Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Обнаружение пострепликативного накопления и восстановления разрывов в клетках человека с помощью анализа волокон ДНК

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63448
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы описываем две модификации анализа волокон ДНК для исследования одноцепочечных разрывов ДНК в репликации ДНК после индукции поражения. Анализ волокон S1 позволяет обнаруживать пострепликтивные промежутки с использованием эндонуклеазы S1, специфичной для ssDNA, в то время как анализ заполнения пробелов позволяет визуализировать и количественно оценивать восстановление пробелов.

Abstract

Анализ ДНК-волокна представляет собой простой и надежный метод анализа динамики репликационной вилки, основанный на иммунодетекции аналогов нуклеотидов, которые включаются в синтез ДНК в клетках человека. Однако этот метод имеет ограниченное разрешение в несколько тысяч килобаз. Следовательно, пострепликтивные одноцепочечные разрывы ДНК (ssDNA) размером всего в несколько сотен оснований не обнаруживаются стандартным анализом. Здесь мы описываем модифицированную версию анализа волокна ДНК, которая использует нуклеазу S1, фермент, который специфически расщепляет ssDNA. При наличии пострепликативных разрывов ssDNA нуклеаза S1 будет нацеливаться и расщеплять промежутки, создавая более короткие тракты, которые могут быть использованы в качестве считывания разрывов ssDNA на текущих вилках. Эти пострепликтивные пробелы сдНК образуются, когда поврежденная ДНК реплицируется прерывисто. Они могут быть восстановлены с помощью механизмов, не связанных с репликацией генома, в процессе, известном как заполнение пробелов или пострепликативное восстановление. Поскольку механизмы заполнения пробелов включают синтез ДНК независимо от S-фазы, изменения в схеме маркировки волокон ДНК также могут быть использованы для мониторинга событий заполнения пробелов. В целом, эти модификации анализа волокон ДНК являются мощными стратегиями для понимания того, как пострепликтивные пробелы формируются и заполняются в геноме клеток человека.

Introduction

Основополагающие работы предоставили доказательства накопления пострепликативных одноцепочечных (ssDNA) пробелов при лечении агентами, повреждающими ДНК, в бактериях1 и клетках человека 2,3. Во время репликации поврежденных шаблонов ДНК механизм синтеза ДНК может обходить поражения, используя специфические транслейсионные синтезные ДНК-полимеразы или с помощью механизмов переключения шаблонов. В качестве альтернативы, реплисома может также просто пропустить поражение, оставив зазор ssDNA позади, чтобы быть восстановленным позже. Совсем недавно исследование ясно показало, что лечение генотоксическими агентами приводит к разрывам ssDNA у эукариот с использованием электронной микроскопии для визуализации специфической структуры промежуточных продуктов репликации4. Формирование этих областей пострепликативных промежутков первоначально предполагалось как простой результат полупереключенного способа репликации ДНК2. В этом случае поражение на запаздывающей нити может блокировать удлинение фрагмента Окадзаки, но прогрессирование вилки естественным образом спасается следующим фрагментом Окадзаки, оставляя после себя разрыв сдНК. Однако дальнейшие исследования показали, что образование промежутков на ведущей нити также возможно, как впервые показано у бактерий5. Было показано, что у эукариот PRIMPOL, уникальная ДНК-полимераза с активностью примазы, способна возобновить синтез ДНК после репликации, блокирующей поражение через ее выговорную активность 6,7,8,9,10,11. Таким образом, активность примазы PRIMPOL может объяснить образование пострепликативных разрывов ссДНК в ведущей цепи при лечении повреждающим ДНК агентом в клетках человека12. Тем не менее, обнаружение этих пробелов, а также восстановление зазоров до недавнего времени требовало косвенных или трудоемких подходов, таких как электронная микроскопия4 или анализы на основе плазмид13. Использование специфической для ssDNA нуклеазы S1 для обнаружения пробелов в клетках человека было впервые предложено ранними исследованиями более сорока лет назад с использованием методов градиента сахарозы 2,3. Совсем недавно наша группа применила использование этой нуклеазы для обнаружения ssDNA в репликации ДНК (пострепликтивные промежутки) с использованием других методов, таких как ДНК-волокно и кометные анализы14. Эти новые подходы проложили путь к нынешнему всплеску исследований пострепликационных пробелов. Здесь мы описываем стратегию использования нуклеазы S1 для обнаружения пострепликативных разрывов ssDNA с помощью анализа волокон ДНК и объясняем, как схема дифференциальной маркировки в протоколе волокна ДНК может позволить изучить восстановление этих пробелов.

Анализ волокон ДНК является мощным методом, который используется растущим числом лабораторий и дает ценную информацию о динамике репликационной вилки и механизмах реакции на стресс репликации. Вкратце, этот метод основан на последовательном включении аналогов нуклеотидов (таких как CldU -5-хлор-2'-дезоксиуридин- и IdU-5-йодо-2'-дезоксиуридин) в реплицирующуюСЯ ДНК. После сбора клеток лизируют, а молекулы ДНК распространяются на стеклянном предметном стекле с положительным покрытием. CldU и IdU затем обнаруживаются специфическими антителами, которые могут быть визуализированы в флуоресцентном микроскопе в виде двухцветных волокон. Наконец, длины трактов IdU и CldU измеряются для выявления любых изменений динамики репликации ДНК в результате индукции повреждения ДНК. Этот метод может быть использован для исследования различных явлений, таких как сваливание вилки, замедление вилки, зарождающаяся деградация ДНК и вариации частоты запуска источника15,16.

Одним из ограничений анализа волокна ДНК является его разрешение в несколько килобаз. Поскольку пострепликтивные пробелы ssDNA могут находиться в диапазоне сотен оснований, невозможно визуализировать эти промежутки непосредственно по стандартному протоколу волокна ДНК. Наличие пробелов ssDNA в репликации ДНК в клетках человека, обработанных генотоксическими агентами, косвенно упоминалось ранее. Например, наблюдение за ssDNA, оцениваемой по набору ssDNA-связывающего белка, репликационного белка A (RPA) в клетках вне S-фазы или образованию ssDNA, обнаруженному при раскручивании щелочной ДНК в сочетании с отсутствием длительного сваливания вилки анализом днк-волокна 12,17,18,19,20,21 было связано с накоплением пробелов в сдНК. Кроме того, пострепликтивные разрывы ssDNA индуцируют ATR-зависимую контрольную точку фазы G2/M и арест клеток, обработанных ядами репликации 18,19,20,21,22.

Нуклеаза S1 разлагает одноцепочечные нуклеиновые кислоты, высвобождая 5'-фосфорилмоно- или олигонуклеотиды, и имеет в 5 раз более высокое сродство к ssDNA по сравнению с РНК. Двухцепочечные нуклеиновые кислоты (ДНК: ДНК, ДНК: РНК или РНК: РНК) устойчивы к нуклеазе S1, за исключением случаев, когда они используются в чрезвычайно высоких концентрациях. Нуклеаза S1 также расщепляет двухцепочечную ДНК в одноцепочечной области, вызванной ником, разрывом, несоответствием или петлей. Таким образом, нуклеаза S1 представляет собой специфическую для ssDNA эндонуклеазу, способную расщеплять промежутки ssDNA, в конечном итоге генерируя двухцепочечные разрывы23,24. Таким образом, добавление шагов для переваривания нуклеазы S1 в протокол волокна ДНК косвенно позволяет обнаружить пострепликтивные пробелы ssDNA. При наличии пробелов обработка открытых ядер нуклеазой S1 до распространения ДНК будет генерировать более короткие тракты в результате расщепления SsDNA SsDNA, по своей сути присутствующего в промежутках14. Соответственно, сокращение тракта является считыванием пробелов в СДНК с использованием этого подхода. По сравнению со стандартным протоколом ДНК-волокна, ДНК-волокно с нуклеазой S1 требует только двух дополнительных этапов: воздействия на ядра (клеточная пермеабилизация) и лечения нуклеазой S1. Важно отметить, что соответствующие средства контроля являются обязательными, такие как образцы, обработанные генотоксическим агентом, но без нуклеазы S1, и образцы, обработанные нуклеазой S1 без генотоксического агента. Сам протокол, включая включение аналогов, обработку S1 и распространение, может быть выполнен за один день и не требует исключительного материала. Для этого требуются только аналоги тимидина, очищенная нуклеаза S1, соответствующие первичные и вторичные антитела и флуоресцентный микроскоп. В целом, днк-волокно, использующее нуклеазу S1, обнаруживает пробелы ssDNA на текущих репликационных вилках, используя относительно простой подход.

Пострепликтивные пробелы сдНК, образовавшиеся в результате механизмов реакции на стресс репликации, могут быть восстановлены (или заполнены) различными механизмами, включая транслейционный синтез ДНК или переключение шаблонов, в процессе, называемом заполнением пробелов или пострепликационным восстановлением (PRR)25. Эти процессы происходят за наступающими форками, включая репликационно-независимый синтез ДНК 14,26,27. Основываясь на этих результатах, схема маркировки, отличная от стандартного анализа волокна ДНК, может быть выполнена для визуализации событий заполнения пробелов в фазе G2 непосредственно 14,16,26,28. В частности, один аналог тимидина может быть использован для маркировки репликационной вилки во время генотоксического лечения и пострепликтивного образования пробелов сдДНК, в то время как другой аналог тимидина может быть использован для маркировки событий заполнения пробелов. В этом протоколе клетки маркируются первым аналогом тимидина (например, IdU) сразу после или одновременно с генотоксическим лечением в течение 1 ч, так что зарождающаяся ДНК мечится в момент образования разрыва. Нокодазол добавляют после лечения в течение 12-24 ч для ареста клеток в G2 / M, предотвращая следующую S-фазу. В течение последних 4 ч лечения нокодазолом второй аналог тимидина (cldU, например) добавляют в среду, которая будет включена во время заполнения пробелов. Важно отметить, что этот анализ может быть использован только для обнаружения событий заполнения пробелов в G2, поскольку сигнал заполнения пробелов от CldU не может быть отличим от сигнала из-за включения CldU в репликацию ДНК в S-фазе. Поэтому, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал, время включения CldU после индукции повреждения должно совпадать с тем, когда большая часть клеточной популяции входит в фазу G214. Поэтому эти сроки будут варьироваться в зависимости от клеточной линии и условий лечения. Рекомендуется оптимизировать прогрессию клеточного цикла перед использованием этого анализа. Совместное окрашивание этих аналогов тимидина позволяет визуализировать участки, заполняющие пробелы (PRR) (пластыри CldU) поверх зарождающейся ДНК (тракты IdU), синтезированной во время генотоксического лечения, когда были созданы пробелы ssDNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Поскольку в исследовании используются человеческие клетки, работа была одобрена Комитетом по этике Института биомедицинских наук при Университете Сан-Паулу (ICB-USP, номер одобрения No 48347515.3.00005467) для исследования с образцами человека.

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы, описанные здесь, использовались в предыдущих публикациях с незначительными изменениями 14,16,28. Здесь основное внимание уделяется использованию ультрафиолетового света C (UVC) в качестве агента, повреждающего ДНК. Тем не менее, другие повреждающие ДНК агенты, такие как цисплатин и гидроксимочевина, также были успешно использованы28. Этот протокол может быть выполнен в массиве клеточных линий, включая U2OS, HEK293T, фибробласты человека и другие 14,28,29. Важно определить экспериментальный вопрос перед выполнением этого протокола. Анализ волокна ДНК с нуклеазой S1 (далее называемый волокном S1) используется для обнаружения наличия пострепликативных пробелов ssDNA, в то время как анализ заполнения пробелов (или PRR) выполняется для количественной оценки событий заполнения пробелов в фазе G2. Таким образом, при анализе наличия пострепликативных пробелов ssDNA исследователь должен выполнить раздел 2 (экспериментальная установка S1 Fiber) и перейти непосредственно к разделу 4 (подготовка волокна ДНК путем распространения) протокола. При анализе событий заполнения пробелов исследователь должен перейти непосредственно к разделу 3 (экспериментальная установка для заполнения пробелов (PRR)).

1. Реагенты и установка

  1. Аналоги тимидина: ресуспенд 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU) и 5-хлор-2'-дезоксиуридин (CldU) в 1 N NH4OH до конечной концентрации 100 мМ. Отфильтруйте аналоги через стерильный шприцевой фильтр (0,2 мкм), аликвоту и храните их при -20 С.
  2. Антитела: Первичные - анти-BrdU крысы (Biorad) и анти-BrdU мыши (BD); Второстепенные - анти-крысиный Alexa Fluor 488 и антимышечный Alexa Fluor 594.
  3. Буфер клеточной пермеабилизации CSK100 для волокна S1: добавьте 100 мМ NaCl, 10 мМ MOPS [pH 7], 3 мМ MgCl2 [pH 7,2], 300 мМ сахарозы и 0,5% Тритона X-100 в дистиллированномH2O.
  4. Буфер нуклеазы S1 [pH 4,6]: Добавьте 30 мМ ацетата натрия [рН 4,6], 10 мМ ацетата цинка, 50 мМ NaCl и 5% глицерина вH2O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер нуклеазы S1 должен иметь конечный рН 4,6, так как активность S1 падает на 50% при рН > 4,9.
  5. Aliquot и хранить при -20 °C нуклеазу S1, очищенную от A. oryzae , предварительно разбавленную в буфере разбавления нуклеазы S1, предоставленном производителем.
  6. Восстановите нокодазол в ДМСО до конечной концентрации 2 мМ для заполнения зазоров. проба.
  7. Буфер лизиса: Добавьте 200 мМ Tris-HCl [pH 7,5], 50 мМ ЭДТА и 0,5 % SDS вH2O.
  8. Готовят фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
  9. Подготовьте PBS-T, добавив 0,1% Tween-20 в PBS.
  10. Приготовьте 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS.
  11. Приготовьте 0,1% BSA в PBS.
  12. Подготовьте PBS-T-BSA, добавив 1% BSA в PBS-T.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эпифлуоресцентный микроскоп с ртутной или ксеноновой лампой с волной волны 510 нм и полосой пропускания 42 нм GFP (FITC, Alexa Fluor 488) и эмиссионным фильтром 624 нм и полосой пропускания 40 нм Texas Red (Alexa Fluor 594) или конфокальный микроскоп с линейным (синим) лазером 488 нм для обнаружения зеленой флуоресценции (обнаруженной между 510 и 560 нм) и 561-нм линейным (желтым) лазером для обнаружения красной флуоресценции ( обнаружен между 575 и 680 нм). Погружной объектив (40x, 63x или 100x).

2. Экспериментальная установка S1 Fiber (2 дня)

  1. День 1: Пластина 4 лунки для каждой клеточной линии: ± UVC и ± S1 нуклеазы с клетками при 70-90% слиянии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть проведен в формате размером с 12-луночную пластину. В этом случае используются все растворы по 0,5 мл/лунка.
  2. День 2: Приготовьте свежий IdU при 20 мкМ и CldU при 200 мкМ в предварительно подогретой (37 °C) среде для культивирования клеток.
  3. Аспирировать культуральную среду и немедленно добавить среду с 20 мкМ IdU и инкубировать клетки при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) в течение ровно 20 мин.
  4. Быстро промывайте клетки предварительно нагретым (37 °C) PBS дважды.
  5. Облучение клеток 20 Дж/м2 UVC. Используйте необработанные клетки в качестве элементов управления.
  6. Немедленно добавьте среду с 200 мкМ CldU и инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) в течение ровно 60 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка IdU и CldU может быть взаимозаменяемой, но концентрация второго аналога должна быть в 5-10 раз выше, чем у первого аналога. Сроки аналоговой инкубации могут быть адаптированы к используемому генотоксическому агенту, но время второй аналоговой инкубации должно быть достаточно длительным, чтобы обеспечить достаточное время для образования разрыва14,16. При использовании препарата, повреждающего ДНК, добавьте препарат вместе с CldU 28,29,30.
  7. Промыть ячейки предварительно подогретым (37 °C) PBS дважды.
  8. Пермеабилизируйте клетки буфером CSK100 в течение 8-10 мин при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная пермеабилизация может быть проверена под микроскопом яркого поля, где должны наблюдаться только ядра.
  9. Тщательно промыть ядра PBS (вылить 0,5 мл вниз по бокам каждой лунки, всего на несколько секунд).
  10. Тщательно промыть ядра буфером S1 (вылить 0,5 мл вниз по бокам каждой лунки, всего на несколько секунд).
  11. Инкубировать ядра с буфером S1 с нуклеазой S1 (20 Ед/мл) или без (в качестве контроля) в течение 30 мин при 37 °C (клеточный инкубатор).
  12. Аспирация буфера S1 и добавление 0,1% BSA в PBS.
  13. Соскоблите ядра и перенесите их в соответствующим образом аннотированную трубку объемом 1,5 мл. Держите трубки на льду все время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное отсоединение ядер может быть проверено под ярким микроскопом.
  14. Гранулирование ядер: центрифуга при ~4600 х г в течение 5 мин, при 4 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от стандартного анализа волокон ДНК, ядра не могут быть подсчитаны, поэтому рассмотрим начальное количество клеток, покрытых. Альтернативно, дополнительный колодец, который не подвергался пермеабилизации, может быть использован для оценки количества клеток с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
  15. Повторно суспендировать гранулы хорошо в PBS в концентрации ~1500 клеток/мкл, поместить пробирки на лед и немедленно приступить к получению волокна ДНК путем немедленного распространения (раздел 4) протокола

3. Экспериментальная установка для заполнения пробелов (PRR) (3 дня)

  1. День 1: Пластина 2 скважины для каждой клеточной линии: ± UVC с ячейками при слиянии ~ 70%.
  2. День 2: Приготовьте свежий IdU при 20 мкм в предварительно подогретой (37 °C) среде для культивирования клеток.
  3. Облучение клеток 20 Дж/м2 UVC.
  4. Немедленно добавьте среду с 20 мкМ IdU и инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) в течение ровно 60 мин.
  5. Промыть ячейки предварительно подогретым (37 °C) PBS дважды.
  6. Немедленно добавляют среду с 200 нг/мл нокодазола и инкубируют клетки при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) в течение 12-24 ч (сроки этой стадии должны быть согласованы между экспериментами).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию нокодазола, возможно, потребуется адаптировать в соответствии с используемой клеточной линией. При использовании генотоксического препарата инкубируют клетки с препаратом28 ± IdU.
  7. День 3: Аспирировать культуральную среду, добавить среду с 20 мкМ CldU + нокодазолом и инкубировать в течение последних 4 ч обработки нокодазолом при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор).
  8. Промывайте ячейки предварительно подогретым (37 °C) PBS.
  9. Добавляют трипсин и инкубируют в течение 1-2 мин при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) для отделения клеток.
  10. Добавьте тот же объем клеточной культуральной среды и соберите клетки (среда + трипсин) в соответствующим образом аннотированную пробирку объемом 1,5 мл. Держите трубки на льду все время.
  11. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
  12. Гранулированные ячейки: центрифуга при ~350 х г в течение 5 мин, при 4 °C.
  13. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в PBS при ~ 1500 клетках / мкл. Держите клетки на льду и начните подготовку волокна ДНК путем немедленного распространения протокола (день 3 или 4).

4. Подготовка волокна ДНК путем распространения (~1 ч на 12 слайдов)

  1. Аннотируйте слайды микроскопа углеродным карандашом и разложите их плоско на подносе.
  2. Постучите по нижней части трубки, чтобы обеспечить гомогенизацию.
  3. Добавьте 2 мкл клеток в верхнюю часть соответствующего слайда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить две капли, одну в верхней части слайда, а другую в середине слайда.
  4. Добавьте 6 мкл буфера лизиса и лизируйте клетки, пипетируя вверх и вниз примерно 5 раз (избегайте образования пузырьков).
  5. Потяните каплю немного к нижней части горки кончиком пипетки (чтобы направить путь распространения капли).
  6. Инкубировать в течение 5 мин при РТ для лизирования ядер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера лизиса и время лизиса могут быть скорректированы, если лизат высыхает слишком быстро или, в качестве альтернативы, недостаточно высыхает. Объем буфера лизиса может варьироваться от 5-7 мкл, а время может приходиться на 4-10 минут.
  7. Наклоните затвор примерно на 20-40° и позвольте капле распространиться на дно слайда с постоянной, низкой скоростью.
  8. Дайте слайду высохнуть при RT в темноте (10-15 мин).
  9. Свежеприготовьте фиксирующий раствор: Смешайте метанол: ледниковую уксусную кислоту в соотношении 3:1.
  10. Погрузите слайды в банку, содержащую фиксирующий раствор, и высиживайте в течение 5 минут на RT, чтобы зафиксировать ДНК на слайдах.
    ВНИМАНИЕ: Метанол очень токсичен и должен храниться под химическим капотом. Выбросить в соответствующий контейнер.
  11. Высушите горки при RT в темноте и храните при 4 °C, защищенные от света до окрашивания.

5. Иммуноокрашивание волокон ДНК (~6 ч)

  1. Мойте слайды PBS дважды в течение 5 минут.
  2. Денатурировать ДНК свежеприготовленными 2,5 М HCl в течение 40-60 мин при RT.
    ВНИМАНИЕ: Чтобы приготовить 2,5 М HCl, влейте кислоту в воду и никогда не наоборот. Это экзотермическая реакция, поэтому она будет немного нагреваться.
  3. Мойте слайды с PBS три раза в течение 5 минут.
  4. Блок с 5% BSA (может храниться при 20 °C до трех применений), предварительно нагретый при 37 °C в течение 30-60 мин при 37 °C.
  5. Удалите лишнюю жидкость со слайдов, осторожно постукивая по бумаге.
  6. Добавьте 30 мкл первичных антител (мышиный анти-BrdU 1/20 (для IdU) и крысиный анти-BrdU 1/100 (для CldU), разведенных в PBS-T-BSA) к слайдам по каплям и поместите сверху крышку. Инкубировать в течение 1-1,5 ч при РТ в темной, влажной камере.
  7. Поместите слайды в банку с PBS на 1-2 мин, затем аккуратно снимите крышки.
  8. Вымойте PBS-T в банке три раза в течение 5 минут, затем поместите слайды в PBS.
  9. Удалите лишнюю жидкость, осторожно постукивая по бумаге.
  10. Добавьте 30 мкл вторичных антител (против мыши Alexa Fluor 594 и анти-крыс Alexa Fluor 488, разведенных на 1/75 в PBS-T-BSA.) к слайдам по каплям и поместите крышку сверху. Инкубировать в течение 45-60 мин при РТ в темной, влажной камере.
  11. Поместите слайды в банку с PBS на 1-2 мин, затем аккуратно снимите крышки.
  12. Вымойте PBS-T в банке три раза в течение 5 минут, затем поместите слайды в PBS.
  13. Удалите лишнюю жидкость, осторожно постукивая по бумаге.
  14. Добавьте 20 мкл монтажного реагента по каплям к слайдам и поместите сверху крышку. Избегайте пузырьков.
  15. Дайте слайдам высохнуть при RT в темноте, затем храните при 4 °C (или -20 °C для более длительного сохранения).

6. Получение и анализ изображений (~1 ч на образец)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эпифлуоресцентный микроскоп может быть использован для обоих протоколов. Тем не менее, для анализа заполнения пробелов (PRR) использование конфокального микроскопа настоятельно рекомендуется для увеличения разрешения изображений.

  1. Поместите каплю погружного масла (для микроскопа) в верхней части слайда, где ячейки были лизированы, и найдите фокус, используя зеленый канал, выполнив поиск зеленых точек на заднем плане (можно использовать цели 40x, 63x и 100x).
  2. Найдите основную концентрацию волокон и переместитесь к краям, чтобы найти хорошо распределенные неперекрывающиеся отдельные волокна, используя только один канал для выбора областей для изображений и избежать потенциального смещения.
  3. Сделайте около 15-20 снимков на слайд вместе со всем слайдом на зеленом и красном каналах и объедините два канала, чтобы получить двухцветные волокна ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании конфокального микроскопа делайте снимки с высоким разрешением (1024 x 1024 пикселей) и используйте значения точечных отверстий, близкие к 1, для красной и зеленой флуоресценции.
  4. Используйте ImageJ (бесплатное программное обеспечение, предоставляемое NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) для измерения длины трактов IdU и CldU.
    1. Откройте рисунок, перетащив его в поле ImageJ.
    2. Используйте шкалу, сгенерированную программным обеспечением микроскопа (соответствующим образом откалиброванную), для преобразования длины в микрометры. Используйте инструмент «Прямая линия », щелкнув5-й значок слева направо на поле ImageJ, чтобы измерить шкалу на предоставленном изображении микрометров и получить измерение в пикселях. Нажмите «Анализировать > «Установить масштаб » и замените «расстояние в пикселях» соответствующим числом, а «единицу длины» на мкм.
    3. В поле ImageJ выберите инструмент «Сегментированная линия », щелкнув левой кнопкоймыши 5-й значок слева направо, а затем выбрав второй вариант сверху вниз.
    4. Нарисуйте точный контур красного (IdU) или зеленого (CldU) тракта, щелкнув левой кнопкой мыши, и остановите рисунок, щелкнув правой кнопкой мыши. Нажмите кнопку M на клавиатуре, чтобы измерить длину.
    5. Для волокна S1 анализируйте только красно-зеленый (двухцветные волокна)16. Измеряйте длину красного и зеленого трактов по крайней мере из 150 волокон из разных изображений, отслеживая измерения красного и зеленого трактов для каждого отдельного волокна.
    6. Для анализа заполнения пробелов измеряйте только длину трактов IdU (красный), которые содержат не менее 1 CldU (зеленого) пятна, но не имеют непрерывного окрашивания CldU. Наберите не менее 10-15 трактов IdU с разных снимков с не менее чем 1 пластырем CldU.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа можно использовать другое программное обеспечение, например, Zeiss LSM Image Browser.
  5. Для волокон S1 отобразите длину трактов IdU, длину трактов CldU и соотношения (CldU/IdU или наоборот) в отдельной графике в виде точечных графиков с медианами.
  6. Измерьте события заполнения пробелов как единицы «плотности на килобаза», разделите общее количество участков CldU (PRR, зеленый) на заданную длину тракта IdU (красный) на общую длину красного тракта в килобазах (учитывая 1 мкм = 2,59 килобаз31). Затем отобразите данные в виде точечных диаграмм с медианами.
  7. В обоих экспериментах выполните статистический анализ между двумя выборками с использованием Манн-Уитни (непараметрический тест) и между более чем двумя выборками с использованием Крускала-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В анализе S1 Fiber, если обработка генотоксическим агентом приводит к пострепликативным пробелам ssDNA, общая длина волокон ДНК из Ядер, обработанных S1, будет короче при лечении повреждением ДНК по сравнению с необработанными образцами, а также с образцами, которые были обработаны генотоксическим агентом, но не были представлены на расщепление S1 (рисунок 1).

В качестве альтернативы, если лечение нуклеазой S1 существенно не влияет на длину волокон ДНК по сравнению с необработанными клетками, возможны различные интерпретации: (1) При лечении используемым генотоксическим агентом и/или в специфическом исследуемом генетическом фоне не происходит образования разрывов постреплективной сДНК. Действительно, ранее мы показали, что УФ-индуцированные 6-4 фотопродукта (6-4PP), но не циклобутановые пиримидиновые димеры (CPD), приводят к образованию разрывов ssDNA в клетках, испытывающих дефицит для репарации нуклеотидной эксцизии (NER, XP-C клетки)14. (2) Пробелы в сдНК были устранены и больше не могут быть обнаружены. (3) Укорочение, вызванное обработкой только генотоксическим агентом, слишком выражено, чтобы можно было обнаружить дальнейшее укорочение через расщепление S1.

Примечательно, что отсутствие эффекта S1 может также отражать технические проблемы, такие как ухудшение условий активности S1, включая ненадлежащий рН буфера S1 или ограниченное количество цинка.

Figure 1
Рисунок 1: Обнаружение пострепликативных пробелов ssDNA на текущих вилках с помощью анализа S1 Fiber. (A) Схематическое представление анализов волокон ДНК с специфической нуклеазой S1 ssDNA (S1 Fiber). Прогрессирующие репликационные вилки мечено аналогами тимидина (IdU, CldU) и могут быть измерены после распространения ДНК и иммуноокрашения. Слева стандартные прогрессирующие вилки без зазоров не подвержены расщеплению нуклеазой S1. Справа, пробелы в зарождающейся ДНК, которые обычно не обнаруживаются, будут нацелены на нуклеазу S1 и будут визуализироваться как более короткие тракты CldU. (B) Схема протокола S1 Fiber. (C) Репрезентативные изображения волокна S1. Сверху, контролируют зарождающийся тракт ДНК без разрывов, непроницаемый для расщепления нуклеазой S1. Нижняя часть, ДНК-тракт, положительная для промежутков, расщепленных нуклеазой S1, что приводит к более короткой длине CldU (зеленого) тракта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В анализе заполнения пробелов (PRR) значительное увеличение плотности коротких участков CldU на трактах IdU свидетельствует об увеличении событий заполнения пробелов (рисунок 2). Высокая плотность событий PRR может быть отражена 1 событием PRR (зеленый / CldU патч) в коротком тракте IdU, а также несколькими событиями PRR в длинном тракте (см. репрезентативные изображения Рисунок 2C). Анализ должен быть строго выполнен путем оценки только патчей CldU, которые находятся поверх трактов IdU, учитывая, что пластыри CldU небольшие и могут быть легко ошибочно приняты за окрашивающий фон (см. репрезентативные изображения Рисунок 2C).

Figure 2
Рисунок 2: Обнаружение пострепликативного ремонта путем заполнения зазора. (A) Схема красного (IdU) тракта с зеленым (CldU) пятном, указывающим на событие заполнения пробела. (B) Схема протокола, используемого для выявления пробелов. (C) Репрезентативные изображения из анализа заполнения пробелов (PRR). Слева, более длинные тракты IdU с по меньшей мере одним пластырем CldU и/или меньшим количеством патчей CldU соответствуют низкой плотности заполнения пробелов (меньше событий заполнения пробелов). Справа, более короткие тракты IdU с по крайней мере одним пластырем CldU и более длинные тракты IdU с большим количеством пластырей CldU в целом соответствуют высокой плотности заполнения пробелов (больше событий заполнения пробелов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги стандартного протокола анализа днк-волокна обсуждались в предыдущей публикации32. Здесь мы описываем модифицированные версии стандартного анализа волокон ДНК для исследования наличия пострепликативных пробелов ssDNA, а также их восстановления путем заполнения пробелов, первоначально описанных в14. В контексте пострепликативного присутствия разрыва ssDNA использование нуклеазы S1 в протоколе S1 Fiber, скорее всего, будет подходящим после воздействия генотоксического агента в течение как минимум 1 ч, чтобы дать время для образования разрыва и последующего обнаружения. Тем не менее, важно отметить, что в некоторых клеточных линиях или генетическом фоне использование нуклеазы S1 может генерировать более короткие пути даже без дополнительного лечения генотоксическими агентами33,34. Поэтому крайне важно включить все средства контроля, чтобы обеспечить надлежащее заключение о том, приводит ли лечение генотоксическим агентом к накоплению разрыва. Кроме того, важно дополнительно проверить результат волокна S1 путем повторения анализа в условиях, в которых зазоры ssDNA больше не образуются или ремонтируются.

Что касается анализа заполнения пробелов (PRR), важно оптимизировать дозу UVC / концентрацию лекарственного средства, которая не влияет на общую длину волокон ДНК, поскольку результаты рассчитываются как плотность на килобаз. При использовании концентрации, которая вызывает укорочение тракта, результаты могут быть искусственно искажены в сторону увеличения плотности заполнения пробелов, что затрудняет интерпретацию данных. Чтобы противодействовать этому ограничению, события заполнения пробелов могут быть визуализированы поверх немаркированной ДНК путем окрашивания общей ДНК с использованием антитела против ssDNA, как описано ранее14,16. Кроме того, может быть проведен кинетический эксперимент для обеспечения максимального обнаружения событий заполнения пробелов.

Обратите внимание, что события заполнения пробелов также можно контролировать с помощью анализа волокна S1, когда клеткам разрешается восстанавливаться перед лечением нуклеазой S1. В частности, когда пострепликтивные пробелы заполняются, волокна ДНК становятся нечувствительными к расщеплению нуклеазой S1, и поэтому длина волокна ДНК может быть использована в качестве считывания для заполнения пробелов в этом контексте28. Таким образом, этот подход может быть использован для изучения заполнения пробелов на протяжении всего клеточного цикла, в отличие от анализа PRR, который ограничен исследованием заполнения пробелов в G2 / M.

Наконец, данные, полученные с помощью анализа PRR, были проверены с использованием волокна S128, предполагая, что нокодазол и искусственная блокировка клеток в G2 / M во время анализа PRR не влияют на заполнение пробелов. Другие агенты, которые индуцируют фазовую блокировку G2 / M, потенциально могут быть использованы в этом анализе.

Волокно S1 все чаще используется лабораториями по всему миру, предоставляя новое понимание механизмов образования пробелов ssDNA и выявляя ранее неоцененные условия, в которых эти разрывы могут образовываться 14,29,34,35,36. Для будущих исследований было бы интересно объединить эти модифицированные протоколы с подходом квантовых точек, который позволяет непосредственно визуализировать поражение ДНК37, чтобы прояснить перекрестные помехи между пострепликативным образованием разрыва ssDNA и восстановлением ДНК, а также то, как характер повреждения определяет механизм реакции на стресс репликации. В качестве альтернативы анализу S1 Fiber нуклеаза S1 также может быть использована для изучения процесса заполнения пробелов в модифицированном нейтральном кометном анализе. Вкратце, если зазоры присутствуют, обработка комет нуклеазой S1 приводит к образованию двухцепочечных разрывов, обнаруживаемых нейтральным кометным анализом. Протоколы анализа нейтральной кометы, а также фермент-модифицированного кометного анализа были ранее опубликованы38,39. В частности, этот подход позволяет обнаруживать разрывы ssDNA во всех фазах клеточного цикла, без необходимости арестовывать клетки в фазе G2. Используя этот подход, в сочетании с протоколами S1 Fiber и заполнения пробелов (PRR), описанными здесь, мы обнаружили, что REV3L (ДНК-полимеразная дзета каталитическая единица) отвечает за заполнение пробелов, образующихся, когда УФ-индуцированные 6-4PP присутствуют в геноме человека14.

При ограниченном доступном техническом подходе пострепликативное образование пробелов в сДНК и, в частности, события заполнения пробелов остаются в основном неисследованными в клетках человека. В целом, эти модифицированные методы (S1 Fiber, анализ заполнения пробелов (PRR) и комета S1) обеспечивают новые стратегии для исследования наличия пробелов ssDNA и того, как эти пробелы в конечном итоге заполняются в геноме человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Работа в лаборатории C.F.M.M. поддерживается Фондом Ампаро в Пескизе на эстаду Сан-Паулу (FAPESP, Сан-Паулу, Бразилия, Гранты No 2019/19435-3, #2013/08028-1 и 2017/05680-0) в рамках Международного сотрудничества исследований от FAPESP и Нидерландской организации научных исследований (NWO, Нидерланды); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid, Glacial Synth 64-19-7 Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Ammonium hydroxide Synth 1336-21-6 Or similar
Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 Invitrogen A11005 -
Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 Invitrogen A21470 -
Antibody Mouse anti-BrdU Becton Disckson 347580 -
Antibody Rat anti-BrdU Abcam  Ab6326 -
Biological security hood Pachane PA 410 Use hood present in the laboratory
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294 Or similar
Cell scraper Thermo Scientific 179693 Or similar
CldU Millipore-Sigma C6891 -
Cloridric acid Synth 7647-01-0 Or similar
Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) Zeiss - Or similar
Cover glass (or coverslips) Thermo Scientific 152460 Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High Glucose LGC/Gibco BR30211-05/12100046 Use culture media specific for the cell line used.
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) Sigma-Aldrich E5314 Or similar
Epifluorescence Microscope Axiovert 200 Zeiss - Or similar
FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco 12657-029 Or similar
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 3110 13-998-074 Use cell incubator present in the laboratory
Glass slide jar Sigma-Aldrich S5516 Or similar
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5 Or similar
Idu Millipore-Sigma I7125 -
Magnesium Chloride Synth 7791-18-6 Or similar
Methanol Merck 67-56-1 Or similar
Microscope slides Denville M1021 Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1
MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) Synth 1132-61-2 Or similar
Nocodazole Sigma-Aldrich 31430-18-9 -
PBS (Phosphate Buffer Saline) Life Thechnologies 3002 Or similar
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Or similar
ProLong Gold AntiFade Mountant Invitrogen P36930 Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used
S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae Invitrogen 18001-016 Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) BioRad 161-0302 Or similar
Sodium Acetate Trihydrate Sigma-Aldrich 6131-90-4 Or similar
Sodium Chloride Synth  7647-14-5 Or similar
Sucrose Sigma-Aldrich 57-50-1 Or similar
Tris Base West Lab Research BP152-1 Or similar
Triton X-100 Synth 9002-93-1 Or similar
Trypsin Gibco 25200072 Or similar
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 Or similar
UVC Lamp Non Specific - Essential: emission lenght of 254 nm
VLX-3W UV Radiometer Vilber Loumart - Or similar
Zinc Acetate Sigma-Aldrich 557-34-6 Or similar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
  3. Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
  4. Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
  5. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
  6. Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
  7. García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
  8. Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
  9. Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
  10. Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
  11. Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
  12. Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
  13. Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  14. Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
  15. Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  16. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  17. Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
  18. Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
  19. Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
  20. Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
  21. Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
  22. Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
  23. Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
  24. Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
  25. Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
  26. Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
  27. Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
  28. Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
  29. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  30. Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
  31. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  32. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
  33. Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
  34. Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
  35. Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
  36. Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
  37. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  38. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
  39. Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).

Tags

Генетика Выпуск 180 пострепликативный одноцепочечный разрыв ДНК заполнение пробелов пострепликационное восстановление репликация ДНК анализ волокон ДНК нуклеаза S1 выговор
Обнаружение пострепликативного накопления и восстановления разрывов в клетках человека с помощью анализа волокон ДНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, D. J., Tirman, S., Quinet,… More

Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. M. Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay. J. Vis. Exp. (180), e63448, doi:10.3791/63448 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter