Summary
כאן, אנו מתארים את הייצור בקנה מידה גדול של כדוריות סטרומליות/תאי גזע שמקורן בשומן (ASC) באמצעות מערכת פיפטינג אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח הומוגניות של גודל וצורת ספרואידים. כדורי ASC אלה יכולים לשמש כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.
Abstract
תאי גזע סטרומליים/גזעיים שמקורם בשומן (ASCs) הם תת-אוכלוסייה של תאים המצויים בחלק הווסקולרי הסטרומלי של רקמת השומן התת-עורית האנושית המוכרת כמקור קלאסי לתאי סטרומל/גזע מזנכימליים. מחקרים רבים פורסמו עם ASCs עבור גישות מבוססות הנדסת רקמות מבוססות פיגומים, אשר חקרו בעיקר את התנהגותם של תאים אלה לאחר זריעתם על פיגומים ביו-אקטיביים. עם זאת, גישות נטולות פיגומים מתפתחות כדי להנדס רקמות במבחנה וב-in vivo, בעיקר על ידי שימוש בספרואידים, כדי להתגבר על המגבלות של גישות מבוססות פיגומים.
ספרואידים הם מיקרוטיסואים תלת-ממדיים הנוצרים על ידי תהליך ההרכבה העצמית. הם יכולים לחקות טוב יותר את הארכיטקטורה והמיקרו-סביבה של רקמות מקומיות, בעיקר הודות להגדלה של אינטראקציות בין תא לתא ומטריצה מחוץ לתא. לאחרונה, ספרואידים נחקרים בעיקר כמודלים למחלות, מחקרי סינון תרופות ואבני בניין להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. עם זאת, עבור גישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, כדוריואידים רבים, הומוגניים בגודלם ובצורתם, נחוצים לביו-פבריקציה של מודלים מורכבים של רקמות ואיברים. בנוסף, כאשר spheroids מיוצרים באופן אוטומטי, יש סיכוי קטן לזיהום מיקרוביולוגי, הגדלת השכפול של השיטה.
הייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים נחשב לצעד החובה הראשון לפיתוח קו ביו-פבריקציה, הממשיך בתהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית ומסתיים בהבשלה מלאה של מבנה הרקמה בביוריאקטורים. עם זאת, מספר המחקרים שבחנו את ייצור כדוריות ה-ASC בקנה מידה גדול עדיין נדיר, יחד עם מספר המחקרים שהשתמשו בספרואידים ASC כאבני בניין להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. לכן, מאמר זה נועד להראות את הייצור בקנה מידה גדול של כדורי ASC באמצעות טכניקת הידרוג'ל מיקרומולד שאינה דביקה המפזרת כדורי ASC כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.
Introduction
ספרואידים נחשבים לגישה נטולת פיגומים בהנדסת רקמות. ASCs מסוגלים ליצור ספרואידים על ידי תהליך ההרכבה העצמית. המיקרו-ארכיטקטורה התלת-ממדית של הספרואיד מגדילה את פוטנציאל ההתחדשות של ASCs, כולל יכולת ההתמיינות לשושלות מרובות 1,2,3. קבוצת מחקר זו עובדת עם כדוריות ASC להנדסת סחוס ורקמות עצם 4,5,6. חשוב מכך, ספרואידים נחשבים לאבני בניין בביו-פבריקציה של רקמות ואיברים, בעיקר בשל יכולת ההיתוך שלהם.
השימוש בספרואידים להיווצרות רקמות תלוי בשלוש נקודות עיקריות: (1) פיתוח שיטות רובוטיות סטנדרטיות ומדרגיות לביו-פבריקציה שלהם7, (2) פנוטיפ שיטתי של כדוריותרקמה 8, (3) פיתוח שיטות להרכבה של רקמות תלת-ממדיות9. ניתן ליצור ספרואידים אלה עם סוגי תאים שונים ולהתקבל בשיטות שונות, כולל טיפה תלויה, צבירה מחדש, מיקרופלואידיקה ומיקרומולדס 8,9,10. לכל אחת מהשיטות הללו יש יתרונות וחסרונות הקשורים להומוגניות של גודל וצורת הספרואידים, התאוששות הספרואידים לאחר היווצרותם, מספר הספרואידים המיוצרים, אוטומציה של תהליכים, עוצמת עבודה ועלויות11.
