Summary
ここでは、病変誘導後のDNA複製における一本鎖DNAギャップを調べるためのDNAファイバーアッセイの2つの改変について説明する。S1ファイバーアッセイは、ssDNA特異的S1エンドヌクレアーゼを使用して複製後ギャップの検出を可能にし、ギャップ充填アッセイはギャップ修復の視覚化および定量を可能にする。
Abstract
DNAファイバーアッセイは、ヒト細胞におけるDNA合成中に組み込まれるヌクレオチド類似体の免疫検出に基づいて、複製フォークダイナミクスを分析するための簡単で堅牢な方法です。しかし、この手法の分解能は数千キロベースに制限されています。その結果、複製後の一本鎖DNA(ssDNA)ギャップは数百塩基ほど小さく、標準的なアッセイでは検出できません。ここでは、ssDNAを特異的に切断する酵素であるS1ヌクレアーゼを利用するDNAファイバーアッセイの改変版について説明する。複製後のssDNAギャップの存在下で、S1ヌクレアーゼはギャップを標的にして切断し、進行中のフォーク上のssDNAギャップの読み出しとして使用できるより短いトラクトを生成する。これらの複製後のssDNAギャップは、損傷したDNAが不連続に複製されるときに形成される。それらは、ゲノム複製から結合されていないメカニズム を介して 、ギャップ充填または複製後修復として知られるプロセスで修復することができる。ギャップ充填機構はS相とは無関係にDNA合成を伴うため、DNAファイバー標識スキームの変化を利用してギャップ充填事象を監視することもできます。全体として、DNAファイバーアッセイのこれらの改変は、複製後のギャップがヒト細胞のゲノムにどのように形成され、埋められるかを理解するための強力な戦略です。
Introduction
精液研究は、細菌1およびヒト細胞2,3におけるDNA損傷剤による処理時に、複製後一本鎖(ssDNA)ギャップの蓄積の証拠を提供している。損傷したDNAテンプレートの複製中、DNA合成機構は、特異的な病変転移合成DNAポリメラーゼを採用することによって、またはテンプレート切り替え機構を介して病変をバイパスすることができる。あるいは、レプリソームはまた、ssDNAギャップを残して病変を単にスキップし、後で修復することもできる。より最近では、遺伝毒性物質による治療が、電子顕微鏡法を利用して複製中間体の特異的構造を可視化することによって、真核生物のssDNAギャップをもたらすことが明らかに示された研究4。複製後ギャップのこれらの領域の形成は、DNA複製の半不連続モードの単純な結果であると最初に提案された2。この場合、遅れ鎖上の病変は岡崎断片の伸長を遮ることができるが、フォークの進行は次の岡崎断片によって自然に救助され、ssDNAギャップが残る。しかし、さらなる研究は、細菌5で最初に示されたように、先行鎖上のギャップの形成も可能であることを実証した。真核生物において、プリマーゼ活性を有するユニークなDNAポリメラーゼであるPRIMPOLは、そのリプライミング活性を介して複製遮断病変の下流でDNA合成を再開できることが示された6、7、8、9、10、11。したがって、PRIMPOL primase活性は、ヒト細胞12においてDNA損傷剤で処理した際の先行鎖における複製後ssDNAギャップの形成を説明し得る。それにもかかわらず、これらのギャップの検出ならびにギャップ修復は、最近まで、電子顕微鏡4またはプラスミドベースのアッセイ13などの間接的または時間のかかるアプローチを必要とした。ヒト細胞のギャップを検出するためのssDNA特異的S1ヌクレアーゼの使用は、スクロース勾配技術を用いた40年以上前の初期の研究によって開拓された2,3。より最近では、我々のグループは、DNAファイバーアッセイや彗星アッセイなどの他の方法を用いて、DNAを複製する際のssDNAを検出するために、このヌクレアーゼの使用を適用した14。これらの新しいアプローチは、複製後のギャップに関する研究の現在の急増への道を開いた。ここでは、S1ヌクレアーゼを使用してDNAファイバーアッセイによる複製後のssDNAギャップを検出する戦略を説明し、DNAファイバープロトコルの差動標識スキームがこれらのギャップの修復の研究をどのように可能にできるかを説明する。
