Summary
هنا ، نصف الإنتاج على نطاق واسع من الكرويات اللحمية / الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ASC) باستخدام نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل الكروية. يمكن استخدام هذه الكروية ASC ككتل بناء لنهج الطباعة الحيوية 3D.
Abstract
الخلايا اللحمية / الجذعية المشتقة من الدهون (ASCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا الموجودة في الجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البشرية تحت الجلد المعترف بها كمصدر كلاسيكي للخلايا اللحمية / الجذعية الوسيطة. تم نشر العديد من الدراسات مع ASCs لنهج هندسة الأنسجة القائمة على السقالات ، والتي استكشفت بشكل رئيسي سلوك هذه الخلايا بعد بذرها على السقالات النشطة بيولوجيا. ومع ذلك ، تظهر مناهج خالية من السقالات لهندسة الأنسجة في المختبر وفي الجسم الحي ، وذلك أساسا باستخدام الكرويات ، للتغلب على قيود النهج القائمة على السقالات.
الكروية هي الأنسجة الدقيقة 3D التي شكلتها عملية التجميع الذاتي. يمكنهم محاكاة البنية والبيئة الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل أفضل ، ويرجع ذلك أساسا إلى تكبير تفاعلات المصفوفة من خلية إلى خلية ومن خلية إلى خارج الخلية. في الآونة الأخيرة ، يتم استكشاف الكرويات بشكل رئيسي كنماذج للأمراض ، ودراسات فحص الأدوية ، ولبنات البناء للطباعة الحيوية 3D. ومع ذلك ، بالنسبة لنهج الطباعة الحيوية 3D ، فإن العديد من الكرويات ، المتجانسة في الحجم والشكل ، ضرورية للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة والأعضاء المعقدة. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم إنتاج الكرويات تلقائيا ، هناك فرصة ضئيلة للتلوث الميكروبيولوجي ، مما يزيد من قابلية تكرار الطريقة.
يعتبر الإنتاج الواسع النطاق للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل لبناء الأنسجة في المفاعلات الحيوية. ومع ذلك ، فإن عدد الدراسات التي استكشفت إنتاج ASC الكروي على نطاق واسع لا يزال نادرا ، إلى جانب عدد الدراسات التي استخدمت كرويات ASC ككتل بناء للطباعة الحيوية 3D. لذلك ، تهدف هذه المقالة إلى إظهار الإنتاج الواسع النطاق للكرويات ASC باستخدام تقنية هيدروجيل غير لاصقة micromolded تنشر كرويات ASC ككتل بناء لأساليب الطباعة الحيوية 3D.
Introduction
تعتبر الكرويات نهجا خاليا من السقالات في هندسة الأنسجة. ASCs قادرة على تشكيل كرويات من خلال عملية التجميع الذاتي. تزيد البنية الدقيقة ثلاثية الأبعاد للكروية من الإمكانات التجديدية ل ASCs ، بما في ذلك قدرة التمايز إلى سلالات متعددة1،2،3. تعمل هذه المجموعة البحثية مع كرويات ASC لهندسة الغضاريف والأنسجة العظمية4،5،6. الأهم من ذلك ، تعتبر الكرويات لبنات بناء في التصنيع الحيوي للأنسجة والأعضاء ، ويرجع ذلك أساسا إلى قدرتها على الاندماج.
يعتمد استخدام الكرويات لتشكيل الأنسجة على ثلاث نقاط رئيسية: (1) تطوير طرق روبوتية موحدة وقابلة للتطوير لتصنيعها الحيوي7 ، (2) التنميط الظاهري المنهجي للكرويات النسيجية8 ، (3) تطوير طرق لتجميع الأنسجة ثلاثية الأبعاد9. يمكن تشكيل هذه الكرويات بأنواع مختلفة من الخلايا والحصول عليها من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك السقوط المعلق ، وإعادة التجميع ، والموائع الدقيقة ، والقوالب الدقيقة8،9،10. كل من هذه الطرق لها مزايا وعيوب تتعلق بتجانس حجم وشكل الكرويات ، واستعادة الكرويات بعد التكوين ، وعدد الكرويات المنتجة ، وأتمتة العمليات ، وكثافة العمالة ، والتكاليف11.
في طريقة micromold ، يتم توزيع الخلايا وإيداعها في الجزء السفلي من micromold بسبب الجاذبية. لا يسمح الهيدروجيل غير اللاصق للخلايا بالالتصاق بالقاع ، وتؤدي التفاعلات بين الخلايا إلى تكوين كروي واحد لكل ركود 8,12. تولد طريقة التصنيع الحيوي هذه كرويات ذات حجم متجانس ومضبوط ، ويمكن استخدامها آليا للإنتاج على نطاق واسع بطريقة فعالة من حيث الوقت بأقل جهد ممكن ، ولها عوامل جيدة من حيث الفعالية من حيث التكلفة في تصميم التصنيع الحيوي للأنسجة الكروية 7,8. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتشكيل كرويات من أي سلالة خلوية لإعداد نوع جديد من الأنسجة بخصائص يمكن التنبؤ بها ومثالية ويمكن التحكم فيها8.
يعرف التصنيع الحيوي بأنه "التوليد الآلي للمنتجات الوظيفية بيولوجيا مع التنظيم الهيكلي ..."13. لذلك ، يعتبر الإنتاج الآلي للكرويات الخطوة الإلزامية الأولى لتطوير خط التصنيع الحيوي ، والذي يستمر في عملية الطباعة الحيوية 3D وينتهي في النضج الكامل للأنسجة المطبوعة بيولوجيا عن طريق الانصهار الكروي. في هذه الدراسة ، لتحسين قابلية التوسع في التصنيع الحيوي الكروي ASC ، نستخدم نظام سحب آلي لزرع تعليق الخلية ، وبالتالي ضمان تجانس حجم وشكل كروي. تظهر هذه الورقة أنه كان من الممكن إنتاج عدد كبير (الآلاف) من الكرويات اللازمة لنهج الطباعة الحيوية 3D للتصنيع الحيوي لنماذج الأنسجة الأكثر تعقيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم عزل ASCs المستخدمة في هذه الدراسة سابقا عن المتبرعين البشريين الأصحاء وحفظها بالتجميد كما هو موضح في14 وفقا للجنة أخلاقيات البحث في مستشفى جامعة كليمنتينو فراغا فيلهو ، الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، البرازيل (25818719.4.0000.5257). انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة.
1. التربسين من ASC أحادي الطبقة في الممر الثالث
- افتح مزرعة الأنسجة 175 سم2 قارورة تحتوي على الطبقة الأحادية من ASCs عند التقاء 80٪ وتخلص من supernatant.
- أضف 7 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS ، 0.01 M) واغسل الطبقة الأحادية مرتين. بعد ذلك ، تخلص من السائل.
- أضف 5 مل من 0.125٪ تريبسين مع 0.78 ملليمتر من حمض الإيثيلين ديامين تتراسيتيك (EDTA). بعد ذلك ، احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- أضف 10 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) منخفض الجلوكوز مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS ) إلى مزرعة الأنسجة 175 سم2 قارورة واخلط تعليق الخلية جيدا مع ماصة 10 مل سورولوجية.
- حصاد تعليق الخلية مع ماصة مصلية 10 مل ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 50 مل. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه ASCs. أعد تعليق حبيبات الخلايا باستخدام DMEM LOW الذي يحتوي على 10٪ FBS.
- قم بإجراء عدد الخلايا عن طريق استبعاد التربان.
- بعد العد ، خذ ما مجموعه 1 × 106 ASCs في أنبوب طرد مركزي منفصل 15 مل لزرع 81 حالة ركود مصقولبة بالهيدروجيل غير الملتصق (ما مجموعه 10000 خلية / مل مبذرة هنا). لزرع 256 حالة ركود من الهيدروجيل غير الملتصق بالميكرومصبوب ، خذ ما مجموعه 5 × 105 ASCs في أنبوب طرد مركزي (ما مجموعه 2500 خلية / مل مبذرة هنا).
2. ميكرومصبوب غير ملتصقة تصنيع هيدروجيل الأغاروز
- تحضير 50 مل من محلول معقم من 2٪ من الأغاروز فائق النقاء في 0.9٪ كلوريد الصوديوم في الماء فائق النقاء. أوتوكلاف الحل لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول الأغاروز المعقم 2٪ فائق النقاء في وسط قالب سيليكون يحتوي على 81 أو 256 استراحة دائرية.
- بعد 40 دقيقة ، قم بفك قالب الأغاروز فائق النقاء من قالب السيليكون وضعه في بئر من لوحة بلاستيكية من 12 بئرا.
- أضف 2 مل من DMEM LOW في البئر مع الأغاروز المصبوب الدقيق واحتضنه في حاضنة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 لمدة 12 ساعة على الأقل قبل بذر ASCs.
3. التصنيع الحيوي للكرويات ASC باستخدام نظام السحب الآلي
- تحقق مما يلي:
- تحقق مما إذا كان التدفق الرقائقي قيد التشغيل ، وأن تدفق الهواء في الخزانة يعمل بشكل صحيح.
- تحقق مما إذا كان الجهاز متصلا بالجهد الصحيح.
- تحقق مما إذا كان الجهاز اللوحي متصلا بالجهاز.
- تحقق مما إذا كان ارتفاع زجاج حماية الخزانة في نفس ارتفاع علامة المستشعر الخاصة بالمعدات.
- اضغط على الزر تشغيل /إيقاف تشغيل على الجانب الأيسر من الجهاز وانتظر حتى يبدأ تشغيل الجهاز اللوحي والجهاز.
- ضع صناديق الأطراف ، ورف أنابيب الطرد المركزي ، واللوحة التي تحتوي على هيدروجيل الأغاروز المصبوب في مساحة عمل المعدات.
- في الجهاز اللوحي مع فتح البرنامج ، انقر أولا على محرر Labware.
- قم بإعداد طاولة عمل افتراضية واختر مواضع الماصات وصناديق الأطراف والحامل للأنابيب البلاستيكية والألواح.
ملاحظة: يجب أن يمثل جدول العمل الظاهري المواضع الفعلية للملحقات في المعدات. - انقر فوق الزر التبديل إلى الإنتاج لتضمين المعلمات (انظر الخطوة 3.10) والأوامر التي ستنفذها المعدات طوال التجربة. انتظر حتى يتم فتح شريط أدوات وقائمة إنتاج في البرنامج.
- في البداية، للإشارة إلى الأوامر، قم بتضمين عدد العينات المراد ماصتها واسحبها إلى قائمة الإنتاج.
ملاحظة: عدد العينات هو عدد أنابيب أجهزة الطرد المركزي البلاستيكية التي تحتوي على تعليق ASC ليتم بذرها في وسط القوالب الدقيقة. - بعد إدخال عدد العينات ، انقر فوق الزر " نقل العينات " الموجود على البرنامج لنقل تعليق ASC إلى آبار لوحة البئر 12 ، التي تحتوي على القوالب الدقيقة ، واسحبها إلى قائمة الإنتاج.
- انقر فوق خصائص لإعداد مواضع البداية والنهاية للمعدات لنقل العينة.
- انتظر حتى يعود البرنامج إلى صفحة جدول العمل. انقر فوق الزر "خيارات" لإعداد المعلمات للبذر الآلي ل ASCs: i) سرعة الطموح 15.4 s-1 ؛ ب) سرعة الاستغناء عن 1 s-1 ؛ ج) ضربة تأخير من 0 مللي ثانية؛ iv) سرعة النفخ 15.4 s-1 ؛ v) السكتة الدماغية الأولية من 100 ٪. حدد الماء كنوع السائل القياسي.
- إعداد المعلمات لخلط ASCs للحصول على تعليق متجانس: i) عدد الدورات من 5 ؛ ب) سرعة 6.5 s-1 ؛ ج) حجم 300 ميكرولتر.
- بعد إعداد المعلمات، أضف الوقت البالغ 40 دقيقة إلى قائمة الإنتاج.
ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه المرة لانتظار تعليق ASC لصب في الجزء السفلي من micromold. - في قائمة الإنتاج، قم بتضمين خيار نقل الكاشف لنقل وسط الثقافة الكروية إلى الآبار المقابلة للوحة.
- كرر الخطوات من 3.9 إلى 3.11 لإعداد تكوينات الموضع والمعلمة لنقل وسيط الثقافة الكروية.
- انقر فوق الزر الذي يحتوي على رمز الاختيار في الشريط العلوي من البرنامج لضمان عدم وجود خطأ في البرمجة.
- انقر فوق الزر "تشغيل" (مع رمز مثلث) في الشريط العلوي من البرنامج لبدء تشغيل البرنامج.
- دع المعدات تبدأ ، كما هو مبرمج ، وانتظر حتى تصدر صوتا ، مما يشير إلى أنها قد انتهت.
- اجمع الصفيحة المكونة من 12 بئرا واحتضنها في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 لمدة 18 ساعة على الأقل حتى يتم تشكيل الكرويات بالكامل وضغطها.
- حصاد الكرويات يدويا بعد 1 و 3 و 7 أيام من الثقافة للتحليل. اغسل الوسط يدويا باستخدام ماصة دقيقة لتحرير الكرويات من هيدروجيل الأغاروز غير الملتصق بالقوالب الدقيقة.
- بعد 5 دقائق ، تحقق تحت المجهر لتحديد ما إذا كانت الكرويات قد تم إطلاقها بالكامل من هيدروجيل الأغاروز غير الملتصق بالقوالب الدقيقة.
- جمع الكرويات يدويا باستخدام ماصة دقيقة ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل.
- اغسل الكرويات مرتين على الأقل باستخدام 0.01 M PBS. تقييم الجدوى وإجراء التحليلات الميكانيكية الحيوية على العينات الكروية الطازجة. لتحليل المورفولوجيا (علم الأنسجة) ، احتضن العينات الكروية في 4٪ paraformaldehyde في PBS لمدة 18 ساعة على الأقل عند 2-8 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن لنظام الماصة الأوتوماتيكي زرع تعليق خلية ASC في 12 بئرا من لوحة واحدة من 12 بئرا في 15 دقيقة. باستخدام 81 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، سينتج 972 كرويا في نهاية البروتوكول. باستخدام 256 هيدروجيل غير ملتصق بالقوالب الدقيقة ، سينتج 3072 كرويا في نهاية البروتوكول. تم تحليل الكرويات ASC للتأكد من تجانس حجمها وشكلها. أظهرت كرويات ASC من القوالب الدقيقة مع 81 حالة ركود قطرا متجانسا خلال فترة الاستزراع على النقيض من الكرويات ASC من micromolds مع 256 حالة ركود (الشكل 1C ، D). كانت نسبة أصغر وأكبر الأقطار (كروية) قريبة من 1 في الكرويات ASC من القوالب الدقيقة مع 81 و 256 حالة ركود (الشكل 1E ، F). توفر نتائج تحليلات الجدوى والتشكل والقوة (الشكل 2) أدلة على الإنتاج الناجح والواسع النطاق للكرويات ASC.
الشكل 1: أظهرت الكرويات ASC قابلية عالية القطر للتكرار. صور مجهرية بصرية تمثيلية للكرويات ASC من الهلاميات الهيدروجيلية غير اللاصقة ذات القوالب الدقيقة مع (A) 81 حالة ركود دائرية و (B) 256 حالة ركود دائرية. (ج، د) قطر كروي عند 1 و 3 و 7 أيام من خمسة هيدروجيل غير لاصق مصبوب مع 81 و 256 حالة ركود دائرية ، على التوالي. (E,F) نسبة أصغر وأكبر الأقطار من الهلاميات المائية غير اللاصقة ذات القوالب الدقيقة مع 81 و 256 حالة ركود دائرية ، على التوالي. لقياس أصغر وأكبر أقطار الكرويات، تم الحصول على الصور أسبوعيا باستخدام مجهر بصري مجهز بكاميرا رقمية. تم قياس العرض والطول باستخدام برنامج ImageJ. تم الحصول على نسبة قطر كل كروي عن طريق قسمة العرض على الطول (كروية كروية). تم قياس ما مجموعه 85 كرويا من الهلاميات المائية غير اللاصقة ذات القوالب الدقيقة مع 81 حالة ركود دائرية ، وتم قياس ما مجموعه 160 كرويا من الهلاميات المائية غير اللاصقة ذات القوالب الدقيقة مع 256 حالة ركود دائرية. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. تشير العلامات النجمية إلى قيم P التي حصلت عليها ANOVA غير البارامترية وغير المقترنة متبوعة بمقارنات متعددة (**P < 0.001 ؛ ****P < 0.0001). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. اختصار: ASC = الخلايا الجذعية / اللحمية الأنسجة الدهنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أظهرت كرويات ASC قابلية عالية للخلايا . (أ) الصور المجهرية الفلورية لفحص الجدوى من الكرويات ASC في اليوم 7 من الهلاميات المائية غير اللاصقة ذات القوالب الدقيقة مع 256 حالة ركود دائرية. لوحظت الخلايا الحية والميتة باللون الأخضر والأحمر ، على التوالي. يظهر التحكم في الموت في الجزء الداخلي. (ب) قسم من كروية ASC ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين من الهلاميات المائية غير اللاصقة ذات القوالب الدقيقة مع 81 حالة ركود دائرية. تم تضمين عينات الكرويات الثابتة في البارافين ، وتم قطع العينات إلى أقسام بسماكة 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. (ج) قوة مقاومة الضغط المقاسة بميكرونيوتن من الكرويات ASC في اليوم 7. تم جمع البيانات من خمسة كرويات وتم التعبير عنها كمتوسط ± الانحراف المعياري ، وفقا للمنهجيةالموصوفة سابقا 5. تشير العلامات النجمية إلى قيمة P التي تم الحصول عليها بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه ، غير البارامترية وغير المقترنة ، تليها مقارنات متعددة. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: ASC = الخلايا الجذعية / اللحمية الأنسجة الدهنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعرض هذه الورقة الجيل الواسع النطاق من الكرويات ASC باستخدام نظام ماصة آلي. الخطوة الحاسمة للبروتوكول هي إعداد البرنامج بدقة لضمان الحجم الصحيح لتعليق الخلايا وسرعتها ومسافة السحب عليها. تم تحديد المعلمات الموصوفة في البروتوكول بعد عدد من التجارب لتحسين توزيع تعليق خلية ASC في آبار ألواح 12 بئرا تحتوي على الهلاميات المائية المقولبة الدقيقة وغير الملتصقة. تم تقييم التحسين عن طريق قياس قطر وكروية الكرويات. تم استخدام مساحة وارتفاع الهلاميات المائية غير الملتصقة الدقيقة لحساب السرعة المثالية لتوزيع تعليق الخلية. إذا تم زرع تعليق الخلية بواسطة المعدات بسرعة توزيع مختلفة ، فإن هذا سيؤثر بشكل مباشر على تكوين الكرويات. وبالتالي ، هذه هي المعلمات الحاسمة التي يجب تحسينها بعد التجارب مع المعدات. يحتوي هذا البروتوكول على بعض القيود. فقط بذر ASCs في هيدروجيل غير ملتصق في micromold يمكن أن يكون آليا ، تليها إضافة وسط زراعة الخلايا. ميزات النظام محدودة بإصدار الجهاز والبرنامج. ومع ذلك ، فإن الميزة الرئيسية لهذا النهج القابل للتكرار هي إنتاج ما يصل إلى 3072 كروية ASC - متجانسة في الحجم والشكل وقابلة للحياة - مع مخاطر طفيفة من الأخطاء البشرية أو التلوث. يمكن تحميل العدد الكبير من كرويات ASC المصنعة بيولوجيا مباشرة في طابعة حيوية 3D لإنتاج نماذج أنسجة أكثر تعقيدا.
بشكل عام ، من المعروف على نطاق واسع أن السحب الدقيق والآلي يلعب دورا مركزيا في أتمتة زراعة الخلايا. تتيح أنظمة زراعة الخلايا الآلية الإنتاج على نطاق واسع وزيادة الدقة التقنية وقابلية التكرار وكفاءة العملية15. لذلك ، يمكن للأنظمة الآلية تسهيل الإنتاج على نطاق واسع ، وهو أمر شائع ومفيد للبيئات الصناعية16,17. ومع ذلك ، هناك عدد قليل من الدراسات التي تصف تطوير بروتوكولات لأتمتة أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد7،18،19،20،21.
استخدم Mehesz والمتعاونون7 و Meseguer-Ripolles وزملاؤهم21 بروتوكولا مشابها للتصنيع الحيوي لكرويات ASC. في الدراسة التي أجراها Mehesz et al.7 ، استخدم المؤلفون نفس نظام السحب الآلي. ومع ذلك ، أنتج بروتوكولهم 96 كرويا فقط ، في حين أن البروتوكول الذي تم تطويره في هذا العمل كان قادرا على إنتاج ما يصل إلى 3072 كروية ASC في وقت واحد ، متجانسة في الحجم والشكل. كما استخدم Meseguer-Ripolles et al.21 نظام سحب آلي لإنتاج ما يصل إلى 73 كروية كبد. هناك نهج آخر تتم مناقشته لتصنيع الكرويات على نطاق واسع في الوقت الحاضر عبر أجهزة الموائع الدقيقة. ومع ذلك ، فإن المقالات المنشورة حتى الآن قد استكشفت التكنولوجيا لتطوير أجهزة أفضل يمكنها إنتاج الكرويات بدلا من زيادة نطاق تصنيع الكروية 7,20.
طريقة أخرى يمكن استخدامها لتصنيع عدد كبير من الكرويات هي باستخدام قوارير دوارة. ومع ذلك ، فإن إحدى القضايا الرئيسية المتعلقة بهذه التقنية هي صعوبة التحكم في حجم وشكل الكرويات22,23. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الطباعة الحيوية 3D بالفعل على الكرويات الحيوية على نطاق واسع. في الدراسة التي أجراها دالي وكيلي19 ، استخدم المؤلفون تقنية نافثة للحبر لإنتاج عدد كبير من الكرويات في غرف مجهرية متعددة الكابرولاكتون. كانت الكرويات قابلة للحياة ومتجانسة في الحجم والشكل.
التطبيق الرئيسي للبروتوكول الموصوف في هذا العمل هو التصنيع الحيوي ASC كرويات على نطاق واسع اللازمة للطباعة الحيوية 3D. كما ناقش ميرونوف والمتعاونونمعه 24 ، ستكون الآلاف من الكرويات ضرورية لتصنيع الأنسجة المعقدة ونماذج الأعضاء بيولوجيا. ستسمح الطريقة الآلية الموضحة في هذا البروتوكول بتصنيع عدد كبير من الكرويات ASC التي يمكن تحميلها مباشرة في الطابعة الحيوية 3D. من الممكن أيضا التمييز بين هذه الكرويات إلى مسار الجلد المتوسط المطلوب لهندسة الأنسجة العضلية الهيكلية. طور De Moor والمتعاونون25 طريقة عالية الإنتاجية لتصنيع عدد كبير من الكرويات الوعائية لتطبيقات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المستقبلية.
يمكن تعديل المعدات لتحسين البروتوكول. تسمح الإصدارات الأحدث من المعدات باستخدام عدد أكبر من الألواح ، مما قد يعزز عدد الكرويات ASC المنتجة. يسمح هذا الإصدار الأخير نفسه بالتكديس الدقيق للألواح ، وهذا من شأنه أيضا أن يوفر كفاءة أفضل للبروتوكول. في الختام ، أظهرنا بنجاح بروتوكولا يسمح بالتصنيع الحيوي لما يصل إلى 3072 كروية ASC متجانسة في الحجم والشكل في 15 دقيقة ، وأن هذه تعتبر الخطوة الأولى لبناء خط تصنيع حيوي لتطبيقات هندسة الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر المعهد الوطني للمترولوجيا والجودة والتكنولوجيا (INMETRO ، RJ ، البرازيل) على استخدام مرافقه. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (Faperj) (قانون التمويل: E26/202.682/2018 و E-26/010.001771/2019 ، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) (رمز التمويل: 307460/2019-3) ، ومكتب البحوث البحرية (ONR) (رمز التمويل: N62909-21-1-2091). تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المركز الوطني للعلوم والتكنولوجيا حول الطب التجديدي - INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
