Summary
여기서 우리는 병변 유도 후 DNA를 복제하는 데있어 단일 가닥 DNA 갭을 조사하기 위해 DNA 섬유 분석의 두 가지 변형을 설명합니다. S1 섬유 분석은 ssDNA 특이적 S1 엔도뉴클레아제를 사용하여 복제 후 갭을 검출할 수 있게 하며, 갭 채우기 분석은 갭 복구의 시각화 및 정량화를 가능하게 합니다.
Abstract
DNA 섬유 분석은 인간 세포에서 DNA 합성 중에 혼입되는 뉴클레오티드 유사체의 면역검출에 기초한 복제 포크 역학의 분석을 위한 간단하고 강력한 방법이다. 그러나이 기술은 수천 킬로베이스의 제한된 해상도를 가지고 있습니다. 결과적으로, 수백 염기만큼 작은 복제 후 단일 가닥 DNA (ssDNA) 갭은 표준 검정에 의해 검출 가능하지 않다. 여기에서는 ssDNA를 특이적으로 절단하는 효소인 S1 뉴클레아제를 활용하는 DNA 섬유 분석의 변형된 버전을 설명한다. 복제 후 ssDNA 갭이 있는 경우, S1 뉴클레아제는 틈새를 표적으로 하고 절단하여 진행 중인 포크에서 ssDNA 갭에 대한 판독으로 사용할 수 있는 더 짧은 영역을 생성합니다. 이러한 복제 후 ssDNA 갭은 손상된 DNA가 불연속적으로 복제될 때 형성된다. 그들은 게놈 복제와 결합되지 않은 메커니즘을 통해 갭 채우기 또는 복제 후 수리로 알려진 과정에서 복구 할 수 있습니다. 갭 채우기 메커니즘은 S 단계와 무관하게 DNA 합성을 포함하기 때문에 DNA 섬유 라벨링 체계의 변경은 또한 갭 채우기 이벤트를 모니터링하기 위해 사용될 수 있습니다. 전체적으로, DNA 섬유 분석의 이러한 변형은 복제 후 갭이 인간 세포의 게놈에서 어떻게 형성되고 채워지는지를 이해하는 강력한 전략입니다.
Introduction
정액 연구는 박테리아1 및 인간 세포 2,3에서 DNA 손상제를 사용한 처리시 복제 후 단일 가닥 (ssDNA) 갭의 축적에 대한 증거를 제공했다. 손상된 DNA 주형의 복제 동안, DNA 합성 기계는 특정 트랜스플레션 합성 DNA 폴리머라제를 사용하거나 주형 스위칭 메커니즘을 통해 병변을 우회할 수 있다. 대안적으로, 리플리솜은 또한 단순히 ssDNA 갭을 남겨두고 병변을 건너 뛰고, 나중에 수리될 수 있다. 보다 최근에, 한 연구는 유전 독성 제제를 사용한 치료가 복제 중간체의 특정 구조를 시각화하기 위해 전자 현미경을 활용하여 진핵생물에서 ssDNA 갭을 유도한다는 것을 분명히 보여주었습니다4. 복제 후 갭의 이들 영역의 형성은 처음에 DNA 복제2의 반불연속 모드의 간단한 결과라고 제안되었다. 이 경우, 뒤쳐진 가닥의 병변은 오카자키 단편의 신장을 차단할 수 있지만, 포크 진행은 ssDNA 갭을 남기고 다음 오카자키 단편에 의해 자연적으로 구출됩니다. 그러나 추가 연구에 따르면 박테리아 5에서 처음 나타난 것처럼 선행 가닥에 틈새 형성이 가능하다는 것이입증되었습니다. 진핵생물에서, 프리미아제 활성을 갖는 독특한 DNA 중합효소인 PRIMPOL은 그의 재검 활성 6,7,8,9,10,11을 통해 병변을 차단하는 복제 하류의 DNA 합성을 재개할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, PRIMPOL 프리마제 활성은 인간 세포(12)에서 DNA 손상제로 처리시 선행 가닥에서 복제 후 ssDNA 갭의 형성을 설명할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 갭의 검출 및 갭 복구는 최근까지 전자 현미경(4) 또는 플라스미드-기반 분석(13)과 같은 간접적 또는 시간-소모적인 접근법을 필요로 하였다. 인간 세포의 틈새를 검출하기 위해 ssDNA 특이적 S1 뉴클레아제의 사용은 수크로오스 구배 기술 2,3을 사용하여 사십 년 전 초기 연구에 의해 개척되었습니다. 보다 최근에, 우리 그룹은 DNA 섬유 및 혜성 분석14와 같은 다른 방법을 사용하여 DNA를 복제 (사후 복제 갭)에서 ssDNA를 검출하기 위해이 뉴클레아제의 사용을 적용했습니다. 이러한 새로운 접근법은 복제 후 격차에 대한 연구의 현재 급증을위한 길을 열었습니다. 여기에서는 S1 뉴클레아제를 사용하여 DNA 섬유 분석법에 의해 복제 후 ssDNA 갭을 탐지하는 전략을 설명하고 DNA 섬유 프로토콜의 차등 표지 체계가 어떻게 이러한 갭의 복구에 대한 연구를 허용 할 수 있는지 설명합니다.