בשיטת המיקרומולד, התאים מחולקים ומופקדים בתחתית המיקרומולד בגלל כוח הכבידה. ההידרוג'ל שאינו דבק אינו מאפשר לתאים להיצמד לתחתית, ואינטראקציות בין תאים לתא מובילות להיווצרות של ספרואיד יחיד לכל מיתון 8,12. שיטת ביו-פבריקציה זו מייצרת ספרואידים בגודל הומוגני ומבוקר, ניתנת לרובוטיזציה לייצור בקנה מידה גדול בצורה חסכונית בזמן עם מאמץ מינימלי, ויש לה גורמים טובים של עלות-תועלת קריטית בתכנון של ביו-פבריקציה של ספרואידרקמה 7,8. ניתן ליישם שיטה זו כדי ליצור ספרואידים של כל שושלת תאים כדי להכין סוג רקמה חדש עם מאפיינים צפויים, אופטימליים וניתנים לשליטה8.
Biofabrication מוגדר כ"ייצור אוטומטי של מוצרים פונקציונליים ביולוגית עם ארגון מבני ..."13. לכן, הייצור האוטומטי של ספרואידים נחשב לצעד החובה הראשון לפיתוח קו ביו-פבריקציה, הממשיך בתהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית ומסתיים בהבשלה מלאה של הרקמה המודפסת ביולוגית על ידי היתוך ספרואידים. במחקר זה, כדי לשפר את יכולת ההרחבה של ביו-פבריקציה של ASC spheroid, אנו משתמשים במערכת צינורות אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח את ההומוגניות של גודל וצורת הספרואידים. מאמר זה מראה כי ניתן היה לייצר מספר רב (אלפי) של ספרואידים הדרושים לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית כדי ליצור ביו-פבריקט של מודלים מורכבים יותר של רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ה- ASCs ששימשו במחקר זה בודדו בעבר מתורמים אנושיים בריאים ושימשו בהקפאה כמתואר14 על פי ועדת האתיקה המחקרית של בית החולים האוניברסיטאי קלמנטינו פראגה פילו, האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, ברזיל (25818719.4.0000.5257). ראה טבלת חומרים לפרטים לגבי כל החומרים והציוד המשמשים במחקר זה.
1. טריפסיניזציה של מונולאייר ASC במעבר שלוש
- פתח את תרבית הרקמה 175 ס"מ2 בקבוקון המכיל את החד-שכבתי של ASCs במפגש של 80% והשלך את הסופרנטנט.
- הוסיפו 7 מ"ל של מי מלח עם חציץ פוספט (PBS, 0.01 מ') ושטפו את החד-שכבתי פעמיים. לאחר מכן, השליכו את הנוזל.
- הוסף 5 מ"ל של 0.125% טריפסין עם 0.78 mM חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA). לאחר מכן, דגירה במשך 5 דקות ב 37 °C (84 °F).
- הוסיפו 10 מ" ל של Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) לתרבית הרקמה 175 ס"מ2 צלוחית וערבבו היטב את תרחיף התא עם פיפטה סורולוגית של 10 מ"ל.
- קוצרים את תרחיף התא עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל ומעבירים אותה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 400 × g במשך 5 דקות כדי לקבל את הכדור של ASCs. בצעו החייאה של גלולת התא באמצעות DMEM LOW המכיל 10% FBS.
- בצע ספירת תאים על-ידי אי הכללת טריפאן.
- לאחר הספירה, קח בסך הכל 1 × 106 ASCs בצינור צנטריפוגה נפרד של 15 מ"ל כדי לזרוע את 81 המיתונים במיקרומולד עם הידרוג'ל שאינו דבק (בסך הכל 10,000 תאים / מ"ל שנזרעו כאן). כדי לזרוע 256 מיתונים של הידרוג'ל שאינו דבק במיקרומולד, קחו בסך הכל 5 ×-105 ASCs לתוך צינור צנטריפוגה (סה"כ 2,500 תאים/מ"ל שנזרעו כאן).
2. ייצור הידרוג'ל אגרוז שאינו דבק במיקרומולד
- הכינו 50 מ"ל של תמיסה סטרילית של 2% אגרוז אולטרה-פורה ב-0.9% NaCl במים אולטרה-פוריים. Autoclave את הפתרון במשך 30 דקות ב 121 °C (66 °F).
- הוסיפו 500 μL של תמיסת אגרוז אולטרה-אפור סטרילית של 2% במרכז תבנית סיליקון המכילה 81 או 256 שקעים עגולים.
- לאחר 40 דקות, שחררו את האגרוס האולטרה-פורה מתבנית הסיליקון והניחו אותו בבאר של צלחת פלסטיק בת 12 בארות.
- הוסיפו 2 מ"ל של DMEM LOW בבאר עם האגרוז המיקרומולד ואינקובטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה של 5% CO2 למשך 12 שעות לפחות לפני זריעת ה-ASCs.
3. ביו-פבריקציה של כדוריות ASC באמצעות מערכת הצינורות האוטומטית
- בדוק את הדברים הבאים:
- בדקו אם הזרימה הלמינרית פועלת, וזרימת האוויר של הארון פועלת כראוי.
- בדוק אם הציוד מחובר למתח הנכון.
- בדוק אם הטאבלט מחובר לציוד.
- בדוק אם גובה זכוכית ההגנה על הארון הוא באותו גובה כמו סימון החיישן של הציוד.
- לחץ על לחצן הפעלה/כיבוי בצד שמאל של הציוד והמתן עד שהטאבלט והציוד יתניעו.
- מקם את תיבות הקצוות, את המדף לצינורות צנטריפוגה ואת הצלחת המכילה את הידרוג'ל האגרוז המיקרו-מסולסל בסביבת העבודה של הציוד.
- בטאבלט עם התוכנה פתוחה, לחץ תחילה על עורך Labware.
- הגדירו שולחן עבודה וירטואלי ובחרו את מיקומי הפיפטות, קופסאות הטיפים, המדף לצינורות הפלסטיק והצלחות.
הערה: שולחן העבודה הווירטואלי חייב לייצג את המיקומים הפיזיים של האביזרים בציוד. - לחץ על הלחצן Switch to Produce כדי לכלול את הפרמטרים (ראה שלב 3.10) ואת הפקודות שהציוד יבצע במהלך הניסוי. המתן לפתיחת סרגל כלים ורשימת הפקה בתוכנה.
- בתחילה, כדי לציין את הפקודות, כלול את מספר הדגימות שיש לצנרת ולגרור אותו לרשימת התוצרת.
הערה: מספר הדגימות הוא מספר צינורות הצנטריפוגה מפלסטיק המכילים את תרחיף ה- ASC שיש לזרוע במרכז המיקרומולדות. - לאחר הזנת מספר הדגימות, לחץ על לחצן הפקודה העברת דגימה בתוכנה כדי להעביר את מתלה ה- ASC לבארות של לוחית 12 הקידוחים, המכילה את המיקרומולדות, ולגרור אותה לרשימת התוצרת.
- לחץ על מאפיינים כדי להגדיר את מיקומי ההתחלה והסיום עבור הציוד להעברת הדגימה.
- המתן עד שהתוכנה תחזור לדף טבלת עבודה. לחץ על כפתור אפשרויות כדי להגדיר את הפרמטרים לזריעה אוטומטית של ה- ASCs: i) מהירות שאיפה של 15.4 s-1; ii) לוותר על מהירות של 1 s-1; 3) עיכוב מכה של 0 אלפיות השנייה; 4) מהירות מכה של 15.4 s-1; v) שבץ ראשוני של 100%. בחר מים כסוג הנוזל הסטנדרטי.
- הגדר את הפרמטרים כדי לערבב את ASCs כדי לקבל השעיה הומוגנית: i) מספר מחזורים של 5; 2) מהירות של 6.5 s-1; iii) נפח של 300 μL.
- לאחר הגדרת הפרמטרים, הוסף את השעה של 40 דקות לרשימת התוצרת.
הערה: הפעם יש צורך להמתין עד שהתרחיף ASC יתפרק בתחתית המיקרומולד. - ברשימת התוצרת, כלול את האפשרות העברת ריאגנטים כדי להעביר את מדיום תרבית הספרואידים לבארות המתאימות של הצלחת.
- חזור על שלבים 3.9-3.11 כדי להגדיר את תצורות המיקום והפרמטרים כדי להעביר את מדיום תרבית הספרואידים.
- לחץ על הכפתור עם סמל סימון בסרגל העליון של התוכנה כדי לוודא שאין שגיאת תכנות.
- לחץ על לחצן הפעל (עם סמל משולש) בסרגל העליון של התוכנה כדי להפעיל את התוכנית.
- תן לציוד להתחיל, כפי שתוכנת, ולחכות שהוא ישמיע צליל, מה שמעיד על כך שהוא הסתיים.
- אספו את צלחת 12 הבאר ודגמו אותה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 18 שעות לפחות כדי שהספרואידים ייווצרו במלואם וקומפקטיים.
- קציר ידנית את הספרואידים לאחר 1, 3 ו -7 ימים של תרבות לניתוח. לשטוף את המדיום באופן ידני עם מיקרופיפט כדי לשחרר את הספרואידים מההידרוג'ל האגרוז שאינו דבק במיקרומולד.
- לאחר 5 דקות, בדקו מתחת למיקרוסקופ כדי לקבוע אם הספרואידים משתחררים לחלוטין מההידרוג'ל האגרוז שאינו דבק במיקרומולד.
- אסוף את הספרואידים באופן ידני באמצעות מיקרופיפט והעביר אותם לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- לשטוף את הספרואידים לפחות פעמיים עם 0.01 M PBS. להעריך את הכדאיות ולבצע ניתוחים ביומכניים על דגימות הספרואידים הטריות. לצורך ניתוח מורפולוגיה (היסטולוגיה), דגירה של דגימות הספרואידים ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 18 שעות לפחות בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת הפיפטה האוטומטית יכולה לזרוע את מתלי תאי ה-ASC ל-12 בארות של צלחת אחת בת 12 בארות ב-15 דקות. שימוש בהידרוג'ל 81 מיקרומולד שאינו דבק יפיק 972 ספרואידים בסוף הפרוטוקול. שימוש בהידרוג'ל 256 מיקרומולד שאינו דבק יפיק 3,072 ספרואידים בסוף הפרוטוקול. כדורי ASC נותחו על ההומוגניות של גודלם וצורתם. כדורי ASC ממיקרומולדות עם 81 מיתונים הראו קוטר הומוגני במהלך תקופת התרבית בניגוד לספרואידים ASC ממיקרומולדות עם 256 מיתונים (איור 1C,D). היחס בין הקטרים הקטנים והגדולים ביותר (כדוריות) היה קרוב ל-1 בספרואידים ASC ממיקרומולדות עם 81 ו-256 מיתונים (איור 1E,F). התוצאות של ניתוחי כדאיות, מורפולוגיה וכוח (איור 2) מספקות ראיות לייצור מוצלח בקנה מידה גדול של כדורי ASC.
איור 1: כדורי ASC הראו יכולת שכפול בקוטר גבוה. מיקרוגרפים אופטיים מייצגים של כדורי ASC מהידרוג'לים שאינם דביקים עם (A) 81 מיתונים מעגליים ו-(B) 256 מיתונים מעגליים. (ג,ד) קוטר ספרואידי של 1, 3 ו-7 ימים מחמישה הידרוג'לים שאינם דביקים במיקרו-מולקולות עם 81 ו-256 מיתונים מעגליים, בהתאמה. (ה,ו) היחס בין הקטרים הקטנים והגדולים ביותר מהידרוג'לים שאינם דביקים עם 81 ו-256 מיתונים מעגליים, בהתאמה. כדי למדוד את הקטרים הקטנים והגדולים ביותר של הספרואידים, התמונות נרכשו מדי שבוע באמצעות מיקרוסקופ אופטי המצויד במצלמה דיגיטלית. הרוחב והאורך נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ. יחס קוטר של כל ספרואיד התקבל על ידי חלוקת רוחב באורך (כדוריות כדוריות). בסך הכל נמדדו 85 ספרואידים מהידרוג'לים מיקרו-מדומדים ולא דביקים עם 81 מיתונים מעגליים, ובסך הכל נמדדו 160 ספרואידים מהידרוג'לים מיקרו-מודים ולא דביקים עם 256 מיתונים מעגליים. הנתונים מבוטאים כסטיית תקן ממוצעת ±. הכוכביות מציינות ערכים של P המתקבלים על ידי ANOVA nonparametric ו- unpaired ולאחר מכן השוואות מרובות (**P < 0.001; ****P < 0.0001). סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: ASC = תאי גזע/סטרומליים של רקמת שומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: כדורי ASC הראו כדאיות גבוהה של התאים. (A) מיקרוגרפים פלואורסצנטיים של בדיקת כדאיות של כדורי ASC ביום 7 מהידרוג'לים מיקרו-מדומדים ולא דביקים עם 256 מיתונים מעגליים. תאים חיים ומתים נצפים בירוק ואדום, בהתאמה. שליטה במוות מוצגת בכניסה. (B) מקטע של ספרואיד ASC המוכתם על ידי המטוקסילין ואוזין מהידרוג'לים מיקרו-דחוסים ולא דביקים עם 81 מיתונים מעגליים. דגימות הספרואידים הקבועות הוטמעו בפרפין, והדגימות נחתכו למקטעים בעובי של 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום. (C) כוח התנגדות דחיסה שנמדד ב-μN של כדורי ASC ביום 7. הנתונים נאספו מחמישה ספרואידים והתבטאו כסטיית תקן ממוצעת ±, על פי מתודולוגיה5 שתוארה קודם לכן. הכוכביות מציינות את הערך של P המתקבל על ידי ANOVA דו-כיווני, לא-פאראמטרי ולא מזווג, ולאחר מכן השוואות מרובות. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: ASC = תאי גזע/סטרומליים של רקמת שומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג את הדור בקנה מידה גדול של כדורי ASC באמצעות מערכת פיפטה אוטומטית. השלב הקריטי של הפרוטוקול הוא להגדיר במדויק את התוכנה כדי להבטיח את הנפח הנכון של מתלה התא, המהירות והמרחק לצינורות. הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול נקבעו לאחר מספר ניסויים כדי לייעל את חלוקת ההשעיה של תאי ASC לבארות של לוחות 12 בארות המכילים את ההידרוג'לים המיקרו-מודלדים והלא דבקים. האופטימיזציה הוערכה על ידי מדידת הקוטר והכדוריות של הספרואידים. השטח והגובה של ההידרוג'לים שאינם דבקים במיקרו-מולקולות שימשו לחישוב המהירות האידיאלית לחלוקת תרחיף התא. אם מתלה התא נזרע על ידי הציוד במהירות חלוקה שונה, זה ישפיע ישירות על היווצרות הספרואידים. לפיכך, אלה הם פרמטרים חיוניים שיש לייעל לאחר ניסויים עם הציוד. לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות. רק זריעה של ה- ASCs בהידרוג'ל שאינו דבק במיקרומולד יכולה להיות אוטומטית, ואחריה תוספת של מדיום תרבית תאים. התכונות של המערכת מוגבלות על ידי גירסת הציוד והתוכנה. עם זאת, היתרון העיקרי של גישה ניתנת לשחזור זו הוא לייצר עד 3,072 כדורי ASC - הומוגניים בגודלם ובצורתם ובר קיימא - עם סיכונים קלים של טעויות אנוש או זיהום. ניתן לטעון ישירות את המספר הגדול של כדוריות ASC ביו-פבריקטיות לתוך ביו-פרינטר תלת-ממדי כדי לייצר מודלים מורכבים יותר של רקמות.
באופן כללי, ידוע כי צנרת מדויקת ואוטומטית ממלאת תפקיד מרכזי באוטומציה של תרבית תאים. מערכות אוטומטיות של תרביות תאים מאפשרות ייצור בקנה מידה גדול ומגבירות את הדיוק הטכני, יכולת השכפול ויעילות התהליך15. לכן, מערכות אוטומטיות יכולות להקל על ייצור בקנה מידה גדול, שהוא נפוץ ומועיל לסביבות תעשייתיות 16,17. עם זאת, ישנם מחקרים מעטים המתארים פיתוח פרוטוקולים לאוטומציה של מערכות תרביות תאים תלת-ממדיות 7,18,19,20,21.
מהס ומשתפי הפעולה7 ו-Meseguer-Ripolles ועמיתיהם21 השתמשו בפרוטוקול דומה לביו-פבריקט של כדורי ASC. במחקר של Mehesz et al.7, המחברים השתמשו באותה מערכת צנרת אוטומטית. עם זאת, הפרוטוקול שלהם ייצר רק 96 ספרואידים, בעוד שהפרוטוקול שפותח בעבודה הנוכחית הצליח לייצר עד 3,072 כדורי ASC בבת אחת, הומוגניים בגודלם ובצורהם. Meseguer-Ripolles et al.21 השתמשו גם במערכת צינורות אוטומטית כדי לייצר עד 73 כדוריות כבד. גישה נוספת הנדונה כיום לייצור ספרואידים בקנה מידה גדול היא באמצעות מכשירי מיקרופלואידיקה. עם זאת, המאמרים שפורסמו עד כה בחנו את הטכנולוגיה לפיתוח מכשירים טובים יותר שיכולים לייצר את הספרואידים במקום להגדיל את קנה המידה לייצור ספרואידים 7,20.
שיטה נוספת שניתן להשתמש בה לייצור מספר גבוה של כדוריות היא באמצעות צלוחיות ספינר. עם זאת, אחת הבעיות העיקריות הנוגעות לטכניקה זו היא הקושי לשלוט בגודל ובצורה של הספרואידים 22,23. בנוסף, הדפסה ביולוגית תלת-ממדית כבר יושמה גם על כדוריות ביו-פבריקט בקנה מידה גדול. במחקרם של דאלי וקלי19, המחברים השתמשו בטכניקת הזרקת דיו כדי לייצר מספר רב של ספרואידים במיקרו-צ'אמברים של פוליקפרולקטון. הספרואידים היו בני קיימא והומוגניים בגודלם ובצורתם.
היישום העיקרי של הפרוטוקול המתואר בעבודה זו הוא ביו-פבריקציה של כדורי ASC בקנה מידה גדול הדרוש להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. כפי שנדון על ידי Mironov ומשתפי פעולה24, אלפי spheroids יהיה צורך כדי biofabricate רקמות מורכבות ומודלים איברים. השיטה האוטומטית המתוארת בפרוטוקול זה תאפשר ייצור של מספר רב של כדורי ASC שניתן לטעון ישירות בביופרינטר התלת-ממדי. אפשר גם להבדיל בין הספרואידים האלה למסלול מזודרמלי רצוי כדי להנדס רקמות שלד-שריר. דה מור ושותפיו25 פיתחו שיטה בתפוקה גבוהה לייצור מספר רב של כדוריות וסקולריות עבור יישומי הדפסה ביולוגית תלת-ממדית עתידיים.
ניתן לשנות את הציוד כדי לשפר את הפרוטוקול. גרסאות עדכניות יותר של הציוד מאפשרות שימוש במספר גדול יותר של לוחות, מה שיכול לשפר את מספר כדוריות ASC המיוצרות. אותה גרסה עדכנית מאפשרת ערימה מדויקת של הלוחות, וזה גם יספק יעילות טובה יותר של הפרוטוקול. לסיכום, הראינו בהצלחה פרוטוקול המאפשר את הביו-פבריקציה עד 3,072 כדורי ASC הומוגניים בגודלם ובצורתם תוך 15 דקות, וכי זה נחשב לצעד הראשון לבניית קו ביו-פבריקציה ליישומי הנדסת רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים למכון הלאומי למטרולוגיה, איכות וטכנולוגיה (INMETRO, RJ, ברזיל) על השימוש במתקנים שלהם. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי קרן קרלוס צ'אגאס פילו לתמיכה מחקרית במדינת ריו דה ז'ניירו (Faperj) (קוד מימון: E26/202.682/2018 ו- E-26/010.001771/2019, המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) (קוד מימון: 307460/2019-3), והמשרד למחקר ימי (ONR) (קוד מימון: N62909-21-1-2091). עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי המרכז הלאומי למדע וטכנולוגיה בנושא רפואה רגנרטיבית-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
