Summary
本文详细介绍了一种新型小鼠判断偏倚协议。还证明了这种嗅觉挖掘任务对情感状态的敏感性的证据，并讨论了其在不同研究领域的实用性。
Abstract
判断偏差（JB）是处于积极和消极情感/情绪状态的个体解释模棱两可信息的方式的差异。这种现象在人类中早已观察到，处于积极状态的个体“乐观地”对模糊性做出反应，而处于消极状态的个体则表现出“悲观主义”。旨在评估动物影响的研究人员利用了这些差异反应，开发了评估判断偏差的任务，作为情感状态的指标。这些任务在各种物种和研究领域越来越受欢迎。然而，对于实验室小鼠，研究中使用最广泛的脊椎动物和严重依赖的物种来模拟情感障碍，只有一个JB任务被成功验证为对情感状态的变化敏感。在这里，我们详细介绍了这种新型小鼠JB任务，并证明了它对小鼠的影响是敏感的。虽然改进仍然是必要的，但对小鼠JB的评估为回答有关小鼠福利的实际问题和关于情感状态在转化研究中的影响的基本问题打开了大门。
Introduction
测量情感调节的判断偏差（以下简称JB）已被证明是研究动物情绪状态的有用工具。这种创新方法借鉴了人类心理学，因为经历积极或消极情感状态（情绪和长期情绪）的人类可靠地证明了他们处理信息的方式的差异1，2，3。例如，经历焦虑或抑郁的人可能会将中性的面部表情解释为消极的，或将中性的句子解释为威胁4，5。这些偏差很可能具有适应性值，因此在物种6，7中是保守的。旨在评估动物影响的研究人员巧妙地利用了这一现象，将乐观主义视为对中性或模糊线索的奖励期望增加，并将悲观主义视为对惩罚或奖励缺失的期望增加8，9。因此，在实验环境中，对模糊刺激的乐观和悲观反应可以分别解释为积极和消极影响的指标，分别为10，11。
与其他动物影响指标相比，JB任务有可能成为特别有价值的工具，因为它们能够检测情感状态的价态和强度10，11。JB任务检测阳性状态的能力（例如，Rygula等人12）特别有用，因为大多数动物影响指标仅限于检测阴性状态13。在JB任务期间，动物通常被训练对预测奖励的正判别提示（例如，高频音调）和预测惩罚的负判别提示（例如，低频音调）做出反应，然后再呈现模棱两可的提示（例如， 中间音调）8。如果为了回应模棱两可的线索，动物“乐观地”对积极线索执行训练的反应（好像期待奖励），这表明存在积极的判断偏差。或者，如果动物表现出消极的训练反应以避免惩罚，这表明“悲观主义”或消极的判断偏差。
自从哈丁及其同事8成功开发出第一个动物JB任务以来，已经为不同研究领域的各种物种开发了几个JB任务7。但是，尽管它们越来越受欢迎，但动物JB任务通常是劳动密集型的。此外，也许是因为它们在方法上与启发它们的人工任务不同，它们有时会产生无效或违反直觉的结果14 ，并且通常只产生很小的治疗效果大小15。因此，开发和实现 JB 任务可能具有挑战性。事实上，对于实验室小鼠，研究中使用最广泛的脊椎动物16，17 和严重依赖的物种来模拟情感障碍18，尽管在过去十年中进行了许多尝试，但只有一项JB任务被成功验证为对情感状态变化敏感19 （参见Resasco等人的补充材料19 以获取摘要）。本文描述了最近验证的murine JB任务，详细介绍了其生物学上的相关设计，并强调了将这种人道任务应用于测试与小鼠影响相关的重要假设的方式。总体而言，该协议可以用于研究小鼠JB上任何感兴趣的变量的情感效应。这将包括此处描述的分类治疗变量（药物或疾病影响，环境条件，遗传背景等），或与连续变量的关系（生理变化，家庭笼子行为等）。
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Protocol
实验由圭尔夫大学动物护理委员会（AUP #3700）批准，符合加拿大动物护理委员会指南，并根据ARREAT（动物研究： 体内 实验报告）20 要求进行报告。
1. 实验准备
- 实验设计（参见 表 1).
