Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

الكشف عن تراكم الفجوات بعد التكرار وإصلاحها في الخلايا البشرية باستخدام فحص ألياف الحمض النووي

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63448
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis
* These authors contributed equally

Summary

هنا نصف تعديلين لفحص ألياف الحمض النووي للتحقيق في فجوات الحمض النووي المفردة في تكرار الحمض النووي بعد تحريض الآفة. يتيح فحص الألياف S1 الكشف عن الفجوات اللاحقة للتكرار باستخدام endonuclease S1 الخاص ب ssDNA ، في حين يسمح فحص ملء الفجوات بالتصور وتحديد كمية إصلاح الفجوة.

Abstract

فحص ألياف الحمض النووي هو طريقة بسيطة وقوية لتحليل ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل ، استنادا إلى الكشف المناعي لنظائر النيوكليوتيدات التي يتم دمجها أثناء تخليق الحمض النووي في الخلايا البشرية. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها دقة محدودة تبلغ بضعة آلاف من الكيلوجرامات. وبالتالي ، فإن فجوات الحمض النووي المفردة بعد النسخ المتماثل (ssDNA) التي لا يمكن اكتشافها بواسطة الفحص القياسي. هنا ، نصف نسخة معدلة من فحص ألياف الحمض النووي الذي يستخدم نوكلياز S1 ، وهو إنزيم يشق ssDNA على وجه التحديد. في وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل ، سيستهدف نوكليز S1 الفجوات ويشقها ، مما يولد مساحات أقصر يمكن استخدامها كقراءة لفجوات ssDNA على الشوكات المستمرة. تتشكل فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل عندما يتم تكرار الحمض النووي التالف بشكل متقطع. يمكن إصلاحها عبر آليات غير مقترنة من تكرار الجينوم ، في عملية تعرف باسم سد الفجوة أو إصلاح ما بعد التكرار. نظرا لأن آليات سد الفجوات تنطوي على تخليق الحمض النووي بشكل مستقل عن المرحلة S ، يمكن أيضا استخدام التعديلات في مخطط وضع العلامات على ألياف الحمض النووي لمراقبة أحداث سد الفجوات. إجمالا، هذه التعديلات على فحص ألياف الحمض النووي هي استراتيجيات قوية لفهم كيفية تشكيل الفجوات اللاحقة للتكرار وملئها في جينوم الخلايا البشرية.

Introduction

قدمت الأعمال المنوية دليلا على تراكم الفجوات الأحادية التي تقطعت بها السبل (ssDNA) بعد النسخ المتماثل عند العلاج بعوامل ضارة بالحمض النووي في البكتيريا1 والخلايا البشرية 2,3. أثناء تكرار قوالب الحمض النووي التالفة ، قد تتجاوز آلية تخليق الحمض النووي الآفات عن طريق استخدام بوليميراز الحمض النووي التخليقي الانتقالي المحدد أو من خلال آليات تبديل القوالب. بدلا من ذلك ، قد يتخطى المضاد ببساطة الآفة تاركا فجوة ssDNA وراءه ، ليتم إصلاحها لاحقا. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة بوضوح أن العلاج بالعوامل السامة للوراثة يؤدي إلى فجوات ssDNA في حقيقيات النوى من خلال استخدام المجهر الإلكتروني لتصور البنية المحددة لوسيطات النسخ المتماثل4. اقترح في البداية أن يكون تشكيل هذه المناطق من الفجوات اللاحقة للتكرار نتيجة بسيطة للوضع شبه المتقطع لتكرار الحمض النووي2. في هذه الحالة ، يمكن للآفة الموجودة على الخيط المتخلف أن تمنع استطالة جزء Okazaki ، ولكن يتم إنقاذ تطور الشوكة بشكل طبيعي بواسطة جزء Okazaki التالي ، تاركا وراءه فجوة ssDNA. ومع ذلك ، أظهرت المزيد من الدراسات أن تكوين فجوات على الشريط الرئيسي ممكن أيضا ، كما هو موضح لأول مرة في البكتيريا5. في حقيقيات النوى ، تبين أن PRIMPOL ، وهو بوليميراز فريد من نوعه للحمض النووي مع نشاط بريماز ، قادر على إعادة تشغيل تخليق الحمض النووي في اتجاه مجرى النهر ، وهو آفة تمنع التكرار من خلال نشاط التوبيخ6،7،8،9،10،11. وبالتالي ، فإن نشاط بريماز PRIMPOL قد يفسر تكوين فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل في الشريط الرئيسي عند العلاج بعامل ضار بالحمض النووي في الخلايا البشرية12. ومع ذلك، فإن الكشف عن هذه الفجوات وكذلك إصلاح الفجوات، حتى وقت قريب، كان يتطلب نهجا غير مباشرة أو مستهلكة للوقت مثل المجهر الإلكتروني4 أو المقايسات القائمة على البلازميد13. كان استخدام نوكليز S1 الخاص ب ssDNA للكشف عن الفجوات في الخلايا البشرية رائدا من خلال الدراسات المبكرة منذ أكثر من أربعين عاما ، باستخدام تقنيات تدرج السكروز 2,3. في الآونة الأخيرة ، طبقت مجموعتنا استخدام هذا النوكليز للكشف عن ssDNA في تكرار الحمض النووي (فجوات ما بعد التكرار) باستخدام طرق أخرى مثل ألياف الحمض النووي ومقايسات المذنبات14. وقد مهدت هذه النهج الجديدة الطريق أمام الطفرة الحالية في الدراسات المتعلقة بالفجوات اللاحقة للتكرار. هنا ، نصف استراتيجية لاستخدام نوكليز S1 للكشف عن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل بواسطة فحص ألياف الحمض النووي ونشرح كيف يمكن لنظام وضع العلامات التفاضلية في بروتوكول ألياف الحمض النووي أن يسمح بدراسة إصلاح هذه الفجوات.

