Summary
Hier beschreiben wir zwei Modifikationen des DNA-Faserassays zur Untersuchung einzelsträngiger DNA-Lücken bei der Replikation von DNA nach Läsionsinduktion. Der S1-Faserassay ermöglicht die Detektion von postreplizierenden Lücken mit der ssDNA-spezifischen S1-Endonuklease, während der lückenfüllende Assay die Visualisierung und Quantifizierung der Spaltreparatur ermöglicht.
Abstract
Der DNA-Faser-Assay ist eine einfache und robuste Methode zur Analyse der Replikationsgabeldynamik, basierend auf dem Immunnachweis von Nukleotidanaloga, die während der DNA-Synthese in menschliche Zellen eingebaut werden. Diese Technik hat jedoch eine begrenzte Auflösung von einigen tausend Kilobasen. Folglich sind postreplizierte einzelsträngige DNA-Lücken (ssDNA), die so klein wie einige hundert Basen sind, mit dem Standardassay nicht nachweisbar. Hier beschreiben wir eine modifizierte Version des DNA-Faserassays, der die S1-Nuklease verwendet, ein Enzym, das speziell ssDNA spaltet. In Gegenwart von postreplizierenden ssDNA-Lücken zielt die S1-Nuklease auf die Lücken ab und spaltet sie, wodurch kürzere Traktate erzeugt werden, die als Auslesevorgang für ssDNA-Lücken auf laufenden Gabeln verwendet werden können. Diese postreplizierenden ssDNA-Lücken entstehen, wenn beschädigte DNA diskontinuierlich repliziert wird. Sie können über Mechanismen repariert werden, die von der Genomreplikation entkoppelt sind, in einem Prozess, der als lückenfüllende oder postreplizierte Reparatur bekannt ist. Da lückenfüllende Mechanismen eine DNA-Synthese unabhängig von der S-Phase beinhalten, können auch Änderungen im DNA-Fasermarkierungsschema verwendet werden, um lückenfüllende Ereignisse zu überwachen. Insgesamt sind diese Modifikationen des DNA-Faser-Assays mächtige Strategien, um zu verstehen, wie postreplizierende Lücken im Genom menschlicher Zellen gebildet und gefüllt werden.
Introduction
Bahnbrechende Arbeiten haben Hinweise auf die Anhäufung von postreplizierenden einzelsträngigen (ssDNA) Lücken bei der Behandlung mit DNA-schädigenden Wirkstoffen in Bakterien 1 und menschlichen Zellen 2,3 geliefert. Während der Replikation beschädigter DNA-Vorlagen kann die DNA-Synthese-Maschinerie die Läsionen umgehen, indem sie spezifische Transläsionssynthese-DNA-Polymerasen oder durch Template-Switching-Mechanismen verwendet. Alternativ kann das Replisom auch einfach die Läsion überspringen und eine ssDNA-Lücke hinterlassen, die später repariert werden soll. In jüngerer Zeit zeigte eine Studie deutlich, dass die Behandlung mit genotoxischen Wirkstoffen zu ssDNA-Lücken in Eukaryoten führt, indem Elektronenmikroskopie verwendet wird, um die spezifische Struktur von Replikationszwischenprodukten zu visualisieren4. Die Bildung dieser Regionen postreplikativer Lücken wurde ursprünglich als einfaches Ergebnis des semi-diskontinuierlichen Modus der DNA-Replikationvorgeschlagen 2. In diesem Fall kann eine Läsion am nachlaufenden Strang die Verlängerung eines Okazaki-Fragments blockieren, aber die Gabelprogression wird natürlich durch das folgende Okazaki-Fragment gerettet und hinterlässt eine ssDNA-Lücke. Weitere Studien zeigten jedoch, dass auch die Bildung von Lücken am führenden Strang möglich ist, wie erstmals bei Bakteriengezeigt wurde 5. In Eukaryoten wurde gezeigt, dass PRIMPOL, eine einzigartige DNA-Polymerase mit Primase-Aktivität, in der Lage ist, die DNA-Synthese stromabwärts einer replikationsblockierenden Läsion durch ihre Zurechtweisungsaktivität 6,7,8,9,10,11 wieder aufzunehmen. Somit kann die PRIMPOL-Primase-Aktivität die Bildung von postreplizierenden ssDNA-Lücken im führenden Strang bei der Behandlung mit einem DNA-schädigenden Wirkstoff in menschlichen Zellenerklären 12. Dennoch erforderte der Nachweis dieser Lücken sowie die Lückenreparatur bis vor kurzem indirekte oder zeitaufwändige Ansätze wie Elektronenmikroskopie4 oder plasmidbasierte Assays13. Die Verwendung der ssDNA-spezifischen S1-Nuklease zum Nachweis von Lücken in menschlichen Zellen wurde vor mehr als vierzig Jahren durch frühe Studien unter Verwendung von Saccharosegradiententechnikenvorangetrieben 2,3. In jüngerer Zeit wandte unsere Gruppe die Verwendung dieser Nuklease an, um ssDNA bei der Replikation von DNA (postreplizierte Lücken) mit anderen Methoden wie DNA-Faser- und Kometenassays14 nachzuweisen. Diese neuen Ansätze ebneten den Weg für die aktuelle Welle von Studien zu postreplizierenden Lücken. Hier beschreiben wir eine Strategie der Verwendung von S1-Nuklease zum Nachweis postreplizierter ssDNA-Lücken durch DNA-Faserassay und erklären, wie ein differentielles Markierungsschema im DNA-Faserprotokoll die Untersuchung der Reparatur dieser Lücken ermöglichen kann.
Der DNA-Faser-Assay ist eine leistungsstarke Technik, die von einer wachsenden Anzahl von Labors eingesetzt wurde und wertvolle Einblicke in die Replikationsgabeldynamik und die Replikationsstressreaktionsmechanismen geliefert hat. Kurz gesagt, diese Technik basiert auf dem sequentiellen Einbau von Nukleotidanaloga (wie CldU-5-Chlor-2'-desoxyuridin- und IdU-5-Jod-2'-desoxyuridin) in die replizierende DNA. Nach der Ernte werden Zellen lysiert und DNA-Moleküle auf einem positiv beschichteten Glasobjektträger verteilt. CldU und IdU werden dann durch spezifische Antikörper nachgewiesen, die in einem fluoreszierenden Mikroskop als zweifarbige Fasern sichtbar gemacht werden können. Schließlich werden die Längen der IdU- und CldU-Trakte gemessen, um Veränderungen der DNA-Replikationsdynamik als Folge der DNA-Schadensinduktion zu identifizieren. Diese Technik kann verwendet werden, um verschiedene Phänomene zu untersuchen, wie z.B. Gabelabriss, Gabelverlangsamung, entstehender DNA-Abbau und Variationen in der Häufigkeit des Ursprungsfeuers15,16.
Eine Einschränkung des DNA-Faser-Assays ist seine Auflösung von wenigen Kilobasen. Da postreplizierte ssDNA-Lücken im Bereich von Hunderten von Basen liegen können, ist es unmöglich, diese Lücken direkt mit dem Standard-DNA-Faserprotokoll zu visualisieren. Das Vorhandensein von ssDNA-Lücken auf replizierender DNA in menschlichen Zellen, die mit genotoxischen Wirkstoffen behandelt wurden, wurde bereits indirekt in Verbindung gebracht. Zum Beispiel die Beobachtung von ssDNA, wie sie durch Rekrutierung des ssDNA-bindenden Proteins, des Replikationsproteins A (RPA), in Zellen außerhalb der S-Phase bewertet wird, oder die Bildung von ssDNA, wie sie durch alkalische DNA-Abwicklung nachgewiesen wird, kombiniert mit dem Fehlen eines längeren Gabelstopps durch DNA-Faserassay 12,17,18,19,20,21 wurde auf die Anhäufung von ssDNA-Lücken zurückgeführt. Darüber hinaus induzieren postreplizierte ssDNA-Lücken einen ATR-abhängigen G2/M-Phasen-Checkpoint und blockieren Zellen, die mit Replikationsgiften 18,19,20,21,22 behandelt wurden.
Die S1-Nuklease baut einzelsträngige Nukleinsäuren unter Freisetzung von 5'-Phosphorylmono- oder Oligonukleotiden ab und hat im Vergleich zu RNA eine 5-mal höhere Affinität zu ssDNA. Doppelsträngige Nukleinsäuren (DNA:DNA, DNA:RNA oder RNA:RNA) sind resistent gegen die S1-Nuklease, außer wenn sie in extrem hohen Konzentrationen eingesetzt werden. Die S1-Nuklease spaltet auch doppelsträngige DNA in der einzelsträngigen Region, die durch einen Nick, eine Lücke, eine Fehlanpassung oder eine Schleife verursacht wird. Die S1-Nuklease ist somit eine ssDNA-spezifische Endonuklease, die in der Lage ist, ssDNA-Lücken zu spalten und letztendlich doppelsträngige Brüche23,24 zu erzeugen. Das Hinzufügen von Schritten für den S1-Nuklease-Aufschluss zum DNA-Faserprotokoll ermöglicht daher indirekt den Nachweis von postreplizierenden ssDNA-Lücken. In Gegenwart von Lücken erzeugt die Behandlung von exponierten Kernen mit der S1-Nuklease vor der DNA-Ausbreitung kürzere Bahnen als Folge der S1-Spaltung der ssDNA, die von Natur aus in Lücken14 vorhanden ist. Dementsprechend ist die Traktverkürzung das Auslesen von ssDNA-Lücken mit diesem Ansatz. Im Vergleich zum Standard-DNA-Faserprotokoll benötigt die DNA-Faser mit der S1-Nuklease nur zwei zusätzliche Schritte: Kernexposition (Zellpermeabilisierung) und Behandlung mit der S1-Nuklease. Es ist wichtig zu beachten, dass geeignete Kontrollen obligatorisch sind, z. B. Proben, die mit dem genotoxischen Mittel, aber ohne die S1-Nuklease behandelt wurden, und Proben, die mit der S1-Nuklease ohne das genotoxische Mittel behandelt wurden. Das Protokoll selbst, einschließlich der Einbeziehung von Analoga, der S1-Behandlung und der Ausbreitung, kann an einem Tag durchgeführt werden und erfordert kein außergewöhnliches Material. Es benötigt nur die Thymidin-Analoga, die gereinigte S1-Nuklease, die entsprechenden primären und sekundären Antikörper und ein fluoreszierendes Mikroskop. Insgesamt erkennt die DNA-Faser, die die S1-Nuklease verwendet, ssDNA-Lücken auf laufenden Replikationsgabeln mit einem relativ einfachen Ansatz.
Die postreplizierten ssDNA-Lücken, die als Folge von Replikations-Stress-Response-Mechanismen gebildet werden, können durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Transläsions-DNA-Synthese oder Template-Switching, in einem Prozess namens Gap-Filling oder Post-Replication Repair (PRR)25 repariert (oder gefüllt) werden. Diese Prozesse finden hinter den vorrückenden Gabeln statt und beinhalten eine replikationsunabhängige DNA-Synthese 14,26,27. Basierend auf diesen Ergebnissen kann ein Markierungsschema durchgeführt werden, das sich vom Standard-DNA-Faserassay unterscheidet, um lückenfüllende Ereignisse in der G2-Phase direkt zu visualisieren 14,16,26,28. Insbesondere kann ein Thymidinanalogon verwendet werden, um die Replikationsgabel zum Zeitpunkt der genotoxischen Behandlung und der postreplizierenden ssDNA-Lückenbildung zu markieren, während ein anderes Thymidinanalogon verwendet werden kann, um lückenfüllende Ereignisse zu markieren. In diesem Protokoll werden die Zellen unmittelbar nach oder gleichzeitig mit einer genotoxischen Behandlung für 1 h mit einem ersten Thymidinanalogon (z. B. IdU) markiert, so dass die entstehende DNA zum Zeitpunkt der Lückenbildung markiert wird. Nocodazol wird bei der Behandlung zwischen 12 und 24 h hinzugefügt, um Zellen in G2 / M zu stoppen und die folgende S-Phase zu verhindern. Für die letzten 4 h der Nocodazol-Behandlung wird dem Medium, das beim Lückenfüllen eingearbeitet werden soll, ein zweites Thymidinanalogon (z. B. CldU) zugesetzt. Wichtig ist, dass dieser Assay nur verwendet werden kann, um lückenfüllende Ereignisse in G2 zu erkennen, da das lückenfüllende Signal von CldU aufgrund der Einarbeitung von CldU in die replizierende DNA in der S-Phase nicht von einem Signal unterschieden werden kann. Um das Hintergrundsignal zu minimieren, sollte daher der Zeitpunkt der CldU-Inkorporation nach Schadensinduktion mit dem Zeitpunkt zusammenfallen, zu dem der größte Teil der Zellpopulation in die G2-Phase14 eintritt. Daher variiert dieser Zeitpunkt je nach Zelllinie und Behandlungsbedingungen. Es wird empfohlen, die Progression des Zellzyklus vor der Anwendung dieses Assays zu optimieren. Die Co-Färbung dieser Thymidin-Analoga ermöglicht die Visualisierung von lückenfüllenden (PRR) Trakten (CldU-Pflastern) auf aufkeimender DNA (IdU-Trakte), die während der genotoxischen Behandlung synthetisiert wurden, wenn ssDNA-Lücken erzeugt wurden.
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Protocol
Da die Studie menschliche Zellen verwendet, wurde die Arbeit von der Ethikkommission des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften an der Universität von São Paulo (ICB-USP, Zulassungsnummer # 48347515.3.00005467) für die Forschung mit menschlichen Proben genehmigt.
HINWEIS: Die hier beschriebenen Protokolle wurden in früheren Veröffentlichungen mit geringfügigen Änderungen14,16,28 verwendet. Hier liegt der Fokus auf der Verwendung von ultraviolettem Licht C (UVC) als DNA-schädigendes Mittel. Aber auch andere DNA-schädigende Mittel wie Cisplatin und Hydroxyharnstoff wurden erfolgreich eingesetzt28. Dieses Protokoll kann in einer Reihe von Zelllinien durchgeführt werden, einschließlich U2OS, HEK293T, menschlichen Fibroblasten und anderen 14,28,29. Es ist wichtig, die experimentelle Frage zu bestimmen, bevor dieses Protokoll durchgeführt wird. Der DNA-Faser-Assay mit der S1-Nuklease (im Folgenden S1-Faser genannt) wird verwendet, um das Vorhandensein von postreplizierenden ssDNA-Lücken nachzuweisen, während der Gap-Filling (oder PRR) Assay durchgeführt wird, um lückenfüllende Ereignisse in der G2-Phase zu quantifizieren. Wenn der Prüfarzt also das Vorhandensein von postreplizierenden ssDNA-Lücken analysiert, sollte er Abschnitt 2 (S1-Faser-Versuchsaufbau) durchführen und direkt mit Abschnitt 4 (DNA-Faservorbereitung durch Spreizung) des Protokolls fortfahren. Bei der Analyse von lückenfüllenden Ereignissen sollte der Prüfer direkt mit Abschnitt 3 (Gap-filling (PRR) experimental setup) fortfahren.
1. Reagenzien und Setup
- Thymidin-Analoga: Resuspend 5-Iodo-2'-desoxyuridin (IdU) und 5-Chlor-2'-desoxyuridin (CldU) in 1 N NH4OH bis zu einer Endkonzentration von 100 mM. Filtern Sie die Analoga durch einen sterilen Spritzenfilter (0,2 μm), aliquot, und lagern Sie sie bei -20 ° C.
- Antikörper: Primär - Anti-BrdU-Ratte (Biorad) und Anti-BrdU-Maus (BD); Sekundäre - Anti-Ratte Alexa Fluor 488 und Anti-Maus Alexa Fluor 594.
- Zelluläre Permeabilisierung CSK100-Puffer für die S1-Faser: 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl 2 [pH 7,2], 300 mM Saccharose und 0,5% Triton X-100 in destilliertem H2 O hinzufügen.
- S1-Nukleasepuffer [pH 4,6]: 30 mM Natriumacetat [pH 4,6], 10 mM Zinkacetat, 50 mM NaCl und 5% Glycerin inH2O hinzufügen.
HINWEIS: Der S1-Nukleasepuffer muss einen End-pH-Wert von 4,6 haben, da die S1-Aktivität bei einem pH-Wert > 4,9 um 50% sinkt. - Aliquot und lagern Sie bei -20 °C die aus A. oryzae gereinigte S1-Nuklease vorverdünnt in S1-Nuklease-Verdünnungspuffer, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt wird.
- Rekonstituieren Sie das Nocodazol in DMSO auf eine Endkonzentration von 2 mM zum Lückenfüllen. Probe.
- Lysepuffer: Zugabe von 200 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM EDTA und 0,5 % SDS inH2O.
- Zubereitung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Bereiten Sie PBS-T vor, indem Sie 0,1% Tween-20 in PBS hinzufügen.
- Bereiten Sie 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS zu.
- Bereiten Sie 0,1% BSA in PBS vor.
- Bereiten Sie PBS-T-BSA vor, indem Sie 1% BSA in PBS-T hinzufügen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop mit einer Quecksilber- oder Xenonlampe mit einer Wellenlänge von 510 nm und einer Bandbreite von 42 nm GFP (FITC, Alexa Fluor 488) und einem 624 nm Wellenlänge und 40 nm Bandbreite Texas Red (Alexa Fluor 594) Emissionsfilter oder ein konfokales Mikroskop mit einem 488-nm Linie (blau) Laser zur Erkennung grüner Fluoreszenz (nachgewiesen zwischen 510 und 560 nm) und einen 561-nm Linie (gelb) Laser zum Nachweis der roten Fluoreszenz ( B. nachgewiesen zwischen 575 und 680 nm). Tauchobjektiv (40x, 63x oder 100x).
2. S1 Fiber Versuchsaufbau (2 Tage)
- Tag 1: Platte 4 Vertiefungen für jede Zelllinie: ± UVC und ± S1-Nuklease mit Zellen mit 70-90% Konfluenz.
HINWEIS: Das Experiment kann in einem Format durchgeführt werden, das so klein ist wie eine 12-Well-Platte. In diesem Fall werden alle Lösungen bei 0,5 ml/Well eingesetzt. - Tag 2: Frisches IdU bei 20 μM und CldU bei 200 μM in vorgewärmten (37 °C) Zellkulturmedien zubereiten.
- Aspirieren Sie die Kulturmedien und fügen Sie die Medien sofort mit 20 μM IdU hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5% CO2 (Zellinkubator) für genau 20 min.
- Waschen Sie die Zellen schnell mit vorgewärmtem (37 °C) PBS zweimal.
- Bestrahlung der Zellen mit 20 J/m2 UVC. Verwenden Sie unbehandelte Zellen als Kontrollen.
- Fügen Sie die Medien sofort mit 200 μM CldU hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5% CO2 (Zellinkubator) für genau 60 min.
HINWEIS: IdU- und CldU-Beschriftungen können ausgetauscht werden, aber die Konzentration des zweiten Analogons sollte 5-10-mal höher sein als die des ersten Analogons. Das Timing der analogen Inkubation kann an das verwendete genotoxische Mittel angepasst werden, aber die Zeit der zweiten analogen Inkubation sollte lang genug sein, um genügend Zeit für die Spaltbildung zu gewährleisten14,16. Wenn Sie ein DNA-schädigendes Medikament verwenden, fügen Sie das Medikament zusammen mit CldU28,29,30 hinzu. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem (37 °C) PBS.
- Permeabilisieren Sie die Zellen mit dem CSK100-Puffer für 8-10 min bei Raumtemperatur (RT).
HINWEIS: Eine erfolgreiche Permeabilisierung kann unter einem Hellfeldmikroskop überprüft werden, wo nur Kerne beobachtbar sein sollten - Waschen Sie die Kerne vorsichtig mit PBS (gießen Sie 0,5 ml an der Seite jedes Brunnens, nur für ein paar Sekunden).
- Waschen Sie die Kerne vorsichtig mit S1-Puffer (gießen Sie 0,5 ml an der Seite jedes Brunnens, nur für ein paar Sekunden).
- Inkubieren Sie die Kerne mit S1-Puffer mit S1-Nuklee (20 U/ml) oder ohne (als Kontrolle) für 30 min bei 37 °C (Zellinkubator).
- Saugen Sie den S1-Puffer ab und fügen Sie 0,1% BSA in PBS hinzu.
- Kratzen Sie die Kerne und übertragen Sie sie in eine entsprechend kommentierte 1,5-ml-Röhre. Halten Sie die Röhren die ganze Zeit auf Eis.
HINWEIS: Die erfolgreiche Ablösung von Kernen kann unter einem Hellfeldmikroskop überprüft werden. - Pellet der Kerne: Zentrifuge bei ~4600 x g für 5 min, bei 4 °C.
HINWEIS: Anders als beim Standard-DNA-Faser-Assay können die Kerne nicht gezählt werden, also betrachten Sie die anfängliche Anzahl der beschichteten Zellen. Alternativ kann eine zusätzliche Vertiefung, die keiner Permeabilisierung unterzogen wurde, verwendet werden, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler zu schätzen. - Resuspendieren Sie die Pellets gut in PBS in einer Konzentration von ~ 1500 Zellen / μL, legen Sie die Röhrchen auf Eis und fahren Sie sofort mit der DNA-Faservorbereitung fort, indem Sie das Protokoll (Abschnitt 4) verteilen
3. Gap-filling (PRR) Versuchsaufbau (3 Tage)
- Tag 1: Platte 2 Vertiefungen für jede Zelllinie: ± UVC mit Zellen bei ~70 % Konfluenz.
- Tag 2: Bereiten Sie frische IdU bei 20 μM in vorgewärmten (37 °C) Zellkulturmedien vor.
- Bestrahlung der Zellen mit 20 J/m2 UVC.
- Fügen Sie die Medien sofort mit 20 μM IdU hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5% CO2 (Zellinkubator) für genau 60 min.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem (37 °C) PBS.
- Fügen Sie die Medien sofort mit 200 ng / ml Nocodazol hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO2 (Zellinkubator) für 12-24 h (der Zeitpunkt dieses Schritts muss zwischen den Experimenten konsistent gehalten werden).
HINWEIS: Die Konzentration von Nocodazol muss möglicherweise entsprechend der verwendeten Zelllinie angepasst werden. Wenn Sie ein genotoxisches Medikament verwenden, inkubieren Sie die Zellen mit IdU ± Medikament28. - Tag 3: Die Nährmedien aspirieren, die Medien mit 20 μM CldU + Nocodazol hinzufügen und für die letzten 4 h der Nocodazolbehandlung bei 37 °C, 5% CO 2 (Zellinkubator) inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem (37 °C) PBS.
- Trypsin hinzufügen und für 1-2 min bei 37 °C, 5% CO2 (Zellinkubator) inkubieren, um Zellen zu lösen.
- Fügen Sie das gleiche Volumen an Zellkulturmedien hinzu und sammeln Sie Zellen (Medien + Trypsin) in einem entsprechend annotierten 1,5-ml-Röhrchen. Halten Sie die Röhren die ganze Zeit auf Eis.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler.
- Pellet der Zellen: Zentrifuge bei ~350 x g für 5 min, bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in PBS bei ~ 1500 Zellen / μL. Halten Sie die Zellen auf Eis und beginnen Sie mit der DNA-Faservorbereitung, indem Sie das Protokoll sofort verteilen (Tag 3 oder 4).
4. DNA-Faservorbereitung durch Streuung (~1 h für 12 Objektträger)
- Kommentieren Sie die Objektträger mit einem Kohlestift und legen Sie sie flach auf ein Tablett.
- Klopfen Sie auf den Boden des Rohres, um eine Homogenisierung zu gewährleisten.
- Fügen Sie 2 μL Zellen auf der Oberseite des entsprechenden Objektträgers hinzu.
HINWEIS: Es können zwei Tropfen hinzugefügt werden, einer oben auf der Folie und ein weiterer in der Mitte der Folie. - Fügen Sie 6 μL des Lysepuffers hinzu und lysieren Sie die Zellen, indem Sie etwa 5 Mal auf und ab pipettieren (vermeiden Sie Blasenbildung).
- Ziehen Sie den Tropfen mit der Pipettenspitze ein wenig in Richtung des Bodens der Folie (um den Weg der Tropfenausbreitung zu führen).
- Inkubiere für 5 min bei RT, um die Kerne zu lysieren.
HINWEIS: Das Volumen des Lysepuffers und der Zeitpunkt der Lyse können eingestellt werden, wenn das Lysat zu schnell trocknet oder alternativ nicht genug trocknet. Das Lysepuffervolumen kann von 5-7 μL variieren und das Timing kann zwischen 4-10 min fallen. - Neigen Sie den Schieber um etwa 20-40 ° und lassen Sie den Tropfen mit konstanter, niedriger Geschwindigkeit auf den Boden der Rutsche ausbreiten.
- Lassen Sie den Schlitten bei RT im Dunkeln (10-15 min) trocknen.
- Fixierlösung frisch zubereiten: Methanol mischen: Eisessigsäure im Verhältnis 3:1.
- Tauchen Sie die Objektträger in ein Glas mit der Befestigungslösung und inkubieren Sie 5 Minuten bei RT, um DNA auf den Objektträgern zu fixieren.
ACHTUNG: Methanol ist hochgiftig und sollte unter einer chemischen Haube aufbewahrt werden. Entsorgen Sie ihn in einem geeigneten Behälter. - Trocknen Sie die Objektträger bei RT im Dunkeln und lagern Sie sie bei 4 °C lichtgeschützt bis zur Färbung.
5. Immunfärbung von DNA-Fasern (~6 h)
- Waschen Sie die Dias zweimal mit PBS für 5 min.
- Denaturieren Sie die DNA mit frisch zubereiteten 2,5 M HCl für 40-60 min bei RT.
ACHTUNG: Um 2,5 M HCl vorzubereiten, gießen Sie Säure in Wasser und niemals das Gegenteil. Dies ist eine exotherme Reaktion, so dass sie sich leicht erwärmt. - Waschen Sie die Dias dreimal mit PBS für 5 min.
- Block mit 5% BSA (kann bei 20 °C für bis zu drei Anwendungen gelagert werden), zuvor bei 37 °C für 30-60 min bei 37 °C erwärmt.
- Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern, indem Sie vorsichtig auf ein Papier tippen.
- 30 μL primäre Antikörper (Maus-Anti-BrdU 1/20 (für IdU) und Ratten-Anti-BrdU 1/100 (für CldU) verdünnt in PBS-T-BSA) in die Objektträger geben und ein Deckglas darauf legen. Inkubieren Sie für 1-1,5 h bei RT in einer dunklen, feuchten Kammer.
- Legen Sie die Dias für 1-2 min in ein Glas mit PBS und entfernen Sie dann vorsichtig die Deckgläser.
- Mit PBS-T dreimal für 5 min in einem Glas waschen und dann die Dias in PBS legen.
- Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie vorsichtig auf ein Papier tippen.
- Fügen Sie 30 μL sekundäre Antikörper (Anti-Maus-Alexa Fluor 594 und Anti-Ratten-Alexa Fluor 488 verdünnt bei 1/75 in PBS-T-BSA.) zu den Objektträgern hinzu und legen Sie ein Deckglas darauf. 45-60 min bei RT in einer dunklen, feuchten Kammer inkubieren.
- Legen Sie die Dias für 1-2 min in ein Glas mit PBS und entfernen Sie dann vorsichtig die Deckgläser.
- Mit PBS-T dreimal für 5 min in einem Glas waschen und dann die Dias in PBS legen.
- Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie vorsichtig auf ein Papier tippen.
- Fügen Sie 20 μL des Montagereagenzes tropfenweise zu den Objektträgern hinzu und legen Sie ein Deckglas darauf. Vermeiden Sie Blasen.
- Lassen Sie die Dias bei RT im Dunkeln trocknen und lagern Sie sie dann bei 4 ° C (oder -20 ° C für längere Konservierung).
6. Bildaufnahme und -analyse (~1 h pro Probe)
HINWEIS: Ein Epifluoreszenzmikroskop kann für beide Protokolle verwendet werden. Für den Gap-Filling (PRR) Assay wird jedoch die Verwendung eines konfokalen Mikroskops für die erhöhte Auflösung der Bilder dringend empfohlen.
- Platzieren Sie einen Tropfen Tauchöl (mikroskopspezifisch) in der Nähe der Oberseite des Objektträgers, wo die Zellen lysiert wurden, und finden Sie den Fokus mithilfe des grünen Kanals, indem Sie grüne Punkte im Hintergrund suchen (40x-, 63x- und 100x-Objektive können verwendet werden).
- Finden Sie die Hauptkonzentration der Fasern und gehen Sie zu den Rändern, um gut verteilte, nicht überlappende einzelne Fasern zu finden, indem Sie nur einen Kanal verwenden, um die Bereiche für die Bilder auszuwählen und mögliche Verzerrungen zu vermeiden.
- Nehmen Sie etwa 15-20 Bilder pro Dia neben dem gesamten Dia an den grünen und roten Kanälen auf und verschmelzen Sie die beiden Kanäle, um zweifarbige DNA-Fasern zu erhalten.
HINWEIS: Wenn Sie ein konfokales Mikroskop verwenden, nehmen Sie Bilder mit hoher Auflösung (1024 x 1024 Pixel) auf und verwenden Sie Pinhole-Werte nahe 1 für rote und grüne Fluoreszenz. - Verwenden Sie ImageJ (freie Software des NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) für IdU- und CldU-Traktlängenmessungen.
- Öffnen Sie ein Bild, indem Sie es in das Feld ImageJ ziehen.
- Verwenden Sie die von der Mikroskopsoftware generierte Skalenleiste (entsprechend kalibriert), um die Länge in Mikrometer umzuwandeln. Verwenden Sie das Geradeaus-Werkzeug , indem Sie das 5. Symbol von links nach rechts im ImageJ-Feld auswählen, um den Maßstabsbalken in den bereitgestellten Mikrometern des Bildes zu messen und eine Messung in Pixeln zuerhalten. Klicken Sie auf Analyze > Set Scale und ersetzen Sie den "Abstand in Pixeln" durch die entsprechende Zahl und die "Längeneinheit" auf μm.
- Wählen Sie im Feld ImageJ das Werkzeug Segmentierte Linie aus, indem Sie mit der linken Maustaste auf das5. Symbol von links nach rechts klicken und dann die zweite Option von oben nach unten auswählen.
- Zeichnen Sie den genauen Pfad des roten (IdU) oder grünen (CldU) Trakts durch Linksklick und stoppen Sie die Zeichnung durch Rechtsklick. Drücken Sie die M-Taste auf der Tastatur, um die Länge zu messen.
- Analysieren Sie für die S1-Faser nur Rot-Grün (zweifarbige Fasern)16. Messen Sie rote und grüne Traktlängen von mindestens 150 Fasern aus verschiedenen Bildern, indem Sie die roten und grünen Traktmessungen für jede einzelne Faser verfolgen.
- Für den lückenfüllenden Assay messen Sie nur die Länge von IdU (roten) Trakten, die mindestens 1 CldU (grünen) Fleck, aber keine kontinuierliche CldU-Färbung enthalten. Erzielen Sie mindestens 10-15 IdU-Tracts aus verschiedenen Bildern mit mindestens 1 CldU-Patch.
HINWEIS: Für die Analysen kann auch andere Software verwendet werden, wie z.B. der Zeiss LSM Image Browser.
- Für die S1-Fasern zeichnen Sie die Länge der IdU-Traktate, die Länge der CldU-Traktate und die Verhältnisse (CldU/IdU oder umgekehrt) in separaten Grafiken als Streupunktdiagramme mit Medianen auf.
- Messen Sie lückenfüllende Ereignisse als Einheiten der "Pro-Kilobasis-Dichte", dividieren Sie die Gesamtzahl der CldU (PRR, grün) Flecken auf einer gegebenen Länge des IdU (roten) Trakts durch die Gesamtlänge des roten Trakts in Kilobasen (unter Berücksichtigung von 1 μm = 2,59 Kilobasen31). Zeichnen Sie dann die Daten als Streupunktdiagramme mit Medianen.
- Führen Sie in beiden Experimenten statistische Analysen zwischen zwei Stichproben mit Mann-Whitney (nichtparametrischer Test) und zwischen mehr als zwei Stichproben mit Kruskal-Wallis durch, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest.
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Representative Results
Wenn im S1-Faser-Assay die Behandlung mit einem genotoxischen Wirkstoff zu postreplizierenden ssDNA-Lücken führt, sind die Gesamtlängen der DNA-Fasern aus S1-behandelten Kernen bei der Behandlung mit DNA-Schäden kürzer als bei unbehandelten Proben sowie bei Proben, die mit dem genotoxischen Mittel behandelt wurden, aber keiner S1-Spaltung unterzogen wurden (Abbildung 1).
Alternativ, wenn die Behandlung mit der S1-Nuklease die Länge der DNA-Fasern im Vergleich zu unbehandelten Zellen nicht signifikant beeinflusst, sind unterschiedliche Interpretationen möglich: (1) Bei der Behandlung mit dem verwendeten genotoxischen Mittel und/oder im spezifischen genetischen Hintergrund kommt es nicht zu einer Bildung von postreplizierenden ssDNA-Lücken. Tatsächlich haben wir bereits gezeigt, dass UV-induzierte 6-4-Photoprodukte (6-4PP), aber keine Cyclobutanpyrimidin-Dimere (CPD) zur Bildung von ssDNA-Lücken in Zellen führen, die für die Nukleotid-Exzisionsreparatur mangelhaft sind (NER, XP-C-Zellen)14. (2) Die ssDNA-Lücken wurden repariert und können nicht mehr nachgewiesen werden. (3) Die durch die Behandlung mit dem Genostatikum induzierte Verkürzung allein ist zu ausgeprägt, um eine weitere Verkürzung über die S1-Spaltung nachweisen zu können.
Insbesondere könnte die fehlende Wirkung des S1 auch technische Probleme wie beeinträchtigte Bedingungen für die S1-Aktivität widerspiegeln, einschließlich eines unangemessenen pH-Werts des S1-Puffers oder einer begrenzten Menge an Zink.
Abbildung 1: Nachweis von post-replizierenden ssDNA-Lücken auf laufenden Gabeln mittels S1-Faser-Assay. (A) Schematische Darstellung von DNA-Faser-Assays mit der ssDNA-spezifischen S1-Nuklease (S1-Faser). Progressive Replikationsgabeln sind mit Thymidinanaloga (IdU, CldU) markiert und können nach DNA-Ausbreitung und Immunfärbung gemessen werden. Links, Standard-Progressionsgabeln ohne Lücken sind nicht anfällig für eine Spaltung durch die S1-Kerne. Richtig, Lücken in der entstehenden DNA, die herkömmlicherweise nicht nachweisbar sind, werden von S1-Nukleasen angegriffen und als kürzere CldU-Trakte visualisiert. (B) Schema des S1-Glasfaserprotokolls. (C) Repräsentative Bilder von S1 Fiber. Oben kontrollieren Sie den entstehenden DNA-Trakt ohne Lücken, der durch die S1-Nuklease unempfindlich gegen Spaltung ist. Boden, DNA-Trakt positiv für Lücken, die durch die S1-Nuklease gespalten werden, was zu einer kürzeren CldU (grünen) Traktlänge führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Im PRR-Assay (Gap-Filling Assay) deutet eine signifikante Zunahme der Dichte von kurzen CldU-Patches auf IdU-Trakten auf erhöhte lückenfüllende Ereignisse hin (Abbildung 2). Eine hohe Dichte von PRR-Ereignissen kann durch 1 PRR-Ereignis (grün/CldU-Patch) in einem kurzen IdU-Trakt sowie durch mehrere PRR-Ereignisse in einem langen Trakt widergespiegelt werden (siehe repräsentative Bilder Abbildung 2C). Die Analyse muss rigoros durchgeführt werden, indem nur CldU-Patches bewertet werden, die sich auf IdU-Trakten befinden, wobei zu berücksichtigen ist, dass die CldU-Patches klein sind und leicht als Fleckenhintergrund verwechselt werden könnten (siehe repräsentative Bilder Abbildung 2C).
Abbildung 2: Erkennung der postreplizierenden Reparatur durch Lückenfüllung . (A) Schema des roten (IdU) Trakts mit grünem (CldU) Patch, der auf ein lückenfüllendes Ereignis hinweist. B) Schema des Protokolls zur Feststellung von Lückenfüllern. (C) Repräsentative Bilder aus dem Gap-Filling (PRR) Assay. Links, längere IdU-Trakte mit mindestens einem CldU-Patch und/oder weniger CldU-Patches insgesamt entsprechen einer geringen lückenfüllenden Dichte (weniger lückenfüllende Ereignisse). Richtig, kürzere IdU-Trakte mit mindestens einem CldU-Patch und längere IdU-Trakte mit mehr CldU-Patches insgesamt entsprechen einer hohen lückenfüllenden Dichte (mehr lückenfüllende Ereignisse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Kritische Schritte des Standard-DNA-Faser-Assay-Protokolls wurden in einer früheren Publikationdiskutiert 32. Hier beschreiben wir modifizierte Versionen des Standard-DNA-Faser-Assays, um das Vorhandensein von postreplizierenden ssDNA-Lücken sowie deren Reparatur durch Lückenfüllung zu untersuchen, die ursprünglich in14 beschrieben wurden. Im Zusammenhang mit der postreplizierenden Präsenz von ssDNA-Lücken wäre die Verwendung der S1-Nuklease im S1-Faserprotokoll höchstwahrscheinlich nach Exposition eines genotoxischen Mittels für mindestens 1 h geeignet, um Zeit für die Spaltbildung und den anschließenden Nachweis zu haben. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass in einigen Zelllinien oder genetischen Hintergründen die Verwendung der S1-Nuklease auch ohne zusätzliche Behandlung mit genotoxischen Wirkstoffen kürzere Bahnen erzeugenkann 33,34. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, alle Kontrollen einzubeziehen, um eine angemessene Schlussfolgerung darüber zu gewährleisten, ob die Behandlung mit einem genotoxischen Wirkstoff zu einer Lückenakkumulation führt. Darüber hinaus ist es wichtig, das Ergebnis der S1-Faser weiter zu validieren, indem der Assay unter Bedingungen wiederholt wird, unter denen keine ssDNA-Lücken mehr gebildet oder repariert werden.
In Bezug auf den PRR-Assay (Gap-Filling) ist es wichtig, eine UVC-Dosis / Wirkstoffkonzentration zu optimieren, die die Gesamtlänge der DNA-Fasern nicht beeinflusst, da die Ergebnisse als Pro-Kilobasendichte berechnet werden. Wenn eine Konzentration verwendet wird, die eine Verkürzung des Trakts induziert, können die Ergebnisse künstlich in Richtung einer erhöhten lückenfüllenden Dichte verzerrt werden, was die Dateninterpretation erschwert. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, können lückenfüllende Ereignisse zusätzlich zu nicht markierter DNA visualisiert werden, indem die Gesamt-DNA mit einem Anti-SS-DNA-Antikörper gefärbt wird, wie zuvor beschrieben14,16. Darüber hinaus könnte ein kinetisches Experiment durchgeführt werden, um eine maximale Erkennung von lückenfüllenden Ereignissen zu gewährleisten.
Beachten Sie, dass lückenfüllende Ereignisse auch mit dem S1-Faserassay überwacht werden können, wenn sich die Zellen vor der Behandlung mit der S1-Nuklee erholen können. Insbesondere wenn postreplizive Lücken gefüllt werden, werden DNA-Fasern unempfindlich gegen Spaltung durch die S1-Nuklease, und die DNA-Faserlänge kann daher in diesem Zusammenhang als Auslese zum Lückenfüllen verwendet werden28. Daher kann dieser Ansatz verwendet werden, um die Lückenfüllung während des gesamten Zellzyklus zu untersuchen, anders als der PRR-Assay, der auf die Untersuchung der Lückenfüllung in G2 / M beschränkt ist.
Schließlich wurden die mit dem PRR-Assay erhaltenen Daten mit der S1-Faser28 validiert, was darauf hindeutet, dass Nocodazol und die künstliche Blockierung von Zellen in G2/M während des PRR-Assays die Lückenfüllung nicht beeinflussen. Andere Wirkstoffe, die eine G2/M-Phasenblockade induzieren, können möglicherweise in diesem Assay verwendet werden.
Die S1-Faser wird zunehmend von Labors weltweit verwendet, um neue Einblicke in die Mechanismen der Bildung von ssDNA-Lücken zu liefern und bisher unerkannte Bedingungen aufzudecken, unter denen diese Lücken gebildet werden können 14,29,34,35,36. Für zukünftige Untersuchungen wäre es interessant, diese modifizierten Protokolle mit dem Quantenpunktansatz zu kombinieren, der eine direkte Visualisierung der DNA-Läsion37 ermöglicht, um das Cross-Talk zwischen postreplizierter ssDNA-Lückenbildung und DNA-Reparatur aufzuklären und wie die Art des Schadens den Mechanismus der Replikationsstressantwort definiert. Als Alternative zum S1-Faser-Assay kann die S1-Nuklease auch verwendet werden, um den lückenfüllenden Prozess in einem modifizierten neutralen Kometenassay zu untersuchen. Kurz gesagt, wenn Lücken vorhanden sind, führt die Behandlung von Kometen mit der S1-Nuklease zur Bildung von doppelsträngigen Brüchen, die durch neutralen Kometentest nachgewiesen werden können. Protokolle für den neutralen Kometenassay sowie den enzymmodifizierten Kometenassaywurden zuvor veröffentlicht 38,39. Insbesondere ermöglicht dieser Ansatz die Erkennung von ssDNA-Lücken in allen Phasen des Zellzyklus, ohne dass Zellen in der G2-Phase blockiert werden müssen. Mit diesem Ansatz, kombiniert mit den hier beschriebenen Protokollen S1 Fiber und Gap-Filling (PRR), fanden wir heraus, dass REV3L (DNA-Polymerase-Zeta-Katalysatoreinheit) für das Füllen von Lücken verantwortlich ist, die entstehen, wenn UV-induzierte 6-4PPs im menschlichen Genomvorhanden sind 14.
Mit dem begrenzten verfügbaren technischen Ansatz sind postreplizive ssDNA-Lückenbildung und insbesondere lückenfüllende Ereignisse in menschlichen Zellen weitgehend unerforscht geblieben. Insgesamt liefern diese modifizierten Techniken (S1-Faser, Gap-Filling (PRR) -Assay und S1-Komet) neuartige Strategien, um das Vorhandensein von ssDNA-Lücken zu untersuchen und wie diese Lücken letztendlich im menschlichen Genom gefüllt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Arbeit im C.F.M.M.-Labor wird von der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasilien, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 und 2017/05680-0) im Rahmen der International Collaboration Research von FAPESP und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO, Niederlande) unterstützt; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
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