DNA 섬유 분석은 점점 더 많은 실험실에서 사용되어 왔으며 복제 포크 역학 및 복제 스트레스 반응 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 강력한 기술입니다. 간략하게, 이 기술은 복제 DNA에 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어 CldU-5-클로로-2'-데옥시우리딘-및 IdU-5-요오도-2'-데옥시우리딘)의 순차적 혼입에 기초한다. 수확 후, 세포는 용해되고, DNA 분자는 양성으로 코팅된 유리 슬라이드 상에 퍼진다. CldU 및 IdU는 이어서 특이적 항체에 의해 검출되며, 이는 이색 섬유로서 형광 현미경으로 가시화될 수 있다. 마지막으로, IdU 및 CldU 관로의 길이는 DNA 손상 유도의 결과로서 DNA 복제 역학의 임의의 변화를 확인하기 위해 측정된다. 이 기술은 포크 스톨링, 포크 슬레이트, 초기 DNA 분해 및 원산지 발사 빈도15,16의 변화와 같은 다양한 현상을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
DNA 섬유 분석의 한 가지 한계는 몇 킬로염기의 분해능입니다. 복제 후 ssDNA 갭은 수백 염기의 범위에있을 수 있기 때문에 표준 DNA 섬유 프로토콜에 의해 이러한 갭을 직접 시각화하는 것은 불가능합니다. 유전 독성 물질로 처리 된 인간 세포에서 DNA를 복제하는 것에 대한 ssDNA 갭의 존재는 이전에 간접적으로 연루되었습니다. 예를 들어, ssDNA 결합 단백질, 복제 단백질 A(RPA)의 모집에 의해 평가된 바와 같이, S 단계 밖의 세포에서, 또는 DNA 섬유 분석법에 의한 장기간의 포크 스톨링의 부재와 결합된 알칼리성 DNA 풀림에 의해 검출된 ssDNA의 형성 12,17,18,19,20,21 ssDNA 갭의 축적에 기인하였다. 또한, 복제 후 ssDNA 갭은 ATR 의존성 G2/M 위상 체크포인트를 유도하고 복제 독극물18,19,20,21,22로 처리된 세포를 정지시킨다.
S1 뉴클레아제는 5'-포스포릴 모노- 또는 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단일 가닥 핵산을 분해하고, RNA에 비해 ssDNA에 대해 5배 더 높은 친화도를 갖는다. 이중 가닥 핵산 (DNA:DNA, DNA:RNA 또는 RNA:RNA)은 매우 높은 농도로 사용되는 경우를 제외하고는 S1 뉴클레아제에 내성이 있습니다. S1 뉴클레아제는 또한 닉, 갭, 미스매치 또는 루프로 인해 발생하는 단일 가닥 영역에서 이중 가닥 DNA를 절단합니다. 따라서 S1 뉴클레아제는 ssDNA 갭을 절단할 수 있는 ssDNA 특이적 엔도뉴클레아제이며, 궁극적으로 이중 가닥 파단23,24를 생성한다. 따라서, DNA 섬유 프로토콜에 S1 뉴클레아제 소화를 위한 단계를 간접적으로 추가함으로써 복제 후 ssDNA 갭의 검출을 가능하게 한다. 갭의 존재하에서, DNA 확산 전에 S1 핵으로 노출된 핵을 처리하면 갭(14)에 본질적으로 존재하는 ssDNA의 S1 절단의 결과로서 더 짧은 관로가 생성될 것이다. 따라서, 트랙트 단축은 이러한 접근법을 사용하는 ssDNA 갭에 대한 판독이다. 표준 DNA 섬유 프로토콜과 비교할 때, S1 뉴클레아제를 가진 DNA 섬유는 핵 노출 (세포 투과화)과 S1 뉴클레아제 치료의 두 가지 추가 단계 만 있으면됩니다. 유전독성제로 처리되었지만 S1 뉴클레아제가 없는 샘플 및 유전독성제가 없는 S1 뉴클레아제로 처리된 샘플과 같이 적절한 조절이 필수적이라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 유사체의 혼입, S1 처리 및 확산을 포함한 프로토콜 자체는 1 일 내에 수행 될 수 있으며 예외적 인 물질을 필요로하지 않습니다. 티미딘 유사체, 정제된 S1 뉴클레아제, 적절한 1차 및 2차 항체, 및 형광 현미경만이 필요하다. 전반적으로, S1 뉴클레아제를 채용하는 DNA 섬유는 비교적 간단한 접근법을 사용하여 진행중인 복제 포크에서 ssDNA 갭을 검출한다.
