Summary
Aqui descrevemos duas modificações do ensaio de fibra de DNA para investigar lacunas de DNA de uma única vez na replicação do DNA após indução da lesão. O ensaio de fibra S1 permite a detecção de lacunas pós-replicativas usando a endonuclease S1 específica do SSDNA, enquanto o ensaio de preenchimento de lacunas permite visualização e quantificação do reparo de lacunas.
Abstract
O ensaio de fibra de DNA é um método simples e robusto para a análise da dinâmica do garfo de replicação, baseado na imunodeetecção de análogos nucleotídeos que são incorporados durante a síntese de DNA em células humanas. No entanto, essa técnica tem uma resolução limitada de alguns milhares de quilobases. Consequentemente, lacunas de DNA de uma única cadeia pós-replicação (ssDNA) tão pequenas quanto algumas centenas de bases não são detectáveis pelo ensaio padrão. Aqui, descrevemos uma versão modificada do ensaio de fibra de DNA que utiliza o nuclease S1, uma enzima que especificamente corta ssDNA. Na presença de lacunas ssDNA pós-replicativas, a nuclease S1 atingirá e diminuirá as lacunas, gerando setores mais curtos que podem ser usados como leitura para lacunas ssDNA em garfos em andamento. Essas lacunas de DNA pós-replicação são formadas quando o DNA danificado é replicado descontínua. Eles podem ser reparados através de mecanismos desacoplados da replicação do genoma, em um processo conhecido como preenchimento de lacunas ou reparo pós-replicativo. Como os mecanismos de preenchimento de lacunas envolvem a síntese de DNA independente da fase S, alterações no esquema de rotulagem de fibras de DNA também podem ser empregadas para monitorar eventos de preenchimento de lacunas. Ao todo, essas modificações do ensaio de fibra de DNA são estratégias poderosas para entender como as lacunas pós-replicativas são formadas e preenchidas no genoma das células humanas.
Introduction
Trabalhos seminais têm proporcionado evidências do acúmulo de lacunas pós-replicativas de single-stranded (ssDNA) após o tratamento com agentes prejudiciais ao DNA em bactérias1 e células humanas 2,3. Durante a replicação de modelos de DNA danificados, o maquinário de síntese de DNA pode contornar as lesões empregando polimerases específicas de DNA de translesão ou através de mecanismos de comutação de modelos. Alternativamente, o replisome também pode simplesmente pular a lesão deixando uma lacuna ssDNA para trás, para ser reparado mais tarde. Mais recentemente, um estudo mostrou claramente que o tratamento com agentes genotóxicos leva a lacunas de SSDNA em eucariotes utilizando microscopia eletrônica para visualizar a estrutura específica dos intermediários de replicação4. A formação dessas regiões de lacunas pós-replicativas foi inicialmente proposta como um simples resultado do modo semicontínuo de replicação de DNA2. Neste caso, uma lesão na cadeia defasada pode bloquear o alongamento de um fragmento de Okazaki, mas a progressão do garfo é naturalmente resgatada pelo seguinte fragmento de Okazaki, deixando para trás uma lacuna de SSDNA. No entanto, outros estudos demonstraram que a formação de lacunas na cadeia líder também é possível, como mostrado pela primeira vez na bactéria5. Nos eucariotes, primpol, uma polimerase de DNA única com atividade primase, mostrou-se capaz de reiniciar a síntese de DNA a jusante uma lesão de bloqueio de replicação através de sua atividadede replicação 6,7,8,9,10,11. Assim, a atividade primase primpol pode explicar a formação de lacunas de SSDNA pós-replicativa na cadeia líder após o tratamento com um agente prejudicial ao DNA em células humanas12. No entanto, a detecção dessas lacunas, bem como o reparo de lacunas, até recentemente, exigiu abordagens indiretas ou demoradas, como microscopia eletrônica4 ou ensaios baseados em plasmídeos13. O uso da nuclease S1 específica do SSDNA para detectar lacunas em células humanas foi pioneiro por estudos iniciais há mais de quarenta anos, utilizando técnicas de gradientede sacarose 2,3. Mais recentemente, nosso grupo aplicou o uso deste nuclease para detectar ssDNA na replicação de DNA (lacunas pós-replicativas) usando outros métodos como fibra de DNA e ensaios de cometa14. Essas novas abordagens abriram caminho para a atual onda de estudos sobre lacunas pós-replicativas. Aqui, descrevemos uma estratégia de uso da nuclease S1 para detectar lacunas de SSNA pós-replicativas por ensaio de fibra de DNA e explicar como um esquema diferenciado de rotulagem no protocolo de fibra de DNA pode permitir o estudo do reparo dessas lacunas.
O ensaio de fibra de DNA é uma técnica poderosa que tem sido usada por um número crescente de laboratórios e forneceu insights valiosos sobre a dinâmica do garfo de replicação e mecanismos de resposta ao estresse de replicação. Resumidamente, esta técnica é baseada na incorporação sequencial de análogos nucleotídeos (como CLdU -5-chloro-2'-desoxyuridine-, e IdU -5-iodo-2'-deoxyuridina) no DNA replicante. Após a colheita, as células são lístidas, e moléculas de DNA se espalham em um slide de vidro revestido positivamente. A UI e a IdU são então detectadas por anticorpos específicos, que podem ser visualizados em um microscópio fluorescente como fibras bicolorizadas. Finalmente, os comprimentos dos tratos de IdU e CLdU são medidos para identificar quaisquer alterações da dinâmica de replicação de DNA como consequência da indução de danos de DNA. Essa técnica pode ser utilizada para investigar diferentes fenômenos, como empatou o garfo, desaceleração do garfo, degradação nascente do DNA e variações na frequência de origem disparando15,16.
Uma limitação do ensaio de fibra de DNA é a resolução de algumas quilobases. Como as lacunas de SSNA pós-replicação podem estar na faixa de centenas de bases, é impossível visualizar essas lacunas diretamente pelo protocolo padrão de fibra de DNA. A presença de lacunas de SSDNA na replicação do DNA em células humanas tratadas com agentes genotoxicos já foi indiretamente implicada antes. Por exemplo, a observação do SSDNA como avaliado pelo recrutamento da proteína de ligação ssDNA, proteína de replicação A (RPA), em células fora da fase S, ou a formação de ssDNA como detectado pelo desenrolar do DNA alcalino combinado com a ausência de bifurcação prolongada por fibra de DNA, conforme 12,17,18,19,20,21 foi atribuído ao acúmulo de lacunas de SSDNA. Além disso, as lacunas de SDNA pós-replicação induzem um ponto de verificação de fase G2/M dependente de ATR e células de prisão tratadas com venenos de replicação 18,19,20,21,22.
O nuclease S1 degrada ácidos nucleicos de fio único liberando mono-ligonucleotídeos de 5'-phosforryl ou oligonucleotídeos e tem uma afinidade 5 vezes maior com o SSDNA em comparação com o RNA. Ácidos nucleicos de dupla tração (DNA:DNA, DNA:RNA ou RNA:RNA) são resistentes à nuclease S1, exceto quando usados em concentrações extremamente altas. A nuclease S1 também corta DNA de dupla renda na região de um único fio causada por um corte, lacuna, incompatibilidade ou loop. A nuclease S1 é, portanto, uma endonuclease específica do SSDNA capaz de cortar lacunas de SSDNA, gerando, em última análise, quebras duplasencalhadas 23,24. Assim, adicionar etapas para a digestão de nuclease S1 ao protocolo de fibra de DNA indiretamente permite a detecção de lacunas ssDNA pós-replicativas. Na presença de lacunas, o tratamento de núcleos expostos com a nuclease S1 antes da disseminação do DNA gerará tratos mais curtos como consequência do decote S1 do SSDNA inerentemente presente nas lacunas14. Assim, o encurtamento do trato é a leitura para lacunas ssDNA usando esta abordagem. Em comparação com o protocolo padrão de fibra de DNA, a fibra de DNA com a nuclease S1 requer apenas dois passos extras: exposição de núcleos (permeabilização celular) e tratamento com a nuclease S1. É importante notar que os controles adequados são obrigatórios, como amostras tratadas com o agente genotóxico, mas sem a nuclease S1 e amostras tratadas com a nuclease S1 sem o agente genotóxico. O próprio protocolo, incluindo a incorporação de análogos, tratamento S1 e disseminação, pode ser realizado em um dia e não requer material excepcional. Requer apenas os análogos de timmidina, a nuclease S1 purificada, os anticorpos primários e secundários apropriados, e um microscópio fluorescente. No geral, a fibra de DNA que emprega o nuclease S1 detecta lacunas ssDNA em garfos de replicação em andamento usando uma abordagem relativamente simples.
As lacunas de DNA pós-replicação formadas como consequência de mecanismos de resposta ao estresse de replicação podem ser reparadas (ou preenchidas) por diferentes mecanismos, incluindo síntese de DNA de translesão ou comutação de modelo, em um processo chamado de preenchimento de lacunas ou reparo pós-replicação (PRR)25. Esses processos ocorrem por trás do avanço dos garfos, envolvendo a síntese de DNA independente da replicação 14,26,27. Com base nesses achados, um esquema de rotulagem distinto do ensaio padrão de fibra de DNA pode ser realizado para visualizar eventos de preenchimento de lacunas na fase G2 diretamente 14,16,26,28. Especificamente, um analógico de timmidina pode ser usado para rotular o garfo de replicação no momento do tratamento genotoxico e a formação de lacunas ssDNA pós-replicação, enquanto outro analógico de timmidina pode ser usado para rotular eventos de preenchimento de lacunas. Neste protocolo, as células são rotuladas com um primeiro analógico de timmidina (UI, por exemplo) imediatamente após ou concomitantemente com tratamento genotóxico por 1h, de modo que o DNA nascente seja rotulado no momento da formação de lacunas. O nocodazol é adicionado após o tratamento para qualquer lugar entre 12-24 h para prender células em G2/M, impedindo a fase S seguinte. Para as últimas 4 horas de tratamento nocodazol, um segundo analógico de timmidina (CLdU, por exemplo) é adicionado à mídia a ser incorporada durante o preenchimento de lacunas. É importante ressaltar que este ensaio só pode ser usado para detectar eventos de preenchimento de lacunas no G2 porque o sinal de preenchimento de lacunas da UIC não pode ser distinguido de um sinal devido à incorporação do CLdU na replicação do DNA na fase S. Portanto, para minimizar o sinal de fundo, o tempo de incorporação da CLDU após indução de danos deve coincidir com quando a maioria da população celular está entrando na faseG2 14. Portanto, esse tempo vai variar dependendo da linha celular e das condições de tratamento. A otimização da progressão do ciclo celular antes de empregar este ensaio é aconselhável. A co-coloração desses análogos de timmidina permite a visualização de tratos de preenchimento de lacunas (manchas de PRR) em cima de DNA nascente (tratos de IdU) sintetizados durante o tratamento genotóxico quando foram geradas lacunas de SSDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Como o estudo utiliza células humanas, o trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP, número de aprovação nº 48347515.3.00005467) para a pesquisa com amostras humanas.
NOTA: Os protocolos aqui descritos foram utilizados em publicações anteriores com pequenas modificações 14,16,28. Aqui o foco é o uso da luz ultravioleta C (UVC) como um agente prejudicial ao DNA. No entanto, outros agentes prejudiciais ao DNA, como cisplatina e hidroxiureia, também foram empregados com sucesso28. Este protocolo pode ser realizado em uma variedade de linhas celulares, incluindo U2OS, HEK293T, fibroblastos humanos e outros 14,28,29. É essencial determinar a questão experimental antes de realizar este protocolo. O ensaio de fibra de DNA com a nuclease S1 (chamada fibra S1 daqui em diante) é usado para detectar a presença de lacunas de DNA pós-replicação, enquanto o ensaio de preenchimento de lacunas (ou PRR) é realizado para quantificar eventos de preenchimento de lacunas na fase G2. Assim, se analisar a presença de lacunas ssDNA pós-replicativas, o investigador deve realizar a seção 2 (configuração experimental de Fibra S1) e seguir diretamente para a seção 4 (preparação de fibra de DNA por disseminação) do protocolo. Se analisar eventos de preenchimento de lacunas, o investigador deve seguir diretamente para a configuração experimental da seção 3 (Gap-filling (PRR).
1. Reagentes e configuração
- Analoges de timmidina: Resuspend 5-Iodo-2'-desoxyuridine (IdU) e 5-Chloro-2'-desoxyuridina (CldU) em 1 N NH4OH a uma concentração final de 100 mM. Filtre os analógicos através de um filtro de seringa estéril (0,2 μm), aliquot e armazene-os a -20 C.
- Anticorpos: Primárias - rato anti-BrdU (Biorad) e camundongo anti-BrdU (BD); Secundários - anti-rato Alexa Fluor 488 e anti-mouse Alexa Fluor 594.
- Tampão de permeabilização celular CSK100 para a Fibra S1: Adicione 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7.2], 300 mM de sacarose e 0,5% Triton X-100 em H2O destilado.
- Tampão de nuclease S1 [pH 4.6]: Adicione acetato de sódio de 30 mM [pH 4.6], acetato de zinco de 10 mM, 50 mM NaCl e 5% Glicerol em H2O.
NOTA: O tampão de nuclease S1 deve ter um pH final de 4,6, já que a atividade S1 cai 50% em pH > 4,9. - Aliquot e armazene a -20 °C o nuclease S1 purificado de A. oryzae pré-diluído no tampão de diluição de nuclease S1 fornecido pelo fabricante.
- Reconstitua o nocodazol em DMSO a uma concentração final de 2 mM para preenchimento de lacunas. Análise.
- Tampão de lise: Adicione 200 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM EDTA e 0,5 % SDS em H2O.
- Preparar soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
- Prepare o PBS-T adicionando 0,1% de Tween-20 na PBS.
- Prepare 5% DeUm Bovine Albumin (BSA) na PBS.
- Prepare 0,1% BSA na PBS.
- Prepare o PBS-T-BSA adicionando 1% de BSA no PBS-T.
NOTA: Use um microscópio epifluorescente com uma lâmpada de mercúrio ou xenônio com um comprimento de onda de 510 nm e 42 nm de largura de banda GFP (FITC, Filtro de emissão Alexa Fluor 488) e um filtro de emissão de 624 nm e largura de banda Texas Red (Alexa Fluor 594) ou um microscópio confocal com um filtro de 48 Laser de linha 8-nm (azul) para detectar fluorescência verde (detectada entre 510 e 560 nm) e um laser de linha de 561 nm (amarelo) para detectar fluorescência vermelha ( detectado entre 575 e 680 nm). Objetivo de imersão (40x, 63x ou 100x).
2. Configuração experimental de fibra S1 (2 dias)
- Dia 1: Placa 4 poços para cada linha celular: ± UVC e ± nuclease S1 com células a 70-90% de confluência.
NOTA: O experimento pode ser feito em um formato tão pequeno quanto uma placa de 12 poços. Neste caso, todas as soluções são usadas a 0,5 mL/well. - Dia 2: Prepare idU fresco a 20 μM e CLdU a 200 μM em mídia de cultura celular pré-aquecida (37 °C).
- Aspire a mídia cultural e adicione imediatamente a mídia com 20 μM IdU e incuba as células a 37 °C, 5% DE CO2 (incubadora celular) por precisamente 20 minutos.
- Lave rapidamente as células com PBS pré-aquecido (37 °C) duas vezes.
- Irradie as células com 20 J/m2 UVC. Use células não tratadas como controles.
- Adicione imediatamente a mídia com 200 μM cldU e incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 (incubadora celular) por precisamente 60 min.
NOTA: A etiqueta idU e a cldu pode ser intercambiada, mas a concentração do segundo analógico deve ser 5-10 vezes maior do que o primeiro analógico. O tempo da incubação analógica pode ser adaptado ao agente genotóxico utilizado, mas o tempo da segunda incubação analógica deve ser longo o suficiente para garantir tempo suficiente para a formação delacunas 14,16. Se usar uma droga prejudicial ao DNA, adicione a droga junto com a U.C. 28,29,30. - Lave as células com PBS pré-aquecido (37 °C) duas vezes.
- Permeabilize as células com o buffer CSK100 por 8-10 min em temperatura ambiente (RT).
NOTA: A permeabilização bem-sucedida pode ser verificada sob um microscópio de campo brilhante onde apenas núcleos devem ser observáveis - Lave cuidadosamente os núcleos com PBS (despeje 0,5 mL para baixo na lateral de cada poço, apenas por alguns segundos).
- Lave cuidadosamente os núcleos com tampão S1 (despeje 0,5 mL pelo lado de cada poço, apenas por alguns segundos).
- Incubar os núcleos com tampão S1 com nuclease S1 (20 U/mL) ou sem (como controle) por 30 min a 37 °C (incubadora celular).
- Aspire o buffer S1 e adicione 0,1% de BSA no PBS.
- Raspe os núcleos e transfira-os para um tubo de 1,5 mL apropriadamente anotado. Mantenha tubos no gelo o tempo todo.
NOTA: O descolamento bem sucedido dos núcleos pode ser verificado sob um microscópio de campo brilhante. - Pelota os núcleos: centrífuga a ~4600 x g por 5 min, a 4 °C.
NOTA: Diferente do ensaio padrão da fibra de DNA, os núcleos não podem ser contados, por isso considere o número inicial de células banhadas. Alternativamente, um poço extra que não foi submetido à permeabilização pode ser usado para estimar a contagem de células usando um hemócito ou um contador celular. - Resuspenque bem as pelotas em PBS a uma concentração de ~1500 células/μL, coloque os tubos no gelo e prossiga para a preparação de fibras de DNA espalhando imediatamente o protocolo (seção 4)
3. Configuração experimental de preenchimento de lacunas (PRR) (3 dias)
- Dia 1: Placa 2 poços para cada linha celular: ± UVC com células a ~70 % de confluência.
- Dia 2: Prepare a IdU fresca a 20 μM em mídia de cultura celular pré-aquecida (37 °C).
- Irradie as células com 20 J/m2 UVC.
- Adicione imediatamente a mídia com 20 μM IdU e incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 (incubadora celular) por precisamente 60 min.
- Lave as células com PBS pré-aquecido (37 °C) duas vezes.
- Adicione imediatamente a mídia com nocodazol de 200 ng/mL e incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 (incubadora celular) por 12-24 h (o tempo desta etapa deve ser mantido consistente entre os experimentos).
NOTA: A concentração de nocodazol pode precisar ser adaptada de acordo com a linha celular utilizada. Se usar uma droga genotoxica, incubar as células com UI ± droga28. - Dia 3: Aspire os meios de cultura, adicione a mídia com 20 μM CLdU + nocodazole, e incubar para as últimas 4h de tratamento nocodazol, a 37 °C, 5% DE CO2 (incubadora celular).
- Lave as células com PBS pré-aquecido (37 °C).
- Adicione trippsina e incubar por 1-2 min a 37 °C, 5% DE CO2 (incubadora celular) para desacoplar células.
- Adicione o mesmo volume de mídia de cultura celular e colete células (mídia + trippsina) em um tubo de 1,5 mL apropriadamente anotado. Mantenha os tubos no gelo o tempo todo.
- Conte as células usando um hemócito ou um contador de células.
- Pelota as células: centrífuga a ~350 x g por 5 min, a 4 °C.
- Remova o supernasce e resuspenque as células em PBS em ~1500 células/μL. Mantenha as células no gelo e inicie a preparação da fibra de DNA espalhando o protocolo imediatamente (dia 3 ou 4).
4. Preparação de fibra de DNA por disseminação (~1 h para 12 slides)
- Anote os slides do microscópio com um lápis de carbono e coloque-os em uma bandeja.
- Toque na parte inferior do tubo para garantir a homogeneização.
- Adicione 2 μL de células na parte superior do slide correspondente.
NOTA: Duas gotas podem ser adicionadas, uma na parte superior do slide e outra no meio do slide. - Adicione 6 μL do tampão de lise elise as células por tubulação para cima e para baixo cerca de 5 vezes (evite fazer bolhas).
- Puxe a gota um pouco em direção à parte inferior do slide com a ponta da pipeta (para guiar o caminho da propagação da gota).
- Incubar por 5 min no RT para lise os núcleos.
NOTA: O volume do tampão de lise e o tempo de lise podem ser ajustados se o lysate secar muito rapidamente ou, alternativamente, não secar o suficiente. O volume do buffer de lise pode variar de 5-7 μL e o tempo pode cair entre 4-10 min. - Incline o slide em torno de 20-40° e deixe a gota se espalhar para o fundo do slide a uma velocidade constante e baixa.
- Deixe o slide secar no RT no escuro (10-15 min).
- Prepare-se recentemente a solução de fixação: Misture o metanol: ácido acético glacial a uma proporção de 3:1.
- Mergulhe os slides em um frasco contendo a solução de fixação e incubar por 5 minutos no RT para fixar DNA nos slides.
ATENÇÃO: O metanol é altamente tóxico e deve ser mantido sob uma capa química. Descarte em um recipiente apropriado. - Seque as lâminas em RT no escuro e armazene a 4 °C protegido da luz até coloração.
5. Imunostaining de fibras de DNA (~6 h)
- Lave os slides com PBS duas vezes por 5 minutos.
- Desnaturar o DNA com recém-preparado 2,5 M HCL para 40-60 min na RT.
ATENÇÃO: Para preparar 2,5 M HCl, despeje ácido na água e nunca o contrário. Esta é uma reação extermica, então vai esquentar um pouco. - Lave os slides com PBS três vezes por 5 min.
- Bloco com 5% de BSA (pode ser armazenado a 20 °C para até três usos) previamente aquecido a 37 °C por 30-60 min a 37 °C.
- Remova o excesso de líquido dos slides tocando suavemente em um papel.
- Adicione 30 μL de anticorpos primários (mouse anti-BrdU 1/20 (para IdU) e anti-BrdU 1/100 (para CLdU) diluídos em PBS-T-BSA) aos slides em sentido e coloque um deslizamento de tampa em cima. Incubar por 1-1,5 h no RT em uma câmara escura e úmida.
- Coloque os slides em um frasco com PBS por 1-2 min e, em seguida, remova cuidadosamente as tampas.
- Lave com PBS-T em um frasco três vezes por 5 minutos e coloque os slides em PBS.
- Remova o excesso de líquido tocando suavemente em um papel.
- Adicione 30 μL de anticorpos secundários (anti-mouse Alexa Fluor 594 e anti-rato Alexa Fluor 488 diluído a 1/75 em PBS-T-BSA.) aos slides dropwise e coloque uma mancha de cobertura em cima. Incubar por 45-60 min na RT em uma câmara escura e úmida.
- Coloque os slides em um frasco com PBS por 1-2 min e, em seguida, remova cuidadosamente as tampas.
- Lave com PBS-T em um frasco três vezes por 5 minutos e coloque os slides em PBS.
- Remova o excesso de líquido tocando suavemente em um papel.
- Adicione 20 μL do reagente de montagem em gota aos slides e coloque uma mancha de cobertura por cima. Evite bolhas.
- Deixe os slides secarem no RT no escuro e, em seguida, armazene a 4 °C (ou -20 °C para maior conservação).
6. Aquisição e análise de imagem (~1 h por amostra)
NOTA: Um microscópio de epifluorescência pode ser usado para ambos os protocolos. No entanto, para o ensaio de preenchimento de lacunas (PRR), o uso de um microscópio confocal é altamente recomendado para o aumento da resolução das imagens.
- Coloque uma gota de óleo de imersão (microscópio específico) perto do topo do slide onde as células foram lísedas e encontre o foco usando o canal verde pesquisando pontos verdes no fundo (40x, 63x e 100x objetivos podem ser usados).
- Encontre a principal concentração de fibras e mova-se para as bordas para encontrar fibras individuais não sobrepostas bem espalhadas usando apenas um canal para selecionar as regiões para as imagens e evitar possíveis viés.
- Tire cerca de 15-20 fotos por slide ao lado de todo o slide nos canais verde e vermelho e mescle os dois canais para obter fibras de DNA bicolor.
NOTA: Se usar um microscópio confocal, tire fotos em alta resolução (1024 x 1024 pixels) e use valores de pinhole perto de 1 para fluorescência vermelha e verde. - Use ImageJ (software livre fornecido pelo NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) para medições de comprimento do tratado IdU e CLdU.
- Abra uma imagem arrastando-a para a caixa ImageJ.
- Use a barra de escala gerada pelo software do microscópio (apropriadamente calibrada) para converter o comprimento em micrômetros. Use a ferramenta Linha reta selecionandoo ícone 5 da esquerda para a direita na caixa ImageJ para medir a barra de escala na imagem fornecida por micrômetros e obter uma medição em pixels. Clique em Analisar > Escala de conjunto e substitua a "distância em pixels" pelo número apropriado e a "unidade de comprimento" para μm.
- Na caixa ImageJ, selecione a ferramenta Linha Segmentada clicando à esquerdano ícone 5 da esquerda para a direita e, em seguida, selecionando a segunda opção de cima para baixo.
- Desenhe o caminho exato do trato vermelho (IdU) ou verde (UD) clicando à esquerda e pare o desenho clicando pela direita. Pressione o botão M no teclado para medir o comprimento.
- Para a Fibra S1, basta analisar o verde-vermelho (fibras bicolores)16. Meça os comprimentos do trato vermelho e verde de pelo menos 150 fibras de diferentes imagens, mantendo o controle das medidas dos tratos vermelho e verde para cada fibra individual.
- Para o ensaio de preenchimento de lacunas, meça apenas o comprimento dos tratos de IdU (vermelho) que contenham pelo menos 1 remendo CLdU (verde), mas sem coloração cldU contínua. Marque pelo menos 10-15 trechos de IdU de diferentes imagens com pelo menos 1 patch cldU.
NOTA: Outros softwares podem ser usados para as análises, como o Zeiss LSM Image Browser.
- Para as Fibras S1, plote o comprimento dos tratos de IdU, o comprimento dos tratos cldU e as proporções (CLdU/IdU ou vice-versa) em gráficos separados como gráficos de pontos de dispersão com medianas.
- Meça eventos de preenchimento de lacunas como unidades de "densidade por quilobase", divida o número total de manchas de CLdU (PRR, verde) em um determinado comprimento de UI (vermelho) pelo comprimento total do trato vermelho em quilobases (considerando 1 μm = 2,59 quilobases31). Em seguida, plote os dados como gráficos de pontos de dispersão com medianas.
- Em ambos os experimentos, realize a análise estatística entre duas amostras usando Mann-Whitney (teste não paramétrico) e entre mais de duas amostras usando Kruskal-Wallis seguidas pelo teste de comparações múltiplas de Dunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
No ensaio de fibra s1, se o tratamento com um agente genotóxico levar a lacunas de SDNA pós-replicação, os comprimentos gerais das fibras de DNA dos núcleos tratados com S1 serão menores após o tratamento com danos de DNA em comparação com amostras não tratadas, bem como para amostras que foram tratadas com o agente genotóxico, mas não foram submetidas ao decote S1 (Figura 1).
Alternativamente, se o tratamento com a nuclease S1 não afetar significativamente o comprimento das fibras de DNA em comparação com células não tratadas, diferentes interpretações são possíveis: (1) Não há formação de lacunas pós-replicativas da SSDNA após o tratamento com o agente genotóxico utilizado, e/ou no fundo genético específico investigado. De fato, já mostramos anteriormente que os fotoprodutos 6-4 induzidos por UV (6-4PP), mas não os dimers de pirimidina ciclobutano (CPD) levam à formação de lacunas de SSDNA em células deficientes para reparo de excisão de nucleotídeos (NER, células XP-C)14. (2) As lacunas de SSDNA foram reparadas e não podem mais ser detectadas. (3) O encurtamento induzido pelo tratamento apenas com o agente genotoxic é muito pronunciado para permitir a detecção de um encurtamento adicional via decote S1.
Notavelmente, a falta de efeito do S1 também pode refletir questões técnicas como condições prejudicadas para a atividade S1, incluindo pH inadequado do buffer S1 ou quantidade limitada de zinco.
Figura 1: Detecção de lacunas ssDNA pós-replicativas em garfos em andamento pelo ensaio de fibra S1. (A) Representação esquemática de ensaios de fibra de DNA com a nuclease S1 específica ssDNA (S1 Fiber). Os garfos de replicação que proem andamento são rotulados com análogos de timmidina (IdU, CLdU) e podem ser medidos após a disseminação do DNA e a imunostenção. À esquerda, garfos de progresso padrão sem lacunas não são suscetíveis ao decote pela nuclease S1. Certo, lacunas no DNA nascente que são convencionalmente indetectáveis serão alvo de nuclease S1 e serão visualizadas como tratos cldu mais curtos. (B) Esquema do protocolo S1 Fiber. (C) Imagens representativas da Fibra S1. Topo, controle o trato de DNA nascente sem lacunas, imune ao decote pela nuclease S1. Inferior, trato de DNA positivo para lacunas cortadas pela nuclease S1 resultando em um comprimento mais curto do trato cldu (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No ensaio de preenchimento de lacunas (PRR), um aumento significativo na densidade de patches curtos de UIC em tratos de IdU é indicativo de eventos de preenchimento de lacunas aumentados (Figura 2). Uma alta densidade de eventos prr pode ser refletida por 1 evento PRR (patch verde/CLdU) em um curto trato de IdU, bem como por múltiplos eventos de RR em um longo trato (ver imagens representativas Figura 2C). A análise deve ser rigorosamente realizada marcando apenas patches de CLdU que estão em cima de tratos de IdU considerando que as manchas cldU são pequenas e podem ser facilmente confundidas como fundo de coloração (ver imagens representativas Figura 2C).
Figura 2: Detecção de reparo pós-replicativo por preenchimento de lacunas. (A) Esquema do trato vermelho (IdU) com patch verde (U CID) indicativo de um evento de preenchimento de lacunas. (B) Esquema do protocolo utilizado para detectar preenchimento de lacunas. (C) Imagens representativas do ensaio de preenchimento de lacunas (PRR). Os tratos de IdU esquerdos e mais longos com pelo menos um patch de CLdU e/ou menos patches de CLdU correspondem a baixa densidade de preenchimento de lacunas (menos eventos de preenchimento de lacunas). À direita, os tratos de IdU mais curtos com pelo menos um patch de CLdU e tratos de IdU mais longos com mais patches de CLDU correspondem a alta densidade de preenchimento de lacunas (mais eventos de preenchimento de lacunas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etapas críticas do protocolo padrão de ensaio de fibra de DNA foram discutidas em uma publicação anterior32. Aqui, descrevemos versões modificadas do ensaio padrão de fibra de DNA para investigar a presença de lacunas ssDNA pós-replicativas, bem como seu reparo por preenchimento de lacunas, inicialmente descrito em14. No contexto da presença de lacuna ssDNA pós-replicativa, o uso da nuclease S1 no protocolo S1 Fiber provavelmente seria adequado após a exposição de um agente genotóxico por um mínimo de 1h para permitir tempo de formação de lacunas e detecção subsequente. No entanto, é essencial notar que em algumas linhas celulares ou origens genéticas, o uso da nuclease S1 pode gerar tratos mais curtos mesmo sem tratamento adicional com agentes genotoxicos33,34. Portanto, é crucial incluir todos os controles para garantir a conclusão adequada sobre se o tratamento com um agente genotoxic leva ao acúmulo de lacunas. Além disso, é importante validar ainda mais o resultado da Fibra S1 repetindo o ensaio em condições em que as lacunas ssDNA não são mais formadas ou são reparadas.
Em relação ao ensaio de preenchimento de lacunas (PRR), é importante otimizar uma dose de UVC/concentração de drogas que não afete o comprimento geral das fibras de DNA, uma vez que os resultados são calculados como uma densidade por quilobase. Se usar uma concentração que induz o encurtamento do trato, os resultados podem ser artificialmente distorcidos para uma densidade aumentada de preenchimento de lacunas, dificultando a interpretação dos dados. Para neutralizar essa limitação, eventos de preenchimento de lacunas podem ser visualizados em cima de DNA não rotulado, manchando DNA total usando um anticorpo anti-ssDNA, como descrito anteriormente 14,16. Além disso, um experimento cinético pode ser realizado para garantir a detecção máxima de eventos de preenchimento de lacunas.
Observe que eventos de preenchimento de lacunas também podem ser monitorados usando o ensaio de fibra S1 quando as células são permitidas a se recuperar antes do tratamento com a nuclease S1. Especificamente, quando as lacunas pós-replicativas são preenchidas, as fibras de DNA tornam-se insensíveis ao decote pela nuclease S1, e o comprimento da fibra de DNA pode, portanto, ser usado como leitura para preenchimento de lacunas neste contexto28. Assim, essa abordagem pode ser utilizada para estudar o preenchimento de lacunas ao longo do ciclo celular, diferentemente do ensaio prr que se limita à investigação do preenchimento de lacunas no G2/M.
Por fim, os dados obtidos com o ensaio PRR foram validados utilizando-se a Fibra S128, sugerindo que nocodazol e bloqueio artificial de células em G2/M durante o ensaio prr não afetam o preenchimento de lacunas. Outros agentes que induzem o bloqueio da fase G2/M podem potencialmente ser usados neste ensaio
O S1 Fiber tem sido cada vez mais utilizado por laboratórios em todo o mundo, fornecendo novas percepções sobre os mecanismos de formação de lacunas ssDNA e revelando condições anteriormente não apreciadas nas quais essas lacunas podem ser formadas 14,29,34,35,36. Para investigações futuras, seria interessante combinar esses protocolos modificados com a abordagem do ponto quântico que permite a visualização direta da lesãode DNA 37 para elucidar a conversa cruzada entre a formação de lacunas de DNA pós-replicação e a reparação de DNA, bem como como a natureza do dano define o mecanismo da resposta ao estresse de replicação. Como alternativa ao ensaio de fibra S1, a nuclease S1 também pode ser usada para estudar o processo de preenchimento de lacunas em um ensaio de cometa neutro modificado. Resumidamente, se houver lacunas, o tratamento de cometas com a nuclease S1 leva à formação de quebras duplas encalhadas, detectáveis por ensaio de cometa neutro. Protocolos para ensaio de cometa neutro, bem como ensaio de cometa modificado por enzimas foram publicados anteriormente38,39. Em particular, essa abordagem permite a detecção de lacunas ssDNA em todas as fases do ciclo celular, sem necessidade de prender células na fase G2. Usando essa abordagem, combinada com os protocolos S1 Fiber e gap-filling (PRR) descritos aqui, descobrimos que o REV3L (unidade catalítico de polimerase de DNA) é responsável pelo preenchimento de lacunas formadas quando 6-4PPs induzidos por UV estão presentes no genoma humano14.
Com a abordagem técnica limitada disponível, a formação de lacunas SDNA pós-replicativas e, em particular, eventos de preenchimento de lacunas permaneceram em grande parte inexplorados em células humanas. Ao todo, essas técnicas modificadas (S1 Fiber, ensaio de preenchimento de lacunas (PRR) e Cometa S1) fornecem novas estratégias para investigar a presença de lacunas ssDNA e como essas lacunas são finalmente preenchidas no genoma humano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho na C.F.M.M. laboratório é apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasil, Bolsas nº 2019/19435-3, #2013/08028-1 e 2017/05680-0) sob a Pesquisa internacional de Colaboração da FAPESP e da Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasil, Bolsas nº 308868/2018-8) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasil, Código financeiro 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
- Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
- Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
- Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
- García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
- Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
- Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
- Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
- Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
- Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
- Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
- Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
- Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
- Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
- Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
- Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
- Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
- Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
- Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
- Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
- Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
- Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
- Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).
