Summary
Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di un nuovo protocollo di bias di giudizio del topo. Vengono anche dimostrate le prove della sensibilità di questo compito di scavo olfattivo allo stato affettivo e viene discussa la sua utilità in diversi campi di ricerca.
Abstract
I bias di giudizio (JB) sono differenze nel modo in cui gli individui in stati affettivi / emotivi positivi e negativi interpretano informazioni ambigue. Questo fenomeno è stato a lungo osservato negli esseri umani, con gli individui in stati positivi che rispondono all'ambiguità "ottimisticamente" e quelli in stati negativi che mostrano invece "pessimismo". I ricercatori che mirano a valutare l'affetto animale hanno approfittato di queste risposte differenziali, sviluppando compiti per valutare il bias di giudizio come indicatore dello stato affettivo. Questi compiti stanno diventando sempre più popolari in diverse specie e campi di ricerca. Tuttavia, per i topi di laboratorio, i vertebrati più utilizzati nella ricerca e una specie su cui si fa molto affidamento per modellare i disturbi affettivi, solo un compito JB è stato convalidato con successo come sensibile ai cambiamenti nello stato affettivo. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di questo nuovo compito murino JB e la prova della sua sensibilità all'influenza del topo. Sebbene i perfezionamenti siano ancora necessari, la valutazione del JB del topo apre la porta per rispondere sia a domande pratiche riguardanti il benessere del topo, sia a domande fondamentali sull'impatto dello stato affettivo nella ricerca traslazionale.
Introduction
Misurare il bias di giudizio affettivamente modulato (d'ora in poi JB) si è dimostrato uno strumento utile per studiare gli stati emotivi degli animali. Questo approccio innovativo prende in prestito dalla psicologia umana poiché gli esseri umani che sperimentano stati affettivi positivi o negativi (emozioni e stati d'animo a lungo termine) dimostrano in modo affidabile le differenze nel modo in cui elaborano le informazioni 1,2,3. Ad esempio, gli esseri umani che soffrono di ansia o depressione potrebbero interpretare le espressioni facciali neutre come negative o frasi neutre come minacciose 4,5. È probabile che questi pregiudizi abbiano un valore adattativo e siano quindi conservati tra le specie 6,7. I ricercatori che mirano a valutare l'affetto animale hanno abilmente approfittato di questo fenomeno, operando l'ottimismo come l'aumento dell'aspettativa di ricompensa in risposta a segnali neutri o ambigui e il pessimismo come l'aumento dell'aspettativa di punizione o assenza di ricompensa 8,9. Pertanto, in un contesto sperimentale, le risposte ottimistiche e pessimistiche a stimoli ambigui possono essere interpretate come indicatori di affetto positivo e negativo, rispettivamente10,11.
Rispetto ad altri indicatori di influenza animale, i compiti JB hanno il potenziale per essere strumenti particolarmente preziosi poiché sono in grado di rilevare sia la valenza che l'intensità degli stati affettivi10,11. La capacità dei compiti JB di rilevare stati positivi (ad esempio, Rygula et al.12) è particolarmente utile poiché la maggior parte degli indicatori di influenza animale sono limitati al rilevamento di stati negativi13. Durante i compiti JB, gli animali sono tipicamente addestrati a rispondere a un segnale discriminante positivo che predice la ricompensa (ad esempio, il tono ad alta frequenza) e un segnale discriminatorio negativo che predice la punizione (ad esempio, il tono a bassa frequenza), prima di essere presentato con un segnale ambiguo (ad esempio, tono intermedio)8. Se in risposta a segnali ambigui un animale esegue "ottimisticamente" la risposta addestrata per il segnale positivo (come se si aspettasse una ricompensa), ciò indica un pregiudizio di giudizio positivo. In alternativa, se gli animali dimostrano la risposta negativa addestrata per evitare la punizione, ciò è indicativo di "pessimismo" o pregiudizio di giudizio negativo.
Dallo sviluppo del primo compito JB di successo per gli animali da parte di Harding e colleghi8, diversi compiti JB sono stati sviluppati per una vasta gamma di specie in diversi campi di ricerca7. Ma nonostante la loro crescente popolarità, i compiti JB animali sono spesso laboriosi. Inoltre, forse perché sono metodologicamente diversi dai compiti umani che li hanno ispirati, a volte producono risultati nulli o controintuitivi14 e comunemente producono solo piccole dimensioni dell'effetto del trattamento15. Di conseguenza, le attività JB possono essere difficili da sviluppare e implementare. Infatti, per i topi di laboratorio, i vertebrati più utilizzati nella ricerca16,17 e una specie su cui si è fatto molto affidamento per modellare i disturbi affettivi18, solo un compito JB è stato convalidato con successo come sensibile ai cambiamenti nello stato affettivo19 nonostante molti tentativi nell'ultimo decennio (vedi materiale supplementare di Resasco et al.19 per un riassunto). Questo articolo descrive il compito JB murino recentemente convalidato, dettagliando il suo design biologicamente rilevante ed evidenziando i modi in cui questo compito umano può essere applicato per testare ipotesi importanti rilevanti per l'effetto del topo. Nel complesso, il protocollo può essere implementato per studiare gli effetti affettivi di qualsiasi variabile di interesse su JB nei topi. Ciò includerebbe variabili di trattamento categoriali come descritto qui (effetti di farmaci o malattie, condizioni ambientali, background genetico, ecc.), O relazioni con variabili continue (cambiamenti fisiologici, comportamenti in gabbia domestica, ecc.).
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Protocol
Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Guelph (AUP #3700), condotti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e segnalati in conformità con i requisiti ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)20 .
1. Preparazione dell'esperimento
- Progettazione sperimentale (vedi Tabella 1).
NOTA: questo test comportamentale è un'attività di scavo Go/Go basata sul profumo, in cui i topi devono scavare per ottenere ricompense di alto o basso valore. Utilizza un'arena rettangolare (Figura 1) con due braccia, in cui un braccio è profumato mentre l'altro è non profumato. Come descritto di seguito, i topi sono addestrati a discriminare tra segnali di odore positivi e negativi prima di essere presentati con una miscela di odori ambigui.- Pseudocasualmente assegna le gabbie ai gruppi di stimolo discriminativo positivo alla menta o alla vaniglia (DS+) come segue.
NOTA: Questo protocollo è stato convalidato solo per i topi assegnati alla miscela di odori di vaniglia DS + (vedere Risultati rappresentativi e Resasco et al.19 per i dettagli). Tuttavia, si raccomanda vivamente di testare i test pilota per confermare che le miscele DS+, DS e ambigue soddisfino i requisiti per una valutazione JB valida (fasi 4.7.3 e 5.3). Pertanto, i metodi qui delineati includono il test sia di una vaniglia che di una menta DS +, per fornire un esempio di un gruppo che soddisfa con successo i requisiti per la valutazione di JB (i topi DS + vaniglia) e un gruppo che non riesce a farlo (i topi DS + menta). I test pilota precedenti identificherebbero questo tipo di problema in anticipo. - Mouse Mint DS+: per questi topi, durante la configurazione dell'arena per l'allenamento (vedi passaggio 1.4 di seguito), contrassegna i distributori di profumi e le pentole contenenti una ricompensa di alto valore con il segnale dell'odore di menta e quelli che non contengono alcuna ricompensa con il segnale dell'odore di vaniglia.