يعد فحص ألياف الحمض النووي تقنية قوية تم استخدامها من قبل عدد متزايد من المختبرات وقدمت رؤى قيمة حول ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل وآليات الاستجابة لإجهاد النسخ المتماثل. باختصار ، تعتمد هذه التقنية على الدمج المتسلسل لنظائر النيوكليوتيدات (مثل CldU -5-chloro-2'-deoxyuridine-، و IdU -5-iodo-2'-deoxyuridine) في الحمض النووي المكرر. بعد الحصاد ، يتم تحليل الخلايا ، وتنتشر جزيئات الحمض النووي على شريحة زجاجية مغلفة إيجابيا. ثم يتم الكشف عن CldU و IdU بواسطة أجسام مضادة محددة ، والتي يمكن تصورها في المجهر الفلوري كألياف ثنائية اللون. وأخيرا ، يتم قياس أطوال مسالك IdU و CldU لتحديد أي تغييرات في ديناميكيات تكرار الحمض النووي نتيجة لتحريض تلف الحمض النووي. يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في ظواهر مختلفة ، مثل توقف الشوكة ، وتباطؤ الشوكة ، وتدهور الحمض النووي الوليد ، والاختلافات في تواتر إطلاق النار الأصلي15,16.

أحد القيود المفروضة على فحص ألياف الحمض النووي هو دقته لبضعة كيلوجرامات. نظرا لأن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل يمكن أن تكون في نطاق مئات القواعد ، فمن المستحيل تصور هذه الفجوات مباشرة بواسطة بروتوكول ألياف الحمض النووي القياسي. وجود فجوات ssDNA على تكرار الحمض النووي في الخلايا البشرية المعالجة بالعوامل السامة للوراثة كان متورطا بشكل غير مباشر من قبل. على سبيل المثال ، ملاحظة ssDNA كما تم تقييمها من خلال توظيف البروتين المرتبط ب ssDNA ، أو بروتين النسخ المتماثل A (RPA) ، في الخلايا خارج المرحلة S ، أو تكوين ssDNA كما تم اكتشافه بواسطة فك الحمض النووي القلوي جنبا إلى جنب مع عدم وجود توقف شوكة مطول بواسطة فحص ألياف الحمض النووي 12,17,18,19,20,21 يعزى إلى تراكم فجوات الحمض النووي المتنقلة (ssDNA). بالإضافة إلى ذلك ، فإن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل تحفز نقطة تفتيش مرحلة G2 / M تعتمد على ATR وتوقف الخلايا المعالجة بسموم النسخ المتماثل18،19،20،21،22.

تحلل نوكلياز S1 الأحماض النووية أحادية الخيط التي تطلق 5 '-phosphoryl mono- أو oligonucleotides ولها تقارب أعلى 5 مرات مع ssDNA مقارنة بالحمض النووي الريبي. الأحماض النووية المزدوجة (DNA:DNA، DNA:RNA، أو RNA:RNA) مقاومة للنوكليز S1 إلا عند استخدامها بتركيزات عالية للغاية. كما يشق نوكليز S1 الحمض النووي المزدوج في المنطقة الواحدة التي تقطعت بها السبل بسبب أو فجوة أو عدم تطابق أو حلقة. وبالتالي فإن نوكليز S1 هو إندونوكليز خاص ب ssDNA قادر على شق فجوات ssDNA ، مما يؤدي في النهاية إلى توليد فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل23,24. وبالتالي ، فإن إضافة خطوات لهضم نوكلياز S1 إلى بروتوكول ألياف الحمض النووي بشكل غير مباشر يمكن من اكتشاف فجوات ssDNA بعد التكرار. في وجود ثغرات ، فإن معالجة النوى المكشوفة باستخدام نوكليز S1 قبل انتشار الحمض النووي ستولد مساحات أقصر نتيجة لانقسام S1 في ssDNA الموجود بطبيعته في الفجوات14. وفقا لذلك ، فإن تقصير المسالك هو القراءة لفجوات ssDNA باستخدام هذا النهج. بالمقارنة مع بروتوكول ألياف الحمض النووي القياسي ، فإن ألياف الحمض النووي مع نوكلياز S1 تتطلب فقط خطوتين إضافيتين: التعرض للنوى (نفاذية الخلية) والعلاج باستخدام نوكلياز S1. ومن المهم ملاحظة أن الضوابط المناسبة إلزامية، مثل العينات المعالجة بالعامل السام الوراثي ولكن بدون نوكليز S1 والعينات المعالجة بنوكليز S1 بدون العامل السام الوراثي. يمكن تنفيذ البروتوكول نفسه ، بما في ذلك دمج النظير ، ومعالجة S1 ، والانتشار ، في يوم واحد ولا يتطلب مواد استثنائية. لا يتطلب سوى نظائر الثيميدين ، ونوكليز S1 المنقى ، والأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة ، والمجهر الفلوري. بشكل عام ، تكتشف ألياف الحمض النووي التي تستخدم نوكلياز S1 فجوات ssDNA على شوكات النسخ المتماثل المستمرة باستخدام نهج بسيط نسبيا.

