Summary
Nous décrivons ici deux modifications du test de la fibre d’ADN pour étudier les lacunes de l’ADN monocaténaire dans la réplication de l’ADN après l’induction de la lésion. Le test de fibre S1 permet la détection des lacunes post-réplicatives à l’aide de l’endonucléase S1 spécifique à l’ADNSS, tandis que le test de remplissage des lacunes permet la visualisation et la quantification de la réparation des lacunes.
Abstract
Le test de la fibre d’ADN est une méthode simple et robuste pour l’analyse de la dynamique de la fourche de réplication, basée sur l’immunodétection d’analogues nucléotidiques incorporés lors de la synthèse de l’ADN dans les cellules humaines. Cependant, cette technique a une résolution limitée de quelques milliers de kilobases. Par conséquent, des lacunes post-réplicatives d’ADN simple brin (ADNSs) aussi petites que quelques centaines de bases ne sont pas détectables par le test standard. Ici, nous décrivons une version modifiée du test de fibre d’ADN qui utilise la nucléase S1, une enzyme qui clive spécifiquement l’ADNSS. En présence de lacunes post-réplicatives d’ADNss, la nucléase S1 ciblera et clivera les lacunes, générant des étendues plus courtes qui peuvent être utilisées comme lecture des lacunes d’ADNSs sur les fourches en cours. Ces lacunes post-réplicatives de l’ADNSS se forment lorsque l’ADN endommagé est répliqué de manière discontinue. Ils peuvent être réparés par des mécanismes découplés de la réplication du génome, dans un processus connu sous le nom de remplissage de lacunes ou de réparation post-réplicative. Étant donné que les mécanismes de remplissage des lacunes impliquent la synthèse de l’ADN indépendamment de la phase S, des altérations du schéma de marquage des fibres d’ADN peuvent également être utilisées pour surveiller les événements de remplissage des lacunes. Dans l’ensemble, ces modifications du test des fibres d’ADN sont des stratégies puissantes pour comprendre comment les lacunes post-réplicatives sont formées et comblées dans le génome des cellules humaines.
Introduction
Des travaux séminaux ont fourni des preuves de l’accumulation de lacunes monocaténaires post-réplicatives (ADNSS) lors d’un traitement avec des agents endommageant l’ADN dans les bactéries1 et les cellules humaines 2,3. Lors de la réplication de modèles d’ADN endommagés, la machinerie de synthèse de l’ADN peut contourner les lésions en utilisant des ADN polymérases de synthèse de translésion spécifiques ou par des mécanismes de commutation de gabarit. Alternativement, le réplisome peut également simplement sauter la lésion laissant un espace ssDNA derrière, pour être réparé plus tard. Plus récemment, une étude a clairement montré que le traitement avec des agents génotoxiques conduit à des lacunes en aDNS SS chez les eucaryotes en utilisant la microscopie électronique pour visualiser la structure spécifique des intermédiaires de réplication4. La formation de ces régions de lacunes post-réplicatives a été initialement proposée comme étant un résultat simple du mode semi-discontinu de réplication de l’ADN2. Dans ce cas, une lésion sur le brin en retard peut bloquer l’allongement d’un fragment d’Okazaki, mais la progression de la fourche est naturellement sauvée par le fragment d’Okazaki suivant, laissant derrière elle un espace d’ADNSS. Cependant, d’autres études ont démontré que la formation de lacunes sur le brin principal est également possible, comme l’a d’abord montré la bactérie5. Chez les eucaryotes, PRIMPOL, une ADN polymérase unique avec une activité primase, s’est avérée capable de redémarrer la synthèse de l’ADN en aval d’une lésion bloquant la réplication grâce à son activité d’amorçage 6,7,8,9,10,11. Ainsi, l’activité primase de PRIMPOL peut expliquer la formation de lacunes post-réplicatives d’ADNSS dans le brin principal lors du traitement avec un agent endommageant l’ADN dans les cellules humaines12. Néanmoins, la détection de ces lacunes ainsi que la réparation des lacunes, jusqu’à récemment, nécessitaient des approches indirectes ou chronophages telles que la microscopie électronique4 ou les essais à base de plasmides13. L’utilisation de la nucléase S1 spécifique à l’ADNSS pour détecter les lacunes dans les cellules humaines a été mise au point par des études préliminaires il y a plus de quarante ans, en utilisant des techniques de gradient de saccharose 2,3. Plus récemment, notre groupe a appliqué l’utilisation de cette nucléase pour détecter l’ADNSs dans la réplication de l’ADN (lacunes post-réplicatives) en utilisant d’autres méthodes telles que les tests de fibres d’ADN et de comètes14. Ces nouvelles approches ont ouvert la voie à la vague actuelle d’études sur les lacunes post-réplicatives. Ici, nous décrivons une stratégie d’utilisation de la nucléase S1 pour détecter les écarts post-réplicatifs de l’ADNSs par un test de fibre d’ADN et expliquons comment un schéma de marquage différentiel dans le protocole de fibre d’ADN peut permettre l’étude de la réparation de ces lacunes.
Le test de la fibre d’ADN est une technique puissante qui a été utilisée par un nombre croissant de laboratoires et a fourni des informations précieuses sur la dynamique de la fourche de réplication et les mécanismes de réponse au stress de réplication. En bref, cette technique est basée sur l’incorporation séquentielle d’analogues nucléotidiques (tels que CldU-5-chloro-2'-désoxyuridine-, et IdU-5-iodo-2'-désoxyuridine) dans l’ADN répliquant. Après la récolte, les cellules sont lysées et les molécules d’ADN se propagent sur une lame de verre recouverte positivement. CldU et IdU sont ensuite détectés par des anticorps spécifiques, qui peuvent être visualisés dans un microscope fluorescent sous forme de fibres bicolores. Enfin, les longueurs des voies IdU et CldU sont mesurées pour identifier toute altération de la dynamique de réplication de l’ADN résultant de l’induction de dommages à l’ADN. Cette technique peut être utilisée pour étudier différents phénomènes, tels que le décrochage de la fourche, le ralentissement de la fourche, la dégradation naissante de l’ADN et les variations de la fréquence de tir d’origine15,16.
Une limitation du test de fibre d’ADN est sa résolution de quelques kilobases. Parce que les écarts d’ADNSs post-réplicatifs peuvent être de l’ordre de centaines de bases, il est impossible de visualiser ces écarts directement par le protocole standard de fibre d’ADN. La présence de lacunes en ADNS SSD sur la réplication de l’ADN dans les cellules humaines traitées avec des agents génotoxiques a déjà été indirectement impliquée. Par exemple, l’observation de l’ADNSs tel qu’évalué par le recrutement de la protéine de liaison à l’ADNSS, la protéine de réplication A (RPA), dans les cellules en dehors de la phase S, ou la formation d’ADNSs détectés par le déroulement de l’ADN alcalin combiné à l’absence de décrochage prolongé de la fourche par le test de fibre d’ADN 12,17,18,19,20,21 a été attribuée à l’accumulation de lacunes en ADNSs. En outre, les écarts post-réplicatifs de l’ADNSS induisent un point de contrôle de phase G2/M dépendant de l’ATR et des cellules d’arrêt traitées avec des poisons de réplication 18,19,20,21,22.
La nucléase S1 dégrade les acides nucléiques monocaténaires libérant des mono- ou oligonucléotides 5'-phosphoryle et a une affinité 5 fois plus élevée pour l’ADNSS par rapport à l’ARN. Les acides nucléiques double brin (ADN:ADN, ADN:ARN ou ARN:ARN) sont résistants à la nucléase S1, sauf lorsqu’ils sont utilisés à des concentrations extrêmement élevées. La nucléase S1 clive également l’ADN double brin dans la région simple brin causée par une entaille, un espace, un décalage ou une boucle. La nucléase S1 est donc une endonucléase spécifique de l’ADNSS capable de cliver les espaces d’ADNSS, générant finalement des cassures double brin23,24. Ainsi, l’ajout d’étapes pour la digestion de la nucléase S1 au protocole de fibre d’ADN permet indirectement la détection des lacunes post-réplicatives de l’ADNSS. En présence de lacunes, le traitement des noyaux exposés avec la nucléase S1 avant la propagation de l’ADN générera des étendues plus courtes en raison du clivage S1 de l’ADNSSS intrinsèquement présent aux lacunes14. En conséquence, le raccourcissement du tractus est la lecture des écarts d’ADNSs à l’aide de cette approche. Par rapport au protocole standard de fibre d’ADN, la fibre d’ADN avec la nucléase S1 ne nécessite que deux étapes supplémentaires: l’exposition aux noyaux (perméabilisation cellulaire) et le traitement avec la nucléase S1. Il est important de noter que des contrôles appropriés sont obligatoires, tels que des échantillons traités avec l’agent génotoxique mais sans la nucléase S1 et des échantillons traités avec la nucléase S1 sans l’agent génotoxique. Le protocole lui-même, y compris l’incorporation d’analogues, le traitement S1 et l’épandage, peut être effectué en une journée et ne nécessite pas de matériel exceptionnel. Il ne nécessite que les analogues de la thymidine, la nucléase S1 purifiée, les anticorps primaires et secondaires appropriés et un microscope fluorescent. Dans l’ensemble, la fibre d’ADN utilisant la nucléase S1 détecte les lacunes de l’ADNS sur les fourches de réplication en cours en utilisant une approche relativement simple.
Les lacunes post-réplicatives de l’ADSSS formées à la suite des mécanismes de réponse au stress de réplication peuvent être réparées (ou comblées) par différents mécanismes, y compris la synthèse de l’ADN de translésion ou le changement de modèle, dans un processus appelé remplissage des lacunes ou réparation post-réplication (PRR)25. Ces processus se produisent derrière les fourches avancées, impliquant une synthèse d’ADN indépendante de la réplication 14,26,27. Sur la base de ces résultats, un schéma d’étiquetage distinct du test standard de fibres d’ADN peut être effectué pour visualiser les événements de comblement des lacunes dans la phase G2 directement 14,16,26,28. Plus précisément, un analogue de la thymidine peut être utilisé pour marquer la fourche de réplication au moment du traitement génotoxique et de la formation post-réplicative de l’écart d’ADNSs, tandis qu’un autre analogue de la thymidine peut être utilisé pour marquer les événements de comblement de l’écart. Dans ce protocole, les cellules sont marquées avec un premier analogue de la thymidine (IdU, par exemple) immédiatement après ou en concomitance avec un traitement génotoxique pendant 1 h, de sorte que l’ADN naissant est marqué au moment de la formation de l’écart. Le nocodazole est ajouté pendant le traitement pendant 12 à 24 heures pour arrêter les cellules dans G2 / M, empêchant la phase S suivante. Pendant les 4 dernières heures de traitement au nocodazole, un deuxième analogue de thymidine (CldU, par exemple) est ajouté au milieu à incorporer lors du remplissage de l’espace. Il est important de noter que ce test ne peut être utilisé que pour détecter les événements de remplissage d’écart dans G2, car le signal de remplissage d’écart de CldU ne peut pas être distingué d’un signal en raison de l’incorporation de CldU dans l’ADN répliquant dans la phase S. Par conséquent, pour minimiser le signal de fond, le moment de l’incorporation de CldU après l’induction des dommages devrait coïncider avec le moment où la majeure partie de la population cellulaire entre dans la phaseG2 14. Par conséquent, ce moment variera en fonction de la lignée cellulaire et des conditions de traitement. Il est conseillé d’optimiser la progression du cycle cellulaire avant d’utiliser ce test. La co-coloration de ces analogues de la thymidine permet la visualisation des voies de remplissage des lacunes (PRR) (patchs CldU) au-dessus de l’ADN naissant (tractus IdU) synthétisé pendant le traitement génotoxique lorsque des lacunes en aDNs ont été générées.
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Protocol
Comme l’étude utilise des cellules humaines, le travail a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo (ICB-USP, numéro d’approbation #48347515.3.00005467) pour la recherche avec des échantillons humains.
NOTE: Les protocoles décrits ici ont été utilisés dans des publications précédentes avec des modifications mineures 14,16,28. Ici, l’accent est mis sur l’utilisation de la lumière ultraviolette C (UVC) comme agent endommageant l’ADN. Cependant, d’autres agents endommageant l’ADN tels que le cisplatine et l’hydroxyurée ont également été utilisés avec succès28. Ce protocole peut être effectué dans un éventail de lignées cellulaires, y compris U2OS, HEK293T, fibroblastes humains et autres 14,28,29. Il est essentiel de déterminer la question expérimentale avant d’effectuer ce protocole. Le test de fibre d’ADN avec la nucléase S1 (appelée fibre S1 ci-après) est utilisé pour détecter la présence de lacunes post-réplicatives d’ADNSS, tandis que le test de remplissage d’écart (ou PRR) est effectué pour quantifier les événements de remplissage d’écart dans la phase G2. Ainsi, s’il analyse la présence de lacunes post-réplicatives d’ADNSS, l’investigateur doit effectuer la section 2 (configuration expérimentale de la fibre S1) et passer directement à la section 4 (préparation de la fibre d’ADN par propagation) du protocole. S’il analyse les événements de comblement des lacunes, l’investigateur doit passer directement à la section 3 (Configuration expérimentale de comblement des lacunes (PRR)).
1. Réactifs et configuration
- Analogues de la thymidine : Remettre en suspension la 5-Iodo-2'-désoxyuridine (IdU) et la 5-Chloro-2'-désoxyuridine (CldU) dans 1 N NH4OH jusqu’à une concentration finale de 100 mM. Filtrer les analogues à travers un filtre à seringue stérile (0,2 μm), aliquote, et les stocker à -20 C.
- Anticorps: Primaires - anti-BrdU rat (Biorad) et anti-BrdU souris (BD); Secondaires - anti-rat Alexa Fluor 488 et anti-souris Alexa Fluor 594.
- Tampon de perméabilisation cellulaire CSK100 pour la fibre S1 : Ajouter 100 mM de NaCl, 10 mM de MOPS [pH 7], 3 mM deMgCl2 [pH 7,2], 300 mM de saccharose et 0,5 % de Triton X-100 dans duH2Odistillé.
- Tampon nucléase S1 [pH 4,6] : Ajouter 30 mM d’acétate de sodium [pH 4,6], 10 mM d’acétate de zinc, 50 mM de NaCl et 5 % de glycérol dansH2O.
REMARQUE: Le tampon nucléase S1 doit avoir un pH final de 4,6, car l’activité S1 diminue de 50% à pH > 4,9. - Aliquote et conserver à -20 °C la nucléase S1 purifiée à partir de A. oryzae pré-diluée dans un tampon de dilution de nucléase S1 fourni par le fabricant.
- Reconstituer le nocodazole dans le DMSO à une concentration finale de 2 mM pour combler les lacunes. Test.
- Tampon de lyse : Ajouter 200 mM de Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM d’EDTA et 0,5 % de FDS dans H2O.
- Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Préparez PBS-T en ajoutant 0,1 % de Tween-20 dans PBS.
- Préparer 5% d’albumine sérique bovine (BSA) dans le PBS.
- Préparer 0,1% BSA dans PBS.
- Préparez PBS-T-BSA en ajoutant 1 % de BSA dans PBS-T.
REMARQUE: Utilisez un microscope épifluorescent avec une lampe au mercure ou au xénon avec une longueur d’onde de 510 nm et une largeur de bande GFP de 42 nm (FITC, Alexa Fluor 488) et un filtre d’émission Texas Red (Alexa Fluor 594) de longueur d’onde de 624 nm et une bande passante de 40 nm ou un microscope confocal avec un laser à ligne de 488 nm (bleu) pour détecter la fluorescence verte (détectée entre 510 et 560 nm) et un laser à ligne de 561 nm (jaune) pour détecter la fluorescence rouge ( détecté entre 575 et 680 nm). Objectif d’immersion (40x, 63x ou 100x).
2. Installation expérimentale de la fibre S1 (2 jours)
- Jour 1: Plaque 4 puits pour chaque lignée cellulaire: ± UVC et ± nucléase S1 avec des cellules à une confluence de 70 à 90%.
REMARQUE: L’expérience peut être faite dans un format aussi petit qu’une plaque de 12 puits. Dans ce cas, toutes les solutions sont utilisées à 0,5 mL/puits. - Jour 2 : Préparer l’IdU frais à 20 μM et le CldU à 200 μM dans des milieux de culture cellulaire préchauffés (37 °C).
- Aspirer le milieu de culture et ajouter immédiatement le milieu avec 20 μM IdU et incuber les cellules à 37 °C, 5% co2 (incubateur cellulaire) pendant 20 min avec précision.
- Lavez rapidement les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C) deux fois.
- Irradier les cellules avec 20 J/m2 UVC. Utilisez des cellules non traitées comme témoins.
- Ajouter immédiatement le milieu avec 200 μM CldU et incuber les cellules à 37 °C, 5% CO2 (incubateur cellulaire) pendant 60 min précises.
REMARQUE: L’étiquetage IdU et CldU peut être interchangé, mais la concentration du deuxième analogique doit être 5 à 10 fois supérieure à celle du premier analogique. Le moment de l’incubation analogique peut être adapté à l’agent génotoxique utilisé, mais le temps de la deuxième incubation analogique doit être suffisamment long pour assurer suffisamment de temps pour la formation d’espace14,16. Si vous utilisez un médicament endommageant l’ADN, ajoutez le médicament avec CldU 28,29,30. - Lavez les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C) deux fois.
- Perméabilisez les cellules avec le tampon CSK100 pendant 8 à 10 minutes à température ambiante (RT).
REMARQUE: Une perméabilisation réussie peut être vérifiée au microscope à fond clair où seuls les noyaux doivent être observables - Lavez soigneusement les noyaux avec du PBS (versez 0,5 mL sur le côté de chaque puits, juste pendant quelques secondes).
- Lavez soigneusement les noyaux avec un tampon S1 (versez 0,5 mL sur le côté de chaque puits, juste pour quelques secondes).
- Incuber les noyaux avec un tampon S1 avec une nucléase S1 (20 U/mL) ou sans (comme témoin) pendant 30 min à 37 °C (incubateur cellulaire).
- Aspirez le tampon S1 et ajoutez 0,1 % de BSA dans PBS.
- Grattez les noyaux et transférez-les dans un tube de 1,5 mL annoté de manière appropriée. Gardez les tubes sur la glace tout le temps.
REMARQUE: Le détachement réussi des noyaux peut être vérifié au microscope à fond clair. - Pastillez les noyaux : centrifugez à ~4600 x g pendant 5 min, à 4 °C.
REMARQUE: Différent du test standard de fibres d’ADN, les noyaux ne peuvent pas être comptés, alors considérez le nombre initial de cellules plaquées. Alternativement, un puits supplémentaire qui n’a pas été soumis à la perméabilisation peut être utilisé pour estimer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire. - Remettre en suspension les granulés bien dans le PBS à une concentration d’environ 1500 cellules / μL, placer les tubes sur la glace et procéder à la préparation des fibres d’ADN en épandant immédiatement (section 4) le protocole
3. Installation expérimentale de comblement des lacunes (PRR) (3 jours)
- Jour 1: Plaque 2 puits pour chaque lignée cellulaire: ± UVC avec des cellules à ~ 70% de confluence.
- Jour 2 : Préparer l’IdU frais à 20 μM dans des milieux de culture cellulaire préchauffés (37 °C).
- Irradier les cellules avec 20 J/m2 UVC.
- Ajouter immédiatement le milieu avec 20 μM IdU et incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 (incubateur cellulaire) pendant 60 min précises.
- Lavez les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C) deux fois.
- Ajouter immédiatement le milieu avec 200 ng/mL de nocodazole et incuber les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 (incubateur cellulaire) pendant 12 à 24 h (le moment de cette étape doit être maintenu cohérent entre les expériences).
REMARQUE: La concentration de nocodazole peut devoir être adaptée en fonction de la lignée cellulaire utilisée. Si vous utilisez un médicament génotoxique, incuber les cellules avec idU ± médicament28. - Jour 3 : Aspirer le milieu de culture, ajouter le milieu avec 20 μM CldU + nocodazole, et incuber pendant les 4 dernières heures de traitement au nocodazole, à 37 °C, 5 % de CO2 (incubateur cellulaire).
- Lavez les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C).
- Ajouter la trypsine et incuber pendant 1-2 min à 37 °C, 5% de CO2 (incubateur cellulaire) pour détacher les cellules.
- Ajouter le même volume de milieux de culture cellulaire et prélever les cellules (milieux + trypsine) dans un tube de 1,5 mL annoté de manière appropriée. Gardez les tubes sur la glace tout le temps.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire.
- Pelleter les cellules: centrifuger à ~350 x g pendant 5 min, à 4 °C.
- Retirez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans le PBS à ~ 1500 cellules / μL. Gardez les cellules sur la glace et commencez la préparation des fibres d’ADN en appliquant le protocole immédiatement (jour 3 ou 4).
4. Préparation des fibres d’ADN par étalement (~1 h pour 12 lames)
- Annotez les lames du microscope avec un crayon en carbone et placez-les à plat sur un plateau.
- Appuyez sur le fond du tube pour assurer l’homogénéisation.
- Ajouter 2 μL de cellules sur le dessus de la lame correspondante.
REMARQUE: Deux gouttes peuvent être ajoutées, une en haut de la diapositive et une autre au milieu de la diapositive. - Ajouter 6 μL du tampon de lyse et lyser les cellules en pipetant de haut en bas environ 5 fois (évitez de faire des bulles).
- Tirez la goutte un peu vers le bas de la glissière avec la pointe de la pipette (pour guider le chemin de la goutte qui se répand).
- Incuber pendant 5 min à TA pour lyser les noyaux.
REMARQUE: Le volume du tampon de lyse et le temps de lyse peuvent être ajustés si le lysat sèche trop rapidement ou, alternativement, ne sèche pas assez. Le volume du tampon de lyse peut varier de 5 à 7 μL et le moment peut varier entre 4 et 10 minutes. - Inclinez la glissière à environ 20-40 ° et laissez la goutte se propager au bas de la diapositive à une vitesse constante et basse.
- Laissez sécher la lame à TA dans l’obscurité (10-15 min).
- Préparez fraîchement la solution de fixation: Mélangez méthanol: acide acétique glacial à un rapport de 3: 1.
- Immergez les lames dans un bocal contenant la solution de fixation et incubez pendant 5 min à RT pour fixer l’ADN sur les lames.
ATTENTION : Le méthanol est très toxique et doit être conservé sous une hotte chimique. Jeter dans un récipient approprié. - Sécher les lames à RT dans l’obscurité et les conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’elles se tachent.
5. Immunocoloration des fibres d’ADN (~6 h)
- Lavez les diapositives avec PBS deux fois pendant 5 min.
- Dénaturer l’ADN avec 2,5 M HCl fraîchement préparé pendant 40 à 60 min à RT.
ATTENTION : Pour préparer 2,5 M HCl, versez de l’acide dans de l’eau et jamais le contraire. Il s’agit d’une réaction exothermique qui se réchauffera légèrement. - Lavez les diapositives avec PBS trois fois pendant 5 min.
- Bloc avec 5% de BSA (peut être conservé à 20 °C pour un maximum de trois utilisations) préalablement réchauffé à 37 °C pendant 30-60 min à 37 °C.
- Retirez l’excès de liquide des lames en tapotant doucement sur un papier.
- Ajouter 30 μL d’anticorps primaires (anti-BrdU 1/20 de souris (pour IdU) et anti-BrdU de rat 1/100 (pour CldU) dilués dans du PBS-T-BSA) aux lames goutte à goutte et placer un couvercle sur le dessus. Incuber pendant 1 à 1,5 h à RT dans une chambre sombre et humide.
- Placez les lames dans un bocal avec PBS pendant 1-2 min, puis retirez soigneusement les couvercles.
- Laver avec PBS-T dans un bocal trois fois pendant 5 min, puis placer les lames dans PBS.
- Retirez l’excès de liquide en tapotant doucement sur un papier.
- Ajouter 30 μL d’anticorps secondaires (anti-souris Alexa Fluor 594 et anti-rat Alexa Fluor 488 dilués à 1/75 dans PBS-T-BSA.) aux lames goutte à goutte et placer un couvercle sur le dessus. Incuber pendant 45-60 min à RT dans une chambre sombre et humide.
- Placez les lames dans un bocal avec PBS pendant 1-2 min, puis retirez soigneusement les couvercles.
- Laver avec PBS-T dans un bocal trois fois pendant 5 min, puis placer les lames dans PBS.
- Retirez l’excès de liquide en tapotant doucement sur un papier.
- Ajoutez 20 μL du réactif de montage goutte à goutte aux glissières et placez un couvercle sur le dessus. Évitez les bulles.
- Laissez sécher les lames à RT dans l’obscurité, puis conservez à 4 °C (ou -20 °C pour une conservation plus longue).
6. Acquisition et analyse d’images (~1 h par échantillon)
REMARQUE: Un microscope à épifluorescence peut être utilisé pour les deux protocoles. Cependant, pour le test de remplissage d’espace (PRR), l’utilisation d’un microscope confocal est fortement recommandée pour la résolution accrue des images.
- Placez une goutte d’huile d’immersion (spécifique au microscope) près du haut de la diapositive où les cellules ont été lysées et trouvez la mise au point en utilisant le canal vert en recherchant des points verts en arrière-plan (des objectifs 40x, 63x et 100x peuvent être utilisés).
- Trouvez la concentration principale de fibres et déplacez-vous vers les bords pour trouver des fibres individuelles bien réparties et ne se chevauchant pas en utilisant un seul canal pour sélectionner les régions des images et éviter les biais potentiels.
- Prenez environ 15 à 20 photos par diapositive à côté de la diapositive entière aux canaux vert et rouge et fusionnez les deux canaux pour obtenir des fibres d’ADN bicolores.
REMARQUE: Si vous utilisez un microscope confocal, prenez des photos à haute résolution (1024 x 1024 pixels) et utilisez des valeurs de sténopé proches de 1 pour la fluorescence rouge et verte. - Utilisez ImageJ (logiciel gratuit fourni par le NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) pour les mesures de longueur de tractus IdU et CldU.
- Ouvrez une image en la faisant glisser dans la zone ImageJ.
- Utilisez la barre d’échelle générée par le logiciel du microscope (calibrée de manière appropriée) pour convertir la longueur en micromètres. Utilisez l’outil Ligne droite en sélectionnant la 5e icône de gauche à droite dans la zone ImageJ pour mesurer la barre d’échelle dans les micromètres fournis par l’image et obtenir une mesure en pixels. Cliquez sur Analyser > Définir l’échelle et remplacez la « distance en pixels » par le nombre approprié et l'"unité de longueur » à μm.
- Dans la zone ImageJ, sélectionnez l’outil Ligne segmentée en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur la5ème icône de gauche à droite, puis en sélectionnant la deuxième option de haut en bas.
- Dessinez le tracé exact du tracé rouge (IdU) ou vert (CldU) en cliquant avec le bouton gauche de la souris et arrêtez le dessin en cliquant avec le bouton droit de la souris. Appuyez sur le bouton M du clavier pour mesurer la longueur.
- Pour la fibre S1, analysez uniquement le rouge-vert (fibres bicolores)16. Mesurez les longueurs des voies rouges et vertes à partir d’au moins 150 fibres provenant de différentes images en gardant une trace des mesures des voies rouges et vertes pour chaque fibre individuelle.
- Pour le test de comblement des lacunes, ne mesurez que la longueur des voies d’IdU (rouges) qui contiennent au moins 1 patch CldU (vert) mais pas de coloration continue de CldU. Notez au moins 10-15 tracts IdU de différentes images avec au moins 1 patch CldU.
REMARQUE: D’autres logiciels peuvent être utilisés pour les analyses, tels que Zeiss LSM Image Browser.
- Pour les fibres S1, tracez la longueur des étendues IdU, la longueur des voies CldU et les rapports (CldU/IdU ou vice versa) dans des graphiques séparés sous forme de nuages de points avec des médianes.
- Mesurer les événements de comblement des lacunes en tant qu’unités de « densité par kilobase », diviser le nombre total de parcelles cldU (PRR, vert) sur une longueur donnée de tractus IdU (rouge) par la longueur totale du tractus rouge en kilobases (en considérant 1 μm = 2,59 kilobases31). Tracez ensuite les données sous forme de nuages de points avec des médianes.
- Dans les deux expériences, effectuer une analyse statistique entre deux échantillons en utilisant Mann-Whitney (test non paramétrique) et entre plus de deux échantillons en utilisant Kruskal-Wallis suivi du test de comparaisons multiples de Dunn.
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Representative Results
Dans le test S1 Fiber, si le traitement avec un agent génotoxique conduit à des lacunes post-réplicatives d’ADNSS, les longueurs totales des fibres d’ADN des noyaux traités S1 seront plus courtes lors du traitement avec des dommages à l’ADN par rapport aux échantillons non traités ainsi qu’aux échantillons qui ont été traités avec l’agent génotoxique mais qui n’ont pas été soumis au clivage S1 (Figure 1).
Alternativement, si le traitement avec la nucléase S1 n’affecte pas de manière significative la longueur des fibres d’ADN par rapport aux cellules non traitées, différentes interprétations sont possibles: (1) Il n’y a pas de formation de lacunes post-réplicatives d’ADNSS lors du traitement avec l’agent génotoxique utilisé et / ou dans le contexte génétique spécifique étudié. En effet, nous avons déjà montré que les photoproduits 6-4 induits par les UV (6-4PP) mais pas les dimères de cyclobutane pyrimidine (CPD) conduisent à la formation de lacunes en ADNSs dans les cellules déficientes pour la réparation de l’excision nucléotidique (NER, cellules XP-C)14. (2) Les lacunes de l’ADNSs ont été réparées et ne peuvent plus être détectées. (3) Le raccourcissement induit par le traitement avec l’agent génotoxique seul est trop prononcé pour permettre la détection d’un raccourcissement supplémentaire via le clivage S1.
Notamment, l’absence d’effet du S1 pourrait également refléter des problèmes techniques tels que des conditions altérées pour l’activité S1, y compris un pH inapproprié du tampon S1 ou une quantité limitée de zinc.
Figure 1 : Détection des lacunes post-réplicatives de l’ADNSS sur les fourches en cours par le test de fibre S1. (A) Représentation schématique des tests de fibres d’ADN avec la nucléase S1 spécifique à l’ADNSS (fibre S1). Les fourches de réplication progressive sont marquées avec des analogues de la thymidine (IdU, CldU) et peuvent être mesurées après la propagation de l’ADN et l’immunocoloration. À gauche, les fourches progressives standard sans interstices ne sont pas sensibles au clivage par la nucléase S1. À droite, les lacunes dans l’ADN naissant qui sont conventionnellement indétectables seront ciblées par la nucléase S1 et seront visualisées comme des voies CldU plus courtes. (B) Schéma du protocole S1 Fiber. (C) Images représentatives de la fibre S1. En haut, contrôlez le tractus d’ADN naissant sans lacunes, imperméable au clivage par la nucléase S1. En bas, le tractus d’ADN positif pour les lacunes clivées par la nucléase S1, ce qui entraîne une longueur de tractus CldU (vert) plus courte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Dans le test de comblement des lacunes (PRR), une augmentation significative de la densité des patchs CldU courts sur les voies d’IdU est révélatrice d’une augmentation des événements de remplissage des lacunes (Figure 2). Une forte densité d’événements PRR peut être reflétée par 1 événement PRR (patch vert/CldU) dans un court tract d’IdU ainsi que par plusieurs événements de PRR dans un long tract (voir les images représentatives Figure 2C). L’analyse doit être rigoureusement effectuée en ne notant que les patchs CldU qui se trouvent au-dessus des zones IdU, étant donné que les patchs CldU sont petits et pourraient facilement être confondus avec un arrière-plan de coloration (voir les images représentatives Figure 2C).
Figure 2: Détection de la réparation post-réplicative par remplissage d’écart. (A) Schéma de tractus rouge (IdU) avec patch vert (CldU) indiquant un événement de remplissage d’écart. B) Schéma du protocole utilisé pour détecter le comblement des lacunes. (C) Images représentatives du test de comblement des lacunes (PRR). À gauche, les étendues IdU plus longues avec au moins un patch CldU et/ou moins de patchs CldU au total correspondent à une faible densité de remplissage des espaces (moins d’événements de remplissage des espaces). Les zones IdU droites plus courtes avec au moins un patch CldU et les étendues IdU plus longues avec plus de patchs CldU correspondent à une densité de remplissage d’écart élevée (plus d’événements de remplissage d’écart). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les étapes critiques du protocole standard d’analyse des fibres d’ADN ont été discutées dans une publication précédente32. Ici, nous décrivons des versions modifiées du test standard de fibres d’ADN pour étudier la présence de lacunes post-réplicatives d’ADNSS ainsi que leur réparation par remplissage de lacunes, initialement décrites dans14. Dans le contexte de la présence post-réplicative d’écart d’ADNSS, l’utilisation de la nucléase S1 dans le protocole S1 Fiber conviendrait très probablement après l’exposition d’un agent génotoxique pendant au moins 1 h pour permettre la formation d’écarts et la détection ultérieure. Cependant, il est essentiel de noter que dans certaines lignées cellulaires ou antécédents génétiques, l’utilisation de la nucléase S1 pourrait générer des voies plus courtes même sans traitement supplémentaire avec des agents génotoxiques33,34. Par conséquent, il est crucial d’inclure tous les contrôles pour assurer une conclusion correcte sur la question de savoir si le traitement avec un agent génotoxique conduit à une accumulation d’écart. En outre, il est important de valider davantage le résultat de la fibre S1 en répétant le test dans des conditions dans lesquelles les écarts d’ADNSs ne sont plus formés ou réparés.
En ce qui concerne le test de comblement des lacunes (PRR), il est important d’optimiser une dose d’UVC / concentration de médicament qui n’affecte pas la longueur totale des fibres d’ADN, car les résultats sont calculés en densité par kilobase. Si vous utilisez une concentration qui induit un raccourcissement des voies, les résultats peuvent être artificiellement faussés vers une densité accrue de comblement des lacunes, ce qui rend l’interprétation des données difficile. Pour contrer cette limitation, les événements de comblement des lacunes peuvent être visualisés au-dessus de l’ADN non marqué en colorant l’ADN total à l’aide d’un anticorps anti-ADNS, comme décrit précédemment14,16. En outre, une expérience cinétique pourrait être effectuée pour assurer une détection maximale des événements de remplissage des lacunes.
Notez que les événements de comblement des lacunes peuvent également être surveillés à l’aide du test S1 Fiber lorsque les cellules sont autorisées à récupérer avant le traitement avec la nucléase S1. Plus précisément, lorsque des lacunes post-réplicatives sont comblées, les fibres d’ADN deviennent insensibles au clivage par la nucléase S1, et la longueur de la fibre d’ADN peut donc être utilisée comme lecture pour combler les lacunes dans ce contexte28. Ainsi, cette approche peut être utilisée pour étudier le comblement des lacunes tout au long du cycle cellulaire, différemment du test PRR qui se limite à l’étude du comblement des lacunes dans G2 / M.
Enfin, les données obtenues avec le test PRR ont été validées à l’aide de la fibre S128, suggérant que le nocodazole et le blocage artificiel des cellules dans G2 / M pendant le test PRR n’affectent pas le comblement des lacunes. D’autres agents qui induisent un blocage de phase G2/M peuvent potentiellement être utilisés dans ce test
La fibre S1 a été de plus en plus utilisée par les laboratoires du monde entier, fournissant de nouvelles informations sur les mécanismes de formation de trous d’ADNSs et révélant des conditions auparavant peu appréciées dans lesquelles ces écarts peuvent être formés 14,29,34,35,36. Pour les recherches futures, il serait intéressant de combiner ces protocoles modifiés avec l’approche des points quantiques qui permet la visualisation directe de la lésiond’ADN 37 pour élucider la diaphonie entre la formation post-réplicative d’écart d’ADNSS et la réparation de l’ADN ainsi que la façon dont la nature des dommages définit le mécanisme de la réponse au stress de réplication. Comme alternative au test de la fibre S1, la nucléase S1 peut également être utilisée pour étudier le processus de remplissage des lacunes dans un test de comète neutre modifié. En bref, si des lacunes sont présentes, le traitement des comètes avec la nucléase S1 conduit à la formation de cassures double brin, détectables par un test de comète neutre. Les protocoles pour le dosage des comètes neutres ainsi que le dosage des comètes modifiées par des enzymes ont déjà été publiés38,39. En particulier, cette approche permet la détection de l’écart ssDNA dans toutes les phases du cycle cellulaire, sans qu’il soit nécessaire d’arrêter les cellules en phase G2. En utilisant cette approche, combinée aux protocoles S1 Fiber et Gap-Filling (PRR) décrits ici, nous avons constaté que REV3L (unité catalytique zêta d’ADN polymérase) est responsable du comblement des lacunes formées lorsque des 6-4PPs induits par les UV sont présents dans le génome humain14.
Avec l’approche technique limitée disponible, la formation d’écarts post-réplicatifs d’ADNds et, en particulier, les événements de comblement des lacunes sont restés largement inexplorés dans les cellules humaines. Dans l’ensemble, ces techniques modifiées (fibre S1, test de remplissage des lacunes (PRR) et comète S1) fournissent de nouvelles stratégies pour étudier la présence de lacunes en ADNSS et la façon dont ces lacunes sont finalement comblées dans le génome humain.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le travail dans le laboratoire C.F.M.M. est soutenu par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brésil, Subventions #2019/19435-3, #2013/08028-1 et 2017/05680-0) dans le cadre de la Collaboration Internationale de Recherche de la FAPESP et de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO, Pays-Bas); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brésil, Grants # 308868/2018-8] et Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brésil, Code financier 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
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