DNAファイバーアッセイは、ますます多くのラボで使用されている強力な技術であり、レプリケーションフォークダイナミクスとレプリケーションストレス応答メカニズムに関する貴重な洞察を提供してきました。簡単に述べると、この技術は、ヌクレオチド類似体(CldU−5−クロロ−2'−デオキシウリジン−、およびIdU−5−ヨード−2'−デオキシウリジンなど)の複製DNAへの逐次的な組み込みに基づいている。回収後、細胞を溶解し、DNA分子を正にコーティングしたスライドガラス上に広げる。その後、CldUおよびIdUは特異的抗体によって検出され、蛍光顕微鏡で二色繊維として可視化することができる。最後に、IdU および CldU 管の長さを測定して、DNA 損傷誘導の結果としての DNA 複製ダイナミクスの変化を同定します。この技術は、フォーク失速、フォーク減速、新生DNA分解、および起源発火の頻度の変動などの異なる現象を調査するために利用することができる15,16。
DNAファイバーアッセイの限界の1つは、数キロ塩基の分解能です。複製後のssDNAギャップは数百塩基の範囲にある可能性があるため、標準的なDNAファイバープロトコルによってこれらのギャップを直接視覚化することは不可能です。遺伝毒性物質で処理されたヒト細胞における複製DNA上のssDNAギャップの存在は、以前に間接的に関与していた。例えば、ssDNA結合タンパク質のリクルートによって評価されるssDNAの観察は、複製プロテインA(RPA)、S期外の細胞において、またはアルカリDNA解舒によって検出されるようなssDNAの形成と、DNAファイバーアッセイによる長時間のフォークストールの不在との組み合わせ12、17、18、19、20、21 ssDNAギャップの蓄積に起因するものであった。さらに、複製後のssDNAギャップは、ATR依存性のG2/M期チェックポイントを誘導し、複製毒18、19、20、21、22で処理された細胞を逮捕する。
S1ヌクレアーゼは、5'-ホスホリルモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを放出する一本鎖核酸を分解し、RNAと比較してssDNAに対して5倍高い親和性を有する。二本鎖核酸(DNA:DNA、DNA:RNA、またはRNA:RNA)は、極端に高濃度で使用される場合を除き、S1ヌクレアーゼに対して耐性を有する。S1ヌクレアーゼはまた、ニック、ギャップ、ミスマッチ、またはループによって引き起こされる一本鎖領域で二本鎖DNAを切断する。したがって、S1ヌクレアーゼは、ssDNAギャップを切断することができるssDNA特異的エンドヌクレアーゼであり、最終的に二本鎖切断23、24を生成する。したがって、S1ヌクレアーゼ消化のためのステップをDNAファイバープロトコルに間接的に追加することにより、複製後のssDNAギャップの検出が可能になる。ギャップの存在下では、DNA拡散の前にS1ヌクレアーゼで露出した核を処理すると、ギャップ14に本質的に存在するssDNAのS1切断の結果として、より短いトラクトが生成されます。したがって、トラクト短縮は、このアプローチを用いたssDNAギャップの読み出しである。標準的なDNAファイバープロトコルと比較して、S1ヌクレアーゼを用いたDNAファイバーは、核曝露(細胞透過処理)およびS1ヌクレアーゼによる処理の2つの余分なステップしか必要としない。遺伝毒性物質で処理したがS1ヌクレアーゼを含まないサンプルや、遺伝毒性物質を含まないS1ヌクレアーゼで処理したサンプルなど、適切なコントロールが必須であることに注意することが重要です。類似体の組み込み、S1処理、および拡散を含むプロトコル自体は、1日で実行することができ、例外的な材料を必要としない。必要なのは、チミジン類似体、精製S1ヌクレアーゼ、適切な一次抗体および二次抗体、および蛍光顕微鏡のみです。全体として、S1ヌクレアーゼを採用したDNAファイバーは、比較的単純なアプローチを使用して、進行中の複製フォーク上のssDNAギャップを検出する。
複製ストレス応答機構の結果として形成された複製後ssDNAギャップは、ギャップ充填または複製後修復(PRR)25と呼ばれるプロセスにおいて、病変転移DNA合成またはテンプレートスイッチングを含む異なる機構によって修復(または充填)され得る25。これらのプロセスは、進行するフォークの後ろで起こり、複製に依存しないDNA合成を伴う14,26,27。これらの知見に基づいて、標準的なDNAファイバーアッセイとは異なる標識スキームを実行して、G2相におけるギャップ充填事象を直接視覚化することができる14、16、26、28。具体的には、1つのチミジン類似体は、遺伝毒性治療および複製後のssDNAギャップ形成時に複製フォークを標識するために使用でき、一方、別のチミジン類似体は、ギャップ充填事象を標識するために使用することができる。このプロトコールでは、細胞は、1時間の遺伝毒性処理の直後またはそれと同時に、第1のチミジン類似体(例えばIdU)で標識され、その結果、新生DNAはギャップ形成時に標識される。ノコダゾールは、G2 / Mの細胞を停止させるために12〜24時間の間の任意の場所で治療時に添加され、以下のS期を防止する。ノコダゾール処理の最後の4時間のために、第2のチミジン類似体(例えばCldU)を、ギャップ充填中に組み込まれる媒体に添加する。重要なことに、このアッセイは、CldUからのギャップ充填シグナルがS期の複製DNAへのCldUの取り込みによるシグナルと区別できないため、G2のギャップ充填事象を検出するためにのみ使用することができる。したがって、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるために、損傷誘導後のCldU取り込みのタイミングは、細胞集団の大部分がG2期14に入っているときと一致するべきである。したがって、このタイミングは、細胞株および処理条件によって異なるであろう。このアッセイを採用する前に細胞周期の進行を最適化することが推奨される。これらのチミジン類似体の共染色により、ssDNAギャップが生成されたときに遺伝毒性処理中に合成された新生DNA(IdUトラクト)の上にギャップ充填(PRR)トラクト(CldUパッチ)を可視化することができます。
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Protocol
この研究はヒト細胞を使用しているため、この研究はサンパウロ大学生物医学研究所の倫理委員会(ICB-USP、承認番号#48347515.3.00005467)によってヒトサンプルを用いた研究のために承認されました。
注:ここで説明するプロトコルは、以前の出版物で使用されており、若干の変更が加えられています14,16,28。ここで焦点は、DNA損傷剤としての紫外線C(UVC)の使用にある。しかし、シスプラチンやヒドロキシ尿素などの他のDNA損傷剤も成功裏に採用されています28。このプロトコルは、U2OS、HEK293T、ヒト線維芽細胞、およびその他14、28、29を含む一連の細胞株において行うことができる。このプロトコルを実行する前に、実験的な質問を決定することが不可欠です。S1ヌクレアーゼ(以下S1ファイバーと呼ぶ)を用いたDNAファイバーアッセイは、複製後のssDNAギャップの存在を検出するために使用され、ギャップ充填(またはPRR)アッセイは、G2相におけるギャップ充填事象を定量するために行われる。したがって、複製後のssDNAギャップの存在を分析する場合、研究者はセクション2(S1ファイバー実験セットアップ)を実行し、プロトコルのセクション4(拡散によるDNAファイバー調製)に直接進む必要があります。ギャップ充填事象を分析する場合、研究者はセクション3(ギャップ充填(PRR)実験セットアップ)に直接進むべきである。
1. 試薬とセットアップ
- チミジン類似体:5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)および5-クロロ-2'-デオキシウリジン(CldU)を1NNH4OH中に終濃度100mMまで再懸濁する。類似体を滅菌シリンジフィルター(0.2μm)、アリコートでろ過し、-20°Cで保存します。
- 抗体:原発性 - 抗BrdUラット(バイオラッド)および抗BrdUマウス(BD);二次 - 抗ラットアレクサFluor 488と抗マウスアレクサFluor 594。
- S1ファイバー用の細胞透過処理CSK100バッファー:蒸留H2Oに100mM NaCl、10mM MOPS[pH7]、3mMMgCl2[pH7.2]、300mMスクロースおよび0.5%Triton X-100を加える。
- S1ヌクレアーゼ緩衝液[pH 4.6]:H2O中に30mM酢酸ナトリウム[pH4.6]、10mM酢酸亜鉛、50mM NaClおよび5%グリセロールを加える。
注: S1 ヌクレアーゼ緩衝液は、pH > 4.9 で S1 活性が 50% 低下するため、最終 pH 4.6 でなければなりません。 - アリコートし、製造業者によって提供されるS1ヌクレアーゼ希釈緩衝液で予め希釈した A. oryzae から精製したS1ヌクレアーゼを-20°Cで保存する。
- DMSO中のノコダゾールをギャップ充填のために2mMの最終濃度に再構成する。試験。
- 溶解緩衝液:200 mM トリス塩酸 [pH 7.5]、50 mM EDTA および 0.5 % SDS を H2O 中に加えます。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製する。
- PBSに0.1%Tween-20を加えてPBS-Tを調製する。
- PBS中に5%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製する。
- PBS中に0.1%BSAを調製する。
- PBS-Tに1%BSAを加えてPBS-T-BSAを調製する。
注:波長510 nmおよび帯域幅42 nmの水銀ランプまたはキセノンランプ(FITC、Alexa Fluor 488)発光フィルターと波長624 nmおよび帯域幅40 nmのテキサスレッド(Alexa Fluor 594)発光フィルターを備えたエピ蛍光顕微鏡、または488nmライン(青)レーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して緑色蛍光(510~560 nmの間で検出)を検出し、561nmライン(黄色)レーザーを使用して赤色蛍光(575〜680nmの間で検出)。イマージョン対物レンズ(40倍、63倍、または100倍)。
2. S1 ファイバー実験セットアップ (2 日間)
- 1日目:プレート4ウェルを各細胞株について:UVCおよび±S1ヌクレアーゼを70〜90%コンフルエントで細胞と共に±した。
注:実験は、12ウェルプレートのような小さなフォーマットで行うことができます。この場合、すべての溶液は0.5mL/ウェルで使用される。 - 2日目:予め加温した(37°C)細胞培養培地中で、20μMで新鮮なIdUおよび200μMでCldUを調製する。
- 培養培地を吸引し、直ちに20μM IdUで培地を加え、37°C、5%CO2 (細胞インキュベーター)で細胞を精密に20分間インキュベートする。
- 予め加温した(37°C)PBSで細胞を2回素早く洗浄する。
- 細胞に20 J/m 2 UVCを 照射する。未処理のセルをコントロールとして使用します。
- 直ちに培地を200μM CldUで加え、細胞を37°C、5%CO2 (細胞インキュベーター)で正確に60分間インキュベートする。
注: IdU と CldU の標識は交換できますが、第 2 アナログの濃度は第 1 アナログの 5 ~ 10 倍高くする必要があります。アナログインキュベーションのタイミングは、使用される遺伝毒性物質に適合させることができるが、第2のアナログインキュベーションの時間は、ギャップ形成のための十分な時間を確保するのに十分な長さでなければならない14、16。DNA損傷薬を使用する場合は、CldU28、29、30と一緒に薬物を加えてください。 - 予め加温した(37°C)PBSで細胞を2回洗浄する。
- CSK100バッファーで細胞を室温(RT)で8~10分間透過処理します。
注:透過処理の成功は、原子核のみが観察可能であるべき明視野顕微鏡下で確認することができる。 - 核をPBSで慎重に洗浄します(わずか数秒間、各ウェルの側面に0.5mLを注ぎます)。
- S1バッファーで核を慎重に洗浄します(各ウェルの側面に0.5 mLを数秒間注ぎます)。
- 核をS1ヌクレアーゼ(20U/mL)を含むS1バッファーまたはなし(対照として)で37°Cで30分間インキュベートする(細胞インキュベーター)。
- S1 バッファーを吸引し、PBS に 0.1% BSA を追加します。
- 核をこすり取り、適切に注釈を付けた1.5 mLチューブに移します。チューブは常に氷の上に置いてください。
注:原子核の剥離が成功したかどうかは、明視野顕微鏡で確認することができます。 - 核をペレット:〜4600 x g で5分間遠心分離し、4°Cで遠心分離する。
注:標準的なDNAファイバーアッセイとは異なり、核はカウントできないため、プレートされた細胞の初期数を考慮してください。あるいは、透過処理を受けなかった余分なウェルを使用して、血球計数計または細胞カウンターを使用して細胞数を推定することができる。 - ペレットを約1500細胞/μLの濃度でPBS中によく再懸濁し、チューブを氷の上に置き、直ちに(セクション4)プロトコルを広げることによってDNA繊維調製に進む
3. ギャップ充填(PRR)実験セットアップ(3日間)
- 1日目:プレート2ウェルを各細胞株について:〜70%コンフルエントで細胞を有するUVCを±する。
- 2日目:予め加温した(37°C)細胞培養培地中で20μMで新鮮なIdUを準備する。
- 細胞に20 J/m 2 UVCを 照射する。
- 直ちに20μM IdUで培地を加え、37°C、5%CO2(細胞インキュベーター)で正確に60分間細胞をインキュベートする。
- 予め加温した(37°C)PBSで細胞を2回洗浄する。
- 直ちに培地に200ng/mLノコダゾールを加え、細胞を37°C、5%CO2(細胞インキュベーター)で12 〜24時間インキュベートする(このステップのタイミングは実験間で一貫していなければならない)。
注:ノコダゾールの濃度は、使用される細胞株に応じて適合させる必要があるかもしれません。遺伝毒性薬物を使用する場合は、細胞をIdU±薬物28と共にインキュベートする。 - 3日目:培養培地を吸引し、培地を20μM CldU+ノコダゾールとともに加え、ノコダゾール処理の最後の4時間、37°C、5%CO2 (細胞インキュベーター)でインキュベートする。
- 予め加温した(37°C)PBSで細胞を洗浄する。
- トリプシンを加え、37°Cで1〜2分間インキュベートし、5%CO2 (細胞インキュベーター)で細胞を剥離する。
- 同じ量の細胞培養培地を加え、適切に注釈を付けた1.5mLチューブに細胞(培地+トリプシン)を集める。チューブは常に氷の上に置いてください。
- 血球計数器または細胞カウンターを使用して細胞をカウントします。
- 細胞をペレット化する:〜350 x g で5分間、4°Cで遠心分離する。
- 上清を除去し、細胞を約1500細胞/μLでPBSに再懸濁し、細胞を氷上に保持し、直ちに拡散プロトコルによってDNA繊維調製を開始する(3日目または4日目)。
4. 広げることによるDNA繊維調製(12枚のスライドで約1時間)
- 顕微鏡スライドにカーボンペンシルで注釈を付け、トレイの上に平らに置きます。
- 均質化を確実にするためにチューブの底部をタップする。
- 対応するスライドの上部に2μLの細胞を加える。
メモ: スライドの上部と中央の 2 つのドロップを追加できます。 - 溶解バッファーを6 μL加え、約5回上下にピペッティングして細胞を溶解します(気泡を作らないでください)。
- ピペットチップでスライドの底に向かってドロップを少し引っ張ります(ドロップが広がる経路を導くため)。
- RTで5分間インキュベートし、核を溶解する。
注:溶解バッファーの量と溶解時間は、溶解液が乾燥が速すぎる場合、または十分に乾燥しない場合に調整できます。溶解緩衝液容量は5〜7μLの範囲で変化し、タイミングは4〜10分の間に収まることができる。 - スライドを約 20 ~ 40 度傾け、ドロップが一定の低速でスライドの底まで広がるようにします。
- スライドを暗所(10~15分)のRTで乾燥させます。
- 新たに固定溶液を調製する:メタノール:氷酢酸を3:1の比率で混合する。
- スライドを固定溶液の入ったジャーに浸し、RTで5分間インキュベートしてスライドにDNAを固定します。
注意: メタノールは毒性が非常に強いため、化学薬品のフードの下に保管してください。適切なコンテナーに破棄します。 - スライドを暗所でRTで乾燥させ、染色するまで光から保護して4°Cで保管してください。
5. DNA繊維の免疫染色(約6時間)
- スライドをPBSで5分間2回洗浄する。
- 新しく調製した2.5 M HClでRTで40〜60分間DNAを変性させる。
注意: 2.5 M HCl を準備するには、水に酸を注ぎ、その逆はしないでください。これは発熱反応なので、少し温まります。 - スライドをPBSで3回5分間洗浄します。
- 5% BSA(20°Cで最大3回まで保存可能)でブロックし、37°Cで37°Cで30〜60分間温めました。
- 紙を軽く叩いて、スライドから余分な液体を取り除きます。
- 30 μL の一次抗体 (マウス抗 BrdU 1/20 (IdU の場合) およびラット抗 BrdU 1/100 (CldU の場合) を PBS-T-BSA で希釈) をスライドに滴下し、上にカバースリップを置きます。暗く湿気の多いチャンバー内でRTで1〜1.5時間インキュベートする。
- スライドをPBSの入った瓶に1〜2分間入れてから、カバースリップを慎重に取り外します。
- PBS-Tを瓶に入れて5分間3回洗浄し、スライドをPBSに入れます。
- 余分な液体は、紙を軽く叩いて取り除きます。
- 30 μLの二次抗体(抗マウスAlexa Fluor 594および抗ラットAlexa Fluor 488をPBS-T-BSAで1/75に希釈)をスライドに滴下し、上にカバースリップを置きます。暗く湿気の多いチャンバー内でRTで45〜60分間インキュベートする。
- スライドをPBSの入った瓶に1〜2分間入れてから、カバースリップを慎重に取り外します。
- PBS-Tを瓶に入れて5分間3回洗浄し、スライドをPBSに入れます。
- 余分な液体は、紙を軽く叩いて取り除きます。
- 20 μLのマウント試薬をスライドに滴下し、その上にカバースリップを置きます。泡を避けてください。
- スライドを暗所のRTで乾燥させてから、4°C(または保存期間を長くするには-20°C)で保存します。
6. 画像の取得と分析(サンプルあたり約1時間)
注:落射蛍光顕微鏡は、両方のプロトコルに使用できます。ただし、ギャップ充填(PRR)アッセイでは、画像の解像度を上げるために共焦点顕微鏡を使用することを強くお勧めします。
- 細胞が溶解されたスライドの上部近くに浸漬油(顕微鏡固有)の滴を置き、背景の緑色の点を検索して緑色のチャネルを使用して焦点を見つけます(40x、63x、および100xの対物レンズを使用できます)。
- ファイバーの主な濃度を見つけ、エッジに移動して、1つのチャンネルのみを使用して、画像の領域を選択し、潜在的なバイアスを回避するために、よく広がる重なり合っていない個々のファイバーを見つけます。
- 緑と赤のチャンネルでスライド全体と一緒にスライドごとに約15〜20枚の写真を撮り、2つのチャンネルをマージしてバイカラーDNAファイバーを取得します。
メモ: 共焦点顕微鏡を使用する場合は、高解像度(1024 x 1024 ピクセル)で写真を撮影し、赤と緑の蛍光の両方に 1 に近いピンホール値を使用します。 - ImageJ (NIH が提供するフリーソフトウェア) を IdU および CldU 管長の測定に使用 https://imagej.nih.gov/ij/ てください。
- 画像を [ImageJ] ボックスにドラッグして開きます。
- 顕微鏡ソフトウェアによって生成されたスケールバー(適切に較正された)を使用して、長さをマイクロメートルに変換します。ImageJ ボックスの左から右に 5番目のアイコンを選択して直線ツールを使用して、画像に用意されたマイクロメーターのスケール バーを測定し、ピクセル単位で測定値を取得します。[分析]>[スケールの設定]をクリックし、[ピクセル単位の距離]を適切な数値に置き換え、「長さの単位」をμmに置き換えます。
- [ImageJ] ボックスで、5 番目のアイコンを左から右に左クリックし、2番目のオプションを上から下に選択して、セグメント化された線ツールを選択します。
- 左クリックで赤(IdU)または緑(CldU)の地区の正確なパスを描画し、右クリックして描画を停止します。キーボードの M ボタンを押して長さを測定します。
- S1 ファイバーの場合、赤と緑(バイカラーファイバー)のみを解析します16。個々の繊維ごとの赤と緑のトラクトの測定値を追跡することにより、異なる画像から少なくとも150本の繊維から赤と緑のトラクトの長さを測定します。
- ギャップ充填アッセイでは、少なくとも 1 つの CldU (緑色) パッチを含む IdU (赤色) 管の長さのみを測定し、連続的な CldU 染色は行いません。少なくとも1つのCldUパッチで異なる写真から少なくとも10-15 IdUトラクトをスコア付けします。
メモ: 解析には、ツァイス LSM イメージブラウザなどの他のソフトウェアを使用できます。
- S1 ファイバーの場合、IdU 地区の長さ、CldU 地区の長さ、および比率(CldU/IdU またはその逆)を、中央値を持つ散布図プロットとして別々のグラフィックスにプロットします。
- ギャップ充填イベントを「キロベースあたりの密度」の単位として測定し、所定の長さのIdU(赤)トラクト上のCldU(PRR、緑)パッチの総数を、赤トラクトの全長(キロベース単位)で除算します(1μm = 2.59キロベース31を考慮する)。次に、中央値を持つ散布図としてデータをプロットします。
- 両方の実験で、Mann-Whitney (ノンパラメトリック検定) を使用した 2 つのサンプル間および Kruskal-Wallis を使用した 2 つ以上のサンプル間で統計分析を実行し、その後に Dunn の多重比較検定を実行します。
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Representative Results
S1ファイバーアッセイでは、遺伝毒性物質による処理が複製後のssDNAギャップにつながる場合、S1処理された核からのDNAファイバーの全長は、未処理のサンプルおよび遺伝毒性物質で処理されたがS1切断に提出されなかったサンプルと比較して、DNA損傷による処理時に短くなります(図1)。
あるいは、S1ヌクレアーゼによる治療が未処理の細胞と比較してDNA線維の長さに有意に影響しない場合、異なる解釈が可能である:(1)使用された遺伝毒性物質による治療、および/または調査された特定の遺伝的背景における複製後ssDNAギャップの形成はない。実際、我々は以前、UV誘導性の6-4光産物(6-4PP)は、シクロブタンピリミジン二量体(CPD)ではなく、ヌクレオチド切除修復が欠損した細胞(NER、XP-C細胞)におけるssDNAギャップの形成をもたらすことを示した14。(2) ssDNAのギャップが修復され、検出できなくなった。(3)遺伝毒性物質単独による処理によって誘導される短縮があまりにも顕著であり、S1切断を介したさらなる短縮の検出を可能にする。
特に、S1の効果の欠如は、S1緩衝液の不適切なpHまたは限られた量の亜鉛を含む、S1活性の障害条件などの技術的問題も反映している可能性がある。
図1:S1ファイバーアッセイによる進行中のフォーク上の複製後ssDNAギャップの検出。 (A)ssDNA特異的S1ヌクレアーゼ(S1ファイバー)を用いたDNAファイバーアッセイの概略図。進行する複製フォークは、チミジン類似体(IdU、CldU)で標識され、DNA拡散および免疫染色後に測定することができる。左図に示すように、ギャップのない標準的な進行フォークは、S1ヌクレアーゼによる切断の影響を受けにくい。そうですね、従来は検出できなかった新生DNAのギャップは、S1ヌクレアーゼによって標的とされ、より短いCldU管として視覚化されます。(B)S1ファイバプロトコルのスキーム。(C)S1ファイバの代表的な画像。上部は、ギャップのない新生DNA管を制御し、S1ヌクレアーゼによる切断に対して不浸透性である。底部は、S1ヌクレアーゼによって切断されたギャップに対して陽性のDNA管が、より短いCldU(緑色)管長をもたらす。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ギャップ充填(PRR)アッセイでは、IdU管上の短いCldUパッチの密度の有意な増加は、ギャップ充填イベントの増加を示す(図2)。高密度のPRRイベントは、短いIdUトラクト内の1つのPRRイベント(緑色/CldUパッチ)および長いトラクト内の複数のPRRイベントによって反映され得る(代表的な画像 図2Cを参照)。CldU パッチが小さく、染色背景と誤解されやすいことを考慮して、IdU 管の上にある CldU パッチのみをスコアリングして、分析を厳密に実行する必要があります (代表的な画像 図 2C を参照)。
図2:ギャップ充填による複製後修復の検出。 (A)ギャップ充填事象を示す緑色(CldU)パッチを有する赤色(IdU)管のスキーム。(B)ギャップ充填を検出するために使用されるプロトコルのスキーム。(C)ギャップ充填(PRR)アッセイからの代表的な画像。左側では、少なくとも 1 つの CldU パッチおよび/または CldU パッチの合計が少ない長い IdU トラクトは、低いギャップ充填密度 (ギャップ充填イベントが少ない) に対応します。右、少なくとも 1 つの CldU パッチを持つ短い IdU トラクトと、より多くの CldU パッチを持つ長い IdU トラクトは、合計で高いギャップ充填密度(より多くのギャップ充填イベント)に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
標準的なDNAファイバーアッセイプロトコルの重要なステップは、以前の刊行物32で議論された。ここでは、複製後のssDNAギャップの存在とギャップ充填によるそれらの修復を調査するための標準的なDNAファイバーアッセイの改変バージョンについて述べる(14で最初に記載)。複製後のssDNAギャップ存在の文脈において、S1ファイバープロトコルにおけるS1ヌクレアーゼの使用は、遺伝毒性物質を最低1時間曝露した後、ギャップ形成およびその後の検出のための時間を可能にするために最も適しているであろう。しかしながら、いくつかの細胞株または遺伝的背景において、S1ヌクレアーゼの使用は、遺伝毒性物質による追加の治療がなくてもより短い管を生成する可能性があることに注意することが不可欠である33、34。したがって、遺伝毒性物質による治療がギャップ蓄積につながるかどうかについての適切な結論を確実にするために、すべての対照を含めることが極めて重要である。さらに、ssDNAギャップがもはや形成されていない、または修復されている条件下でアッセイを繰り返すことによって、S1ファイバーの結果をさらに検証することが重要です。
ギャップ充填(PRR)アッセイに関しては、結果がキロ塩基当たりの密度として計算されるため、DNA繊維の全長に影響を与えないUVC用量/薬物濃度を最適化することが重要です。トラクトの短縮を誘発する濃度を使用すると、結果がギャップ充填密度の増加に向かって人為的に歪められ、データの解釈が困難になる可能性があります。この制限を打ち消すために、前述のように、抗ssDNA抗体を用いて全DNAを染色することによって、非標識DNAの上にギャップ充填事象を可視化することができる14、16。さらに、ギャップ充填イベントの最大検出を確実にするために、キネティック実験を実行することもできます。
ギャップ充填イベントは、S1ヌクレアーゼによる処理前に細胞を回復させた場合、S1ファイバーアッセイを使用して監視することもできます。具体的には、複製後のギャップが埋められると、DNA繊維はS1ヌクレアーゼによる切断に対して鈍感になり、したがってDNA繊維長は、この文脈においてギャップ充填のための読み出しとして使用することができる28。したがって、このアプローチは、G2/Mにおけるギャップ充填の調査に限定されたPRRアッセイとは異なる方法で、細胞周期全体にわたるギャップ充填を研究するために使用することができる。
最後に、PRRアッセイで得られたデータはS1ファイバー28を使用して検証され、PRRアッセイ中のG2/M中のノコダゾールおよび人工的な細胞の遮断はギャップ充填に影響を及ぼさないことが示唆された。G2/M相閉塞を誘導する他の薬剤は、このアッセイにおいて潜在的に使用され得る
S1ファイバーは世界中のラボでますます使用されており、ssDNAギャップ形成のメカニズムに関する新しい洞察を提供し、これらのギャップが形成され得る以前は認識されていなかった条件を明らかにしています14,29,34,35,36。今後の研究のためには、これらの改変プロトコルをDNA病変37の直接可視化を可能にする量子ドットアプローチと組み合わせて、複製後のssDNAギャップ形成とDNA修復との間のクロストーク、ならびに損傷の性質が複製ストレス応答のメカニズムをどのように定義するかを解明することは興味深いであろう。S1ファイバーアッセイの代替として、S1ヌクレアーゼは、修飾中性彗星アッセイにおけるギャップ充填プロセスを研究するためにも使用することができる。簡単に言えば、ギャップが存在する場合、S1ヌクレアーゼによる彗星の処理は、中性彗星アッセイによって検出可能な二本鎖切断の形成をもたらす。中性彗星アッセイおよび酵素修飾彗星アッセイのためのプロトコールは、以前に公開された38,39。特に、このアプローチは、細胞周期のすべての段階においてssDNAギャップ検出を可能にし、G2期の細胞を停止させる必要がない。このアプローチを、ここで説明したS1ファイバーおよびギャップ充填(PRR)プロトコルと組み合わせて使用して、REV3L(DNAポリメラーゼゼータ触媒ユニット)が、UV誘導性の6-4PPがヒトゲノムに存在するときに形成されるギャップを埋める役割を担っていることを見出した14。
利用可能な技術的アプローチが限られているため、複製後のssDNAギャップ形成、特にギャップ充填イベントは、ヒト細胞においてほとんど未開拓のままである。全体として、これらの改変された技術(S1ファイバー、ギャップ充填(PRR)アッセイ、およびS1彗星)は、ssDNAギャップの存在と、これらのギャップが最終的にヒトゲノム内でどのように埋められるかを調査するための新しい戦略を提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
C.F.M.M.研究所での研究は、FAPESPとオランダ科学研究機構(NWO、オランダ)の国際共同研究の下で、サンパウロ財団(ブラジル、サンパウロ、FAPESP、助成金#2019/19435-3、#2013/08028-1、2017/05680-0)の支援を受けています。Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] および Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
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