يمكن إصلاح (أو ملء) فجوات الحمض النووي عبر الحمض النووي المتماثل التي تشكلت نتيجة لآليات الاستجابة لإجهاد النسخ المتماثل بواسطة آليات مختلفة، بما في ذلك تخليق الحمض النووي العابر للآفة أو تبديل القالب، في عملية تسمى سد الفجوة أو إصلاح ما بعد النسخ المتماثل (PRR)25. تحدث هذه العمليات خلف الشوكات المتقدمة ، والتي تنطوي على تخليق الحمض النووي المستقل عن النسخ المتماثل14،26،27. بناء على هذه النتائج ، يمكن إجراء مخطط وضع العلامات المختلف عن فحص ألياف الحمض النووي القياسي لتصور أحداث سد الفجوات في مرحلة G2 مباشرة14،16،26،28. على وجه التحديد ، يمكن استخدام تناظرية ثيميدين واحدة لتسمية شوكة النسخ المتماثل في وقت العلاج السام وراثيا وتشكيل فجوة ssDNA بعد النسخ المتماثل ، في حين يمكن استخدام تناظرية ثيميدين أخرى لتسمية أحداث ملء الفجوة. في هذا البروتوكول ، يتم تصنيف الخلايا بأول تناظرية ثيميدين (IdU ، على سبيل المثال) مباشرة بعد أو بالتزامن مع العلاج السام الوراثي لمدة 1 ساعة ، بحيث يتم تسمية الحمض النووي الوليد في وقت تكوين الفجوة. يضاف نوكودازول عند العلاج لمدة تتراوح بين 12-24 ساعة لاعتقال الخلايا في G2 / M ، مما يمنع المرحلة S التالية. بالنسبة لآخر 4 ساعات من علاج نوكودازول ، تتم إضافة تناظرية ثيميدين ثانية (CldU ، على سبيل المثال) إلى الوسائط التي سيتم دمجها أثناء ملء الفجوة. الأهم من ذلك ، لا يمكن استخدام هذا الفحص إلا للكشف عن أحداث ملء الفجوة في G2 لأنه لا يمكن تمييز إشارة ملء الفجوة من CldU عن إشارة بسبب دمج CldU في تكرار الحمض النووي في مرحلة S. لذلك ، لتقليل إشارة الخلفية ، يجب أن يتزامن توقيت دمج CldU بعد تحريض الضرر مع الوقت الذي يدخل فيه معظم سكان الخلايا المرحلةG2 14. لذلك ، سيختلف هذا التوقيت اعتمادا على خط الخلية وظروف العلاج. ينصح بتحسين تقدم دورة الخلية قبل استخدام هذا الفحص. يسمح التلطيخ المشترك لهذه النظائر الثيميدين بتصور مسالك ملء الفجوات (PRR) (بقع CldU) فوق الحمض النووي الوليد (IdU tracts) الذي تم تصنيعه أثناء العلاج السام للوراثة عندما تم إنشاء فجوات ssDNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

نظرا لأن الدراسة تستخدم خلايا بشرية ، فقد تمت الموافقة على العمل من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو (ICB-USP ، رقم الموافقة #48347515.3.00005467) للبحث مع عينات بشرية.

ملاحظة: تم استخدام البروتوكولات الموضحة هنا في المنشورات السابقة مع تعديلات طفيفة14،16،28. هنا ينصب التركيز على استخدام الأشعة فوق البنفسجية C (UVC) كعامل ضار بالحمض النووي. ومع ذلك ، فقد تم استخدام عوامل أخرى ضارة بالحمض النووي مثل سيسبلاتين وهيدروكسي يوريا بنجاح28. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في مجموعة من خطوط الخلايا ، بما في ذلك U2OS و HEK293T والخلايا الليفية البشرية وغيرهامن 14،28،29. من الضروري تحديد السؤال التجريبي قبل تنفيذ هذا البروتوكول. يتم استخدام فحص ألياف الحمض النووي مع نوكليز S1 (يسمى S1 Fiber فيما بعد) للكشف عن وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل ، في حين يتم إجراء فحص ملء الفجوة (أو PRR) لتحديد أحداث ملء الفجوة في مرحلة G2. وبالتالي ، عند تحليل وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل ، يجب على الباحث إجراء القسم 2 (الإعداد التجريبي لألياف S1) والانتقال مباشرة إلى القسم 4 (إعداد ألياف الحمض النووي عن طريق الانتشار) من البروتوكول. في حالة تحليل أحداث سد الفجوات ، يجب على المحقق الانتقال مباشرة إلى القسم 3 (الإعداد التجريبي لملء الفجوات (PRR).

1. الكواشف والإعداد

  1. نظائر الثيميدين: إعادة تعليق 5-Iodo-2'-deoxyuridine (IdU) و 5-Chloro-2'-deoxyuridine (CldU) في 1 N NH4OH إلى تركيز نهائي قدره 100 mM. قم بتصفية النظير من خلال مرشح حقنة معقم (0.2 ميكرومتر) ، aliquot ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  2. الأجسام المضادة: الأولية - الفئران المضادة BrdU (Biorad) والفأر المضادة BrdU (BD) ؛ الثانوية - مكافحة الفئران اليكسا فلور 488 ومكافحة الفأر اليكسا فلور 594.
  3. العازلة للنفاذية الخلوية CSK100 لألياف S1: أضف 100 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 10 ملليمتر MOPS [الرقم الهيدروجيني 7] ، 3 ملم MgCl 2 [الرقم الهيدروجيني 7.2] ، 300 mM السكروز و 0.5 ٪ Triton X-100 في H2 O المقطر.
  4. S1 nuclease buffer [pH 4.6]: أضف 30 mM Sodium Acetate [pH 4.6] و 10 mM Zinc Acetate و 50 mM NaCl و 5٪ Glycerol في H2O.
    ملاحظة: يجب أن يكون للمخزن المؤقت للنوكليز S1 درجة حموضة نهائية تبلغ 4.6 ، حيث ينخفض نشاط S1 بنسبة 50٪ عند درجة الحموضة > 4.9.
  5. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية نوكليز S1 تنقية من A. oryzae المخفف مسبقا في S1 نوكليز تخفيف المخزن المؤقت المقدمة من الشركة المصنعة.
  6. أعد تشكيل نوكودازول في DMSO إلى تركيز نهائي قدره 2 مللي متر لملء الفجوات. تحليل.
  7. المخزن المؤقت للتحلل: أضف 200 mM Tris-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] و 50 mM EDTA و 0.5٪ SDS في H2O.
  8. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  9. قم بإعداد PBS-T بإضافة 0.1٪ Tween-20 في PBS.
  10. تحضير 5٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS.
  11. إعداد 0.1٪ BSA في PBS.
  12. تحضير PBS-T-BSA عن طريق إضافة 1٪ BSA في PBS-T.
    ملاحظة: استخدم مجهرا فوق فلورسنت مع مصباح زئبق أو زينون بطول موجي 510 نانومتر وعرض نطاق ترددي 42 نانومتر GFP (FITC ، Alexa Fluor 488) مرشح انبعاث وطول موجي 624 نانومتر وعرض نطاق ترددي 40 نانومتر تكساس ريد (Alexa Fluor 594) مرشح أو مجهر بؤري مع ليزر خط 488 نانومتر (أزرق) للكشف عن التألق الأخضر (تم اكتشافه بين 510 و 560 نانومتر) وليزر خط 561 نانومتر (أصفر) للكشف عن التألق الأحمر ( تم اكتشافها بين 575 و 680 نانومتر). هدف الغمر (40x أو 63x أو 100x).