복제 스트레스 반응 메카니즘의 결과로서 형성된 복제 후 ssDNA 갭은 갭 필링 또는 복제 후 복구(PRR)25라고 불리는 프로세스에서 트랜스플레션 DNA 합성 또는 주형 스위칭을 포함한 상이한 메카니즘에 의해 복구(또는 채워짐)될 수 있다. 이러한 과정은 복제 독립적 인 DNA 합성14,26,27을 포함하는 전진하는 포크 뒤에서 발생합니다. 이러한 발견에 기초하여, 표준 DNA 섬유 분석과 구별되는 라벨링 스킴을 수행하여 G2 단계의 갭 채우기 이벤트를 직접 시각화 할 수 있습니다 14,16,26,28. 구체적으로, 하나의 티미딘 유사체는 유전 독성 처리 및 복제 후 ssDNA 갭 형성시에 복제 포크를 라벨링하는 데 사용될 수 있고, 다른 티미딘 유사체는 갭 채우기 이벤트를 라벨링하는데 사용될 수 있다. 이 프로토콜에서, 세포는 1시간 동안 유전독성 처리 직후 또는 이와 동시에 제1 티미딘 유사체 (예를 들어, IdU)로 표지되어, 초기 DNA가 갭 형성시에 표지된다. Nocodazole은 G2 / M에서 세포를 체포하기 위해 12-24 시간 동안 치료시 첨가되어 다음 S 단계를 예방합니다. 노코다졸 처리의 마지막 4시간 동안, 두 번째 티미딘 유사체(예를 들어, CldU)가 갭 충전 동안 혼입될 배지에 첨가된다. 중요하게도, 이 분석은 CldU로부터의 갭 채우기 신호가 S 단계에서 복제 DNA로의 CldU 혼입으로 인한 신호와 구별될 수 없기 때문에 G2에서 갭 채우기 이벤트를 검출하는 데에만 사용될 수 있다. 따라서, 배경 신호를 최소화하기 위해, 손상 유도 후 CldU 혼입의 타이밍은 대부분의 세포 집단이 G2 단계14에 진입할 때와 일치해야 한다. 따라서, 이러한 타이밍은 세포주 및 치료 조건에 따라 달라질 것이다. 이 검정을 채택하기 전에 세포 주기 진행을 최적화하는 것이 좋습니다. 이들 티미딘 유사체의 공동-염색은 ssDNA 갭이 생성되었을 때 유전독성 처리 동안 합성된 초기 DNA(IdU tracts)의 상부에 갭 필링(PRR) 관(CldU 패치)의 시각화를 가능하게 한다.
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Protocol
이 연구는 인간 세포를 사용함에 따라 상파울루 대학의 생물 의학 연구소 윤리위원회 (ICB-USP, 승인 번호 #48347515.3.00005467)에서 인간 샘플을 사용한 연구를 승인했습니다.
참고: 여기에 설명된 프로토콜은 이전 간행물에서 약간의 수정 14,16,28로 사용되었습니다. 여기서 초점은 DNA 손상제로서 자외선 C (UVC)의 사용에 있습니다. 그러나, 시스플라틴 및 히드록시우레아와 같은 다른 DNA 손상 제제도 성공적으로 사용되었다(28). 이러한 프로토콜은 U2OS, HEK293T, 인간 섬유아세포, 및 기타 14,28,29를 포함하는 세포주의 어레이에서 수행될 수 있다. 이 프로토콜을 수행하기 전에 실험적 질문을 결정하는 것이 중요합니다. S1 뉴클레아제를 사용한 DNA 섬유 분석(이후 S1 파이버라고 함)은 복제 후 ssDNA 갭의 존재를 검출하는 데 사용되는 반면, 갭 채우기(또는 PRR) 분석은 G2 단계에서 갭 채우기 이벤트를 정량화하기 위해 수행됩니다. 따라서, 복제 후 ssDNA 갭의 존재를 분석하는 경우, 조사자는 섹션 2(S1 Fiber 실험 설정)를 수행하고 프로토콜의 섹션 4(확산에 의한 DNA 섬유 준비)로 직접 진행해야 한다. 갭 채우기 이벤트를 분석하는 경우, 조사자는 섹션 3 (갭 채우기 (PRR) 실험 설정)으로 직접 진행해야합니다.
1. 시약 및 설정
- 티미딘 유사체: 5-요오도-2'-데옥시우리딘 (IdU) 및 5-클로로-2'-데옥시우리딘 (CldU)을 1 NNH4OH중에서 100 mM의 최종 농도로 재현탁시킨다. 유사체를 멸균 주사기 필터 (0.2 μm)를 통해 여과하고, 분취량을 -20 C에 저장한다.
- 항체: 원발성 - 항-BrdU 래트 (바이오라드) 및 항-BrdU 마우스 (BD); 보조-래트 항-래트 알렉사 플루오르 488 및 안티마우스 알렉사 플루오르 594.
- S1 섬유를 위한 세포 투과화 CSK100 완충액: 증류된H2O에 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mMMgCl2 [pH 7.2], 300 mM 수크로오스 및 0.5% 트리톤 X-100을 첨가한다.
- S1 뉴클레아제 완충액 [pH 4.6]:H2O중의 30 mM 아세트산나트륨[pH 4.6], 10 mM 아연 아세테이트, 50 mM NaCl 및 5% 글리세롤을 첨가한다.
참고: S1 뉴클레아제 버퍼는 S1 활성이 pH > 4.9에서 50% 감소하므로 최종 pH가 4.6이어야 합니다. - 분취량을 -20°C에서 저장하고 , A. 오리 제로부터 정제된 S1 뉴클레아제를 미리 희석하여 제조자에 의해 제공된 S1 뉴클레아제 희석 완충액에 희석한다.
- DMSO 중의 노코다졸을 갭 충전을 위해 최종 농도 2 mM로 재구성한다. 시험.
- 용해 완충액: H2O에 200 mM 트리스-HCl[pH 7.5], 50 mM EDTA 및 0.5% SDS를 첨가한다.
- 인산완충식염수(PBS)를 준비한다.
- PBS에 0.1% 트윈-20을 첨가하여 PBS-T를 제조하였다.
- PBS에서 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비한다.
- PBS로 0.1% BSA를 준비한다.
- PBS-T에 1% BSA를 첨가하여 PBS-T-BSSA를 제조하였다.
참고: 510nm 파장과 42nm 대역폭의 GFP(FITC, Alexa Fluor 488) 방출 필터와 624nm 파장 및 40nm 대역폭의 텍사스 레드(Alexa Fluor 594) 방출 필터가 있는 수은 또는 크세논 램프가 있는 후성형광 현미경 또는 녹색 형광(510nm에서 560nm 사이에서 검출됨)과 561nm 라인(노란색) 레이저가 있는 공초점 현미경을 사용하여 적색 형광을 감지합니다( 575 ~ 680 nm 사이에서 검출됨). 침수 목표 (40x, 63x 또는 100x).
2. S1 섬유 실험 설정 (2 일)
- 제1일: 각 세포주에 대해 플레이트 4 웰: ± UVC 및 ± S1 뉴클레아제를 70-90% 컨플루언시에서 세포로 수득하였다.
참고: 실험은 12웰 플레이트만큼 작은 형식으로 수행할 수 있습니다. 이 경우 모든 용액은 0.5 mL / 웰에서 사용됩니다. - 제2일: 예비가온된(37°C) 세포 배양 배지에서 200 μM에서 신선한 IdU 및 200 μM에서 CldU를 준비한다.
- 배양 배지를 흡인하고, 즉시 배지를 20 μM IdU로 첨가하고, 세포를 정확하게 20분 동안 37°C, 5%CO2 (세포 인큐베이터)에서 인큐베이션한다.
- 세포를 예비가온된(37°C) PBS로 두 번 빠르게 세척한다.
- 세포를 20 J/m2 UVC로 조사하십시오. 처리되지 않은 세포를 대조군으로 사용하십시오.
- 배지를 즉시 200 μM CldU로 첨가하고, 세포를 정확하게 60분 동안 37°C, 5%CO2 (세포 인큐베이터)에서 인큐베이션한다.
참고: IdU 및 CldU 라벨링은 서로 바뀔 수 있지만 두 번째 아날로그의 농도는 첫 번째 아날로그보다 5-10배 높아야 합니다. 아날로그 인큐베이션의 타이밍은 사용된 유전독성제에 적응될 수 있지만, 두 번째 아날로그 인큐베이션의 시간은 갭 형성(14,16)을 위한 충분한 시간을 보장하기에 충분히 길어야 한다. DNA 손상 약물을 사용하는 경우 CldU 28,29,30과 함께 약물을 추가하십시오. - 세포를 예열된(37°C) PBS로 두 번 세척한다.
- 세포를 실온 (RT)에서 8-10 분 동안 CSK100 완충액으로 투과시킨다.
참고 : 성공적인 투과는 핵 만 관찰 할 수 있어야하는 밝은 장 현미경으로 확인할 수 있습니다. - 핵을 PBS로 조심스럽게 세척한다(0.5 mL를 각 웰의 측면에 붓고, 단지 몇 초 동안).
- S1 버퍼로 핵을 조심스럽게 씻으십시오 (0.5 mL를 각 웰의 측면에 부어 몇 초 동안).
- 핵을 S1 뉴클레아제(20 U/mL)와 함께 또는 대조군으로) 없이 37°C(세포 인큐베이터)에서 30분 동안 S1 완충액으로 인큐베이션한다.
- S1 완충액을 흡인하고 PBS에 0.1% BSA를 첨가한다.
- 핵을 긁어 적절하게 주석이 달린 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 튜브를 항상 얼음 위에 보관하십시오.
참고 : 핵의 성공적인 분리는 밝은 장 현미경으로 확인할 수 있습니다. - 핵을 펠릿: 4°C에서 5분 동안 ∼4600 x g 에서 원심분리한다.
참고 : 표준 DNA 섬유 분석과 달리 핵을 계산할 수 없으므로 도금 된 세포의 초기 수를 고려하십시오. 대안적으로, 투과를 실시하지 않은 여분의 웰은 혈구측정기 또는 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 추정하는데 사용될 수 있다. - 펠렛을 ~ 1500 세포 / μL의 농도로 PBS에 잘 재현탁시키고 튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 확산시켜 DNA 섬유 준비를 진행하십시오 (섹션 4) 프로토콜
3. 갭 채우기 (PRR) 실험 설정 (3 일)
- 제1일: 각 세포주에 대해 플레이트 2 웰: ~70% 컨플루언시에서 세포를 갖는 UVC를 ±다.
- 제2일: 예비가온된(37°C) 세포 배양 배지에서 20 μM에서 신선한 IdU를 준비한다.
- 세포를 20 J/m2 UVC로 조사하십시오.
- 즉시 20 μM IdU로 배지를 첨가하고, 세포를 정확하게 60분 동안 37°C, 5% CO2 (세포 인큐베이터)에서 인큐베이션한다.
- 세포를 예열된(37°C) PBS로 두 번 세척한다.
- 즉시 200 ng/mL 노코다졸로 배지를 첨가하고, 세포를 37°C, 5%CO2 (세포 인큐베이터)에서 12-24 h 동안 인큐베이션한다(이 단계의 타이밍은 실험 간에 일관되게 유지되어야 한다).
참고: 노코다졸의 농도는 사용된 세포주에 따라 조정되어야 할 수도 있다. 유전 독성 약물을 사용하는 경우, 세포를 IdU ± 약물28로 인큐베이션하십시오. - 제3일: 배양 배지를 흡인하고, 배지를 20 μM CldU+노코다졸로 첨가하고, 37°C, 5%CO2 (세포 인큐베이터)에서 노코다졸 처리의 마지막 4시간 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 예비가온된(37°C) PBS로 세척한다.
- 트립신을 첨가하고 세포를 분리하기 위해 37°C, 5%CO2 (세포 인큐베이터)에서 1-2분 동안 인큐베이션한다.
- 동일한 부피의 세포 배양 배지를 첨가하고, 적절하게 주석이 달린 1.5 mL 튜브에서 세포(배지 + 트립신)를 수집한다. 튜브를 항상 얼음 위에 보관하십시오.
- 혈구측정기 또는 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하십시오.
- 세포를 펠릿: 4°C에서 5분 동안 ∼350 x g 에서 원심분리한다.
- 상층액을 제거하고 ~ 1500 cells/μL의 PBS에 세포를 재현탁하십시오. 세포를 얼음 위에 보관하고 즉시 프로토콜을 확산시켜 DNA 섬유 준비를 시작하십시오 (3 일 또는 4 일).
4. 확산에 의한 DNA 섬유 준비 (12 슬라이드의 경우 ~ 1 시간)
- 현미경 슬라이드에 탄소 연필로 주석을 달고 트레이에 평평하게 놓습니다.
- 튜브의 바닥을 탭하여 균질화를 보장합니다.
- 해당 슬라이드의 상단에 2 μL의 세포를 추가하십시오.
참고: 두 방울을 추가할 수 있는데, 하나는 슬라이드 위쪽에 있고 다른 하나는 슬라이드 가운데에 있습니다. - 용해 완충액 6 μL를 첨가하고 약 5 번 위아래로 피펫팅하여 세포를 용해시킵니다 (거품을 피하십시오).
- 피펫 팁으로 슬라이드 아래쪽으로 드롭을 약간 당깁니다(드롭 확산 경로를 안내하기 위해).
- 핵을 용해시키기 위해 RT에서 5분 동안 인큐베이션한다.
참고 : 용해 완충액의 부피와 용해 시간은 용해물이 너무 빨리 건조되거나 또는 충분히 건조되지 않으면 조정할 수 있습니다. 용해 완충액 부피는 5-7 μL에서 다양할 수 있고 타이밍은 4-10분 사이에 떨어질 수 있다. - 슬라이드를 약 20-40°로 기울이고 드롭이 일정한 저속으로 슬라이드 바닥으로 퍼지도록 합니다.
- 어둠 속에서 RT에서 슬라이드를 말리십시오 (10-15 분).
- 갓 고착액을 준비하십시오 : 메탄올 : 빙초산을 3:1 비율로 혼합하십시오.
- 슬라이드를 고정 용액이 들어있는 항아리에 담그고 RT에서 5 분 동안 배양하여 DNA를 슬라이드 상에 고정시킵니다.
주의: 메탄올은 독성이 강하므로 화학적 후드 아래에 보관해야 합니다. 적절한 컨테이너에서 폐기하십시오. - 슬라이드를 어둠 속에서 RT에서 건조시키고 염색될 때까지 빛으로부터 보호하여 4°C에서 보관한다.
5. DNA 섬유의 면역 염색 (~ 6 시간)
- 슬라이드를 PBS로 5분 동안 두 번 세척한다.
- DNA를 RT에서 40-60분 동안 갓 준비된 2.5 M HCl로 변성시킨다.
주의: 2.5 M HCl을 준비하려면 물에 산을 붓고 그 반대는 절대로 붓지 마십시오. 이것은 발열 반응이므로 약간 따뜻해집니다. - 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세 번 세척한다.
- 5% BSA를 사용한 블록(최대 3가지 용도로 20°C에서 보관할 수 있음)은 이전에 37°C에서 37°C에서 30-60분 동안 예열되었습니다.
- 종이를 부드럽게 두드려 슬라이드에서 과도한 액체를 제거합니다.
- 30 μL의 일차 항체 (마우스 항-BrdU 1/20 (IdU의 경우) 및 PBS-T-BSA에 희석된 래트 항-BrdU 1/100 (CldU의 경우)를 슬라이드에 적하하고 커버슬립을 위에 놓습니다. 어둡고 습한 챔버에서 RT에서 1-1.5 시간 동안 배양하십시오.
- 슬라이드를 PBS가있는 항아리에 1-2 분 동안 놓은 다음 조심스럽게 커버 슬립을 제거하십시오.
- 항아리에서 PBS-T로 5분 동안 세 번 세척한 다음, 슬라이드를 PBS에 넣는다.
- 종이를 부드럽게 두드려 과도한 액체를 제거하십시오.
- 30 μL의 이차 항체(PBS-T-BSA에서 1/75로 희석된 항-마우스 알렉사 플루오르 594 및 항-래트 알렉사 플루오르 488)를 슬라이드에 적가하고 커버슬립을 위에 올려 놓는다. 어둡고 습한 챔버에서 RT에서 45-60 분 동안 배양하십시오.
- 슬라이드를 PBS가있는 항아리에 1-2 분 동안 놓은 다음 조심스럽게 커버 슬립을 제거하십시오.
- 항아리에서 PBS-T로 5분 동안 세 번 세척한 다음, 슬라이드를 PBS에 넣는다.
- 종이를 부드럽게 두드려 과도한 액체를 제거하십시오.
- 장착 시약 20μL를 슬라이드에 적하하고 커버슬립을 위에 놓습니다. 거품을 피하십시오.
- 슬라이드를 어둠 속에서 RT에서 건조시킨 다음 4 ° C (또는 더 긴 보존을 위해 -20 ° C)에서 보관하십시오.
6. 이미지 수집 및 분석 (샘플 당 ~ 1 시간)
참고: 후불형광 현미경은 두 프로토콜 모두에 사용할 수 있습니다. 그러나, 갭-필링(PRR) 분석의 경우, 공초점 현미경을 사용하는 것이 이미지의 증가된 해상도를 위해 매우 권장된다.
- 세포가 용해된 슬라이드의 상단 근처에 침지 오일(현미경 특정) 한 방울을 놓고 배경에서 녹색 점을 검색하여 녹색 채널을 사용하여 초점을 찾습니다(40x, 63x 및 100x 목표 사용 가능).
- 섬유의 주요 농도를 찾고 가장자리로 이동하여 그림에 대한 영역을 선택하고 잠재적 인 편향을 피하기 위해 하나의 채널 만 사용하여 잘 퍼진 겹치지 않는 개별 섬유를 찾으십시오.
- 녹색과 빨간색 채널에서 전체 슬라이드와 함께 슬라이드 당 약 15-20 장의 사진을 찍고 두 채널을 병합하여 이중 색상 DNA 섬유를 얻습니다.
참고: 공초점 현미경을 사용하는 경우 고해상도(1024 x 1024픽셀)로 사진을 찍고 빨간색과 녹색 형광 모두에 대해 1에 가까운 핀홀 값을 사용합니다. - IdU 및 CldU 트랙트 길이 측정을 위해 ImageJ(NIH, https://imagej.nih.gov/ij/ 에서 제공하는 무료 소프트웨어)를 사용하십시오.
- 그림을 ImageJ 상자로 드래그하여 엽니다.
- 현미경 소프트웨어에 의해 생성 된 스케일 바 (적절하게 보정 된)를 사용하여 길이를 마이크로 미터로 변환하십시오. ImageJ 상자에서 왼쪽에서 오른쪽으로 5번째 아이콘을 선택하여 직선 도구를 사용하여 제공된 그림의 배율 막대를 마이크로미터로 측정하고 픽셀 단위로 측정값을 가져옵니다. 분석 > 배율 설정을 클릭하고 "픽셀 단위의 거리"를 적절한 수로 바꾸고 "길이 단위"를 μm로 바꿉니다.
- ImageJ 상자에서 왼쪽에서 오른쪽으로 5 번째 아이콘을 마우스 왼쪽 단추로 클릭 한 다음 위에서 아래로 두번째 옵션을 선택하여 세그먼트 선 도구를 선택하십시오.
- 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 빨간색(IdU) 또는 녹색(CldU) 트랙의 정확한 경로를 그리고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 드로잉을 중지합니다. 키보드의 M 버튼을 눌러 길이를 측정합니다.
- S1 파이버의 경우 적색-녹색(바이컬러 섬유)만 분석합니다16. 각 개별 섬유에 대한 적색 및 녹색 트랙의 측정을 추적하여 서로 다른 사진의 최소 150개 섬유에서 적색 및 녹색 트랙의 길이를 측정합니다.
- 갭-필링 분석의 경우, 적어도 1개의 CldU(녹색) 패치를 포함하지만 연속적인 CldU 염색은 포함하지 않는 IdU(적색) 트랙의 길이만을 측정한다. 적어도 1 CldU 패치가있는 다른 사진에서 적어도 10-15 IdU 트랙의 점수를 매기십시오.
참고: Zeiss LSM 이미지 브라우저와 같은 다른 소프트웨어를 분석에 사용할 수 있습니다.
- S1 파이버의 경우 IdU 트랙트 길이, CldU 트랙트 길이 및 비율(CldU/IdU 또는 그 반대)을 중앙값이 있는 산점도표로 별도의 그래픽에 플로팅합니다.
- 갭 채우기 이벤트를 "킬로베이스당 밀도"의 단위로 측정하고, 주어진 길이의 IdU(적색) 트랙에 있는 CldU(PRR, 녹색) 패치의 총 수를 킬로베이스(1μm = 2.59킬로베이스(31)로 간주)의 적색 트랙의 총 길이로 나눕니다. 그런 다음 데이터를 중앙값이 있는 산점도표로 플로팅합니다.
- 두 실험 모두 Mann-Whitney (비모수 테스트)를 사용하여 두 샘플 간의 통계 분석을 수행하고 Kruskal-Wallis를 사용하여 두 개 이상의 샘플 사이에서 통계 분석을 수행 한 다음 Dunn의 다중 비교 테스트를 수행합니다.
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Representative Results
S1 Fiber 분석에서, 유전 독성제로 처리하면 복제 후 ssDNA 갭이 생기면 S1 처리 된 핵으로부터의 DNA 섬유의 전체 길이는 유전 독성제로 처리되었지만 S1 절단에 제출되지 않은 샘플뿐만 아니라 처리되지 않은 샘플에 비해 DNA 손상으로 처리 할 때 짧아집니다 (그림 1).
대안적으로, S1 뉴클레아제를 사용한 치료가 처리되지 않은 세포에 비해 DNA 섬유의 길이에 유의한 영향을 미치지 않는다면, 상이한 해석이 가능하다: (1) 사용된 유전독성제를 사용한 치료 시 및/또는 조사된 특정 유전적 배경에서 복제 후 ssDNA 갭의 형성이 없다. 실제로, 우리는 이전에 UV로 유도된 6-4 광생성물 (6-4PP)이 아니라 사이클로부탄 피리미딘 이량체 (CPD)가 뉴클레오티드 절제 복구를 위해 결핍된 세포에서 ssDNA 갭의 형성을 유도한다는 것을 이전에 보여주었다 (NER, XP-C 세포)14. (2) ssDNA 갭은 수리되었으며 더 이상 검출 될 수 없습니다. (3) 유전독성제 단독으로의 처리에 의해 유도되는 단축은 S1 절단을 통한 추가적인 단축의 검출을 허용하기에는 너무 뚜렷하다.
특히, S1의 효과의 부족은 또한 S1 완충액의 부적절한 pH 또는 제한된 양의 아연을 포함하여 S1 활성에 대한 손상된 조건과 같은 기술적 문제를 반영 할 수 있습니다.
그림 1: S1 Fiber assay에 의한 진행 중인 포크에서 복제 후 ssDNA 갭의 검출. (A) ssDNA 특이적 S1 뉴클레아제(S1 Fiber)를 사용한 DNA 섬유 분석의 개략적인 표현. 진행중인 복제 포크는 티미딘 유사체 (IdU, CldU)로 표지되며 DNA 확산 및 면역 염색 후에 측정 할 수 있습니다. 왼쪽, 갭이 없는 표준 진행 포크는 S1 뉴클레아제에 의한 절단에 취약하지 않다. 종래에 검출할 수 없는 초기 DNA의 갭은 S1 뉴클레아제에 의해 표적화될 것이고, 더 짧은 CldU 관으로 가시화될 것이다. (B) S1 파이버 프로토콜의 구성표. (C) S1 섬유의 대표적인 이미지. 상단, 틈새없이 초기 DNA 관을 제어하고, S1 뉴클레아제에 의해 절단에 불침투성. 바닥, DNA 관은 S1 뉴클레아제에 의해 절단된 틈새에 대해 양성이어서 더 짧은 CldU(녹색) 관 길이를 초래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
갭 채우기 (PRR) 분석에서, IdU 관에서 짧은 CldU 패치의 밀도가 크게 증가한 것은 증가된 갭 채우기 이벤트를 나타냅니다 (그림 2). 고밀도의 PRR 이벤트는 짧은 IdU 트랙에서 1 PRR 이벤트 (녹색 / CldU 패치)와 긴 트랙의 여러 PRR 이벤트에 의해 반영 될 수 있습니다 (대표 이미지 그림 2C 참조). 분석은 CldU 패치가 작고 염색 배경으로 쉽게 오인 될 수 있다는 점을 고려하여 IdU 트랙의 상단에있는 CldU 패치 만 채점하여 엄격하게 수행해야합니다 (대표 이미지 그림 2C 참조).
그림 2: 갭 채우기에 의한 복제 후 복구의 감지 . (A) 갭 채우기 이벤트를 나타내는 녹색(CldU) 패치가 있는 빨간색(IdU) 트랙의 구성표. (B) 갭 채우기를 검출하기 위해 사용되는 프로토콜의 구성표. (c) 갭 필링(PRR) 분석으로부터의 대표적인 이미지. 적어도 하나의 CldU 패치 및/또는 더 적은 CldU 패치 총합을 갖는 왼쪽의 더 긴 IdU 트랙은 낮은 갭 채우기 밀도(더 적은 갭 채우기 이벤트)와 일치한다. 적어도 하나의 CldU 패치가있는 더 짧은 IdU 트랙과 더 많은 CldU 패치가있는 더 긴 IdU 트랙은 높은 갭 채우기 밀도 (더 많은 갭 채우기 이벤트)와 일치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
표준 DNA 섬유 분석 프로토콜의 중요한 단계는 이전 간행물32에서 논의되었다. 여기에서, 우리는14에서 초기에 기술된 갭 채우기에 의한 그들의 복구뿐만 아니라 복제 후 ssDNA 갭의 존재를 조사하기 위해 표준 DNA 섬유 분석의 변형된 버전을 기술한다. 복제 후 ssDNA 갭 존재의 맥락에서, S1 섬유 프로토콜에서 S1 뉴클레아제를 사용하는 것은 갭 형성 및 후속 검출을 위한 시간을 허용하기 위해 최소 1시간 동안 유전독성제의 노출 후에 적합할 가능성이 가장 높다. 그러나, 일부 세포주 또는 유전적 배경에서, S1 뉴클레아제의 사용은 유전독성제(33,34)를 사용한 추가적인 치료 없이도 더 짧은 관을 생성할 수 있다는 점에 유의하는 것이 필수적이다. 따라서 유전 독성 제제를 사용한 치료가 간격 축적으로 이어지는지에 대한 적절한 결론을 보장하기 위해 모든 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 또한 ssDNA 갭이 더 이상 형성되지 않거나 복구되지 않는 조건에서 분석을 반복하여 S1 Fiber 결과를 추가로 검증하는 것이 중요합니다.