注意：此行为测试是一项基于气味的Go/Go挖掘任务，其中老鼠必须挖掘以获得高价值或低价值的奖励。它使用一个矩形竞技场（图 1）有两只胳膊，其中一只胳膊有香味，而另一只胳膊没有香味。如下所述，在呈现模棱两可的气味混合物之前，小鼠被训练区分阳性和负性气味线索。- 假随机地将笼子分配给薄荷或香草阳性判别刺激（DS +）组，如下所示。
注意：该协议仅适用于分配到香草DS +气味混合物的小鼠（有关详细信息，请参阅代表性结果和Resasco等人19 ）。但是，强烈建议进行试点测试，以确认 DS+、DS-和不明确的混合物符合有效 JB 评估的要求（步骤 4.7.3 和 5.3）。因此，这里概述的方法包括测试香草和薄荷DS +，以提供成功满足评估JB要求的组（香草DS +小鼠）和未能满足评估要求的组（薄荷DS +小鼠）的示例。先前的试点测试将提前识别此类问题。 - 薄荷DS+小鼠：对于这些小鼠，在竞技场设置训练期间（见下面的步骤1.4），用薄荷气味提示标记含有高价值奖励的气味分配器和罐子，以及那些没有香草气味提示的奖励。
- Vanilla DS+小鼠：对于这些小鼠，在竞技场设置训练期间（请参阅下面的步骤1.4），用香草气味提示标记含有高价值奖励的气味分配器和罐子，以及那些没有薄荷气味提示的奖励。
注意：此任务包括强化训练试验和未强化试验。在未强化的测试试验期间，小鼠无法获得任何奖励（参见下面的步骤1.4.3），并且薄荷和香草DS +小鼠的模糊气味提示是相同的1：1薄荷/香草混合物。 - 假性地将笼子分配给左侧或右侧气味的手臂组（平衡DS +气味组），如下所示。
- 左图：对于这些小鼠，在竞技场设置进行训练和测试期间（请参阅下面的步骤1.4），用适当的DS +或DS-气味提示标记左臂，并确保右臂始终无味（仅用蒸馏水标记）。
- 右：对于这些小鼠，在竞技场设置进行训练和测试期间（请参阅下面的步骤1.4），用适当的DS +或DS-气味提示标记右臂，并确保左臂始终无味（仅用蒸馏水标记）。
- 随机为每个动物分配一个“盲码”，如下所示。
注意：盲法允许研究人员处理小鼠并对其行为进行评分，以保持对动物ID或治疗的不知情，从而避免不良的主观偏差。这是遵守ARREAGE（动物研究： 体内 实验报告）指南和其他参考文件20的强制性步骤。 - 在电子表格中添加盲码列，其中包含每个动物ID以及它们被分配到的相应处理方法。
- 随机为每个动物分配一个与笼号或处理无关的唯一代码（例如，字母和数字组合“A2”）。
注意：所有随机化都应使用随机数生成器（例如，Random.org）进行。在此随机化步骤中，在适用的情况下，在治疗，菌株等之间进行平衡。由研究助理完成这项工作，他将在整个实验过程中保持“不盲目”的治疗。此人不得在测试期间收集数据，以避免有偏见的评估。 - 在所有数据收集过程中，为“盲人”研究人员提供实时和视频评分延迟，以便仅使用动物的盲码进行挖掘和挖掘，以使研究人员对治疗视而不见。
注意：数据收集期间使用的电子表格将仅包括动物的盲码以及每次试验的相应挖掘和挖掘延迟。在实验结束时，可以将相应的动物ID和治疗信息添加到电子表格中，从而“解盲”研究人员进行数据分析。
- 假随机地将笼子分配给薄荷或香草阳性判别刺激（DS +）组，如下所示。
- 材料准备。
- 高价值食品奖励：用手将干的加糖香蕉片分成约0.5厘米x 0.5厘米的碎片。
- 低价值食物奖励：使用砧板和刀，将啮齿动物的chow（从动物的常规饮食中）切成约0.125厘米3 块。
注意：在开始任务之前，应进行试点测试以确定高价值和低价值奖励。 - 薄荷和香草精华：使用1毫升注射器或微量移液器，将薄荷和香草精加入标记的离心管中。用蒸馏水以1：4稀释提取物，并通过倒置几次混合。每天制作这些，并在使用前反复倒置，以确保混合物新鲜且一致。
- 气味模糊的混合物：薄荷和香草香精稀释后，向离心管中加入等体积的离心管（产生稀释香精的1：1混合物）。在测试对模糊气味混合物的反应的当天进行这些，并在使用前反复反转，以确保混合物新鲜且一致。
注意：强烈建议进行试点测试，以确定适当的稀释液和中间气味混合物，以确保模棱两可的探头的效用，因为强度可能因制造商，批次等而异。如果提供了多个模棱两可的线索，则随机将小鼠分配到接近阳性，中点，接近阴性的测试线索。有关更多详细信息，请参阅讨论。 - 化妆棉：将每个圆形化妆棉切成六块相等的碎片（使它们适合用作香味分配器的组织盒）。
注意：高价值和低价值食品奖励，化妆棉和气味混合物的数量将取决于被测试的受试者数量。请参阅 表1 了解每个阶段每个受试者的试验数量， 以及表2 了解每种试验类型所需的材料。 - 确定实验区域：在蚁群室或其他地方的长凳上进行训练和测试。在小鼠活跃的黑暗阶段在红光下进行所有试验。
- 预训练（实验前1周）在家庭笼子里挖掘。
- 对于每个被测试的笼子，将少量玉米棒垫料倒入两个挖罐中（刚好足以覆盖锅的底部），以帮助零食在被埋葬时留在锅的中心。
- 在一个锅中，将高价值奖励的碎片放在玉米棒层的顶部，以便笼子中的每只老鼠都可以有一块（例如，三只老鼠的笼子里有三块香蕉片）。在另一个锅中，将低价值奖励的碎片放在玉米棒层的顶部，以便笼子中的每只老鼠都可以有一块（例如，三块食物为三只老鼠的笼子）。
- 慢慢地将玉米棒垫料倒在每个花盆的零食上，盖上它们，并将花盆填满3厘米的高度。
- 同时在每个笼子中放置一个高值和一个低值的锅10分钟。10分钟后，从所有笼子中取出锅。
- 丢弃锅中剩余的玉米棒和零食。用70%乙醇彻底擦拭所有罐子，以防止动物和笼子的气味影响未来的试验。
- 每天重复一次步骤 1.3.1-1.3.5，连续 5 天。
注意：这个阶段的目标是让所有笼子的同伴有机会在正式训练开始之前挖出和吃点心。这也有助于习惯食物奖励。
- 竞技场设置为培训和测试。
- 将竞技场放在工作台上，在红灯下。用70%乙醇彻底擦拭竞技场，挖掘锅和香味分配器的所有组件，以去除先前试验中的灰尘和任何气味。
- 按如下方式准备挖掘锅。
- 将适当的食物奖励放入“无法进入的隔间”中（见 图1）。
注意：此隔间中包含的奖励取决于在给定试验中埋藏的零食（如果有的话）（见 表2）。因此，每个锅将始终包含一块香蕉片和一块横跨两个隔间的chow。- DS+异味罐：在强化试验期间，将一块食物放在无法进入的隔间中，并将一块香蕉片埋在锅的可触及区域。
- DS-气味罐：在强化试验期间，将一块食物和一块香蕉片放在难以接近的隔间中。在锅的可访问区域将不提供食物奖励。
- 无味的罐子：在强化试验期间，将一块香蕉片放在难以接近的隔间中，并将一块chow埋在锅的可触及区域。
- 在所有未强化的测试试验（阳性、阴性和含糊不清）中，将一块食物和一块香蕉片放在难以接近的隔间中。在锅的可访问区域将不提供食物奖励。
注意：此步骤是为了防止埋藏的零食的气味显示哪个锅是奖励的。因此，两个隔间之间的屏障被穿孔以促进气味的传播。
- 将少量的玉米棒床上用品倒入每个锅中，以便在埋葬时保持食物奖励的中心。将一块适当的食物奖励（见 表2）放在玉米棒层的顶部，慢慢地将玉米棒垫料倒在零食上，盖上它们并将花盆装满3厘米高。
- 使用1 mL注射器或微量移液器，吸取0.1 mL适当的气味混合物（即薄荷，香草或模棱两可的混合物）或蒸馏水（见 表2），并以圆周运动将其直接注射在玉米芯上。
- 准备香味分配器。
- 将一块化妆棉片放在纸巾盒的底部。使用1mL注射器或微量移液器，吸取0.1mL适当的气味混合物（即薄荷，香草或模棱两可的混合物）或蒸馏水（见 表2）并将其注射到棉片上。用盖子盖住纸巾盒，以包裹有香味的棉花，形成一个香味分配器。
- 将挖罐放在手臂的末端，将香味分配器放在每个手臂的开头。将可拆卸的“门”插入暗盒插槽的正前方，以阻止进入竞技场臂并创建启动隔间（请参阅 图 1）。
注意：挖壶、香氛分配器和注射器必须明确标明，并且在整个实验过程中仅用于一种香味，以避免无意中混合气味线索（即，在整个过程中对薄荷、香草、无香味和含糊不清的混合物使用不同的材料）。
2. 挖掘训练：5天，每天2次阳性试验（表2）
- 快速小鼠在家庭笼子中训练1小时，方法是从料斗中取出食物。
- 按照上面的竞技场设置说明（步骤1.4）设置竞技场以进行强化的积极试验。
- 在挖掘训练的第1天，将食物奖励放在3厘米的玉米棒垫料上，而不是埋葬它们。
- 在接下来的4天里，逐步将奖励埋在玉米芯下更深处，直到它们在第5天（即第1天：在玉米芯的顶部，第2天：被一层非常薄的玉米芯埋下，第3天：埋在锅底的一半，第4天： 埋到锅底的四分之三路，第5天：埋在锅底）。
- 将小鼠从家笼子转移到空的运输笼中。在运输笼的顶部放置一张带有动物盲码的提示卡，以便进行实验的研究人员对动物ID和治疗视而不见。将小鼠带到实验区。
注意：步骤2.1和2.5应由熟悉小鼠的研究助理完成。试验期间的后续步骤将由对动物ID（和治疗，如果适用）视而不见的研究人员进行。始终使用杯子处理（张开手）或隧道处理（用纸杯或塑料隧道）来处理小鼠，以避免传统尾巴处理的厌恶效果21。 - 将小鼠从运输笼移动到竞技场的起始隔间。取下起始“门”，立即将有机玻璃盖放在竞技场上，然后启动5分钟的试用计时器。
注意：如果来自同一笼子的多只小鼠正在接受测试，则应同时进行测试。然而，同时接受测试的动物数量将取决于可用的盲人观察者的数量;理想情况下，研究人员将一次观察和处理一只动物，但如有必要，一个人可以同时观察和处理两只动物。 - 实时得分延迟挖掘和延迟吃掉两只手臂的奖励。
- 将要挖掘的延迟记录为观察到第一次挖掘的时间。挖掘被描述为老鼠用前爪和/或枪口主动推动或操纵玉米棒垫料。
- 将进食延迟记录为观察到第一次进食的时间。进食被描述为老鼠在将它抱在前爪并坐在趴上时消耗奖励。
- 试验结束后，提起有机玻璃盖，然后将鼠标移回其运输笼。
- 丢弃所有留在花盆中的玉米棒床上用品和零食。打开纸巾盒并丢弃棉花片。擦拭竞技场和挖掘锅的所有组件，并用70%乙醇彻底闻到分配器的香味。
- 为第二次阳性试验设置竞技场（步骤1.4）。重复步骤2.6-2.9以获得强化的阳性试验。
- 将运输笼归还给研究助理，以便将小鼠放回家中。
- 连续 5 天重复步骤 2.1-2.11。
3. 鉴别训练：10天，每天四次试验
- 按照步骤 1.4 中的说明设置阳性或阴性试验的竞技场（请参阅 表 2）。
- 按照 表2 中概述的顺序每天进行两次阳性和两次阴性试验（即，第1-5天交替进行阳性和阴性试验，第6-10天进行假随机试验）。
- 在每个培训日开始时，按照步骤 2.1 中的说明进行操作，然后按照步骤 2.5-2.10 进行操作。重复此步骤，直到小鼠总共接受了四次试验。
- 将运输笼归还给研究助理，以便将小鼠放回家中。
- 每天重复一次步骤 3.1-3.4，总共 10 天（即，连续两个 5 天工作周，以 2 天的周末间隔）。
4. 测试
注意：测试持续时间为3-5天（取决于每只小鼠满足学习标准所需的时间），进行阳性和阴性测试试验的会话每天五次试验，进行模糊测试时每天进行三次试验。
- 在从料斗中取出食物，在家庭笼子中训练/测试之前，快速小鼠1小时。
- 按照步骤 1.4中的竞技场设置说明和步骤2.5-2.10中的强化试验说明，以随机顺序进行一次阳性试验和一次阴性试验（见表1）。
- 执行一次视频录制的未强化测试试验。
注意：未强化的试验与强化的试验相同，但奖励的放置位置除外。因此，在未强化的试验中，每个高价值和低价值奖励的一块被放置在难以接近的隔间中，用于有香味和无味的罐子。- 每天对每只小鼠进行一次阳性或阴性测试试验，直到满足学习标准（最多4天;学习标准在步骤4.7.3中描述）。确保阳性和阴性测试试验在几天内交替进行（例如，第1天：阳性测试，第2天：阴性测试，第3天：阳性测试等）。
- 按照步骤 1.4 中的竞技场设置说明进行操作。
- 将小鼠从运输笼移动到竞技场的起始隔间。在三脚架上设置摄像机，以便手臂末端的两个花盆都在视野中，然后开始录制。确保在视频中记录带有动物盲码和试验类型（阳性测试或阴性测试）的提示卡（在视频评分期间参考）。
- 取下起始“门”，立即将有机玻璃盖放在竞技场上，然后启动2分钟的试用计时器。
- 试用结束后，停止录制，将相机移到一侧，提起有机玻璃盖，将鼠标移回运输笼。
- 丢弃所有留在花盆中的玉米棒床上用品和零食。打开纸巾盒并丢弃棉花片。用70%乙醇彻底擦拭竞技场，挖掘锅和香味分配器的所有组件。
- 按照步骤 1.4中的竞技场设置说明和步骤2.5-2.10中的强化试验说明，以随机顺序进行一次阳性试验和一次阴性试验（见表1）。
- 将运输笼归还给研究助理，以便将小鼠放回家中。
- 一旦所有小鼠都完成了每天的五次试验，将视频从相机存储卡传输到计算机进行视频评分。
- 在测试当天对测试试验视频进行阳性和阴性评分，以评估小鼠是否符合学习标准。确保当天的视频评分，因为符合学习标准的动物将在第二天接受模棱两可的测试。
- 使用事件记录软件或秒表，让对治疗视而不见的研究人员记录每只小鼠在阳性和阴性测试试验的第一分钟内在每个罐中挖掘和挖掘的潜伏期。
- 将要挖掘的延迟记录为观察到第一次挖掘的时间。挖掘被描述为老鼠用前爪和/或枪口主动推动或操纵玉米棒垫料。将挖掘持续时间记录为鼠标进行挖掘的总时间。
- 比较每只小鼠的阳性（DS+）和阴性（DS-）试验之间在有香味的手臂中的挖掘持续时间，以确定动物是否可以区分任务。在测试的第一分钟（DS+ 挖挖持续时间最短为 3 秒），如果 DS+ 香味臂的挖掘时间至少是 DS-香味臂的两倍，请考虑要满足的学习标准。
- 每天重复步骤4.1-4.7，直到小鼠达到学习标准。
- 从模棱两可的试验中排除到第4天未达到标准的个体（从而进行判断偏倚评估）。
- 对于符合学习标准的小鼠，测试对模糊气味混合物的反应。
- 在从料斗中取出食物，在家庭笼子中训练/测试之前，快速小鼠1小时。
- 按照步骤 1.4 中的竞技场设置说明和步骤 2.5-2.10 中的强化试验说明，以随机顺序执行一次阳性和一次阴性强化试验。
- 使用模糊的气味混合物，按照步骤4.3中所述进行一次视频记录的未增强测试试验（见 表2）。
- 对模棱两可的试验视频进行评分，以评估判断偏差。
- 使用事件记录软件或秒表，让一名对动物ID和治疗视而不见的研究人员记录每只小鼠在测试试验的前1分钟和2分钟内在每个罐中挖掘的潜伏期（参见步骤4.7.2）。
5. 数据分析
注意：所需的精确分析将取决于实验设计的细节。这里概述了一个总体概述，但强烈建议研究人员在计划动物JB实验分析时参考Gygax22 ，在选择样本量时参考Gaskill和Garner23 （因为所需的分析对于 先验 功效分析来说通常太复杂了）。
- 研究人员通过向电子表格中“非盲”地将每个盲码的相应动物ID和治疗信息（例如，富集或常规外壳，药物或安慰剂等）添加到电子表格中。确保生成的电子表格包含符合学习标准（即阳性、阴性和模棱两可的测试试验）的每只动物的三行，表明在有香味的手臂中挖掘的潜伏期。
- 使用首选统计软件运行重复测量广义线性混合模型。在这里，结果变量将是挖掘的延迟。确保模型包含“处理”（或感兴趣的连续变量）、“试验类型”和“处理 x 试验类型”交互作用作为固定效应。包括鼠标ID（嵌套在治疗中）作为随机效果。模型中包含的其他术语将取决于所应用的实验设计。
注意：如果小鼠是群居的（适合这个社会物种24）并且笼子配偶被测试，那么在处理中嵌套的笼子（如果存在）必须作为随机效应包含在模型中（并且小鼠ID随后必须嵌套在笼内）。 - 绘制每种试验类型中延迟的最小二乘均值，以确认所呈现的模糊提示被解释为中间值（即，模棱两可试验的延迟最小二乘均值估计值应落在正延迟和负延迟之间的中间点）。仅当满足此要求时才评估鼠标 JB。
- 通过调查治疗x试验类型相互作用来确定小鼠是否显示情感调节的JB，评估治疗（或感兴趣的连续变量）对潜伏期的简单影响，以挖掘模糊试验。
图1：实验装置示意图。 JB设备包括一个带有两个手臂的矩形竞技场。每个臂都包含一个位于起点的香味分配器和一个位于末端的挖掘锅。经爱思唯尔许可转载自雷萨科等人19 。 请点击此处查看此图的大图。
| 阶段： | 试验设计 | |
| 都 | 高价值奖励 | 香蕉片 |
| 低价值奖励 | 啮齿动物周 | |
| 断续器+ | 薄荷或香草（平衡） | |
| 断续器 | 薄荷或香草（平衡） | |
| 挖掘培训 | 挖掘训练时间表 | 5 天：2 次 POS 试用/天 |
| 挖掘试验持续时间 | 5 分钟 | |
| 歧视培训 | 歧视培训时间表 | 10 天：4 次试验/天 |
| 挖掘试用订单 | 第1-5天：4次/天 | |
| 试用版 1：姿势 | ||
| 试炼2：否定 | ||
| 试用版 3：姿势 | ||
| 审判4：否定 | ||
| 第6-10天：4次/天* | ||
| 歧视审判期限 | 5 分钟 | |
| 测试 | 测试时间表 | 3-5天（取决于达到学习标准的时间） |
| 5 次试验/天 | ||
| 测试阶段顺序 | 试验 1 和 2：姿势或负** | |
| 试验3：试验 | ||
| 试验 4 和 5：姿势或否定** | ||
| 测试试用时间 | 2 分钟 | |
| *试验是伪随机化的，因此小鼠每天总是进行两次Pos试验和两次Neg试验 | ||
| **试验是伪随机化的，因此小鼠在试验前后总是有一个Pos试验和一个Neg试验 | ||
表1：实验设计和训练和测试时间表摘要 除了实验设计详细信息外，挖掘训练、鉴别训练和测试阶段每天的试验次数和顺序。经爱思唯尔许可转载自雷萨科等人19。
| 试用详情 | |||||||
| 阶段 | 试用类型 | 香薰手臂 | 无味的手臂 | ||||
| 气味提示 | 埋藏的奖励 | 无法获得的奖励 | 气味提示 | 埋藏的奖励 | 无法获得的奖励 | ||
| 挖掘和歧视培训 | 邮政培训 | 断续器+ | 香蕉 | 食物 | 水 | 食物 | 香蕉 |
| 负训练 | 断续器 | 无奖励 | 香蕉+周 | 水 | 食物 | 香蕉 | |
| 测试 | 位置测试 | 断续器+ | 无奖励 | 香蕉+周 | 水 | 无奖励 | 香蕉+周 |
| 否定测试 | 断续器 | 无奖励 | 香蕉+周 | 水 | 无奖励 | 香蕉+周 | |
| 模棱两可的测试 | 薄荷/ 香草混合物 |
无奖励 | 香蕉+周 | 水 | 无奖励 | 香蕉+周 | |
| 学习标准 | 老鼠在 DS+ 罐（Pos 测试）中的挖掘时间必须比 DS- 罐（负测试）长两倍，并且至少要挖 3 秒 | ||||||
表 2.试用详细信息摘要。 在挖掘训练、鉴别训练和测试阶段，每种试验类型中都呈现气味提示和奖励。DS（+）： 正判别刺激， DS（-）： 负判别刺激， Pos： 正， 否定： 负。经爱思唯尔许可转载自雷萨科等人19。有关扩展表，请参阅原始文章中的补充表 S2。
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Representative Results
这里介绍的结果反映了Resasco等人实验19的相关发现。本实验的受试者是18只雌性C57BL / 6NCrl（“C57”）和18只巴尔布/cAnNCrl（“巴尔布”）小鼠。动物在3-4周龄时到达设施，并在混合菌株四重奏25中随机分配到环境丰富或常规住房治疗（分别为EH或CH）。每个笼子里含有一个C57和一个巴尔布，此外还有两个DBA / 2NCrl小鼠在另一个实验中使用。在这里，雌性小鼠的使用允许具有环境丰富的这种社会物种的群体住房，同时避免了雄性小鼠26 中可能发生的升高的攻击性和资源保护（尽管请注意，该任务也已应用于非富集的雄性裸鼠19）。CH小鼠被保存在带有玉米芯垫垫，两种类型的筑巢材料（皱纸条和棉巢; 图2A），和一个纸杯“庇护所”。EH笼是不透明的塑料，尺寸为60L x 60W x 30H cm3 ，带有一个红色有机玻璃窗口用于观察（n = 9; 图 2B，C）。已知这些条件可以改善福利：包含各种富集（如前所述Nip等人27），小鼠有动力访问28，并减少表明福利差的行为（例如，刻板行为，侵略性和抑郁样不活动27，28，29).每个EH笼还包括一个连接的“附件”笼（与CH笼相同，但仅包含垫料），小鼠 可以通过 隧道自由进入（图2C）。附件笼允许轻松捕获和处理EH小鼠，当一杯装满甜燕麦麦片的杯子被摇动时，训练进入这种附件以获得食物奖励。一旦老鼠进入附属笼子，通道可以被阻塞，并且可以使用杯子或隧道处理21轻松地将小鼠从笼子中移走。因此，这种方法避免了在复杂丰富的环境中进行压力“追逐”30。食物和水是 随意 提供的，殖民地室保持在21±1°C和35%-55%相对湿度，反向12：12小时光照周期（06：00熄灯，18：00开灯）。在开始在设备中进行挖掘训练之前，将小鼠差异地饲养5周（参见 图2D中的时间线）。