2. S1 الألياف الإعداد التجريبي (2 أيام)

  1. اليوم الأول: لوحة 4 آبار لكل خط خلية: ± UVC و ± S1 nuclease مع الخلايا عند التقاء 70-90٪.
    ملاحظة: يمكن إجراء التجربة بتنسيق صغير مثل لوحة 12 بئرا. في هذه الحالة ، يتم استخدام جميع الحلول عند 0.5 مل / بئر.
  2. اليوم 2: تحضير IdU الطازج عند 20 ميكرومتر و CldU عند 200 ميكرومتر في وسائط زراعة الخلايا المدفأة مسبقا (37 درجة مئوية).
  3. استنشاق وسائط الثقافة وأضف الوسائط على الفور باستخدام 20 ميكرومتر IdU واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 (حاضنة الخلايا) لمدة 20 دقيقة بالضبط.
  4. اغسل الخلايا بسرعة باستخدام PBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مرتين.
  5. تشعيع الخلايا مع 20 J / m2 UVC. استخدم الخلايا غير المعالجة كعناصر تحكم.
  6. أضف الوسائط على الفور مع 200 ميكرومتر CldU واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 (حاضنة الخلايا) لمدة 60 دقيقة بالضبط.
    ملاحظة: يمكن تبادل وسم IdU و CldU ، ولكن يجب أن يكون تركيز التناظرية الثانية أعلى 5-10 مرات من التناظرية الأولى. يمكن تكييف توقيت الحضانة التناظرية مع العامل السام للوراثة المستخدم ، ولكن يجب أن يكون وقت الحضانة التناظرية الثانية طويلا بما يكفي لضمان وقت كاف لتشكيل الفجوة14,16. في حالة استخدام دواء ضار بالحمض النووي ، أضف الدواء مع CldU28,29,30.
  7. اغسل الخلايا باستخدام PBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مرتين.
  8. تخلل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت CSK100 لمدة 8-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: يمكن التحقق من النفاذية الناجحة تحت المجهر الساطع حيث يجب ملاحظة النوى فقط
  9. اغسل النوى بعناية باستخدام PBS (صب 0.5 مل أسفل جانب كل بئر ، لبضع ثوان فقط).
  10. اغسل النوى بعناية باستخدام المخزن المؤقت S1 (صب 0.5 مل أسفل جانب كل بئر ، لبضع ثوان فقط).
  11. احتضن النوى باستخدام المخزن المؤقت S1 مع نوكليز S1 (20 U / mL) أو بدون (كعنصر تحكم) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (حاضنة الخلايا).
  12. استنشق المخزن المؤقت S1 وأضف 0.1٪ BSA في PBS.
  13. كشط النوى ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل مشروح بشكل مناسب. احتفظ بالأنابيب على الجليد طوال الوقت.
    ملاحظة: يمكن التحقق من الانفصال الناجح للنوى تحت مجهر برايتفيلد.
  14. بيليه النوى: جهاز طرد مركزي عند ~ 4600 × g لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تختلف عن فحص ألياف الحمض النووي القياسي ، لا يمكن حساب النوى ، لذلك ضع في اعتبارك العدد الأولي للخلايا المطلية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام بئر إضافي لم يتعرض للنفاذية لتقدير عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
  15. أعد تعليق الكريات جيدا في PBS بتركيز ~ 1500 خلية / ميكرولتر ، وضع الأنابيب على الجليد والمضي قدما في إعداد ألياف الحمض النووي عن طريق نشر بروتوكول (القسم 4) على الفور

3. الإعداد التجريبي لملء الفجوات (PRR) (3 أيام)

  1. اليوم 1: لوحة 2 آبار لكل خط خلية: ± UVC مع الخلايا عند التقاء ~ 70٪.
  2. اليوم 2: تحضير IdU الطازج عند 20 ميكرومتر في وسائط زراعة الخلايا المدفأة مسبقا (37 درجة مئوية).
  3. تشعيع الخلايا مع 20 J / m2 UVC.
  4. أضف الوسائط على الفور مع 20 ميكرومتر IdU واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 (حاضنة الخلايا) لمدة 60 دقيقة بالضبط.
  5. اغسل الخلايا باستخدام PBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مرتين.
  6. أضف الوسائط على الفور مع نوكودازول 200 نانوغرام / مل واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 (حاضنة الخلايا) لمدة 12-24 ساعة (يجب أن يظل توقيت هذه الخطوة متسقا بين التجارب).
    ملاحظة: قد يلزم تكييف تركيز نوكودازول وفقا لخط الخلية المستخدم. إذا كنت تستخدم دواء ساما وراثيا ، فقم باحتضان الخلايا باستخدام عقار IdU ±28.
  7. اليوم 3: استنشاق وسائل الإعلام الثقافية ، وإضافة الوسائط مع 20 ميكرومتر CldU + نوكودازول ، واحتضان لآخر 4 ساعات من علاج نوكودازول ، عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 (حاضنة الخلايا).
  8. اغسل الخلايا باستخدام PBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
  9. أضف التربسين واحتضنه لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 (حاضنة الخلايا) لفصل الخلايا.
  10. أضف نفس الحجم من وسائط زراعة الخلايا وجمع الخلايا (الوسائط + التربسين) في أنبوب 1.5 مل مشروح بشكل مناسب. حافظ على الأنابيب على الجليد طوال الوقت.
  11. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
  12. بيليه الخلايا: جهاز طرد مركزي في ~ 350 × غرام لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية.
  13. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في PBS عند ~ 1500 خلية / ميكرولتر.