- Topi Vanilla DS+: per questi topi, durante la configurazione dell'arena per l'allenamento (vedere il passaggio 1.4 di seguito), contrassegnare i distributori di profumo e le pentole contenenti una ricompensa di alto valore con il segnale dell'odore di vaniglia e quelli che non contengono alcuna ricompensa con il segnale dell'odore di menta.
NOTA: questo compito consiste in prove di addestramento rinforzate e prove di prova non rinforzate. Durante le prove di test non rinforzate, nessuna ricompensa è accessibile ai topi (vedere il passaggio 1.4.3 di seguito) e il segnale di odore ambiguo per i topi DS + di menta e vaniglia è la stessa miscela di menta / vaniglia 1: 1. - Assegna pseudocasualmente le gabbie ai gruppi di braccia profumate sinistra o destra (controbilanciando i gruppi di odori DS +) come segue.
- A sinistra: per questi topi, durante la configurazione dell'arena per l'allenamento e il test (vedere il passaggio 1.4 di seguito), contrassegnare il braccio sinistro con l'apposito segnale di odore DS + o DS- e assicurarsi che il braccio destro sia sempre non profumato (contrassegnato solo con acqua distillata).
- A destra: per questi topi, durante la configurazione dell'arena per l'allenamento e il test (vedere il passaggio 1.4 di seguito), contrassegnare il braccio destro con l'appropriato segnale di odore DS + o DS- e assicurarsi che il braccio sinistro sia sempre non profumato (contrassegnato solo con acqua distillata).
- Assegna in modo casuale a ciascun animale un "codice cieco" come segue.
NOTA: l'accecamento consente al ricercatore che gestisce i topi e valuta il loro comportamento di rimanere inconsapevole dell'ID o del trattamento dell'animale, evitando pregiudizi soggettivi indesiderati. Questo è un passaggio obbligatorio per conformarsi alle linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) e ad altri documenti di riferimento20. - Aggiungi una colonna per il codice cieco in un foglio di calcolo contenente ogni ID animale e il trattamento corrispondente a cui sono stati assegnati.
- Assegna in modo casuale a ciascun animale un codice univoco (ad esempio, una combinazione di lettere e numeri "A2") che non è correlato al numero di gabbia o al trattamento.
NOTA: Tutta la randomizzazione deve essere condotta utilizzando un generatore di numeri casuali (ad esempio, Random.org). Durante questa fase di randomizzazione, controbilanciare il trattamento, lo sforzo, ecc., Ove applicabile. Fatelo fare da un assistente di ricerca che rimarrà "non cieco" al trattamento durante gli esperimenti. Questo individuo non deve raccogliere dati durante i test, per evitare valutazioni distorte. - Durante tutta la raccolta dei dati, fornisci al ricercatore "cieco" che ha la latenza di punteggio live e video per scavare e scavare la durata solo con il codice cieco dell'animale per mantenere il ricercatore cieco al trattamento.
NOTA: i fogli di calcolo utilizzati durante la raccolta dei dati includeranno solo il codice cieco dell'animale e la latenza corrispondente per scavare e scavare la durata per ogni prova. Alla fine degli esperimenti, l'ID animale corrispondente e le informazioni sul trattamento possono essere aggiunte al foglio di calcolo, "svelando" così i ricercatori per l'analisi dei dati.
- Pseudocasualmente assegna le gabbie ai gruppi di stimolo discriminativo positivo alla menta o alla vaniglia (DS+) come segue.
- Preparazione del materiale.
- Ricompense alimentari di alto valore: rompere a mano le patatine di banana zuccherate essiccate in pezzi di circa 0,5 cm x 0,5 cm.
- Ricompense alimentari di basso valore: usando un tagliere e un coltello, taglia il chow dei roditori (dalla dieta regolare degli animali) in circa 0,125 cme 3 pezzi.
NOTA: i test pilota per identificare i premi di alto e basso valore devono essere condotti prima di iniziare l'attività. - Essenze di menta e vaniglia: utilizzando una siringa o una micropipetta da 1 mL, aggiungere l'estratto di menta e vaniglia in tubi di centrifuga etichettati. Diluire gli estratti 1:4 con acqua distillata e mescolare invertendo più volte. Prepararli quotidianamente e capovolgerli ripetutamente prima dell'uso per garantire che le miscele siano fresche e coerenti.
- Miscela di odori ambigui: dopo che le essenze di menta e vaniglia sono state diluite, aggiungere volumi uguali a un tubo di centrifuga (creando una miscela 1:1 delle essenze diluite). Esegui questi il giorno del test delle risposte alla miscela di odori ambigui e inverti ripetutamente prima dell'uso per garantire che la miscela sia fresca e coerente.
NOTA: i test pilota per identificare diluizioni appropriate e miscele di odori intermedi sono fortemente incoraggiati per garantire l'utilità di sonde ambigue, poiché l'intensità può variare tra produttori, lotti, ecc. Se vengono offerti più segnali ambigui, assegnare casualmente i topi ai segnali di test quasi positivi, intermedi, quasi negativi. Vedi Discussione per ulteriori dettagli. - Tamponi di cotone: tagliare ogni batuffolo di cotone circolare in sei pezzi uguali (consentendo loro di adattarsi alle cassette di tessuto utilizzate come distributori di profumo).
NOTA: il numero di ricompense alimentari di alto e basso valore, tamponi di cotone e volumi di miscele di odori dipenderà dal numero di soggetti sottoposti a test. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 per il numero di prove per soggetto in ciascuna fase e alla Tabella 2 per i materiali richiesti in ciascun tipo di prova. - Identificare l'area sperimentale: condurre corsi di formazione e test su un banco nella stanza della colonia o altrove. Condurre tutte le prove sotto luce rossa durante la fase buia quando i topi sono attivi.
- Pre-allenamento (1 settimana prima degli esperimenti) per scavare nella gabbia domestica.
- Per ogni gabbia da testare, versare una piccola quantità di lettiera di pannocchia di mais in due vasi da scavo (quanto basta per coprire il fondo della pentola) per aiutare i dolcetti a rimanere al centro della pentola quando vengono sepolti.
- In una pentola, posiziona pezzi di ricompensa di alto valore sopra lo strato di pannocchia di mais in modo che ogni topo nella gabbia possa avere un pezzo (ad esempio, tre pezzi di patatine di banana per una gabbia di tre topi). Nell'altra pentola, posiziona pezzi di ricompensa di basso valore sopra lo strato di pannocchia di mais in modo che ogni topo nella gabbia possa avere un pezzo (ad esempio, tre pezzi di chow per una gabbia di tre topi).
- Versare lentamente la biancheria da letto di pannocchia sopra le prelibatezze in ogni pentola, coprendole e riempiendo le pentole ad un'altezza di 3 cm.
- Posiziona contemporaneamente un vaso di alto valore e uno di basso valore in ogni gabbia per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere i vasi da tutte le gabbie.
- Scartare qualsiasi pannocchia di mais e dolcetti rimanenti nella pentola. Pulire accuratamente tutte le pentole con etanolo al 70% per evitare che gli odori degli animali e delle gabbie influenzino le prove future.
- Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.5 una volta al giorno per 5 giorni consecutivi.
NOTA: L'obiettivo di questa fase è quello di consentire a tutti i compagni di gabbia l'opportunità di scavare e mangiare un trattamento prima dell'inizio dell'allenamento formale. Questo facilita anche l'assuefazione alle ricompense alimentari.
- Arena allestita per allenamenti e test.
- Posiziona l'arena su un banco da lavoro sotto la luce rossa. Pulire accuratamente tutti i componenti dell'arena, i vasi di scavo e i distributori di profumi con etanolo al 70% per rimuovere la polvere e gli odori delle prove precedenti.
- Preparare i vasi da scavo come segue.
- Metti le ricompense alimentari appropriate nel "compartimento inaccessibile" (vedi Figura 1).
NOTA: le ricompense incluse in questo compartimento dipendono da quali prelibatezze (se presenti) sono sepolte in una determinata prova (vedere Tabella 2). Pertanto, ogni pentola conterrà sempre un pezzo di chip di banana e un pezzo di chow attraverso i due scomparti.- Vasi per odori DS+: durante le prove rinforzate, posizionare un pezzo di chow nel compartimento inaccessibile e seppellire un pezzo di chip di banana nell'area accessibile del vaso.
- DS- odor pots: durante le prove rinforzate, posizionare un pezzo di chow e un pezzo di banana chip nel compartimento inaccessibile. Nessun premio alimentare sarà disponibile nell'area accessibile del piatto.
- Vasi non profumati: durante le prove rinforzate, posizionare un pezzo di chip di banana nel compartimento inaccessibile e seppellire un pezzo di chow nell'area accessibile del vaso.
- Durante tutte le prove di prova non rinforzate (positive, negative e ambigue), posizionare un pezzo di chow e un pezzo di chip di banana nel compartimento inaccessibile. Nessun premio alimentare sarà disponibile nell'area accessibile del piatto.
NOTA: Questo passaggio è quello di evitare che il profumo delle prelibatezze sepolte riveli quale vaso viene premiato. Come tale, la barriera tra i due scomparti è perforata per facilitare la trasmissione degli odori.
- Versare una piccola quantità di biancheria da letto di pannocchia di mais in ogni pentola per mantenere le ricompense alimentari centrate quando vengono sepolte. Metti un pezzo della ricompensa alimentare appropriata (vedi Tabella 2) sopra lo strato di pannocchia di mais e versa lentamente la biancheria da letto di pannocchia sopra le prelibatezze, coprendole e riempiendo le pentole fino a un'altezza di 3 cm.
- Utilizzando una siringa da 1 mL o una micropipetta, prelevare 0,1 mL della miscela di odori appropriata (cioè menta, vaniglia o miscele ambigue) o acqua distillata (vedere Tabella 2) e iniettarla direttamente sulla pannocchia di mais con un movimento circolare.
- Preparare dispenser di profumo.
- Posizionare un pezzo di batuffolo di cotone nella base della cassetta di tessuto. Utilizzando una siringa o una micropipetta da 1 mL, prelevare 0,1 mL della miscela di odori appropriata (ad esempio, menta, vaniglia o miscele ambigue) o acqua distillata (vedere Tabella 2) e iniettarla sul pezzo di cotone. Coprire la cassetta di tessuto con il coperchio per racchiudere il cotone profumato creando un distributore di profumo.
- Posiziona i vasi da scavo alle estremità delle braccia e i distributori di profumo all'inizio di ogni braccio. Inserire la "porta" rimovibile immediatamente prima degli slot della cassetta per bloccare l'ingresso ai bracci dell'arena e creare il compartimento di partenza (vedere la Figura 1).
NOTA: pentole da scavo, distributori di profumi e siringhe devono essere chiaramente etichettati e utilizzati solo per un profumo durante gli esperimenti per evitare la miscelazione involontaria di segnali di odore (ad esempio, utilizzare un diverso set di materiali per menta, vaniglia, miscele non profumate e ambigue in tutto).
2. Allenamento di scavo: 5 giorni, due prove positive al giorno (Tabella 2)
- Topi veloci per 1 ora prima di allenarsi nella loro gabbia domestica rimuovendo il cibo dalla tramoggia.
- Prepara l'arena per una prova positiva rinforzata seguendo le istruzioni di configurazione dell'arena sopra (passaggio 1.4).
- Il giorno 1 dell'allenamento di scavo, posiziona le ricompense alimentari sopra la biancheria da letto di pannocchia di mais di 3 cm invece di seppellirle.
- Seppellire progressivamente le ricompense più in profondità sotto la pannocchia di mais nei successivi 4 giorni, fino a quando non si trovano nella parte inferiore della lettiera di 3 cm entro il giorno 5 (cioè, Giorno 1: sopra la pannocchia di mais, Giorno 2: sepolto da uno strato molto sottile di pannocchia di mais, Giorno 3: sepolto a metà strada verso il fondo del vaso, Giorno 4: sepolto tre quarti della strada verso il fondo della pentola, e giorno 5: sepolto sul fondo della pentola).
- Sposta i topi dalla loro gabbia di casa a una gabbia di trasporto vuota. Posiziona una scheda di spunto con il codice cieco dell'animale sopra la gabbia di trasporto in modo che il ricercatore che conduce esperimenti rimanga cieco all'ID e al trattamento degli animali. Porta i topi nell'area sperimentale.
NOTA: i passaggi 2.1 e 2.5 devono essere completati da un assistente di ricerca che abbia familiarità con i topi. Le fasi successive durante le prove saranno condotte da un ricercatore cieco all'ID animale (e al trattamento, se applicabile). Maneggiare sempre i topi utilizzando la manipolazione della tazza (a mano aperta) o la gestione del tunnel (con un bicchiere di carta o un tunnel di plastica) per evitare gli effetti avversi della tradizionale manipolazione della coda21. - Sposta i topi dalla gabbia di trasporto al compartimento di partenza dell'arena. Rimuovere la "porta" di avvio, abbassare immediatamente il coperchio in plexiglass sull'arena e avviare il timer di prova di 5 minuti.
NOTA: se vengono testati più topi della stessa gabbia, questo dovrebbe essere fatto contemporaneamente. Tuttavia, il numero di animali sottoposti a test contemporaneamente dipenderà dal numero di osservatori ciechi disponibili; idealmente, un ricercatore osserverà e gestirà un animale alla volta, ma un individuo può osservare e gestire due animali contemporaneamente, se necessario. - Latenza del punteggio in tempo reale per scavare e latenza per mangiare la ricompensa in entrambe le braccia.
- Registra la latenza da scavare come il momento in cui viene osservata la prima occorrenza di scavo. Lo scavo è descritto come un topo che spinge attivamente o manipola la lettiera di pannocchia con le zampe anteriori e / o il muso.
- Registra la latenza da mangiare come il momento in cui si osserva la prima occorrenza di mangiare. Mangiare è descritto come un topo che consuma una ricompensa mentre lo tiene nelle zampe anteriori e si siede sulle cosce.
- Al termine della prova, sollevare il coperchio in plexiglass e riportare il mouse nella sua gabbia di trasporto.
- Scartare tutte le lenzuola di pannocchia e le prelibatezze lasciate nei vasi. Aprire cassette di tessuto e scartare pezzi di cotone. Pulire tutti i componenti dell'arena e le pentole da scavo e profumare accuratamente i dispenser con il 70% di etanolo.
- Prepara l'arena per una seconda prova positiva (passaggio 1.4). Ripetere i passaggi 2.6-2.9 per uno studio positivo rinforzato.
- Restituire la gabbia di trasporto all'assistente di ricerca in modo che i topi possano essere ricollocati nella loro gabbia di casa.
- Ripetere i passaggi 2.1-2.11 per 5 giorni consecutivi.
3. Formazione sulla discriminazione: 10 giorni, quattro prove al giorno
- Impostare l'arena per una prova positiva o negativa (vedere Tabella 2) seguendo le istruzioni al punto 1.4.
- Condurre due studi positivi e due negativi al giorno seguendo l'ordine delineato nella Tabella 2 (cioè, alternando studi positivi e negativi nei giorni 1-5 e ordine pseudocasuale nei giorni 6-10).
- Seguire le istruzioni nel passaggio 2.1 all'inizio di ogni giornata di allenamento, quindi seguire i passaggi da 2.5 a 2.10. Ripetere fino a quando i topi hanno subito quattro prove in totale.
- Restituire la gabbia di trasporto all'assistente di ricerca in modo che i topi possano essere ricollocati nella loro gabbia di casa.
- Ripeti i passaggi 3.1-3.4 una volta al giorno per 10 giorni in totale (cioè due settimane lavorative consecutive di 5 giorni, separate da un fine settimana di 2 giorni).
4. Test
NOTA: la durata del test è di 3-5 giorni (a seconda del tempo impiegato da ciascun topo per soddisfare i criteri di apprendimento), cinque prove al giorno per le sessioni in cui vengono condotti studi positivi e negativi e tre prove al giorno quando viene condotto il test ambiguo.
- Topi veloci per 1 ora prima dell'allenamento / test nella loro gabbia di casa rimuovendo il cibo dalla tramoggia.
- Eseguire uno studio positivo e uno studio negativo in ordine randomizzato (vedere Tabella 1) seguendo le istruzioni di configurazione dell'arena nel passaggio 1.4 e le istruzioni di prova rinforzate nei passaggi 2.5-2.10.
- Eseguire una prova di prova non rinforzata videoregistrata.
NOTA: le prove non rinforzate sono identiche alle prove rinforzate, ad eccezione del luogo in cui sono collocate le ricompense. Pertanto, nella prova non rinforzata, un pezzo di ogni ricompensa di alto e basso valore viene collocato nel compartimento inaccessibile sia per i vasi profumati che per quelli non profumati.- Condurre uno studio di test positivo o negativo per ogni topo al giorno fino a quando i criteri di apprendimento non sono soddisfatti (massimo 4 giorni; i criteri di apprendimento sono descritti nel passaggio 4.7.3). Assicurarsi che le prove positive e negative siano condotte in ordine alternato tra giorni (ad esempio, Giorno 1: test positivo, Giorno 2: test negativo, Giorno 3: test positivo, ecc.).
- Seguire le istruzioni di configurazione dell'arena nel passaggio 1.4.
- Sposta i topi dalla gabbia di trasporto al compartimento di partenza dell'arena. Installa una videocamera su un treppiede in modo che entrambi i vasi alle estremità delle braccia siano in vista e inizia a registrare. Assicurarsi che la scheda di cue con il codice cieco dell'animale e il tipo di prova (test positivo o test negativo) sia registrato nel video (per riferimento durante il punteggio video).
- Rimuovere la "porta" di avvio, abbassare immediatamente il coperchio in plexiglass sopra l'arena e avviare il timer di prova di 2 minuti.
- Al termine della prova, interrompere la registrazione, spostare la telecamera di lato, sollevare il coperchio in plexiglass, riportare il mouse nella gabbia di trasporto.
- Scartare tutte le lenzuola di pannocchia e le prelibatezze lasciate nei vasi. Aprire cassette di tessuto e scartare pezzi di cotone. Pulire accuratamente tutti i componenti dell'arena, i vasi da scavo e i distributori di profumi con etanolo al 70%.
- Eseguire uno studio positivo e uno studio negativo in ordine randomizzato (vedere Tabella 1) seguendo le istruzioni di configurazione dell'arena nel passaggio 1.4 e le istruzioni di prova rinforzate nei passaggi 2.5-2.10.
- Restituire la gabbia di trasporto all'assistente di ricerca in modo che i topi possano essere ricollocati nella loro gabbia di casa.
- Una volta che tutti i mouse hanno completato le loro cinque prove giornaliere, trasferisci i video dalla scheda di memoria della fotocamera a un computer per il punteggio video.
- Segna video di prova positivi e negativi il giorno del test per valutare se i topi hanno soddisfatto i criteri di apprendimento. Assicurati il punteggio video dello stesso giorno poiché gli animali che soddisfano i criteri di apprendimento saranno sottoposti a test ambigui il giorno seguente.
- Utilizzando un software di registrazione degli eventi o un cronometro, chiedi al ricercatore che è cieco al trattamento di registrare la latenza di ciascun topo per scavare e scavare la durata in ogni pentola durante il primo minuto di prove positive e negative.
- Registra la latenza da scavare come il momento in cui viene osservata la prima occorrenza di scavo. Lo scavo è descritto come un topo che spinge attivamente o manipola la lettiera di pannocchia con le zampe anteriori e / o il muso. Registrare la durata dello scavo come il tempo totale che un mouse trascorre a scavare.
- Confronta la durata dello scavo nel braccio profumato tra studi positivi (DS +) e negativi (DS-) per ciascun topo per determinare se gli animali possono discriminare il compito. Considerare il criterio di apprendimento da soddisfare se la durata dello scavo nel braccio profumato DS+ è almeno il doppio di quella del braccio profumato DS durante il primo minuto di test (con una durata minima di scavo DS+ di 3 s).
- Ripeti i passaggi 4.1-4.7 al giorno fino a quando i topi non hanno soddisfatto il criterio di apprendimento.
- Escludere gli individui che non hanno soddisfatto il criterio entro il giorno 4 da processi ambigui (e quindi, valutazione del pregiudizio del giudizio).
- Per i topi che hanno soddisfatto i criteri di apprendimento, testare le risposte alla miscela di odori ambigui.
- Topi veloci per 1 ora prima dell'allenamento / test nella loro gabbia di casa rimuovendo il cibo dalla tramoggia.
- Eseguire uno studio rinforzato positivo e uno negativo in ordine randomizzato seguendo le istruzioni di configurazione dell'arena nei passaggi 1.4 e le istruzioni di prova rinforzate nei passaggi 2.5-2.10.
- Eseguire una prova videoregistrata non rinforzata come descritto nel passaggio 4.3 utilizzando la miscela di odori ambigui (vedere Tabella 2).
- Segna video di prova ambigui per valutare i pregiudizi del giudizio.
- Utilizzando un software di registrazione degli eventi o un cronometro, chiedi a un ricercatore cieco all'ID animale e al trattamento di registrare la latenza di ciascun topo per scavare (vedi passo 4.7.2) in ogni pentola durante i primi 1 minuto e 2 minuti di prove di prova.
5. Analisi dei dati
NOTA: le analisi esatte richieste dipenderanno dai dettagli del progetto sperimentale. Una panoramica generale è delineata qui, ma i ricercatori sono fortemente incoraggiati a fare riferimento a Gygax22 quando si pianificano analisi per esperimenti JB su animali e a Gaskill e Garner23 quando si seleziona la dimensione del campione (poiché le analisi richieste sono spesso troppo complesse per le analisi di potenza a priori ).
- "Unblind" il ricercatore aggiungendo l'ID animale corrispondente e le informazioni sul trattamento (ad esempio, alloggiamento arricchito o convenzionale; farmaco o placebo ecc.) per ogni codice cieco al foglio di calcolo. Assicurati che il foglio di calcolo risultante includa tre righe per ogni animale che ha soddisfatto i criteri di apprendimento (ad esempio, per gli studi di test positivi, negativi e ambigui) che indicano latenze da scavare nel braccio profumato.
- Eseguire un modello misto lineare generalizzato a misure ripetute, utilizzando il software statistico preferito. Qui, la variabile di risultato sarà la latenza da scavare. Assicurarsi che il modello includa il trattamento (o la variabile continua di interesse), il tipo di prova e l'interazione trattamento x tipo di prova come effetti fissi. Includi l'ID del mouse (nidificato all'interno del trattamento) come effetto casuale. I termini aggiuntivi inclusi nel modello dipenderanno dal progetto sperimentale applicato.
NOTA: se i topi sono alloggiati in gruppo (come è appropriato per questa specie sociale24) e i compagni di gabbia vengono testati, allora la gabbia nidificata durante il trattamento (se presente) deve essere inclusa nel modello come effetto casuale (e l'ID del topo deve essere successivamente nidificato all'interno della gabbia). - Tracciare i mezzi di latenza al minimo quadrato in ciascun tipo di prova per confermare che il segnale ambiguo presentato è stato interpretato come intermedio (ad esempio, la latenza al minimo quadrato significa che la stima per lo studio ambiguo dovrebbe cadere a un punto intermedio tra le latenze positive e negative). Valutare JB del mouse solo se questo requisito è soddisfatto.
- Valutare il semplice effetto del trattamento (o la variabile continua di interesse) sulla latenza per scavare nello studio ambiguo studiando l'interazione Trattamento x Tipo di prova per determinare se i topi mostrano JB modulato dall'effetto.
Figura 1: Schema dell'apparato sperimentale. L'apparato JB comprende un'arena rettangolare con due bracci. Ogni braccio contiene un distributore di profumo situato all'inizio e una pentola di scavo posta alla fine. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fase: | Progettazione Sperimentale | |
| Tutto | Ricompensa di alto valore | Chip di banana |
| Ricompensa di basso valore | Chow di roditore | |
| DS+ | Menta o Vaniglia (controbilanciato) | |
| DS- | Menta o Vaniglia (controbilanciato) | |
| Formazione di scavo | Programma di allenamento di scavo | 5 giorni: 2 prove Pos/giorno |
| Durata della prova di scavo | 5 minuti | |
| Formazione sulla discriminazione | Programma di formazione sulla discriminazione | 10 giorni: 4 prove al giorno |
| Ordine di prova di scavo | Giorni 1-5: 4 prove al giorno | |
| Prova 1: Pos | ||
| Prova 2: Neg | ||
| Prova 3: Pos | ||
| Prova 4: Neg | ||
| Giorni 6-10: 4 prove al giorno* | ||
| Durata del processo sulla discriminazione | 5 minuti | |
| Collaudo | Programma di test | 3-5 giorni (a seconda del tempo per soddisfare i criteri di apprendimento) |
| 5 prove/giorno | ||
| Ordine della fase di test | Prove 1 e 2: Pos o Neg** | |
| Prova 3: prova di prova | ||
| Prove 4 e 5: Pos o Neg** | ||
| Durata della prova del test | 2 minuti | |
| * Le prove sono state pseudocasualizzate, quindi i topi hanno sempre avuto due Prove Pos e due Neg al giorno | ||
| ** Le prove sono state pseudocasualizzate, quindi i topi hanno sempre avuto un Pos e uno studio Neg prima e dopo il test trial | ||
Tabella 1: Riepilogo della progettazione sperimentale e programma per la formazione e le prove. Numero e ordine di prove al giorno per le fasi di addestramento allo scavo, formazione sulla discriminazione e test, oltre ai dettagli di progettazione sperimentale. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier.
| Dettagli della versione di prova | |||||||
| Fase | Tipo di prova | Braccio profumato | Braccio non profumato | ||||
| Odore Cue | Ricompensa sepolta | Ricompensa inaccessibile | Odore Cue | Ricompensa sepolta | Ricompensa inaccessibile | ||
| Formazione su scavi e discriminazioni | Formazione Pos | DS+ | Banana | Pappa | Acqua | Pappa | Banana |
| Formazione Neg | DS- | Nessuna ricompensa | Banana + chow | Acqua | Pappa | Banana | |
| Collaudo | Pos Test | DS+ | Nessuna ricompensa | Banana + chow | Acqua | Nessuna ricompensa | Banana + chow |
| Neg Test | DS- | Nessuna ricompensa | Banana + chow | Acqua | Nessuna ricompensa | Banana + chow | |
| Test ambiguo | Menta/ miscela di vaniglia |
Nessuna ricompensa | Banana + chow | Acqua | Nessuna ricompensa | Banana + chow | |
| Criterio di apprendimento | I topi devono scavare il doppio del tempo nel vaso DS + (test Pos) rispetto al DS-pot (test Neg) e scavare per un minimo di 3 s | ||||||
Tabella 2. Riepilogo dei dettagli della prova. Segnali di odore e ricompense presentati in ogni tipo di prova durante le fasi di addestramento allo scavo, formazione sulla discriminazione e test. DS(+): stimolo discriminatorio positivo, DS(-): stimolo discriminatorio negativo, Pos: positivo, Neg: negativo. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier. Vedere la tabella supplementare S2 nell'articolo originale per la tabella espansa.
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Representative Results
I risultati qui presentati riflettono i risultati rilevanti dell'esperimento 1 di Resasco et al.19. I soggetti in questo esperimento erano 18 femmine C57BL/6NCrl ('C57') e 18 topi Balb/cAnNCrl ('Balb'). Gli animali sono arrivati alla struttura a 3-4 settimane di età e sono stati assegnati in modo casuale a trattamenti abitativi arricchiti per l'ambiente o convenzionali (EH o CH, rispettivamente) in quartetti di ceppi misti25. Ogni gabbia conteneva un C57 e un Balb, oltre a due topi DBA/2NCrl utilizzati in un altro esperimento. Qui, l'uso di topi femmina ha permesso l'alloggio di gruppo di questa specie sociale con arricchimento ambientale, evitando l'elevata aggressività e la protezione delle risorse che possono verificarsi nei topi maschi26 (anche se si noti che il compito è stato applicato anche in topi nudi maschi non arricchiti19). I topi CH sono stati tenuti in gabbie di polietilene trasparente a cielo aperto (27L x 16W x 12H cm; n = 9) con lettiera di pannocchia di mais, due tipi di materiale di nidificazione (strisce di carta increspate e nidiacei di cotone; Figura 2A), e un bicchiere di carta "rifugio". Le gabbie EH erano in plastica opaca, misuravano 60L x 60W x 30H cm3 con una finestra in plexiglass rosso per le osservazioni (n = 9; Figura 2B,C). Queste condizioni sono note per migliorare il benessere: contengono diversi arricchimenti (come descritto in precedenza da Nip et al.27) che i topi sono motivati ad accedere a28 e che riducono i comportamenti indicativi di scarso benessere (ad esempio, comportamento stereotipato, aggressività e inattività simile alla depressione 27,28,29 ). Ogni gabbia EH includeva anche una gabbia "annessa" (identica alle gabbie CH ma contenente solo lettiera), a cui i topi potevano accedere liberamente tramite un tunnel (Figura 2C). Le gabbie annesse consentivano di catturare e maneggiare i topi EH addestrati a entrare in questo allegato per ricompense alimentari quando una tazza piena di cereali d'avena dolce veniva scossa. Una volta che un topo entrava nella gabbia dell'annesso, il tunnel di accesso poteva essere bloccato e i topi potevano essere facilmente rimossi dalle gabbie usando la gestione della tazza o del tunnel21. Questo approccio ha quindi evitato stressanti "inseguimenti" attraverso complessi ambienti arricchiti30. Cibo e acqua erano disponibili ad libitum e la stanza della colonia è stata mantenuta a 21 ± 1 ° C e 35% -55% di umidità relativa, su un ciclo di luce inverso di 12:12 h (luci spente alle 06:00 e accese alle 18:00). I topi sono stati alloggiati in modo differenziale per 5 settimane prima dell'inizio dell'addestramento di scavo nell'apparato (vedi cronologia nella Figura 2D).
I topi sono stati sottoposti a formazione e test nel compito JB come delineato nel protocollo sopra. La latenza per scavare nel braccio profumato durante il primo e completo 2 minuti di prove di test positive, negative e ambigue è stata utilizzata per testare gli effetti abitativi su JB. Qui, i dati sono stati analizzati utilizzando modelli misti lineari generalizzati, applicando trasformazioni ove necessario per soddisfare le ipotesi di normalità e omogeneità. Vedi Resasco et al.19 per una descrizione dettagliata delle analisi (ad esempio, selezione del modello). In breve, i modelli di misure ripetute includevano sempre Trial Type, Housing, Strain, Trial Type x Housing, DS+ Odor, Trial Type x Strain, Trial Type x DS+ Odor, Trial Type x Housing x DS+ Odor, Cage (un effetto casuale nidificato in Housing e DS+ Odor) e Mouse ID (un effetto casuale annidato in Cage, Housing, DS+ Odor and Strain). I semplici effetti dell'alloggiamento sulla latenza sono stati determinati dal tipo di prova x alloggiamento nel calcolo dei minimi quadrati significa31. Nota, i valori p a due code sono riportati in tutto per dimostrare l'indagine sugli effetti del trattamento, ma il lavoro di convalida originale di Resasco et al.19 ha utilizzato valori p a una coda dove appropriato32 poiché era necessaria una risposta specifica per convalidare l'attività (vedi Resasco et al.19 per la discussione sulla convalida).
Prima che il pregiudizio di giudizio possa essere valutato in qualsiasi compito animale, è fondamentale che siano soddisfatti due criteri tecnici: in primo luogo, gli animali devono discriminare con successo tra segnali positivi e negativi (cioè, soddisfare i criteri di apprendimento). Per gli animali che soddisfano questo criterio, deve quindi essere dimostrato che il segnale ambiguo è interpretato come intermedio. Se uno di questi non è soddisfatto, non è possibile dedurre il pregiudizio del giudizio e i corrispondenti stati affettivi. In questo esperimento, tutti tranne quattro topi C57 hanno soddisfatto i criteri di apprendimento e un C57 è stato rimosso prima di testare il barbiere di un compagno di gabbia (n = 31). Sia nel primo che nei 2 minuti completi di test, Trial Type x DS+ Odor è stato significativo (1 min: F2,62 = 5,67 , p = 0,006; 2 min: F2,62 = 5,74 , p = 0,005), rivelando che i topi Mint DS+ hanno inaspettatamente interpretato le miscele di odori ambigui come positive (come se fossero al 100% menta), mentre i topi Vanilla DS+ hanno trattato le stesse miscele di odori ambigui come intermedie (Figura 3A, B). Questo risultato ha indicato che solo i topi Vanilla DS+ soddisfacevano il requisito tecnico di trattare la miscela di profumi come intermedio tra DS+ e DS-, e quindi i topi Mint DS+ sono stati esclusi dalle successive analisi JB.
Per i topi Vanilla DS+, i semplici effetti dell'alloggiamento sono stati calcolati dal trial type x housing term31. All'interno di questo gruppo, Housing ha influenzato le latenze di scavo con animali CH che sono più lenti di EH a scavare in studi ambigui, ma non in studi positivi o negativi. Questo era vero dopo 1 min (ambiguo: t = 2.27, d.f. = 92.94, p = 0.014, d di Cohen = 1.148; positivo: t = 0.22, d.f. = 92.94, p = 0.414, d di Cohen = 0.110; negativo: t = 0.80, d.f. = 92.94, p = 0.214, d di Cohen = 0.404; vedi Figura 4A) e dopo il 2 min completo (ambiguo: t = 2.14, d.f. = 91.89, p = 0.018, d di Cohen = 1.083; positivo: t = 0,39, d.f. = 91,89, p = 0,348, d di Cohen = 0,198; negativo: t = 0,61, d.f. = 91,89, p = 0,273, d di Cohen = 0,308; vedi Figura 4B), anche se Trial Type x Housing x DS+ Odor (1 min: F3,65.37 = 0.36, p = 0.7835; 2 min: F3,65.37 = 0.49, p = 0.688) e Trial Type x Housing (1 min: F2,62 = 1.66, p = 0.198; 2 min: F2,62 = 1.41, p = 0,252) non ha tenuto conto di variazioni significative. Queste interpretazioni pessimistiche di segnali ambigui da parte dei topi CH riflettono pregiudizi di giudizio negativi indicativi di effetti negativi.
Figura 2: Trattamenti di alloggiamento e tempistica degli esperimenti. (A) Gabbia di laboratorio CH. (B) Vista dall'alto di EH. (C) Vista frontale di EH con annessa gabbia "annessa" per facilitare la cattura/manipolazione del topo. (D) Cronologia sperimentale e riepilogo delle prove di formazione e test positive, negative e ambigue. DS(+): stimolo discriminatorio positivo, DS(-): stimolo discriminatorio negativo, AMB: miscela ambigua (50% vaniglia-50% menta), B: banana chip, C: dieta dei roditori ('chow'), X: nessuna ricompensa alimentare. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Determinare se i topi soddisfano i requisiti per la valutazione JB. Scavare la latenza al minimo quadrato significa (±errore standard) durante le prove di test positive, negative e ambigue. (A) 1 min di latenza di scavo nei topi che ricevono menta (M, n = 15) o vaniglia (V, n = 16) come stimolo discriminatorio positivo (DS+) (dati Box Cox trasformato). (B) 2 min di latenza di scavo negli stessi soggetti (dati logaritmicamente trasformati). Durante entrambi i periodi di tempo, i mouse Vanilla DS+ hanno soddisfatto il requisito tecnico di interpretare segnali ambigui come intermedi. I topi Mint DS+ non sono riusciti a farlo (interpretando invece il segnale ambiguo come positivo) e sono stati conseguentemente eliminati dalle successive analisi JB. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Impatto del trattamento abitativo sulla JB modulata dagli affetti. Scavare la latenza al minimo quadrato significa (±errore standard) durante le prove di test positive, negative e ambigue. (A) 1 min di latenza di scavo nei topi Vanilla DS+ da alloggiamento convenzionale (CH, n = 7) o arricchito (EH, n = 9) (dati Box Cox trasformato). (B) 2 min di latenza di scavo negli stessi soggetti (dati logaritmicamente trasformati). Durante entrambi i periodi di tempo, gli animali CH hanno dimostrato latenze significativamente più lunghe da scavare durante studi ambigui rispetto ai conspecifici EH, indicando JB negativo. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo di scavo basato sul profumo e i risultati qui delineati dimostrano la capacità di questo nuovo compito JB di rilevare i cambiamenti nello stato affettivo del topo. Il compito rappresenta quindi uno strumento prezioso per diversi campi di ricerca. Analogamente a qualsiasi compito JB, per valutare l'influenza animale è fondamentale che gli animali imparino prima a discriminare tra i segnali (passo 4.7.3) e che lo stimolo ambiguo sia interpretato come intermedio (passo 5.3). Sebbene semplice, soddisfare questi requisiti può essere impegnativo, in particolare nei topi di laboratorio per i quali oltre 15 tentativi passati di sviluppare e implementare un'attività JB del mouse sono falliti19. Qui, più componenti hanno svolto un ruolo essenziale nel soddisfare questi criteri tecnici e hanno contribuito al successo e all'utilità del compito.
In primo luogo, il design etologico del compito ha promosso un apprendimento di discriminazione di successo poiché sia i segnali discriminatori che le risposte richieste erano biologicamente rilevanti: i topi hanno impressionanti capacità olfattive, rendendoli capaci di un rapido apprendimento e di notevoli intervalli di memoria quando presentati con stimoliodorivi 33, e sono naturalmente spinti a eseguire scavi per l'esplorazione generale, il foraggiamento e la costruzione di tane24, 34. Inoltre, il controbilanciamento degli odori DS+ ha rivelato differenze nei modi in cui i topi Vanilla DS+ e Mint DS+ hanno interpretato la miscela ambigua, confermando che il segnale ambiguo è stato interpretato come intermedio per i topi Vanilla DS+, ma non per i topi Mint DS+. Si raccomanda pertanto di utilizzare solo Vanilla come DS+ per qualsiasi lavoro futuro che utilizzi le marche di estratti e i ceppi di topo utilizzati qui. È importante sottolineare che, sebbene il controbilanciamento abbia prodotto risultati positivi nel presente esperimento, esortiamo i ricercatori a condurre test pilota per identificare miscele ambigue appropriate se si implementano modifiche, poiché il controbilanciamento può talvolta aggiungere un rumore considerevole ai dati, aumentando il rischio di mascherare gli effetti del trattamento35.
Anche quando questi criteri essenziali sono soddisfatti, JB non è sempre facile da rilevare, forse a causa delle piccole dimensioni dell'effetto del trattamento che questi esperimenti comunemente producono15. Pertanto, per garantire la sensibilità delle attività, viene utilizzato un design Go/Go unico poiché questo approccio ha dimostrato di essere più sensibile ai cambiamenti nell'affetto animale rispetto ai progetti Go/No-Go in altre specie15. Tuttavia, l'uso di un braccio non profumato contenente una ricompensa di basso valore in tutte le prove differenzia questo compito dai precedenti tentativi falliti di convalidare un'attività Go/Go JB per topi 36,37,38. Qui, durante le prove positive, i topi scelgono tra una ricompensa di alto valore nel braccio DS + e una ricompensa di basso valore nel braccio non profumato; e nelle prove negative, scelgono tra nessuna ricompensa nel braccio DS e una ricompensa di basso valore nel braccio non profumato. Sebbene ciò richieda ai topi di apprendere un compito più complesso (ad esempio, discriminando tra i segnali che prevedono diversi valori di ricompensa, piuttosto che semplicemente premiare la presenza o l'assenza), sembra che avere un'opzione coerente, in cui una ricompensa di basso valore era sempre presente, potrebbe aver reso l'allenamento e il test meno stressanti per i topi e un apprendimento migliorato (con l'86% dei topi che soddisfano i criteri di apprendimento). Mentre i topi sono spesso considerati difficili da addestrare o incapaci di apprendere compiti difficili18, i risultati qui suggeriscono che le loro capacità non dovrebbero essere sottovalutate e che la progettazione di compiti etologici a basso stress può essere un approccio più efficace per rilevare i cambiamenti negli affetti rispetto ai compiti più semplici o a quelli con conseguenze più dure (ad esempio, coinvolgendo punizioni come sbuffi d'aria o luce bianca invece di premiare semplicemente l'assenza39, 40,41).
Infine, per ridurre ulteriormente i fattori di stress che potrebbero altrimenti interferire con gli effetti del trattamento e introdurre variabilità indesiderate, sono stati implementati metodi di manipolazione umani21. Qui, i topi sono stati maneggiati solo con metodi a tazza o tunnel per tutta la vita (comprese le gabbie di trasporto e l'apparato JB) per evitare gli effetti avversivi della tradizionale manipolazione della coda21. Oltre a questo, gli animali EH sono stati addestrati a entrare volontariamente in una gabbia annessa per la manipolazione, evitando così stressanti "inseguimenti" attraverso ambienti complessi. Insieme, questo approccio ha portato al rilevamento di pregiudizi di giudizio pessimistici nei topi CH attraverso latenze più lunghe in risposta a segnali ambigui. I futuri ricercatori dovrebbero allo stesso modo considerare se gli aspetti dei loro trattamenti di interesse, alloggio o pratiche di allevamento hanno il potenziale per mascherare gli effetti del trattamento o indurre effetti sul pavimento (cioè, dove tutti gli animali mostrano un marcato pessimismo, negando la capacità del compito di rilevare differenze di trattamento più sottili) in modo che queste possano essere prevenute o mitigate.
Sono ora necessarie ulteriori repliche e perfezionamenti di questo promettente compito. Ad oggi, questo compito JB è stato applicato solo agli animali che sperimentano un effetto negativo a lungo termine e a bassa eccitazione (a causa di alloggi restrittivi o malattie croniche19). È quindi importante che il lavoro futuro miri a testare la sensibilità di questo compito ai fattori di stress acuti e agli stati affettivi negativi ad alta eccitazione. Inoltre, massimizzare il valore di questo compito comporterebbe anche studi di replica che indagano l'affidabilità del test-retest degli individui allo stesso o a più sonde ambigue. Il nuovo test con le stesse sonde consentirebbe ai ricercatori di testare ipotesi riguardanti i cambiamenti negli affetti nel tempo, mentre l'esposizione dei soggetti a uno spettro di segnali ambigui (cioè quasi positivi, intermedi e quasi negativi) potrebbe potenzialmente consentire l'identificazione di diversi tipi di stati negativi (in particolare depressione rispetto a condizioni simili all'ansia)11,42 . Ulteriori esperimenti di convalida dovrebbero anche studiare il valore di protocolli più brevi, così come le potenziali differenze tra ceppi e sessi (anche se la pubblicazione originale affronta questi problemi, impiegando con successo un protocollo più breve per valutare l'effetto nei topi maschi19). In effetti, questo compito potrebbe potenzialmente essere esteso a tutti i roditori intrinsecamente motivati a fare tane43,44 a condizione che vengano apportate opportune modifiche alle dimensioni e che la convalida sia confermata. Tali repliche e perfezionamenti sono importanti poiché non sono stati sviluppati altri compiti JB validi per i topi fino ad oggi e poiché i compiti JB sono sensibili sia alla valenza che all'intensità degli stati affettivi (come delineato nell'introduzione), qualcosa che la maggior parte degli indicatori di affetto animale non riesce a fare (ad esempio, l'attività ipotalamo-ipofisaria-surrenale può essere alterata in risposta a esperienze sia positive che negative7, 45).
Nel complesso, lo sviluppo di un compito JB del mouse rappresenta un nuovo strumento promettente e apre la porta a grandi progressi nella valutazione dell'influenza del mouse. I topi sono i vertebrati più utilizzati sia nella ricerca di base che in quella traslazionale17, e questo compito fornisce un mezzo per rispondere a domande essenziali sul benessere di queste decine di milioni di animali utilizzati a livello globale, nonché sui legami tra l'affetto e le malattie o le condizioni che vengono utilizzati per modellare. Sebbene l'uso di questo compito non sia raccomandato per la valutazione quotidiana del benessere, l'indagine sperimentale sulle pratiche di alloggio e allevamento potrebbe aiutare a identificare i perfezionamenti che promuovono il benessere dei topi e aiutano a identificare segni più sottili di sofferenza animale che possono essere osservati in gabbia. Data la natura umana e potenzialmente arricchente di questo compito e il basso costo economico dell'implementazione del protocollo, questo nuovo compito JB ha una grande utilità.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati a Miguel Ayala, Lindsey Kitchenham, Dr. Michelle Edwards, Sylvia Lam e Stephanie Dejardin per i loro contributi al lavoro di convalida Reseasco et al.19 su cui si basa questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare i topi e i nostri meravigliosi tecnici di cura degli animali, Michaela Randall e Michelle Cieplak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Commercial alcohol | P016EAAN | Dilute to 70% with distilled water, for cleaning |
| Centrifuge tubes | Fischer | 55395 | 15 mL tubes used to dilute essences here. However, size may be selected based on total volume required for sample size |
| Cheerios (original) | Cheerios | N/A | Commercially available. Used as reward to train animals to enter annex cage for handling |
| Corncob bedding | Envigo | 7092 | Teklad 1/8 corncob bedding used in digging pots and animal cages |
| Cotton pads | Equate | N/A | Commercially available. Modified in lab to fit within tissue cassettes for scent dispensing |
| Digging pots | Rubbermaid | N/A | Commercially available. Containers were modified to fit the apparatus in the lab |
| Dried, sweetened banana chips | Stock and Barrel | N/A | Commercially available. High value reward in JB task |
| JB apparatus | N/A | The apparatus was made in the lab | |
| JWatcher event recording software | Animal Behavior Laboratory, Macquarie University | Version 1.0 | Freely available for download online. Used to score digging behavior during JB task |
| Mint extract | Fleibor | N/A | Commercially "Menta (Solución)". Discriminative stimulus odor |
| Rodent Diet | Envigo | 2914 | Teklad global 14% protein rodent maintenance diets. Low value reward in JB task and regular diet in home cage |
| SAS statistical software | SAS | Version 9.4 | Other comparable software programs (e.g. R) are also appropriate |
| Vanilla extract | Fleibor | Commercially available "Vainilla (Solución)". Discriminative stimulus odor | |
| Video camera | Sony | DCR-SX22 | Sony handycam. |
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