Summary
Här beskriver vi storskalig produktion av fett-härledda stroma / stamcell (ASC) sfäroider med hjälp av ett automatiserat pipetteringssystem för att så cellsuspensionen, vilket säkerställer homogenitet av sfäroid storlek och form. Dessa ASC-sfäroider kan användas som byggstenar för 3D-bioprintningsmetoder.
Abstract
Fett-härledda stroma/ stamceller (ASC) är en subpopulation av celler som finns i den stromala vaskulära fraktionen av human subkutan fettvävnad som erkänns som en klassisk källa till mesenkymal stromal / stamceller. Många studier har publicerats med ASC för ställningsbaserade vävnadstekniska metoder, som främst utforskade beteendet hos dessa celler efter deras sådd på bioaktiva byggnadsställningar. Ställningsfria metoder växer dock fram för att konstruera vävnader in vitro och in vivo, främst genom att använda sfäroider, för att övervinna begränsningarna i ställningsbaserade tillvägagångssätt.
Sfäroider är 3D-mikrotissuer som bildas av självmonteringsprocessen. De kan bättre efterlikna arkitekturen och mikromiljön hos inhemska vävnader, främst på grund av förstoring av cell-till-cell och cell-till-extracellulära matrisinteraktioner. Nyligen utforskas sfäroider främst som sjukdomsmodeller, läkemedelsscreeningsstudier och byggstenar för 3D-bioprintning. För 3D-bioprintningsmetoder är emellertid många sfäroider, homogena i storlek och form, nödvändiga för att biofabricera komplexa vävnads- och organmodeller. Dessutom, när sfäroider produceras automatiskt, finns det liten chans för mikrobiologisk förorening, vilket ökar metodens reproducerbarhet.
Den storskaliga produktionen av sfäroider anses vara det första obligatoriska steget för att utveckla en biofabriceringslinje, som fortsätter i 3D-bioprintningsprocessen och avslutas i full mognad av vävnadskonstruktionen i bioreaktorer. Antalet studier som undersökte den storskaliga ASC-sfäroidproduktionen är dock fortfarande knapphändigt, tillsammans med antalet studier som använde ASC-sfäroider som byggstenar för 3D-bioprintning. Därför syftar denna artikel till att visa storskalig produktion av ASC-sfäroider med hjälp av en icke-adhesiv mikroformad hydrogelteknik som sprider ASC-sfäroider som byggstenar för 3D-bioprintningsmetoder.
Introduction
Sfäroider anses vara ett ställningsfritt tillvägagångssätt inom vävnadsteknik. ASC kan bilda sfäroider genom självmonteringsprocessen. Sfäroidens 3D-mikroarkitektur ökar den regenerativa potentialen hos ASC, inklusive differentieringskapaciteten i flera linjer 1,2,3. Denna forskargrupp har arbetat med ASC-sfäroider för brosk- och benvävnadsteknik 4,5,6. Ännu viktigare är att sfäroider betraktas som byggstenar i biofabrikationen av vävnader och organ, främst på grund av deras fusionskapacitet.
Användningen av sfäroider för vävnadsbildning beror på tre huvudpunkter: (1) utvecklingen av standardiserade och skalbara robotmetoder för deras biofabricering7, (2) systematisk fenotypning av vävnadssfäroider8, (3) utveckling av metoder för montering av 3D-vävnader9. Dessa sfäroider kan bildas med olika celltyper och erhållas genom olika metoder, inklusive hängande droppe, reaggregering, mikrofluidik och mikromold 8,9,10. Var och en av dessa metoder har fördelar och nackdelar relaterade till sfäroidernas homogenitet och form, återvinning av sfäroiderna efter bildning, antalet producerade sfäroider, processautomatisering, arbetsintensitet och kostnader11.
I mikromoldmetoden dispenseras cellerna och deponeras i botten av mikromolden på grund av tyngdkraften. Den icke-adhesiva hydrogelen tillåter inte cellerna att fästa vid botten, och cell-till-cell-interaktioner leder till bildandet av en enda sfäroid per recession 8,12. Denna biofabriceringsmetod genererar sfäroider av homogen och kontrollerad storlek, kan robotiseras för storskalig produktion på ett tidseffektivt sätt med minimal ansträngning och har goda kostnadseffektivitetskritiska faktorer vid utformningen av en biofabricering av vävnadssfäroid 7,8. Denna metod kan tillämpas för att bilda sfäroider av vilken cellinje som helst för att förbereda en ny vävnadstyp med förutsägbara, optimala och kontrollerbara egenskaper8.
Biofabricering definieras som "automatiserad generering av biologiskt funktionella produkter med strukturell organisation ..."13. Därför anses den automatiserade produktionen av sfäroider vara det första obligatoriska steget för att utveckla en biofabriceringslinje, som fortsätter i 3D-bioprintningsprocessen och avslutas i full mognad av den bioprintade vävnaden genom sfäroidfusion. I denna studie, för att förbättra skalbarheten för ASC-sfäroidbiofabricering, använder vi ett automatiserat pipetteringssystem för att så cellsuspensionen, vilket säkerställer homogeniteten av sfäroidstorlek och form. Detta dokument visar att det var möjligt att producera ett stort antal (tusentals) sfäroider som behövs för 3D-bioprintningsmetoder för att biofabricera mer komplexa vävnadsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ASC: erna som användes i denna studie isolerades tidigare från friska mänskliga givare och kryokonserverades enligt beskrivningen14 enligt forskningsetiska kommittén vid Clementino Fraga Filho University Hospital, Federal University of Rio de Janeiro, Brasilien (25818719.4.0000.5257). Se materialtabell för detaljer om allt material och utrustning som används i denna studie.
1. Trypsinisering av ASC-monolager vid passage tre
- Öppna vävnadskulturen 175 cm2-kolven som innehåller monolagret av ASC vid 80% sammanflöde och kassera supernatanten.
- Tillsätt 7 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,01 M) och tvätta monolagret två gånger. Kassera sedan vätskan.
- Tillsätt 5 ml 0,125% trypsin med 0,78 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Inkubera sedan i 5 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 10 ml lågglukos Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) med 10% fetalt bovint serum (FBS) till vävnadskulturen 175 cm2 kolv och blanda cellsuspensionen väl med en 10 ml sorologisk pipett.
- Skörda cellsuspensionen med en 10 ml serologisk pipett och överför den till ett 50 ml centrifugrör. Därefter centrifugera vid 400 × g i 5 min för att erhålla pelleten av ASC. Resuspendera cellpelleten med DMEM LOW innehållande 10% FBS.
- Utför ett cellantal genom trypan-uteslutning.
- Efter räkning, ta totalt 1 × 106 ASC i ett separat 15 ml centrifugrör för att så de 81 recessionerna mikroformade med icke-vidhäftande hydrogel (totalt 10 000 celler / ml sådd här). För att så 256 lågkonjunkturer av mikroformad icke-vidhäftande hydrogel, ta totalt 5 × 105 ASC i ett centrifugrör (totalt 2 500 celler / ml sådd här).
2. Mikroformad icke-vidhäftande agaroshydrogeltillverkning
- Förbered 50 ml av en steril lösning av 2% ultraren agaros i 0,9% NaCl i ultrarent vatten. Autoklavera lösningen i 30 minuter vid 121 °C.
- Tillsätt 500 μL steril 2% ultraren agaroslösning i mitten av en silikonform innehållande 81 eller 256 cirkulära urtag.
- Efter 40 minuter, avforma den ultrarena agarosen från silikonformen och placera den i en brunn på en 12-brunna plastplatta.
- Tillsätt 2 ml DMEM LOW i brunnen med den mikroformade agarosen och inkubera i en inkubator vid 37 °C i en 5 % CO2-atmosfär i minst 12 timmar innan ASC:erna sås.
3. Biofabricering av ASC-sfäroider med hjälp av det automatiska pipetteringssystemet
- Kontrollera följande:
- Kontrollera om det laminära flödet är på och skåpets luftflöde fungerar korrekt.
- Kontrollera om utrustningen är ansluten till rätt spänning.
- Kontrollera om surfplattan är ansluten till utrustningen.
- Kontrollera om höjden på skåpskyddsglaset är i samma höjd som sensormärkningen på utrustningen.
- Tryck på på /av-knappen på vänster sida av utrustningen och vänta tills surfplattan och utrustningen startar.
- Placera spetslådorna, racket för centrifugrör och plattan som innehåller den mikroformade agaroshydrogelen i utrustningens arbetsyta.
- På surfplattan med programvaran öppen klickar du först på Labware Editor.
- Ställ in ett virtuellt arbetsbord och välj positionerna för pipetter, spetslådor, stället för plaströren och plattorna.
OBS: Det virtuella arbetsbordet måste representera de fysiska positionerna för tillbehören i utrustningen. - Klicka på knappen Växla till produktion för att inkludera parametrarna (se steg 3.10) och kommandon som utrustningen kommer att utföra under hela experimentet. Vänta tills ett verktygsfält och en produktionslista öppnas i programvaran.
- Om du vill ange kommandona inkluderar du inledningsvis antalet exempel som ska pipetteras och drar det till listan Producera.
OBS: Antalet prover är antalet plastcentrifugrör som innehåller ASC-suspensionen som ska sås i mitten av mikromolderna. - När du har angett antalet prover klickar du på kommandoknappen Provöverföring på programvaran för att överföra ASC-upphängningen till brunnarna på 12-brunnsplattan, som innehåller mikromolderna, och dra den till produktionslistan.
- Klicka på Egenskaper för att ställa in start- och slutpositioner för utrustningen för att överföra provet.
- Vänta tills programvaran återgår till arbetstabellsidan . Klicka på alternativknappen för att ställa in parametrarna för automatiserad sådd av ASC: erna: i) Aspirationshastighet på 15,4 s-1; ii) Utmatningshastighet på 1 s-1; iii) Blåsfördröjning på 0 ms; iv) Blåshastighet på 15,4 s-1; v) Initial stroke på 100%. Välj Vatten som standardvätsketyp.
- Ställ in parametrarna för att blanda ASC: erna för att erhålla en homogen suspension: i) Antal cykler på 5; ii) Hastighet på 6,5 s-1; iii) Volym på 300 μL.
- När du har ställt in parametrarna lägger du till tiden 40 minuter i produktionslistan.
OBS: Den här tiden behövs för att vänta på att ASC-upphängningen ska dekantera i botten av mikromolden. - I produktlistan inkluderar du alternativet Reagensöverföring för att överföra sfäroidkulturmediet till motsvarande brunnar på plattan.
- Upprepa steg 3.9-3.11 för att ställa in positions- och parameterkonfigurationerna för överföring av sfäroidkulturmediet.
- Klicka på knappen med en kontrollsymbol i programvarans övre fält för att säkerställa att det inte finns något programmeringsfel.
- Klicka på Play-knappen (med en triangelsymbol) i det övre fältet i programvaran för att starta programmet.
- Låt utrustningen starta, som programmerad, och vänta tills den gör ett ljud, vilket indikerar att den är klar.
- Samla upp 12-brunnsplattan och inkubera den i en inkubator vid 37 °C, 5 %CO2 i minst 18 timmar för att sfäroiderna ska vara helt formade och kompakta.
- Skörda sfäroiderna manuellt efter 1, 3 och 7 dagars kultur för analys. Spola mediet manuellt med en mikropipett för att frigöra sfäroiderna från den mikroformade icke-vidhäftande agaroshydrogelen.
- Efter 5 minuter, kontrollera under mikroskopet för att avgöra om sfäroiderna frigörs helt från den mikroformade icke-vidhäftande agaroshydrogelen.
- Samla sfäroiderna manuellt med en mikropipett och överför dem till ett 15 ml centrifugrör.
- Tvätta sfäroiderna minst två gånger med 0,01 M PBS. Bedöm viabiliteten och utför biomekaniska analyser på de färska sfäroidproverna. För morfologisk analys (histologi), inkubera sfäroidproverna i 4% paraformaldehyd i PBS i minst 18 timmar vid 2-8 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det automatiska pipettsystemet kan så ASC-cellsuspensionen i 12 brunnar på en 12-brunnsplatta på 15 minuter. Att använda den 81 mikroformade icke-vidhäftande hydrogelen kommer att producera 972 sfäroider i slutet av protokollet. Att använda den 256 mikroformade icke-vidhäftande hydrogelen kommer att producera 3 072 sfäroider i slutet av protokollet. ASC-sfäroider analyserades för homogeniteten av deras storlek och form. ASC-sfäroider från mikromold med 81 recessioner visade homogen diameter under odlingsperioden i motsats till ASC-sfäroider från mikromold med 256 recessioner (Figur 1C, D). Förhållandet mellan de minsta och största diametrarna (sfäricitet) var nära 1 i ASC-sfäroider från mikromolder med 81 och 256 recessioner (figur 1E,F). Resultaten från viabilitets-, morfologi- och kraftanalyser (figur 2) ger bevis för framgångsrik, storskalig produktion av ASC-sfäroider.
Figur 1: ASC-sfäroider visade reproducerbarhet med hög diameter. Representativa optiska mikrografer av ASC-sfäroider från mikroformade icke-adhesiva hydrogeler med (A) 81 cirkulära recessioner och (B) 256 cirkulära recessioner. (C,D) Sfäroiddiameter vid 1, 3 och 7 dagar från fem mikroformade icke-adhesiva hydrogeler med 81 respektive 256 cirkulära lågkonjunkturer. (E,F) Förhållandet mellan de minsta och största diametrarna från mikroformade icke-adhesiva hydrogeler med 81 respektive 256 cirkulära lågkonjunkturer. För att mäta sfäroidernas minsta och största diametrar förvärvades bilder varje vecka med hjälp av ett optiskt mikroskop utrustat med en digitalkamera. Bredd och längd mättes med hjälp av ImageJ-programvaran. Ett diameterförhållande för varje sfäroid erhölls genom att dividera bredd med längd (sfäroidsfäricitet). Totalt 85 sfäroider mättes från mikroformade, icke-adhesiva hydrogeler med 81 cirkulära recessioner, och totalt 160 sfäroider mättes från mikroformade, icke-adhesiva hydrogeler med 256 cirkulära recessioner. Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± standardavvikelsen. Asteriskerna anger värden på P som erhållits av ANOVA icke-parametriska och oparade följt av flera jämförelser (**P < 0,001; ****P < 0,0001). Skalstänger = 100 μm. Förkortning: ASC = fettvävnadsstam / stromaceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ASC-sfäroider visade hög cellviabilitet. Levande och döda celler observeras i grönt respektive rött. Dödskontroll visas i insatsen. (B) Sektion av en ASC-sfäroid färgad av hematoxylin och eosin från mikroformade, icke-adhesiva hydrogeler med 81 cirkulära recessioner. De fasta sfäroidproverna inbäddades i paraffin och proverna skars i sektioner med 5 μm tjocklek med hjälp av en mikrotom. C) Tryckmotståndskraften mätt i μN ASC-sfäroider dag 7. Data samlades in från fem sfäroider och uttrycktes som genomsnittlig ± standardavvikelse, enligt tidigare beskriven metod5. Asteriskerna anger värdet på P erhållet med tvåvägs ANOVA, icke-parametrisk och oparad, följt av flera jämförelser. Skalstänger = 50 μm. Förkortning: ASC = fettvävnadsstam / stromaceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument presenterar den storskaliga genereringen av ASC-sfäroider med hjälp av ett automatiserat pipettsystem. Det kritiska steget i protokollet är att exakt ställa in programvaran för att säkerställa rätt volym cellupphängning, hastighet och avstånd för pipettering. Parametrarna som beskrivs i protokollet bestämdes efter ett antal försök för att optimera doseringen av ASC-cellsuspensionen i brunnarna på 12-brunnsplattor innehållande de mikroformade, icke-vidhäftande hydrogelerna. Optimeringen utvärderades genom att mäta sfäroidernas diameter och sfäricitet. Området och höjden på de mikroformade icke-vidhäftande hydrogelerna användes för att beräkna den ideala hastigheten för att dispensera cellsuspensionen. Om cellsuspensionen sås av utrustningen med en annan utmatningshastighet kommer detta direkt att påverka bildandet av sfäroiderna. Därför är dessa viktiga parametrar som ska optimeras efter försök med utrustningen. Detta protokoll har vissa begränsningar. Endast sådd av ASC i den icke-vidhäftande hydrogelen i mikromolden kan automatiseras, följt av tillsats av cellodlingsmedium. Systemets funktioner begränsas av versionen av utrustningen och programvaran. Den största fördelen med detta reproducerbara tillvägagångssätt är dock att producera upp till 3 072 ASC-sfäroider - homogena i storlek och form och livskraftiga - med mindre risker för mänskliga fel eller kontaminering. Det stora antalet biofabricerade ASC-sfäroider kan laddas direkt i en 3D-bioprinter för att producera mer komplexa vävnadsmodeller.
I allmänhet är det allmänt känt att exakt och automatiserad pipettering spelar en central roll i automatiseringen av cellodling. Automatiserade cellodlingssystem möjliggör storskalig produktion och ökar teknisk noggrannhet, reproducerbarhet och processeffektivitet15. Därför kan automatiserade system underlätta storskalig produktion, vilket är vanligt och fördelaktigt för industriella miljöer16,17. Det finns dock få studier som beskriver utvecklingen av protokoll för att automatisera 3D-cellodlingssystem 7,18,19,20,21.
Mehesz och medarbetarna7 och Meseguer-Ripolles och kollegor21 använde ett liknande protokoll för att biofabricera ASC-sfäroider. I studien av Mehesz et al.7 använde författarna samma automatiserade pipetteringssystem. Men deras protokoll producerade endast 96 sfäroider, medan protokollet som utvecklades i det nuvarande arbetet kunde producera upp till 3 072 ASC-sfäroider samtidigt, homogena i storlek och form. Meseguer-Ripolles et al.21 använde också ett automatiserat pipetteringssystem för att producera upp till 73 leversfäroider. Ett annat tillvägagångssätt som diskuteras för att tillverka sfäroider i stor skala nuförtiden är via mikrofluidikanordningar. De artiklar som hittills publicerats har dock utforskat tekniken för att utveckla bättre enheter som kan producera sfäroiderna snarare än att öka skalan för sfäroidtillverkning 7,20.
En annan metod som kan användas för att tillverka ett stort antal sfäroider är att använda spinnarkolvar. En huvudfråga om denna teknik är dock svårigheten att kontrollera storleken och formen på sfäroiderna22,23. Dessutom tillämpades 3D-bioprintning redan på biofabricatsfäroider i stor skala. I studien av Daly och Kelly19 använde författarna en bläckstråleteknik för att producera ett stort antal sfäroider i polykaprolaktonmikrokammare. Sfäroiderna var livskraftiga och homogena i storlek och form.
Huvudtillämpningen av protokollet som beskrivs i detta arbete är att biofabricera ASC-sfäroider i stor skala som behövs för 3D-bioprintning. Som diskuterats av Mironov och medarbetare24 kommer tusentals sfäroider att vara nödvändiga för att biofabricera komplexa vävnader och organmodeller. Den automatiserade metoden som beskrivs i detta protokoll möjliggör tillverkning av ett stort antal ASC-sfäroider som kan laddas direkt i 3D-bioprintern. Det är också möjligt att differentiera dessa sfäroider till en önskad mesodermal väg för att konstruera muskuloskeletala vävnader. De Moor och samarbetspartners25 utvecklade en metod med hög genomströmning för att tillverka ett stort antal vaskulära sfäroider för framtida 3D-bioprintningsapplikationer.
Utrustningen kan modifieras för att förbättra protokollet. Nyare versioner av utrustningen tillåter användning av ett större antal plattor, vilket kan förbättra antalet ASC-sfäroider som produceras. Samma senaste version möjliggör exakt stapling av plattorna, och detta skulle också ge en bättre effektivitet i protokollet. Sammanfattningsvis visade vi framgångsrikt ett protokoll som tillåter biofabricering upp till 3 072 ASC-sfäroider homogena i storlek och form på 15 minuter, och att detta anses vara det första steget för att bygga en biofabriceringslinje för Tissue Engineering-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasilien) för användningen av deras anläggningar. Denna studie stöddes delvis av Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support i delstaten Rio de Janeiro (Faperj) (finanskod: E26/202.682/2018 och E-26/010.001771/2019, National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (finanskod: 307460/2019-3) och Office of Naval Research (ONR) (finanskod: N62909-21-1-2091). Detta arbete stöddes delvis av National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