갭 채우기 (PRR) 분석과 관련하여 결과가 킬로염기 당 밀도로 계산되므로 DNA 섬유의 전체 길이에 영향을 미치지 않는 UVC 용량 / 약물 농도를 최적화하는 것이 중요합니다. 트랙트 단축을 유도하는 농도를 사용하는 경우, 결과는 인위적으로 증가된 갭 채우기 밀도로 치우쳐 데이터 해석을 어렵게 만들 수 있습니다. 이러한 제한에 대응하기 위해, 갭-채우기 이벤트는 앞서 기술된 바와 같이 항-ssDNA 항체를 사용하여 총 DNA를 염색함으로써 표지되지 않은 DNA의 상부에서 가시화될 수 있다(14,16). 또한, 갭 채우기 이벤트의 최대 검출을 보장하기 위해 운동 실험을 수행 할 수 있습니다.
갭 채우기 이벤트는 S1 뉴클레아제로 처리하기 전에 세포가 회복되도록 허용될 때 S1 Fiber assay를 사용하여 모니터링될 수도 있습니다. 구체적으로, 사후 복제 갭이 채워질 때, DNA 섬유는 S1 뉴클레아제에 의한 절단에 둔감해지고, 따라서 DNA 섬유 길이는 이러한 맥락(28)에서 갭 채우기를 위한 판독으로서 사용될 수 있다. 따라서, 이 접근법은 G2/M에서의 갭 채우기의 조사로 제한되는 PRR 분석과는 다르게 세포 주기 전반에 걸쳐 갭 채우기를 연구하는데 사용될 수 있다.
마지막으로, PRR 분석으로 얻은 데이터는 S1 Fiber 28을 사용하여 검증되었으며, 이는 PRR 분석 중G2/M에서 노코다졸 및 인공 세포 막힘이 갭 채우기에 영향을 미치지 않음을 시사한다. G2/M 상 막힘을 유도하는 다른 작용제가 잠재적으로 이 검정에 사용될 수 있다.
S1 Fiber는 전 세계 실험실에서 점점 더 많이 사용되어 왔으며, ssDNA 갭 형성 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 이러한 갭이형성 될 수있는 이전에는 인정받지 못했던 조건을 밝혀 냈습니다 14,29,34,35,36. 앞으로의 조사를 위해, 이러한 변형된 프로토콜을 DNA 병변(37)의 직접적인 시각화를 가능하게 하는 양자점 접근법과 결합하여 복제 후 ssDNA 갭 형성과 DNA 복구 사이의 교차 대화뿐만 아니라 손상의 본질이 복제 스트레스 반응의 메카니즘을 어떻게 정의하는지를 밝히는 것이 흥미로울 것이다. S1 Fiber 분석의 대안으로, S1 뉴클레아제는 변형된 중성 혜성 분석에서 갭 채우기 과정을 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 간략하게, 갭이 존재하면, S1 뉴클레아제로 혜성을 처리하면 중성 혜성 분석에 의해 검출 가능한 이중 가닥 파단의 형성으로 이어진다. 중성 혜성 분석과 효소 변형 혜성 분석을 위한 프로토콜은 이전에38,39개로 발표되었다. 특히, 이러한 접근법은 G2 단계에서 세포를 정지시킬 필요 없이 세포 주기의 모든 단계에서 ssDNA 갭 검출을 허용한다. 여기에 설명된 S1 파이버 및 갭 필링(PRR) 프로토콜과 결합된 이 접근법을 사용하여, 우리는 REV3L(DNA 중합효소 제타 촉매 유닛)이 UV 유도 6-4PP가 인간 게놈(14)에 존재할 때 형성된 갭을 채우는 역할을 한다는 것을 발견하였다.
제한된 이용 가능한 기술적 접근으로, 복제 후 ssDNA 갭 형성, 특히 갭 채우기 사건은 인간 세포에서 크게 탐구되지 않은 채로 남아있다. 전체적으로, 이러한 변형 기술 (S1 섬유, 갭 채우기 (PRR) 분석 및 S1 혜성)은 ssDNA 갭의 존재와 이러한 갭이 궁극적으로 인간 게놈에서 어떻게 채워지는지를 조사하기위한 새로운 전략을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
C.F.M.M. 실험실에서의 연구는 FAPESP와 네덜란드 과학 연구기구 (NWO, 네덜란드)의 국제 협력 연구에 따라 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 상파울루, 브라질, 보조금 #2019/19435-3, #2013/08028-1 및 2017/05680-0)의 지원을 받습니다. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
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