4. إعداد ألياف الحمض النووي عن طريق الانتشار (~ 1 ساعة لمدة 12 شريحة)

  1. قم بتعليق شرائح المجهر بقلم رصاص كربوني وضعها مسطحة على صينية.
  2. اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لضمان التجانس.
  3. أضف 2 ميكرولتر من الخلايا أعلى الشريحة المقابلة.
    ملاحظة: يمكن إضافة قطرتين، واحدة في أعلى الشريحة والأخرى في منتصف الشريحة.
  4. أضف 6 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل وقم بتحليل الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي 5 مرات (تجنب صنع فقاعات).
  5. اسحب القطرة قليلا نحو الجزء السفلي من الشريحة باستخدام طرف الماصة (لتوجيه مسار انتشار السقوط).
  6. احتضان لمدة 5 دقائق في RT لتحليل النوى.
    ملاحظة: يمكن ضبط حجم المخزن المؤقت للتحلل ووقت التحلل إذا جف التحلل بسرعة كبيرة أو بدلا من ذلك، لم يجف بما فيه الكفاية. يمكن أن يختلف حجم المخزن المؤقت للتحلل من 5-7 ميكرولتر ويمكن أن يتراوح التوقيت بين 4-10 دقائق.
  7. قم بإمالة الشريحة عند حوالي 20-40 درجة واسمح للانخفاض بالانتشار إلى أسفل الشريحة بسرعة منخفضة ثابتة.
  8. اترك الشريحة لتجف في RT في الظلام (10-15 دقيقة).
  9. تحضير محلول التثبيت طازجا: امزج الميثانول: حمض الخليك الجليدي بنسبة 3: 1.
  10. اغمر الشرائح في جرة تحتوي على محلول التثبيت واحتضنها لمدة 5 دقائق في RT لتثبيت الحمض النووي على الشرائح.
    تحذير: الميثانول شديد السمية ويجب أن يبقى تحت غطاء كيميائي. تخلص منه في حاوية مناسبة.
  11. جفف الشرائح في RT في الظلام واحفظها على درجة حرارة 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى تلطيخها.

5. تلطيخ مناعي من ألياف الحمض النووي (~ 6 ساعات)

  1. اغسل الشرائح باستخدام PBS مرتين لمدة 5 دقائق.
  2. قم بتشويه الحمض النووي باستخدام 2.5 مليون HCl طازج لمدة 40-60 دقيقة في RT.
    تحذير: لتحضير 2.5 مليون HCl ، صب الحمض في الماء وليس العكس أبدا. هذا هو رد فعل طارد للحرارة لذلك سوف يسخن قليلا.
  3. اغسل الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
  4. كتلة مع 5٪ BSA (يمكن تخزينها في 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة استخدامات) تم تسخينها مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. قم بإزالة السائل الزائد من الشرائح عن طريق النقر برفق على ورقة.
  6. أضف 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (الفأر المضاد ل BrdU 1/20 (ل IdU) والفئران المضادة ل BrdU 1/100 (ل CldU) المخففة في PBS-T-BSA) إلى الشرائح dropwise ووضع غطاء في الأعلى. احتضان لمدة 1-1.5 ساعة في RT في غرفة مظلمة ورطبة.
  7. ضع الشرائح في جرة مع PBS لمدة 1-2 دقيقة ، ثم قم بإزالة الأغطية بعناية.
  8. اغسل مع PBS-T في جرة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق ، ثم ضع الشرائح في PBS.
  9. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق النقر برفق على ورقة.
  10. أضف 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (مضاد الفأر Alexa Fluor 594 ومضاد للفئران Alexa Fluor 488 المخفف عند 1/75 في PBS-T-BSA.) إلى الشرائح بانخفاض ووضع غطاء في الأعلى. احتضن لمدة 45-60 دقيقة في RT في غرفة مظلمة ورطبة.
  11. ضع الشرائح في جرة مع PBS لمدة 1-2 دقيقة ، ثم قم بإزالة الأغطية بعناية.
  12. اغسل مع PBS-T في جرة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق ، ثم ضع الشرائح في PBS.
  13. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق النقر برفق على ورقة.
  14. أضف 20 ميكرولتر من كاشف التركيب قطرة إلى الشرائح وضع غطاء في الأعلى. تجنب الفقاعات.
  15. اترك الشرائح تجف في RT في الظلام ، ثم احفظها في 4 درجات مئوية (أو -20 درجة مئوية للحفظ لفترة أطول).

6. الحصول على الصور وتحليلها (~ 1 ساعة لكل عينة)

ملاحظة: يمكن استخدام مجهر epifluorescence لكلا البروتوكولين. ومع ذلك ، بالنسبة لفحص ملء الفجوة (PRR) ، يوصى بشدة باستخدام المجهر البؤري لزيادة دقة الصور.

  1. ضع قطرة من زيت الغمر (محدد المجهر) بالقرب من الجزء العلوي من الشريحة حيث تم تحليل الخلايا وابحث عن التركيز باستخدام القناة الخضراء عن طريق البحث عن النقاط الخضراء في الخلفية (يمكن استخدام أهداف 40x و 63x و 100x).
  2. ابحث عن التركيز الرئيسي للألياف وانتقل إلى الحواف للعثور على ألياف فردية غير متداخلة منتشرة بشكل جيد باستخدام قناة واحدة فقط لتحديد مناطق الصور وتجنب التحيز المحتمل.
  3. التقط حوالي 15-20 صورة لكل شريحة إلى جانب الشريحة بأكملها في القناتين الخضراء والحمراء وادمج القناتين للحصول على ألياف الحمض النووي ثنائية اللون.
    ملاحظة: في حالة استخدام مجهر متحد البؤرة، التقط صورا بدقة عالية (1024 × 1024 بكسل) واستخدم قيم ثقب قريبة من 1 لكل من التألق الأحمر والأخضر.
  4. استخدم ImageJ (برنامج مجاني توفره المعاهد الوطنية للصحة ، https://imagej.nih.gov/ij/) لقياسات طول المسالك IdU و CldU.
    1. افتح صورة عن طريق سحبها إلى المربع ImageJ.
    2. استخدم شريط المقياس الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج المجهر (تمت معايرته بشكل مناسب) لتحويل الطول إلى ميكرومتر. استخدم أداة الخط المستقيم عن طريق تحديد الرمز 5th من اليسار إلى اليمين في مربع ImageJ لقياس شريط المقياس في الصورة المقدمة ميكرومتر والحصول على قياس بالبكسل. انقر فوق تحليل > تعيين المقياس واستبدال "المسافة بالبكسل" بالرقم المناسب و "وحدة الطول" إلى ميكرومتر.
    3. في المربع ImageJ ، حدد أداة الخط المجزأ بالنقر بزر الماوس الأيسرعلى أيقونة 5th من اليسار إلى اليمين ثم تحديد الخيار الثاني من أعلى إلى أسفل.
    4. ارسم المسار الدقيق للمسار الأحمر (IdU) أو الأخضر (CldU) عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر وأوقف الرسم بالنقر بزر الماوس الأيمن. اضغط على الزر M على لوحة المفاتيح لقياس الطول.
    5. بالنسبة لألياف S1 ، قم فقط بتحليل الأحمر والأخضر (الألياف ثنائية اللون)16. قم بقياس أطوال المسالك الحمراء والخضراء من 150 ليفا على الأقل من صور مختلفة من خلال تتبع قياسات المسالك الحمراء والخضراء لكل ألياف فردية.
    6. بالنسبة لفحص ملء الفجوات ، قم فقط بقياس طول مسالك IdU (الحمراء) التي تحتوي على ما لا يقل عن 1 رقعة CldU (خضراء) ولكن لا يوجد تلطيخ CldU مستمر. سجل ما لا يقل عن 10-15 مسالك IdU من صور مختلفة مع ما لا يقل عن 1 CldU التصحيح.
      ملاحظة: يمكن استخدام برامج أخرى للتحليلات، مثل Zeiss LSM Image Browser.
  5. بالنسبة لألياف S1 ، ارسم طول مساحات IdU وطول مساحات CldU والنسب (CldU / IdU أو العكس) في رسومات منفصلة كمخططات نقطية مبعثرة مع وسطيات.
  6. قم بقياس أحداث ملء الفجوة كوحدات "لكل كيلوقاعدة كباعة" ، واقسم العدد الإجمالي لبقع CldU (PRR ، الخضراء) على طول معين من IdU (الأحمر) على الطول الإجمالي للمسار الأحمر بالكيلوقاعدة (مع الأخذ في الاعتبار 1 ميكرومتر = 2.59 كيلو قاعدة31). ثم ارسم البيانات كمؤامرات نقطية مبعثرة مع وسطيات.
  7. في كلتا التجربتين ، قم بإجراء تحليل إحصائي بين عينتين باستخدام Mann-Whitney (اختبار غير بارامتري) وبين أكثر من عينتين باستخدام Kruskal-Wallis متبوعا باختبار المقارنات المتعددة ل Dunn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في فحص الألياف S1 ، إذا أدى العلاج بعامل سام وراثيا إلى فجوات ssDNA بعد التكرار ، فإن الأطوال الإجمالية لألياف الحمض النووي من النوى المعالجة ب S1 ستكون أقصر عند العلاج بتلف الحمض النووي مقارنة بالعينات غير المعالجة وكذلك العينات التي عولجت بالعامل السام الوراثي ولكن لم يتم تقديمها إلى الانقسام S1 (الشكل 1).

بدلا من ذلك ، إذا كان العلاج باستخدام نوكليز S1 لا يؤثر بشكل كبير على طول ألياف الحمض النووي مقارنة بالخلايا غير المعالجة ، فمن الممكن إجراء تفسيرات مختلفة: (1) لا يوجد تكوين فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل عند العلاج بالعامل السام الوراثي المستخدم ، و / أو في الخلفية الجينية المحددة التي تم التحقيق فيها. في الواقع ، لقد أظهرنا سابقا أن المنتجات الضوئية 6-4 الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية (6-4PP) ولكن ليس سيكلوبوتان بيريميدين ديمرز (CPD) تؤدي إلى تكوين فجوات ssDNA في الخلايا التي تعاني من نقص لإصلاح استئصال النيوكليوتيدات (NER ، خلايا XP-C)14. (2) تم إصلاح فجوات ssDNA ولم يعد من الممكن اكتشافها. (3) إن التقصير الناجم عن العلاج بالعامل السام للوراثة وحده واضح جدا بحيث لا يسمح بالكشف عن مزيد من التقصير عن طريق الانقسام S1.

ومن الجدير بالذكر أن عدم تأثير S1 قد يعكس أيضا مسائل تقنية مثل الظروف الضعيفة لنشاط S1، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني غير المناسب للمخزن المؤقت S1 أو كمية محدودة من الزنك.

Figure 1
الشكل 1: الكشف عن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل على الشوكات المستمرة بواسطة فحص الألياف S1. (أ) التمثيل التخطيطي لمقايسات ألياف الحمض النووي مع نوكلياز S1 المحدد ل ssDNA (ألياف S1). يتم تصنيف شوكات النسخ المتماثل المتقدمة بنظائر الثيميدين (IdU ، CldU) ويمكن قياسها بعد انتشار الحمض النووي والتلطيخ المناعي. على اليسار ، فإن الشوكات القياسية المتقدمة بدون فجوات ليست عرضة للانقسام بواسطة نوكليز S1. صحيح ، سيتم استهداف الفجوات في الحمض النووي الناشئ التي لا يمكن اكتشافها تقليديا بواسطة نوكليز S1 وسيتم تصورها على أنها مساحات CldU أقصر. (ب) مخطط بروتوكول الألياف S1. (ج) صور تمثيلية لألياف S1. أعلى ، والسيطرة على المسالك الحمض النووي الناشئة دون ثغرات ، منيعة للانقسام بواسطة نوكليز S1. في الأسفل ، مسار الحمض النووي إيجابي للفجوات المشقوقة بواسطة نوكليز S1 مما يؤدي إلى طول مسار CldU (أخضر) أقصر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في فحص سد الفجوات (PRR) ، تشير الزيادة الكبيرة في كثافة بقع CldU القصيرة على مسالك IdU إلى زيادة أحداث ملء الفجوة (الشكل 2). يمكن أن تنعكس الكثافة العالية لأحداث PRR بواسطة حدث PRR 1 (رقعة خضراء / CldU) في مسار IdU قصير وكذلك من خلال أحداث PRR متعددة في مسار طويل (انظر الصور التمثيلية الشكل 2C). يجب إجراء التحليل بدقة عن طريق تسجيل بقع CldU فقط الموجودة فوق مسالك IdU مع الأخذ في الاعتبار أن بقع CldU صغيرة ويمكن بسهولة الخلط بينها كخلفية ملطخة (انظر الصور التمثيلية الشكل 2C).

Figure 2
الشكل 2: الكشف عن الإصلاح اللاحق للتكرار عن طريق ملء الفجوة. (أ) مخطط المسالك الحمراء (IdU) مع رقعة خضراء (CldU) تشير إلى حدث ملء الفجوة. (ب) مخطط البروتوكول المستخدم للكشف عن سد الثغرات. (ج) صور تمثيلية من فحص سد الفجوات (PRR). تتوافق مساحات IdU الأطول اليسرى مع رقعة CldU واحدة على الأقل و / أو عدد أقل من بقع CldU مع كثافة منخفضة لملء الفجوة (عدد أقل من أحداث ملء الفجوات). صحيح ، تتوافق مساحات IdU الأقصر مع رقعة CldU واحدة على الأقل ومساحات IdU الأطول مع المزيد من بقع CldU الإجمالية مع كثافة عالية لملء الفجوة (المزيد من أحداث ملء الفجوات). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نوقشت الخطوات الحاسمة لبروتوكول فحص ألياف الحمض النووي القياسي في منشور سابق32. هنا ، نصف الإصدارات المعدلة من فحص ألياف الحمض النووي القياسي للتحقيق في وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل وكذلك إصلاحها عن طريق ملء الفجوات ، الموصوفة في البداية في14. في سياق وجود فجوة ssDNA بعد النسخ المتماثل ، من المرجح أن يكون استخدام نوكليز S1 في بروتوكول الألياف S1 مناسبا بعد التعرض لعامل سام وراثي لمدة لا تقل عن 1 ساعة لإتاحة الوقت لتشكيل الفجوة والكشف اللاحق. ومع ذلك ، من الضروري ملاحظة أنه في بعض خطوط الخلايا أو الخلفيات الجينية ، قد يؤدي استخدام نوكلياز S1 إلى توليد مساحات أقصر حتى بدون علاج إضافي بعوامل سامة جينية33,34. لذلك ، من الأهمية بمكان تضمين جميع الضوابط لضمان الاستنتاج السليم حول ما إذا كان العلاج بعامل سام وراثيا يؤدي إلى تراكم الفجوات. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم التحقق من صحة نتيجة ألياف S1 عن طريق تكرار الفحص في الظروف التي لم تعد فيها فجوات ssDNA تتشكل أو يتم إصلاحها.

فيما يتعلق بفحص ملء الفجوة (PRR) ، من المهم تحسين تركيز جرعة / دواء UVC الذي لا يؤثر على الطول الكلي لألياف الحمض النووي ، حيث يتم حساب النتائج ككثافة لكل كيلوقاعدة . إذا تم استخدام تركيز يحفز تقصير المسالك ، فقد تنحرف النتائج بشكل مصطنع نحو زيادة كثافة ملء الفجوة ، مما يجعل تفسير البيانات صعبا. لمواجهة هذا القيد ، يمكن تصور أحداث ملء الفجوة فوق الحمض النووي غير المسمى عن طريق تلطيخ الحمض النووي الكلي باستخدام جسم مضاد مضاد ل ssDNA ، كما هو موضح سابقا14,16. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء تجربة حركية لضمان أقصى قدر من الكشف عن أحداث سد الفجوات.

لاحظ أنه يمكن أيضا مراقبة أحداث ملء الفجوات باستخدام فحص الألياف S1 عندما يسمح للخلايا بالتعافي قبل العلاج باستخدام نوكليز S1. على وجه التحديد ، عندما يتم ملء الفجوات اللاحقة للتكرار ، تصبح ألياف الحمض النووي غير حساسة للانقسام بواسطة نوكليز S1 ، وبالتالي يمكن استخدام طول ألياف الحمض النووي كقراءة لملء الفجوة في هذا السياق28. وبالتالي ، يمكن استخدام هذا النهج لدراسة سد الفجوات طوال دورة الخلية ، بشكل مختلف عن فحص PRR الذي يقتصر على التحقيق في سد الفجوة في G2 / M.

وأخيرا ، تم التحقق من صحة البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام اختبار PRR باستخدام S1 Fiber28 ، مما يشير إلى أن nocodazole والانسداد الاصطناعي للخلايا في G2 / M أثناء فحص PRR لا يؤثران على ملء الفجوة. يمكن استخدام العوامل الأخرى التي تحفز انسداد مرحلة G2 / M في هذا الفحص

تم استخدام ألياف S1 بشكل متزايد من قبل المختبرات في جميع أنحاء العالم ، مما يوفر رؤى جديدة حول آليات تكوين فجوات ssDNA ويكشف عن الظروف التي لم تكن موضع تقدير من قبل والتي يمكن فيها تشكيل هذه الفجوات14،29،34،35،36. بالنسبة للتحقيقات المستقبلية ، سيكون من المثير للاهتمام الجمع بين هذه البروتوكولات المعدلة ونهج النقطة الكمومية الذي يسمح بالتصور المباشر لآفة الحمض النووي37 لتوضيح الحديث المتبادل بين تكوين فجوة ssDNA بعد النسخ المتماثل وإصلاح الحمض النووي وكذلك كيف تحدد طبيعة الضرر آلية استجابة الإجهاد التكراري. كبديل لفحص الألياف S1 ، يمكن أيضا استخدام نوكليز S1 لدراسة عملية ملء الفجوة في فحص مذنب محايد معدل. باختصار ، إذا كانت هناك فجوات ، فإن معالجة المذنبات باستخدام نوكليز S1 تؤدي إلى تكوين فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل ، يمكن اكتشافها عن طريق فحص المذنبات المحايدة. تم نشر بروتوكولات فحص المذنبات المحايدة وكذلك فحص المذنبات المعدلة بالإنزيم سابقا38,39. على وجه الخصوص ، يسمح هذا النهج باكتشاف فجوة ssDNA في جميع مراحل دورة الخلية ، دون الحاجة إلى اعتقال الخلايا في مرحلة G2. باستخدام هذا النهج ، جنبا إلى جنب مع بروتوكولات الألياف S1 وملء الفجوات (PRR) الموضحة هنا ، وجدنا أن REV3L (وحدة تحفيز الحمض النووي بوليميراز زيتا) مسؤولة عن سد الفجوات التي تشكلت عند وجود 6-4PPs الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية في الجينوم البشري14.

ومع محدودية النهج التقني المتاح، ظل تكوين فجوة الحمض النووي عبر الحمض النووي بعد النسخ المتماثل، وعلى وجه الخصوص، أحداث سد الفجوات غير مستكشفة إلى حد كبير في الخلايا البشرية. وإجمالا، توفر هذه التقنيات المعدلة (ألياف S1، وفحص ملء الفجوات (PRR)، والمذنب S1) استراتيجيات جديدة للتحقيق في وجود فجوات الحمض النووي (ssDNA) وكيفية ملء هذه الفجوات في نهاية المطاف في الجينوم البشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يتم دعم العمل في مختبر C.F.M.M. من قبل Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP ، ساو باولو ، البرازيل ، المنح # 2019/19435-3 ، # 2013/08028-1 و 2017/05680-0) في إطار أبحاث التعاون الدولي من FAPESP والمنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO ، هولندا) ؛ Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Financial Code 001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid, Glacial Synth 64-19-7 Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Ammonium hydroxide Synth 1336-21-6 Or similar
Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 Invitrogen A11005 -
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 Invitrogen A21470 -
Antibody Mouse anti-BrdU Becton Disckson 347580 -
Antibody Rat anti-BrdU Abcam  Ab6326 -
Biological security hood Pachane PA 410 Use hood present in the laboratory
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294 Or similar
Cell scraper Thermo Scientific 179693 Or similar
CldU Millipore-Sigma C6891 -
Cloridric acid Synth 7647-01-0 Or similar
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) Zeiss - Or similar
Cover glass (or coverslips) Thermo Scientific 152460 Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High Glucose LGC/Gibco BR30211-05/12100046 Use culture media specific for the cell line used.
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) Sigma-Aldrich E5314 Or similar
Epifluorescence Microscope Axiovert 200 Zeiss - Or similar
FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco 12657-029 Or similar
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 3110 13-998-074 Use cell incubator present in the laboratory
Glass slide jar Sigma-Aldrich S5516 Or similar
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5 Or similar
Idu Millipore-Sigma I7125 -
Magnesium Chloride Synth 7791-18-6 Or similar
Methanol Merck 67-56-1 Or similar
Microscope slides Denville M1021 Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) Synth 1132-61-2 Or similar
Nocodazole Sigma-Aldrich 31430-18-9 -
PBS (Phosphate Buffer Saline) Life Thechnologies 3002 Or similar
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Or similar
ProLong Gold AntiFade Mountant Invitrogen P36930 Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used
S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae Invitrogen 18001-016 Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) BioRad 161-0302 Or similar
Sodium Acetate Trihydrate Sigma-Aldrich 6131-90-4 Or similar
Sodium Chloride Synth  7647-14-5 Or similar
Sucrose Sigma-Aldrich 57-50-1 Or similar
Tris Base West Lab Research BP152-1 Or similar
Triton X-100 Synth 9002-93-1 Or similar
Trypsin Gibco 25200072 Or similar
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 Or similar
UVC Lamp Non Specific - Essential: emission lenght of 254 nm
VLX-3W UV Radiometer Vilber Loumart - Or similar
Zinc Acetate Sigma-Aldrich 557-34-6 Or similar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
  3. Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
  4. Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
  5. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
  6. Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
  7. García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
  8. Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
  9. Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
  10. Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
  11. Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
  12. Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
  13. Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  14. Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
  15. Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  16. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  17. Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
  18. Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
  19. Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
  20. Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
  21. Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
  22. Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
  23. Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
  24. Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
  25. Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
  26. Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
  27. Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
  28. Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
  29. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  30. Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
  31. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  32. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
  33. Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
  34. Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
  35. Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
  36. Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
  37. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  38. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
  39. Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).

Tags

علم الوراثة ، العدد 180 ، فجوة الحمض النووي الأحادية التي تقطعت بها السبل بعد النسخ المتماثل ، ملء الفجوة ، إصلاح ما بعد النسخ المتماثل ، تكرار الحمض النووي ، فحص ألياف الحمض النووي ، نوكليز S1 ، التوبيخ
الكشف عن تراكم الفجوات بعد التكرار وإصلاحها في الخلايا البشرية باستخدام فحص ألياف الحمض النووي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, D. J., Tirman, S., Quinet,… More

Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. M. Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay. J. Vis. Exp. (180), e63448, doi:10.3791/63448 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter