Summary
Här beskriver vi två modifieringar av DNA-fiberanalysen för att undersöka enkelsträngade DNA-luckor vid replikering av DNA efter lesionsinduktion. S1-fiberanalysen möjliggör detektering av postreplikativa luckor med hjälp av det ssDNA-specifika S1-endonukleaset, medan den gapfyllande analysen möjliggör visualisering och kvantifiering av gapreparation.
Abstract
DNA-fiberanalysen är en enkel och robust metod för analys av replikationsgaffeldynamik, baserat på immunodetektion av nukleotidanaloger som införlivas under DNA-syntes i mänskliga celler. Denna teknik har dock en begränsad upplösning på några tusen kilobaser. Följaktligen kan postreplikativa enkelsträngade DNA -luckor (ssDNA) så små som några hundra baser inte detekteras av standardanalysen. Här beskriver vi en modifierad version av DNA-fiberanalysen som använder S1-nukleaset, ett enzym som specifikt klyver ssDNA. I närvaro av postreplikativa ssDNA-luckor kommer S1-nukleaset att rikta in sig på och klyva luckorna, vilket genererar kortare kanaler som kan användas som avläsning för ssDNA-luckor på pågående gafflar. Dessa postreplikativa ssDNA-luckor bildas när skadat DNA replikeras diskontinuerligt. De kan repareras via mekanismer som är frikopplade från genomreplikation, i en process som kallas gap-filling eller post-replicative repair. Eftersom gapfyllningsmekanismer involverar DNA-syntes oberoende av S-fasen, kan förändringar i DNA-fibermärkningsschemat också användas för att övervaka gap-fyllningshändelser. Sammantaget är dessa modifieringar av DNA-fiberanalysen kraftfulla strategier för att förstå hur postreplikativa luckor bildas och fylls i genomet hos mänskliga celler.
Introduction
Banbrytande arbeten har gett bevis för ackumulering av postreplikativa enkelsträngade (ssDNA) luckor vid behandling med DNA-skadliga medel i bakterier1 och mänskliga celler 2,3. Under replikation av skadade DNA-mallar kan DNA-syntesmaskineriet kringgå lesionerna genom att använda specifika translesionssyntes-DNA-polymeraser eller genom mallväxlingsmekanismer. Alternativt kan replisome också helt enkelt hoppa över lesionen och lämna ett ssDNA-gap bakom sig för att repareras senare. På senare tid visade en studie tydligt att behandling med genotoxiska medel leder till ssDNA-luckor i eukaryoter genom att använda elektronmikroskopi för att visualisera den specifika strukturen hos replikationsmellanprodukter4. Bildandet av dessa regioner av postreplikativa luckor föreslogs ursprungligen vara ett enkelt resultat av det semi-diskontinuerliga läget för DNA-replikation2. I detta fall kan en lesion på den eftersläpande strängen blockera förlängningen av ett Okazaki-fragment, men gaffelprogressionen räddas naturligt av följande Okazaki-fragment och lämnar ett ssDNA-gap. Ytterligare studier visade emellertid att bildandet av luckor på den ledande strängen också är möjlig, vilket först visades i bakterier5. I eukaryoter visade sig PRIMPOL, ett unikt DNA-polymeras med primasaktivitet, kunna starta om DNA-syntesen nedströms en replikationsblockerande lesion genom sin reprimeringsaktivitet 6,7,8,9,10,11. Således kan PRIMPOL-primasaktiviteten förklara bildandet av postreplikativa ssDNA-luckor i den ledande strängen vid behandling med ett DNA-skadligt medel i mänskliga celler12. Icke desto mindre krävde upptäckt av dessa luckor såväl som gapreparation, tills nyligen, indirekta eller tidskrävande metoder såsom elektronmikroskopi4 eller plasmidbaserade analyser13. Användningen av det ssDNA-specifika S1-nukleaset för att upptäcka luckor i mänskliga celler var banbrytande av tidiga studier för mer än fyrtio år sedan, med hjälp av sackarosgradienttekniker 2,3. På senare tid tillämpade vår grupp användningen av detta nukleas för att detektera ssDNA vid replikering av DNA (postreplikativa luckor) med andra metoder som DNA-fiber och kometanalyser14. Dessa nya tillvägagångssätt banade väg för den nuvarande ökningen av studier om postreplikativa luckor. Här beskriver vi en strategi för att använda S1-nukleas för att upptäcka postreplikativa ssDNA-luckor genom DNA-fiberanalys och förklarar hur ett differentiellt märkningsschema i DNA-fiberprotokollet kan möjliggöra studier av reparationen av dessa luckor.
DNA-fiberanalysen är en kraftfull teknik som har använts av ett växande antal laboratorier och har gett värdefulla insikter om replikationsgaffeldynamik och replikationsspänningsresponsmekanismer. Kortfattat är denna teknik baserad på sekventiell införlivande av nukleotidanaloger (såsom CldU -5-klor-2'-deoxyuridin- och IdU-5-jod-2'-deoxiuridin) i det replikerande DNA. Efter skörd lyseras celler och DNA-molekyler sprids på en positivt belagd glasskiva. CldU och IdU detekteras sedan av specifika antikroppar, som kan visualiseras i ett fluorescerande mikroskop som tvåfärgade fibrer. Slutligen mäts längderna på IdU- och CldU-kanalerna för att identifiera eventuella förändringar av DNA-replikationsdynamiken som en följd av DNA-skadeinduktion. Denna teknik kan användas för att undersöka olika fenomen, såsom gaffelstoppning, gaffelbromsning, begynnande DNA-nedbrytning och variationer i ursprungsfrekvensen som skjuter15,16.
En begränsning av DNA-fiberanalysen är dess upplösning på några kilobaser. Eftersom postreplikativa ssDNA-luckor kan ligga i intervallet hundratals baser är det omöjligt att visualisera dessa luckor direkt med standard DNA-fiberprotokollet. Förekomsten av ssDNA-luckor vid replikering av DNA i mänskliga celler behandlade med genotoxiska medel har varit indirekt inblandad tidigare. Till exempel observationen av ssDNA som bedömts genom rekrytering av det ssDNA-bindande proteinet, replikationsproteinet A (RPA), i celler utanför S-fasen, eller bildandet av ssDNA som detekterats genom alkalisk DNA-avveckling i kombination med frånvaron av långvarig gaffelstoppning genom DNA-fiberanalys 12,17,18,19,20,21 tillskrevs ackumuleringen av ssDNA-luckor. Dessutom inducerar postreplikativa ssDNA-luckor en ATR-beroende G2 / M-faskontrollpunkt och arresterar celler behandlade med replikationsgifter 18,19,20,21,22.
S1-nukleaset bryter ned enkelsträngade nukleinsyror som frigör 5'-fosforylmono- eller oligonukleotider och har en 5 gånger högre affinitet till ssDNA jämfört med RNA. Dubbelsträngade nukleinsyror (DNA: DNA, DNA: RNA eller RNA: RNA) är resistenta mot S1-nukleaset utom när de används i extremt höga koncentrationer. S1-nukleaset klyver också dubbelsträngat DNA vid det enkelsträngade området orsakat av ett nick, gap, mismatch eller loop. S1-nukleaset är således ett ssDNA-specifikt endonukleas som kan klyva ssDNA-luckor, vilket i slutändan genererar dubbelsträngade brott 23,24. Således möjliggör tillägg av steg för S1-nukleasförtunning till DNA-fiberprotokollet indirekt detektering av postreplikativa ssDNA-luckor. I närvaro av luckor kommer behandling av exponerade kärnor med S1-nukleaset före DNA-spridning att generera kortare kanaler som en följd av S1-klyvning av ssDNA som i sig finns vid luckor14. Följaktligen är traktförkortning avläsningen för ssDNA-luckor med hjälp av denna metod. Jämfört med det vanliga DNA-fiberprotokollet kräver DNA-fibern med S1-nukleaset endast två extra steg: kärnexponering (cellpermeabilisering) och behandling med S1-nukleaset. Det är viktigt att notera att lämpliga kontroller är obligatoriska, såsom prover som behandlats med det genotoxiska medlet men utan S1-nukleas och prover som behandlats med S1-nukleas utan genotoxiskt medel. Protokollet i sig, inklusive införlivande av analoger, S1-behandling och spridning, kan utföras på en dag och kräver inte exceptionellt material. Det kräver bara tymidinanalogerna, det renade S1-nukleaset, lämpliga primära och sekundära antikroppar och ett fluorescerande mikroskop. Sammantaget upptäcker DNA-fibern som använder S1-nukleaset ssDNA-luckor på pågående replikationsgafflar med ett relativt enkelt tillvägagångssätt.
De postreplikativa ssDNA-luckorna som bildas som en följd av replikationsspänningsresponsmekanismer kan repareras (eller fyllas) av olika mekanismer, inklusive translesions-DNA-syntes eller mallväxling, i en process som kallas gap-filling eller post-replication repair (PRR)25. Dessa processer sker bakom de framryckande gafflarna, vilket involverar replikationsoberoende DNA-syntes 14,26,27. Baserat på dessa resultat kan ett märkningsschema som skiljer sig från standard DNA-fiberanalysen utföras för att visualisera gapfyllningshändelser i G2-fasen direkt 14,16,26,28. Specifikt kan en tymidinanalog användas för att märka replikationsgaffeln vid tidpunkten för genotoxisk behandling och postreplikativ ssDNA-gapbildning, medan en annan tymidinanalog kan användas för att märka gapfyllande händelser. I detta protokoll märks celler med en första tymidinanalog (till exempel IdU) omedelbart efter eller samtidigt med genotoxisk behandling i 1 timme, så att det framväxande DNA:t märks vid tidpunkten för gapbildning. Nocodazol tillsätts vid behandling för någonstans mellan 12-24 h för att arrestera celler i G2 / M, vilket förhindrar följande S-fas. För de sista 4 timmarna av nocodazolbehandling tillsätts en andra tymidinanalog (till exempel CldU) till mediet som ska införlivas under gapfyllning. Viktigt är att denna analys endast kan användas för att upptäcka gapfyllande händelser i G2 eftersom gapfyllningssignalen från CldU inte kan särskiljas från en signal på grund av CldU-införlivande i replikerande DNA i S-fasen. För att minimera bakgrundssignalen bör därför tidpunkten för CldU-införlivande efter skadeinduktion sammanfalla med när större delen av cellpopulationen går in i G2-fas14. Därför kommer denna tidpunkt att variera beroende på cellinje och behandlingsförhållanden. Optimering av cellcykelprogression innan du använder denna analys rekommenderas. Samfärgning av dessa tymidinanaloger möjliggör visualisering av gapfyllande (PRR) kanaler (CldU-fläckar) ovanpå begynnande DNA (IdU-kanaler) syntetiserade under den genotoxiska behandlingen när ssDNA-luckor genererades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eftersom studien använder mänskliga celler godkändes arbetet av etikkommittén vid Institutet för biomedicinsk vetenskap vid universitetet i São Paulo (ICB-USP, godkännandenummer #48347515.3.00005467) för forskning med mänskliga prover.
OBS: Protokollen som beskrivs här användes i tidigare publikationer med mindre ändringar 14,16,28. Här ligger fokus på användningen av ultraviolett ljus C (UVC) som ett DNA-skadligt medel. Men andra DNA-skadliga medel som cisplatin och hydroxyurea har också framgångsrikt använts28. Detta protokoll kan utföras i en rad cellinjer, inklusive U2OS, HEK293T, humana fibroblaster och andra 14,28,29. Det är viktigt att bestämma den experimentella frågan innan du utför detta protokoll. DNA-fiberanalysen med S1-nukleaset (kallad S1 Fiber nedan) används för att detektera närvaron av postreplikativa ssDNA-luckor, medan gapfyllningen (eller PRR) -analysen utförs för att kvantifiera gapfyllningshändelser i G2-fasen. Således, om man analyserar förekomsten av postreplikativa ssDNA-luckor, bör utredaren utföra avsnitt 2 (S1 Fiber experimentell installation) och fortsätta direkt till avsnitt 4 (DNA-fiberberedning genom spridning) i protokollet. Om man analyserar gap-fill-händelser bör utredaren gå direkt till avsnitt 3 (Gap-filling (PRR) experimentell installation).
1. Reagenser och installation
- Tymidinanaloger: Resuspend 5-jod-2'-deoxyuridin (IdU) och 5-klor-2'-deoxyuridin (CldU) i 1 NNH4OHtill en slutlig koncentration av 100 mM. Filtrera analogerna genom ett sterilt sprutfilter (0,2 μm), alikvot och förvara dem vid -20 C.
- Antikroppar: Primaries - anti-BrdU råtta (Biorad) och anti-BrdU mus (BD); Secondaries - anti-råtta Alexa Fluor 488 och anti-mus Alexa Fluor 594.
- Cellulär permeabilisering CSK100-buffert för S1 Fiber: Tillsätt 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7,2], 300 mM sackaros och 0,5% Triton X-100 i destilleradH2O.
- S1-nukleasbuffert [pH 4,6]: Tillsätt 30 mM natriumacetat [pH 4,6], 10 mM zinkacetat, 50 mM NaCl och 5 % glycerol iH2O.
OBS: S1-nukleasbufferten måste ha ett slutligt pH på 4,6, eftersom S1-aktiviteten sjunker 50% vid pH > 4,9. - Alikvotera och förvara vid -20 °C det S1-nukleas som renats från A. oryzae förspätt i S1-nukleasutspädningsbuffert som tillhandahålls av tillverkaren.
- Rekonstituera nokodazolet i DMSO till en slutlig koncentration av 2 mM för gapfyllning. prövning.
- Lysbuffert: Tillsätt 200 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM EDTA och 0,5 % SDS iH2O.
- Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Förbered PBS-T genom att lägga till 0,1 % Tween-20 i PBS.
- Förbered 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
- Förbered 0,1% BSA i PBS.
- Förbered PBS-T-BSA genom att lägga till 1 % BSA i PBS-T.
OBS: Använd ett epifluorescerande mikroskop med en kvicksilver- eller xenonlampa med en 510 nm våglängd och 42 nm bandbredd GFP (FITC, Alexa Fluor 488) emissionsfilter och en 624 nm våglängd och 40 nm bandbredd Texas Red (Alexa Fluor 594) emissionsfilter eller ett konfokalmikroskop med en 488-nm linje (blå) laser för att detektera grön fluorescens (detekterad mellan 510 och 560 nm) och en 561 nm linje (gul) laser för att detektera röd fluorescens ( detekterad mellan 575 och 680 nm). Nedsänkningsmål (40x, 63x eller 100x).
2. S1 Fiber experimentell installation (2 dagar)
- Dag 1: Platta 4 brunnar för varje cellinje: ± UVC och ± S1-nukleas med celler vid 70-90% sammanflöde.
OBS: Experimentet kan göras i ett format så litet som en 12-brunnsplatta. I detta fall används alla lösningar vid 0,5 ml/brunn. - Dag 2: Förbered färsk IdU vid 20 μM och CldU vid 200 μM i förvärmda (37 °C) cellodlingsmedier.
- Aspirera odlingsmediet och tillsätt omedelbart mediet med 20 μM IdU och inkubera cellerna vid 37 °C, 5%CO2 (cellinkubator) i exakt 20 minuter.
- Tvätta snabbt cellerna med förvärmd (37 °C) PBS två gånger.
- Bestråla cellerna med 20 J/m2 UVC. Använd obehandlade celler som kontroller.
- Tillsätt omedelbart mediet med 200 μM CldU och inkubera cellerna vid 37 °C, 5%CO2 (cellinkubator) i exakt 60 min.
OBS: IdU- och CldU-märkning kan bytas ut, men koncentrationen av den andra analogen bör vara 5-10 gånger högre än den första analogen. Tidpunkten för den analoga inkubationen kan anpassas till det genotoxiska medel som används, men tiden för den andra analoga inkubationen bör vara tillräckligt lång för att säkerställa tillräckligt med tid för gapbildning14,16. Om du använder ett DNA-skadligt läkemedel, lägg till läkemedlet tillsammans med CldU 28,29,30. - Tvätta cellerna med förvärmd (37 °C) PBS två gånger.
- Permeabilisera cellerna med CSK100-bufferten i 8-10 min vid rumstemperatur (RT).
OBS: Framgångsrik permeabilisering kan kontrolleras under ett ljusfältmikroskop där endast kärnor ska vara observerbara - Tvätta försiktigt kärnorna med PBS (häll 0,5 ml ner på sidan av varje brunn, bara i några sekunder).
- Tvätta försiktigt kärnorna med S1-buffert (häll 0,5 ml ner på sidan av varje brunn, bara i några sekunder).
- Inkubera kärnorna med S1-buffert med S1-nukleas (20 U/ml) eller utan (som kontroll) i 30 minuter vid 37 °C (cellinkubator).
- Aspirera S1-bufferten och tillsätt 0,1% BSA i PBS.
- Skrapa kärnorna och överför dem till ett lämpligt kommenterat 1,5 ml rör. Håll rören på is hela tiden.
OBS: Framgångsrik lossning av kärnor kan kontrolleras under ett ljusfältmikroskop. - Pelletera kärnorna: centrifugera vid ~4600 x g i 5 min, vid 4 °C.
OBS: Till skillnad från den vanliga DNA-fiberanalysen kan kärnorna inte räknas, så tänk på det ursprungliga antalet celler som pläteras. Alternativt kan en extra brunn som inte utsattes för permeabilisering användas för att uppskatta cellantalet med hjälp av en hemocytometer eller en cellräknare. - Resuspendera pelletsbrunnen i PBS i en koncentration av ~ 1500 celler / μL, placera rören på is och fortsätt till DNA-fiberberedning genom att sprida (avsnitt 4) protokoll omedelbart
3. Gap-filling (PRR) experimentell installation (3 dagar)
- Dag 1: Platta 2 brunnar för varje cellinje: ± UVC med celler vid ~ 70% sammanflöde.
- Dag 2: Förbered färsk IdU vid 20 μM i förvärmda (37 °C) cellodlingsmedier.
- Bestråla cellerna med 20 J/m2 UVC.
- Tillsätt omedelbart mediet med 20 μM IdU och inkubera cellerna vid 37 °C, 5% CO2 (cellinkubator) i exakt 60 minuter.
- Tvätta cellerna med förvärmd (37 °C) PBS två gånger.
- Tillsätt omedelbart mediet med 200 ng/ml nokodazol och inkubera cellerna vid 37 °C, 5 %CO2 (cellinkubator) i 12–24 timmar (tidpunkten för detta steg måste hållas konsekvent mellan experimenten).
OBS: Koncentrationen av nocodazol kan behöva anpassas enligt den cellinje som används. Om du använder ett genotoxiskt läkemedel, inkubera cellerna med IdU ± läkemedel28. - Dag 3: Aspirera odlingsmediet, tillsätt mediet med 20 μM CldU + nokodazol och inkubera under de sista 4 timmarna av nocodazolbehandling, vid 37 °C, 5%CO2 (cellinkubator).
- Tvätta cellerna med förvärmd (37 °C) PBS.
- Tillsätt trypsin och inkubera i 1-2 min vid 37 °C, 5%CO2 (cellinkubator) för att lossa celler.
- Tillsätt samma volym cellodlingsmedier och samla celler (media + trypsin) i ett lämpligt kommenterat 1,5 ml rör. Håll rören på is hela tiden.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en cellräknare.
- Pelletera cellerna: centrifugera vid ~350 x g i 5 min, vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i PBS vid ~ 1500 celler / μL. Håll cellerna på is och starta DNA-fiberberedning genom att sprida protokollet omedelbart (dag 3 eller 4).
4. DNA-fiberberedning genom spridning (~ 1 h för 12 bilder)
- Kommentera mikroskopglasen med en kolpenna och placera dem platt på en bricka.
- Knacka på rörets botten för att säkerställa homogenisering.
- Tillsätt 2 μL celler på toppen av motsvarande bild.
OBS: Två droppar kan läggas till, en på toppen av bilden och en annan i mitten av bilden. - Tillsätt 6 μL av lysbufferten och lysera cellerna genom att pipettera upp och ner cirka 5 gånger (undvik att göra bubblor).
- Dra droppen en liten bit mot botten av bilden med pipettspetsen (för att styra droppspridningens väg).
- Inkubera i 5 min vid RT för att lysera kärnorna.
OBS: Volymen av lysbufferten och tiden för lysen kan justeras om lysaten torkar för snabbt eller alternativt inte torkar tillräckligt. Lysis buffertvolym kan variera från 5-7 μl och timing kan falla mellan 4-10 min. - Luta bilden på cirka 20-40 ° och låt droppen spridas till botten av bilden med konstant, låg hastighet.
- Låt bilden torka vid RUMSTEMPERATUR i mörker (10-15 min).
- Förbered nyligen fixeringslösningen: Blanda metanol: isättika i förhållandet 3: 1.
- Sänk ner bilderna i en burk som innehåller fixeringslösningen och inkubera i 5 minuter vid RT för att fixera DNA på bilderna.
VARNING: Metanol är mycket giftigt och bör förvaras under en kemisk huva. Kassera i en lämplig behållare. - Torka objektglasen vid RT i mörker och förvara vid 4 °C skyddade från ljus tills de färgas.
5. Immunfärgning av DNA-fibrer (~ 6 h)
- Tvätta bilderna med PBS två gånger i 5 minuter.
- Denaturera DNA med nyberedda 2,5 M HCl i 40-60 min vid RT.
VARNING: För att förbereda 2,5 M HCl, häll syra i vatten och aldrig motsatsen. Detta är en exoterm reaktion så det kommer att värmas upp något. - Tvätta bilderna med PBS tre gånger i 5 min.
- Block med 5% BSA (kan förvaras vid 20 °C för upp till tre användningsområden) som tidigare värmts vid 37 °C i 30-60 min vid 37 °C.
- Ta bort överskottsvätskan från bilderna genom att försiktigt knacka på ett papper.
- Tillsätt 30 μL primära antikroppar (mus anti-BrdU 1/20 (för IdU) och råtta anti-BrdU 1/100 (för CldU) utspädda i PBS-T-BSA) till objektsglasen droppvis och placera ett täckglas ovanpå. Inkubera i 1-1,5 h vid RT i en mörk, fuktig kammare.
- Placera bilderna i en burk med PBS i 1-2 minuter och ta sedan försiktigt bort täckglasen.
- Tvätta med PBS-T i en burk tre gånger i 5 minuter och placera sedan bilderna i PBS.
- Ta bort överskottsvätskan genom att försiktigt knacka på ett papper.
- Tillsätt 30 μL sekundära antikroppar (anti-mus Alexa Fluor 594 och anti-råtta Alexa Fluor 488 utspädd vid 1/75 i PBS-T-BSA.) till bilderna droppvis och placera ett täckglas ovanpå. Inkubera i 45-60 min vid RT i en mörk, fuktig kammare.
- Placera bilderna i en burk med PBS i 1-2 minuter och ta sedan försiktigt bort täckglasen.
- Tvätta med PBS-T i en burk tre gånger i 5 minuter och placera sedan bilderna i PBS.
- Ta bort överskottsvätskan genom att försiktigt knacka på ett papper.
- Tillsätt 20 μL av monteringsreagenset droppvis till objektglasen och placera ett täckglas ovanpå. Undvik bubblor.
- Låt objektsglasen torka vid RT i mörker och förvara sedan vid 4 °C (eller -20 °C för längre konservering).
6. Bildförvärv och analys (~ 1 h per prov)
OBS: Ett epifluorescensmikroskop kan användas för båda protokollen. För GAP-fyllning (PRR) -analysen rekommenderas dock användning av ett konfokalmikroskop för ökad upplösning av bilderna.
- Placera en droppe nedsänkningsolja (mikroskopspecifik) nära toppen av bilden där cellerna lyserades och hitta fokus med hjälp av den gröna kanalen genom att söka efter gröna prickar i bakgrunden (40x, 63x och 100x mål kan användas).
- Hitta huvudkoncentrationen av fibrer och flytta till kanterna för att hitta väl spridda icke-överlappande enskilda fibrer med endast en kanal för att välja regioner för bilderna och undvika potentiell förspänning.
- Ta cirka 15-20 bilder per bild tillsammans med hela bilden vid de gröna och röda kanalerna och slå samman de två kanalerna för att få tvåfärgade DNA-fibrer.
OBS: Om du använder ett konfokalmikroskop, ta bilder med hög upplösning (1024 x 1024 pixlar) och använd pinhålvärden nära 1 för både röd och grön fluorescens. - Använd ImageJ (fri programvara som tillhandahålls av NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) för IdU- och CldU-flödeslängdsmätningar.
- Öppna en bild genom att dra den till rutan ImageJ.
- Använd skalstrecket som genereras av mikroskopprogramvaran (lämpligt kalibrerad) för att konvertera längden till mikrometer. Använd verktyget Straight-line genom att välja den 5: e ikonen från vänster till höger i rutan ImageJ för att mäta skalstrecket i bilden som tillhandahålls mikrometrar och få ett mått i pixlar. Klicka på Analysera > Ställ in skala och ersätt "avståndet i pixlar" med lämpligt antal och "längdenheten" till μm.
- I rutan ImageJ väljer du segmenterad linje genom att vänsterklicka på den 5: e ikonen från vänster till höger och sedan välja det andra alternativet uppifrån och ner.
- Rita den exakta sökvägen för det röda (IdU) eller gröna (CldU) området genom att vänsterklicka och stoppa ritningen genom att högerklicka. Tryck på M-knappen på tangentbordet för att mäta längden.
- För S1 Fiber, analysera endast rödgröna (tvåfärgade fibrer)16. Mät röda och gröna draglängder från minst 150 fibrer från olika bilder genom att hålla reda på de röda och gröna kanalmätningarna för varje enskild fiber.
- För den gapfyllande analysen, mät endast längden på IdU (röda) kanaler som innehåller minst 1 CldU (grön) lapp men ingen kontinuerlig CldU-färgning. Gör minst 10-15 IdU-traktat från olika bilder med minst 1 CldU-patch.
OBS: Annan programvara kan användas för analyserna, till exempel Zeiss LSM Image Browser.
- För S1-fibrerna ritar du IdU-kanalernas längd, CldU-trakternas längd och förhållanden (CldU/IdU eller vice versa) i separat grafik som spridningspunktdiagram med medianer.
- Mät gapfyllande händelser som enheter av "per kilobasdensitet", dela det totala antalet CldU (PRR, grön) fläckar på en given längd av IdU (röd) kanal med den totala längden på det röda området i kilobaser (med tanke på 1 μm = 2,59kilobaser 31). Plotta sedan data som spridningspunktdiagram med medianer.
- I båda experimenten utför du statistisk analys mellan två prover med Mann-Whitney (icke-parametriskt test) och mellan mer än två prover med Kruskal-Wallis följt av Dunns test för flera jämförelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I S1 Fiber-analysen, om behandling med ett genotoxiskt medel leder till postreplikativa ssDNA-luckor, kommer de totala längderna av DNA-fibrer från S1-behandlade kärnor att vara kortare vid behandling med DNA-skador jämfört med obehandlade prover samt prover som behandlades med det genotoxiska medlet men inte skickades till S1-klyvning (figur 1).
Alternativt, om behandling med S1-nukleaset inte signifikant påverkar längden på DNA-fibrer jämfört med obehandlade celler, är olika tolkningar möjliga: (1) Det finns ingen bildning av postreplikativa ssDNA-luckor vid behandling med det genotoxiska medlet som används och / eller i den specifika genetiska bakgrunden som undersökts. Vi har faktiskt tidigare visat att UV-inducerade 6-4 fotoprodukter (6-4PP) men inte cyklobutanpyrimidindimerer (CPD) leder till bildandet av ssDNA-luckor i celler som är bristfälliga för nukleotidexcisionsreparation (NER, XP-C-celler)14. (2) SSDNA-luckorna reparerades och kan inte längre upptäckas. (3) Den förkortning som orsakas av behandling med enbart det genotoxiska medlet är alltför uttalad för att möjliggöra detektion av en ytterligare förkortning via S1-klyvning.
I synnerhet kan bristen på effekt av S1 också återspegla tekniska problem som försämrade förhållanden för S1-aktiviteten, inklusive olämpligt pH i S1-bufferten eller begränsad mängd zink.
Figur 1: Detektion av postreplikativa ssDNA-luckor på pågående gafflar med S1 Fiber-analys (A) Schematisk representation av DNA-fiberanalyser med det ssDNA-specifika S1-nukleaset (S1 Fiber). Fortskridande replikationsgafflar är märkta med tymidinanaloger (IdU, CldU) och kan mätas efter DNA-spridning och immunfärgning. Vänster, vanliga framåtgående gafflar utan luckor är inte mottagliga för klyvning av S1-nukleaset. Rätt, luckor i begynnande DNA som är konventionellt omöjliga att upptäcka kommer att riktas mot S1-nukleas och kommer att visualiseras som kortare CldU-kanaler. (B) Schema för S1 Fiber-protokollet. (C) Representativa bilder av S1 Fiber. Topp, kontrollera begynnande DNA-kanaler utan luckor, ogenomträngliga för klyvning av S1-nukleaset. Botten, DNA-kanalpositiv för luckor klyvda av S1-nukleaset vilket resulterar i en kortare CldU (grön) kanallängd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I GAP-fyllningsanalysen (PRR) är en signifikant ökning av densiteten hos korta CldU-plåster på IdU-kanaler ett tecken på ökade gap-fyllningshändelser (Figur 2). En hög densitet av PRR-händelser kan återspeglas av 1 PRR-händelse (grön / CldU-lapp) i ett kort IdU-område samt av flera PRR-händelser i ett långt område (se representativa bilder figur 2C). Analysen måste utföras noggrant genom att endast poängsätta CldU-patchar som ligger ovanpå IdU-områden med tanke på att CldU-plåstren är små och lätt kan misstas som färgningsbakgrund (se representativa bilder Figur 2C).
Figur 2: Detektion av postreplikativ reparation genom gapfyllning. (B) Schema för det protokoll som används för att upptäcka fyllning av luckor. (C) Representativa bilder från GAP-filling (PRR) -analys. Vänster, längre IdU-kanaler med minst en CldU-lapp och/eller färre CldU-plåster totalt motsvarar låg gap-fyllningstäthet (färre gap-fyllningshändelser). Höger, kortare IdU-kanaler med minst en CldU-lapp och längre IdU-trakter med fler CldU-patchar totalt motsvarar hög gap-fyllningstäthet (fler gap-fyllningshändelser). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i det vanliga DNA-fiberanalysprotokollet diskuterades i en tidigare publikation32. Här beskriver vi modifierade versioner av standard DNA-fiberanalysen för att undersöka förekomsten av postreplikativa ssDNA-luckor samt deras reparation genom gapfyllning, som ursprungligen beskrivs i14. I samband med postreplikativ ssDNA-gapnärvaro skulle användningen av S1-nukleaset i S1 Fiber-protokollet sannolikt vara lämplig efter exponering av ett genotoxiskt medel i minst 1 timme för att ge tid för gapbildning och efterföljande detektion. Det är dock viktigt att notera att i vissa cellinjer eller genetiska bakgrunder kan användningen av S1-nukleas generera kortare kanaler även utan ytterligare behandling med genotoxiska medel33,34. Därför är det viktigt att inkludera alla kontroller för att säkerställa en korrekt slutsats om huruvida behandling med ett genotoxiskt medel leder till gapackumulering. Dessutom är det viktigt att ytterligare validera S1 Fiber-resultatet genom att upprepa analysen under förhållanden där ssDNA-luckor inte längre bildas eller repareras.
När det gäller GAP-fyllningsanalysen (PRR) är det viktigt att optimera en UVC-dos / läkemedelskoncentration som inte påverkar DNA-fibrernas totala längd, eftersom resultaten beräknas som en densitet per kilobas. Om du använder en koncentration som inducerar förkortad trakt kan resultaten vara artificiellt snedställda mot en ökad gapfyllningstäthet, vilket gör datatolkning svår. För att motverka denna begränsning kan gapfyllande händelser visualiseras ovanpå icke-märkt DNA genom färgning av totalt DNA med hjälp av en anti-ssDNA-antikropp, som tidigare beskrivits 14,16. Dessutom kan ett kinetiskt experiment utföras för att säkerställa maximal upptäckt av gapfyllande händelser.
Observera att gapfyllande händelser också kan övervakas med hjälp av S1 Fiber-analysen när celler får återhämta sig före behandling med S1-nukleaset. Specifikt, när postreplikativa luckor fylls, blir DNA-fibrer okänsliga för klyvning av S1-nukleaset, och DNA-fiberlängd kan därför användas som en avläsning för gapfyllning i detta sammanhang28. Således kan detta tillvägagångssätt användas för att studera gapfyllning under hela cellcykeln, annorlunda än PRR-analysen som är begränsad till undersökningen av gapfyllning i G2 / M.
Slutligen validerades data som erhållits med PRR-analysen med hjälp av S1 Fiber28, vilket tyder på att nokodazol och artificiell blockering av celler i G2 / M under PRR-analysen inte påverkar gapfyllning. Andra medel som inducerar G2 / M-fasblockering kan potentiellt användas i denna analys
S1 Fiber har i allt högre grad använts av laboratorier över hela världen, vilket ger nya insikter om mekanismerna för ssDNA-gapbildning och avslöjar tidigare ouppskattade förhållanden där dessa luckor kan bildas 14,29,34,35,36. För framtida undersökningar skulle det vara intressant att kombinera dessa modifierade protokoll med kvantprickmetoden som möjliggör direkt visualisering av DNA-lesionen37 för att belysa korssamtalet mellan postreplikativ ssDNA-gapbildning och DNA-reparation samt hur skadans art definierar mekanismen för replikationsstressresponsen. Som ett alternativ till S1 Fiber-analysen kan S1-nukleaset också användas för att studera gapfyllningsprocessen i en modifierad neutral kometanalys. Kortfattat, om luckor är närvarande, leder behandling av kometer med S1-nukleaset till bildandet av dubbelsträngade raster, detekterbara genom neutral kometanalys. Protokoll för neutral kometanalys samt enzymmodifierad kometanalys har tidigare publicerats38,39. I synnerhet möjliggör detta tillvägagångssätt ssDNA-gapdetektering i alla faser av cellcykeln, utan att behöva arrestera celler i G2-fas. Med hjälp av detta tillvägagångssätt, i kombination med S1 Fiber and gap-filling (PRR) -protokollen som beskrivs här, fann vi att REV3L (DNA-polymeras zeta katalytisk enhet) är ansvarig för att fylla luckor som bildas när UV-inducerade 6-4PPs är närvarande i det mänskliga genomet14.
Med det begränsade tillgängliga tekniska tillvägagångssättet har postreplikativ ssDNA-gapbildning och i synnerhet gap-fyllningshändelser förblivit i stort sett outforskade i mänskliga celler. Sammantaget ger dessa modifierade tekniker (S1 Fiber, GAP-filling (PRR) analys och S1 Comet) nya strategier för att undersöka förekomsten av ssDNA-luckor och hur dessa luckor i slutändan fylls i det mänskliga genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet i C.F.M.M.-laboratoriet stöds av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasilien, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 och 2017/05680-0) inom ramen för International Collaboration Research från FAPESP och Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (NWO, Nederländerna); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasilien, Grants # 308868/2018-8] och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasilien, Finanskod 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
- Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
- Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
- Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
- García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
- Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
- Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
- Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
- Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
- Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
- Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
- Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
- Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
- Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
- Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
- Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
- Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
- Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
- Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
- Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
- Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
- Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
- Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).