小鼠在JB任务中接受了上述协议中概述的训练和测试。在第一次和整整2分钟的阳性，阴性和模糊性测试试验中挖掘气味手臂的潜伏期用于测试对JB的外壳影响。在这里，使用广义线性混合模型分析数据，并在必要时应用变换以满足正态性和同质性的假设。有关分析（例如，模型选择）的详细说明，请参见Resasco等人19 。简而言之，重复测量模型始终包括试验类型，外壳，应变，试验类型x外壳，DS +气味，试验类型x应变，试验类型x DS +气味，试验类型x外壳x DS +气味，笼子（嵌套在外壳和DS +气味中的随机效应）和鼠标ID（嵌套在笼子，外壳，DS +气味和应变中的随机效应）。外壳对延迟的简单影响是在计算最小二乘均值31 时从试验类型 x 外壳确定的。请注意，自始至终都报告了双尾p值以证明对治疗效果的研究，但是Resasco等人的原始验证工作19 在适当的情况下使用了单尾p值32 ，因为需要一个特定的响应来验证任务（参见Resasco等人19 的验证讨论）。
在任何动物任务中评估判断偏差之前，满足两个技术标准至关重要：首先，动物必须成功地区分积极和消极的线索（即满足学习标准）。对于符合此标准的动物，必须证明模棱两可的线索被解释为中间线索。如果其中任何一个不满足，那么就无法推断出判断偏差和相应的情感状态。在这个实验中，除了四只C57小鼠之外，所有C57小鼠都符合学习标准，并且在测试理发笼伴侣之前去除了一只C57（n = 31）。在第一次和整整2分钟的测试中，试验型x DS +气味显着（1分钟： F2，62 = 5.67， p = 0.006; 2分钟： F2，62 = 5.74， p = 0.005），表明Mint DS +小鼠意外地将模糊的气味混合物解释为阳性（好像100%薄荷），而Vanilla DS +小鼠将同样模糊的气味混合物视为中间体（图3A，图3A，这一发现表明，只有香草DS+小鼠符合将气味混合物作为DS+和DS-之间的中间体处理的技术要求，因此薄荷DS +小鼠被排除在随后的JB分析之外。
对于香草DS +小鼠，根据试验类型x外壳术语31计算外壳的简单效应。在这一组中，Housing影响了CH动物的挖掘潜伏期，在模棱两可的试验中，CH动物的挖掘速度比EH慢，但在阳性或阴性试验中则不然。1 分钟后（歧义：t = 2.27，d.f. = 92.94， p = 0.014， 科恩 d = 1.148; 正数： t = 0.22，d.f. = 92.94， p = 0.414， 科恩 d = 0.110;负数： t = 0.80，d.f. = 92.94， p = 0.214， 科恩 d = 0.404;参见 图 4A）和完整 2 分钟之后（模棱两可： t = 2.14，d.f. = 91.89， p = 0.018， 科恩 d = 1.083; 正数： t = 0.39， d.f. = 91.89， p = 0.348， 科恩 d = 0.198;负数： t = 0.61，d.f. = 91.89， p = 0.273， 科恩 d = 0.308;参见 图4B），即使试验类型x外壳x DS+气味（1分钟： F3，65.37 = 0.36， p = 0.7835; 2分钟： F3，65.37 = 0.49， p = 0.688）和试验类型x外壳（1分钟： F2，62 = 1.66， p = 0.198; 2分钟： F2，62 = 1.41， p = 0.252）没有考虑显着的变化。CH小鼠对模糊线索的这些悲观解释反映了表明负面影响的负面判断偏差。
图2：外壳处理和实验时间表。（B） EH 的俯视图。（C） 带有附加“附件”笼的EH前视图，便于捕捉/处理鼠标。（D）实验时间表和阳性，阴性和模糊的训练和测试试验摘要。DS（+）：积极的判别刺激，DS（-）：消极的歧视性刺激，AMB：模棱两可的混合物（50%香草-50%薄荷），B：香蕉片，C：啮齿动物饮食（“chow”），X：没有食物奖励。经爱思唯尔许可转载自雷萨科等人19。请点击此处查看此图的大图。
图 3：确定小鼠是否满足 JB 评估的要求。 在阳性、阴性和模棱两可的测试试验期间挖掘延迟最小二乘均值（±标准误差）。（A）在接受薄荷（M，n = 15）或香草（V，n = 16）作为正判别刺激（DS +）（数据框Cox变换）的小鼠中1分钟的挖掘延迟。（B）相同受试者的2分钟挖掘延迟（数据对数转换）。在这两个时间段内，Vanilla DS +小鼠都满足了将模棱两可的线索解释为中间线索的技术要求。Mint DS +小鼠未能这样做（而是将模棱两可的线索解释为阳性），因此从随后的JB分析中被淘汰。经爱思唯尔许可转载自雷萨科等人19。 请点击此处查看此图的大图。
图4：住房治疗对影响调节JB的影响。 在阳性、阴性和模棱两可的测试试验中挖掘延迟最小二乘均值（±标准误差）。（A）在常规（CH，n = 7）或富集（EH，n = 9）外壳（数据框Cox转换）的香草DS +小鼠中挖掘1分钟延迟。（B）相同受试者的2分钟挖掘延迟（数据对数转换）。在这两个时间段内，CH动物在模棱两可的试验中表现出比EH同种更长的挖掘潜伏期，表明阴性JB。经爱思唯尔许可转载自雷萨科等人19。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里概述的基于气味的挖掘方案和结果证明了这种新型JB任务检测小鼠情感状态变化的能力。因此，这项任务为不同的研究领域提供了一个有价值的工具。与任何JB任务类似，要评估动物影响，动物首先要学会区分线索（步骤4.7.3），并且将模糊刺激解释为中间刺激（步骤5.3）至关重要。虽然很简单，但满足这些要求可能具有挑战性，特别是在实验室小鼠中，过去超过15次开发和实施小鼠JB任务的尝试都失败了19次。在这里，多个组件在满足这些技术标准方面发挥了至关重要的作用，并为任务的成功和实用性做出了贡献。
首先，该任务的行为学设计促进了成功的辨别学习，因为判别线索和所需的反应都与生物学相关：小鼠具有令人印象深刻的嗅觉能力，使它们能够在呈现气味刺激33时快速学习和相当大的记忆跨度，并且它们自然地被驱使进行挖掘以进行一般探索，觅食和洞穴构造24，34.此外，平衡的DS +气味揭示了香草DS +和薄荷DS +小鼠解释模糊混合物的方式的差异，证实了模糊的线索被解释为香草DS +小鼠的中间体，而不是薄荷DS +小鼠。因此，建议仅将香草用作DS +，用于利用此处使用的提取物品牌和小鼠菌株的任何未来工作。重要的是，尽管平衡在本实验中取得了成功的结果，但我们敦促研究人员进行试点测试，以便在实施改变时识别适当的模糊混合物，因为平衡有时会给数据增加相当大的噪音，增加掩盖治疗效果的风险35。
即使满足这些基本标准，JB也并不总是容易检测到，这可能是由于这些实验通常产生15的处理效果很小。因此，为了确保任务敏感性，使用了独特的Go/Go设计，因为这种方法已被证明比其他物种15中的Go/No-Go设计对动物影响的变化更敏感。然而，在所有试验中使用含有低值奖励的无味手臂将此任务与先前验证小鼠36，37，38的Go / Go JB任务的失败尝试区分开来。在这里，在阳性试验期间，小鼠在DS +组中的高价值奖励和无味手臂中的低价值奖励之间进行选择;在负面试验中，他们在DS-手臂中没有奖励和无味手臂的低价值奖励之间做出选择。虽然这需要小鼠学习更复杂的任务（即，区分预测不同奖励值的线索，而不是简单地奖励存在或不存在），但似乎具有一致的选项，其中低值奖励始终存在，可能使小鼠的训练和测试压力减轻，并增强了学习（86%的小鼠符合学习标准）。虽然老鼠通常被认为难以训练或无法学习困难的任务18，但这里的结果表明，它们的能力不应被低估，并且设计低压力，行为学任务可能是检测影响变化的更有效方法，而不是更简单的任务或具有更严重后果的任务（例如，涉及像气喘或白光这样的惩罚，而不是简单地奖励缺席39，40，41）。
最后，为了进一步减少可能干扰治疗效果并引入不需要的可变性的压力源，实施了人道处理方法21。在这里，小鼠在其整个生命中仅 通过 杯或隧道方法处理（包括往返运输笼和JB装置），以避免传统尾巴处理的厌恶效应21。除此之外，EH动物还被训练自愿进入附件笼进行处理，从而避免了在复杂环境中进行压力的“追逐”。总之，这种方法通过更长的潜伏期来检测CH小鼠的悲观判断偏差，以响应模糊的线索。未来的研究人员应该同样考虑他们的兴趣，住房或畜牧实践的治疗方面是否有可能掩盖治疗效果或诱发地板效应（即，所有动物都表现出明显的悲观情绪，否定任务检测更细微的治疗差异的能力），以便可以预防或减轻这些差异。
现在需要进一步推广和完善这项有希望的任务。迄今为止，这项JB任务仅适用于经历长期低唤醒负面影响的动物（由于限制性住房或慢性疾病19）。因此，重要的是，未来的工作旨在测试这项任务对急性应激源和高唤醒性负面情绪状态的敏感性。此外，最大化这项任务的价值还将涉及重复研究，调查个体对相同或多个模糊探针的测试 - 重测可靠性。使用相同的探针重新测试将允许研究人员测试有关影响随时间变化的假设，而将受试者暴露于一系列模糊的线索（即接近阳性，中间和接近阴性）可能允许识别不同类型的阴性状态（特别是抑郁与焦虑样情况）11，42.额外的验证实验还应研究较短方案的价值，以及菌株和性别之间的潜在差异（尽管原始出版物确实解决了这些问题，成功地采用了较短的方案来评估对雄性小鼠的影响19）。事实上，这项任务可能会扩展到任何有内在动机的啮齿动物，只要进行适当的大小修改，并确认验证，就可以制造洞穴43，44。这种复制和改进很重要，因为迄今为止还没有为小鼠开发其他有效的JB任务，并且由于JB任务对情感状态的价态和强度都很敏感（如引言中所述），这是大多数动物影响指标无法做到的事情（例如，下丘脑 - 垂体 - 肾上腺活动可以改变以响应积极和消极的经历7，45）。
总体而言，鼠标JB任务的开发代表了一个有前途的新工具，并为评估鼠标影响的巨大进展打开了大门。小鼠是基础和转化研究中使用最广泛的脊椎动物17，这项任务提供了一种回答有关全球使用的数千万种动物的福利的基本问题的方法，以及影响与它们用于建模的疾病或病症之间的联系。虽然不建议将这项任务用于日常福利评估，但对住房和畜牧业实践的实验性调查可以帮助确定促进小鼠福利的改进，并有助于识别可以观察到的更微妙的动物痛苦迹象。鉴于这项任务的人道性和潜在的丰富性，以及实现该协议的低经济成本，这个新颖的JB任务具有很大的实用性。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
作者感谢米格尔·阿亚拉、林赛·基奇纳姆、米歇尔·爱德华兹博士、西尔维娅·林和斯蒂芬妮·德贾尔丁对Reseasco等人19 验证工作的贡献，这些工作是该协议所基于的。我们还要感谢老鼠和我们出色的动物护理技术人员，迈克尔·兰德尔和米歇尔·切普拉克。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Commercial alcohol | P016EAAN | Dilute to 70% with distilled water, for cleaning |
| Centrifuge tubes | Fischer | 55395 | 15 mL tubes used to dilute essences here. However, size may be selected based on total volume required for sample size |
| Cheerios (original) | Cheerios | N/A | Commercially available. Used as reward to train animals to enter annex cage for handling |
| Corncob bedding | Envigo | 7092 | Teklad 1/8 corncob bedding used in digging pots and animal cages |
| Cotton pads | Equate | N/A | Commercially available. Modified in lab to fit within tissue cassettes for scent dispensing |
| Digging pots | Rubbermaid | N/A | Commercially available. Containers were modified to fit the apparatus in the lab |
| Dried, sweetened banana chips | Stock and Barrel | N/A | Commercially available. High value reward in JB task |
| JB apparatus | N/A | The apparatus was made in the lab | |
| JWatcher event recording software | Animal Behavior Laboratory, Macquarie University | Version 1.0 | Freely available for download online. Used to score digging behavior during JB task |
| Mint extract | Fleibor | N/A | Commercially "Menta (Solución)". Discriminative stimulus odor |
| Rodent Diet | Envigo | 2914 | Teklad global 14% protein rodent maintenance diets. Low value reward in JB task and regular diet in home cage |
| SAS statistical software | SAS | Version 9.4 | Other comparable software programs (e.g. R) are also appropriate |
| Vanilla extract | Fleibor | Commercially available "Vainilla (Solución)". Discriminative stimulus odor | |
| Video camera | Sony | DCR-SX22 | Sony handycam. |
References
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