gezien de waarde van het gebruik van micro-CT-scanning om xyleembolismen breder te onderzoeken12,37, kan het hier gepresenteerde protocol ook de visualisatie en kwantitatieve analyse van xyleemembolie in andere niet-parasitaire plantensoorten verbeteren.

Kortom, dit protocol benadert een van de kritische vooruitgang die wordt verwacht in plantenmicrotomografie, namelijk het toepassen van contrasterende middelen om structuren te helpen onderscheiden met een lage röntgenabsorptie24. Zoals hier getoond, kunnen contrastoplossingen de visualisatie van haustoriumstructuren op het grensvlak tussen parasitaire planten en hun gastheren aanzienlijk verbeteren. Verschillende verbindingen kunnen worden gekozen op basis van hun specificiteit in reactie met reserveverbindingen, zoals zetmeel, dat vaak anders is verdeeld over parasiet- en gastheerweefsels. De benadering van contrasttoepassing in haustoriummonsters kan ook worden gekozen om specifieke kenmerken van de parasiet-gastheerinterface te onderzoeken, zoals directe verbinding tussen vat en vat. Bovendien kan dit protocol ook worden toegepast op niet-parasitaire soorten, waardoor de detectie van endofytische schimmels en de kwantificering van xyleemembolie mogelijk worden verbeterd. In elke toepassing kan het hier beschreven protocol ter verbetering van de microtomografie-analyse worden gecombineerd met andere hulpmiddelen, zoals optische projectietomografie en geautomatiseerde virtuele segmentatie, om nieuwe en opwindende inzichten te bieden in de driedimensionale ontwikkeling van de verbinding tussen deze planten en hun gastheren38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteur heeft niets te onthullen.

Acknowledgments

Ik wil dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, University of Sao Paulo, Brazilië) en Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, VS) bedanken voor hun belangrijkste hulp en onmisbare gebruikerstraining voor verschillende microtomografiesystemen en data-analysesoftware. Ik dank ook het personeel van de EEB Greenhouse aan de Universiteit van Connecticut (VS), in het bijzonder Clinton Morse en Matthew Opel voor het leveren van de exemplaren van Viscum minimum. Dr. John Wenzel bood de gelegenheid en grote hulp voor het bemonsteren van Pyrularia pubera. MSc. Carolina Bastos, MSc. Yasmin Hirao en Talitha Motta hebben enorm geholpen met de bemonstering van Scybalium fungiforme. MSc. Ariadne Furtado, en Drs. Fernanda Oliveira en Maria Aline Neves leverden de referentie voor het gebruik van phloxine B voor de analyse van endofytische schimmels. Video-opnames aan de Vrije Universiteit Brussel werden mogelijk gemaakt door de hulp van Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka en Dr. Harry Olde Venterink. De financiering werd verstrekt door de Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brazilië) en de Harvard University Herbaria (VS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D X-ray microscope (XRM) system Zeiss Versa 620 used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22 Zeiss Versa 620 Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software Nikon version XT 3.1.11 Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software Bruker version 3.3.1 Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software Object Research Systems - ORS version Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials Glass Vials Inc. SE V2708C-FM-SP Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X Zeiss version XT 3.1.11 Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N WR Chemicals BDH BDH7422-1 Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 g Vetec 361.08 Sold by SPLab
Microtomography scanner Bruker Skyscan1176 Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner Nikon X-Tek HMXST225 Used for scanning the species V. minimum
NRecon software Bruker version 1.0.0 Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution Electron Microscopy Sciences 101410-756 Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm) Heathrow Scientific PM996 Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mL Taylor 3478 Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4'' Nalge Nunc International SC63013-164 Sold by VWR - USA
Scanning system Nikon X-Tek HMXST225 used to scan Viscum minimum
Scanning system Bruker Skyscan 1176 used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software Zeiss version 16 Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve ToToT DMTWVS-5 Sold by Amazon USA
Two-part syringe HSW Henke-Ject 4850001000 Used without the plunger
Vacuum chamber Binder 80080-434 Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software Volume Graphics version 3.0 Used for analyses and acquisition of images and videos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. The Biology of Parasitic Flowering Plants. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 179 Microtomografie haustorium holoparasiet endoparasiet Cuscuta maretak cytochemie
Gebruik maken van micro-CT-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teixeira-Costa, L. Leveraging… More

Teixeira-Costa, L. Leveraging Micro-CT Scanning to Analyze Parasitic Plant-Host Interactions. J. Vis. Exp. (179), e63423, doi:10.3791/63423 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter