Summary
Her beskriver vi to modifikasjoner av DNA-fiberanalysen for å undersøke enkeltstrengede DNA-hull i replikering av DNA etter lesjonsinduksjon. S1 fiberanalyse gjør det mulig å oppdage postrepliktive hull ved hjelp av den ssDNA-spesifikke S1 endonuclease, mens gapfyllingsanalysen tillater visualisering og kvantifisering av gapreparasjon.
Abstract
DNA-fiberanalysen er en enkel og robust metode for analyse av replikerings gaffeldynamikk, basert på immunodeteksjon av nukleotidanaloger som er innlemmet under DNA-syntese i menneskelige celler. Denne teknikken har imidlertid en begrenset oppløsning på noen få tusen kilobaser. Følgelig kan ikke postrepliktive enkeltstrengede DNA-hull (ssDNA) så små som noen få hundre baser påvises av standardanalysen. Her beskriver vi en modifisert versjon av DNA-fiberanalysen som benytter S1-kjernen, et enzym som spesifikt cleaves ssDNA. I nærvær av postrepliktive ssDNA-hull vil S1-kjernen målrette og spalte hullene, og generere kortere trakter som kan brukes som en avlesning for ssDNA-hull på pågående gafler. Disse postrepliktive ssDNA-hullene dannes når skadet DNA replikeres diskontinuerlig. De kan repareres via mekanismer som ikke er koblet fra genomreplikering, i en prosess kjent som gapfylling eller postreplikativ reparasjon. Fordi gapfyllingsmekanismer involverer DNA-syntese uavhengig av S-fasen, kan endringer i DNA fibermerkingsordningen også brukes til å overvåke gapfyllingshendelser. Til sammen er disse modifikasjonene av DNA-fiberanalysen kraftige strategier for å forstå hvordan postrepliktive hull dannes og fylles i genomet av menneskelige celler.
Introduction
Seminale arbeider har gitt bevis for opphopning av postrepliktive enkeltstrengede (ssDNA) hull ved behandling med DNA-skadelige midler i bakterie1 og humane celler 2,3. Under replikering av skadede DNA-maler kan DNA-syntesemaskineriet omgå lesjonene ved å bruke spesifikke translesionsyntese DNA-polymeraser eller gjennom malvekslingsmekanismer. Alternativt kan den svarte også bare hoppe over lesjonen og etterlate et ssDNA-gap bak, som skal repareres senere. Mer nylig viste en studie tydelig at behandling med gentoksiske midler fører til ssDNA-hull i eukaryoter ved å bruke elektronmikroskopi for å visualisere den spesifikke strukturen til replikasjons mellomprodukter4. Dannelsen av disse regionene av postrepliktive hull ble opprinnelig foreslått å være et enkelt resultat av den semi-diskontinuerlige modusen for DNA-replikasjon2. I dette tilfellet kan en lesjon på den hengende tråden blokkere forlengelsen av et Okazaki-fragment, men gaffelprogresjon blir naturlig reddet av følgende Okazaki-fragment, og etterlater et ssDNA-gap. Videre studier viste imidlertid at dannelsen av hull på den ledende tråden også er mulig, som først vist i bakterie5. I eukaryoter ble PRIMPOL, en unik DNA-polymerase med primasisk aktivitet, vist seg å kunne starte DNA-syntesen nedstrøms en replikeringsblokkeringslesjon gjennom sin reprimingaktivitet 6,7,8,9,10,11. Dermed kan PRIMPOL primase-aktiviteten forklare dannelsen av postrepliktive ssDNA-hull i den ledende tråden ved behandling med et DNA-skadelig middel i humane celler12. Likevel krevde deteksjon av disse hullene samt gapreparasjon inntil nylig indirekte eller tidkrevende tilnærminger som elektronmikroskopi4 eller plasmidbaserte analyser13. Bruken av den ssDNA-spesifikke S1-kjernen for å oppdage hull i menneskelige celler ble banebrytende av tidlige studier for mer enn førti år siden, ved hjelp av sukrose gradient teknikker 2,3. Mer nylig brukte gruppen vår bruken av denne kjernen for å oppdage ssDNA i å replikere DNA (postreplikerende hull) ved hjelp av andre metoder som DNA-fiber og kometanalyser14. Disse nye tilnærmingene banet vei for den nåværende bølgen av studier på postrepliktive hull. Her beskriver vi en strategi for å bruke S1-kjernease for å oppdage postrepliktive ssDNA-hull ved DNA-fiberanalyse og forklare hvordan en differensialmerkingsordning i DNA-fiberprotokollen kan tillate studiet av reparasjon av disse hullene.
DNA-fiberanalysen er en kraftig teknikk som har blitt brukt av et økende antall laboratorier og har gitt verdifull innsikt i replikeringsgaffeldynamikk og replikeringsspenningsresponsmekanismer. Kort sagt er denne teknikken basert på sekvensiell inkorporering av nukleotidanaloger (som CldU -5-klor-2'-deoksyuridin- og IdU -5-iodo-2'-deoksyuridin) i det replikerende DNA. Etter høsting lyser cellene, og DNA-molekyler sprer seg på en positivt belagt glasssklie. CldU og IdU oppdages deretter av spesifikke antistoffer, som kan visualiseres i et fluorescerende mikroskop som bicolored fibre. Til slutt måles lengdene på IdU- og CldU-traktatene for å identifisere eventuelle endringer i DNA-replikeringsdynamikken som følge av DNA-skadeinduksjon. Denne teknikken kan brukes til å undersøke forskjellige fenomener, for eksempel gaffelboding, gaffelbremsing, nascent DNA-nedbrytning og variasjoner i opprinnelsesfrekvensen som avfyrer15,16.
En begrensning av DNA-fiberanalysen er oppløsningen på noen få kilobaser. Fordi postrepliktive ssDNA-hull kan være i området med hundrevis av baser, er det umulig å visualisere disse hullene direkte av standard DNA fiberprotokoll. Tilstedeværelsen av ssDNA-hull på replikering av DNA i humane celler behandlet med gentoksiske midler har blitt indirekte implisert før. For eksempel, observasjon av ssDNA som vurdert ved rekruttering av ssDNA-bindende protein, replikasjonsprotein A (RPA), i celler utenfor S-fasen, eller dannelsen av ssDNA som påvist ved alkalisk DNA-avslapping kombinert med fravær av langvarig gaffel stalling av DNA fiberanalyse 12,17,18,19,20,21 ble tilskrevet akkumulering av ssDNA-hull. I tillegg induserer postrepliktive ssDNA-hull et ATR-avhengig G2/M fasekontrollpunkt og arrestceller behandlet med replikasjonsgifter 18,19,20,21,22.
S1-kjernen forringes enkeltstrengede nukleinsyrer som frigjør 5'-fosforylmono- eller oligonukleotider og har en 5 ganger høyere affinitet til ssDNA sammenlignet med RNA. Dobbeltstrengede nukleinsyrer (DNA:DNA, DNA:RNA eller RNA:RNA) er motstandsdyktige mot S1-kjernen, unntatt når de brukes i ekstremt høye konsentrasjoner. S1-kjernen klemmer også dobbeltstrenget DNA i den enstrengede regionen forårsaket av en nick, gap, mismatch eller loop. S1-kjernen er dermed en ssDNA-spesifikk endonuclease som er i stand til å spalte ssDNA-hull, og til slutt generere dobbeltstrengede pauser23,24. Dermed muliggjør det å legge til trinn for S1-nuklease fordøyelse til DNA fiberprotokollen indirekte deteksjon av postrepliktive ssDNA-hull. I nærvær av hull vil behandling av eksponerte kjerner med S1-kjernen før DNA-spredning generere kortere trakter som følge av S1 spalting av ssDNA iboende tilstede ved hull14. Følgelig er tract-forkortelsen avlesningen for ssDNA-hull ved hjelp av denne tilnærmingen. Sammenlignet med standard DNA fiberprotokoll, krever DNA-fiberen med S1-kjernen bare to ekstra trinn: nukleieksponering (cellepermeabilisering) og behandling med S1-kjernen. Det er viktig å merke seg at passende kontroller er obligatoriske, for eksempel prøver behandlet med gentoksisk middel, men uten S1-nuklease og prøver behandlet med S1-kjernen uten gentoksisk middel. Protokollen i seg selv, inkludert inkorporering av analoger, S1-behandling og spredning, kan utføres på en dag og krever ikke eksepsjonell materiale. Det krever bare tymidanalogene, den rensede S1-kjernen, de riktige primære og sekundære antistoffene og et fluorescerende mikroskop. Totalt sett oppdager DNA-fiberen som bruker S1-kjernen ssDNA-hull på pågående replikeringsgafler ved hjelp av en relativt enkel tilnærming.
De postrepliktive ssDNA-hullene som dannes som følge av replikeringsspenningsresponsmekanismer, kan repareres (eller fylles) av forskjellige mekanismer, inkludert translesion DNA-syntese eller malveksling, i en prosess som kalles gapfylling eller postreplikeringsreparasjon (PRR)25. Disse prosessene oppstår bak de fremadstormende gaflene, som involverer replikeringsuavhengig DNA-syntese 14,26,27. Basert på disse funnene kan det utføres et merkeskjema som skiller seg fra standard DNA-fiberanalyse for å visualisere gapfyllingshendelser i G2-fasen direkte 14,16,26,28. Spesielt kan en tymidanalog brukes til å merke replikeringsgiffelen på tidspunktet for gentoksisk behandling og postreplikativ ssDNA-gapdannelse, mens en annen tymidinanalog kan brukes til å merke gapfyllingshendelser. I denne protokollen er celler merket med en første tymidinanalog (for eksempel IdU) umiddelbart etter eller samtidig med gentoksisk behandling i 1 time, slik at nascent DNA er merket på tidspunktet for gapdannelse. Nocodazol tilsettes ved behandling i mellom 12-24 timer for å arrestere celler i G2/M, noe som forhindrer følgende S-fase. For de siste 4 t nokodazolbehandling legges en annen tymidanalog (cldU, for eksempel) til mediet som skal innlemmes under gapfylling. Det er viktig at denne analysen bare kan brukes til å oppdage gapfyllingshendelser i G2 fordi gapfyllingssignalet fra CldU ikke kan skilles fra et signal på grunn av CldU-inkorporering i replikering av DNA i S-fasen. Derfor, for å minimere bakgrunnssignalet, bør tidspunktet for CldU-inkorporering etter skadeinduksjon falle sammen med når mesteparten av cellepopulasjonen går inn i G2 fase14. Derfor vil denne timingen variere avhengig av cellelinje og behandlingsforhold. Optimalisering av cellesyklusprogresjon før bruk av denne analysen anbefales. Samtidig farging av disse tymidanalogene gjør det mulig å visualisere gapfyllingskanaler (PRR) (CldU-flekker) på toppen av nascent DNA (IdU-traktater) syntetisert under gentoksisk behandling når ssDNA-hull ble generert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ettersom studien bruker humane celler, ble arbeidet godkjent av Etikkkomiteen ved Institutt for biomedisinsk vitenskap ved Universitetet i São Paulo (ICB-USP, godkjenningsnummer #48347515.3.00005467) for forskning med menneskelige prøver.
MERK: Protokollene som er beskrevet her, ble brukt i tidligere publikasjoner med mindre modifikasjoner 14,16,28. Her er fokuset på bruk av ultrafiolett lys C (UVC) som DNA-skadelig middel. Imidlertid har andre DNA-skadelige midler som cisplatin og hydroxyurea også blitt brukt28. Denne protokollen kan utføres i en rekke cellelinjer, inkludert U2OS, HEK293T, humane fibroblaster og andre 14,28,29. Det er viktig å bestemme det eksperimentelle spørsmålet før du utfører denne protokollen. DNA-fiberanalysen med S1-kjernen (kalt S1 Fiber heretter) brukes til å oppdage tilstedeværelsen av postrepliktive ssDNA-hull, mens gapfyllingsanalysen (eller PRR)-analysen utføres for å kvantifisere gapfyllingshendelser i G2-fasen. Således, hvis man analyserer tilstedeværelsen av postrepliktive ssDNA-hull, bør undersøkeren utføre seksjon 2 (S1 Fiber eksperimentelt oppsett) og gå direkte til seksjon 4 (DNA fiberforberedelse ved å spre) av protokollen. Hvis du analyserer gapfyllingshendelser, bør undersøkeren gå direkte til § 3 (Gap-filling (PRR) eksperimentelt oppsett).
1. Reagenser og oppsett
- Thymidine analoger: Resuspend 5-Iodo-2'-deoxyuridine (IdU) og 5-Chloro-2'-deoxyuridine (CldU) i 1 N NH4OH til en endelig konsentrasjon på 100 mM. Filtrer analogene gjennom et sterilt sprøytefilter (0,2 μm), aliquot, og oppbevar dem ved -20 C.
- Antistoffer: Primær - anti-BrdU rotte (Biorad) og anti-BrdU mus (BD); Secondaries - anti-rotte Alexa Fluor 488 og anti-mus Alexa Fluor 594.
- Cellulær permeabilisering CSK100 buffer for S1 Fiber: Tilsett 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH 7.2], 300 mM sukrose og 0,5% Triton X-100 i destillert H2O.
- S1 kjernebuffer [pH 4.6]: Tilsett 30 mM natriumacetat [pH 4.6], 10 mM sinkacetat, 50 mM NaCl og 5% Glyserol i H2O.
MERK: S1-nukleasebufferen må ha en endelig pH på 4,6, da S1-aktiviteten faller 50 % ved pH-> 4,9. - Aliquot og oppbevar ved -20 °C S1-nukleasen renset fra A. oryzae pre-fortynnet i S1 nukleasefortynningsbuffer levert av produsenten.
- Rekonstituer nokodazolet i DMSO til en endelig konsentrasjon på 2 mM for gapfylling. Analyse.
- Lysis buffer: Tilsett 200 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM EDTA og 0,5 % SDS iH2O.
- Forbered fosfatbufret saltvann (PBS).
- Forbered PBS-T ved å legge til 0,1 % Tween-20 i PBS.
- Forbered 5% Bovine Serum Albumin (BSA) i PBS.
- Forbered 0,1% BSA i PBS.
- Forbered PBS-T-BSA ved å legge til 1% BSA i PBS-T.
MERK: Bruk et epifluorescerende mikroskop med en kvikksølv- eller xenonlampe med en bølgelengde på 510 nm og 42 nm båndbredde GFP (FITC, Alexa Fluor 488) utslippsfilter og en 624 nm bølgelengde og 40 nm båndbredde Texas Red (Alexa Fluor 594) utslippsfilter eller et konfokalt mikroskop med en 488-nm linje (blå) laser for å oppdage grønn fluorescens (oppdaget mellom 510 og 560 nm) og en 561-nm linje (gul) laser for å oppdage rød fluorescens ( mellom 575 og 680 nm). Nedsenkingsmål (40x, 63x eller 100x).
2. S1 Fiber eksperimentelt oppsett (2 dager)
- Dag 1: Plate 4 brønner for hver cellelinje: ± UVC og ± S1 nuklease med celler ved 70-90% samløp.
MERK: Eksperimentet kan gjøres i et format så lite som en 12-brønns plate. I dette tilfellet brukes alle løsninger ved 0,5 ml/brønn. - Dag 2: Forbered fersk IdU ved 20 μM og CldU ved 200 μM i forhåndsvarmede (37 °C) cellekulturmedier.
- Aspirer kulturmediene og legg umiddelbart til media med 20 μM IdU og inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO2 (celleinkubator) i nøyaktig 20 minutter.
- Vask cellene raskt med forvarmet PBS to ganger.
- Bestråle cellene med 20 J/m2 UVC. Bruk ubehandlede celler som kontroller.
- Tilsett umiddelbart mediet med 200 μM CldU og inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO2 (celleinkubator) i nøyaktig 60 minutter.
MERK: IdU- og CldU-merking kan byttes ut, men konsentrasjonen av den andre analogen skal være 5-10 ganger høyere enn den første analogen. Tidspunktet for den analoge inkubasjonen kan tilpasses gentoksisk middel som brukes, men tidspunktet for den andre analoge inkubasjonen skal være lang nok til å sikre nok tid til gapdannelse14,16. Hvis du bruker et DNA-skadelig stoff, legg stoffet sammen med CldU 28,29,30. - Vask cellene med forvarmet (37 °C) PBS to ganger.
- Permeabiliser cellene med CSK100-bufferen i 8-10 min ved romtemperatur (RT).
MERK: Vellykket permeabilisering kan kontrolleres under et brightfield-mikroskop der bare kjerner skal være observerbare - Vask forsiktig kjernen med PBS (hell 0,5 ml ned på siden av hver brønn, bare i noen sekunder).
- Vask forsiktig kjernen med S1 buffer (hell 0,5 ml ned på siden av hver brønn, bare i noen sekunder).
- Inkuber kjernene med S1-buffer med S1-nuklease (20 U/ml) eller uten (som kontroll) i 30 minutter ved 37 °C (celleinkubator).
- Aspirer S1-bufferen og tilsett 0,1 % BSA i PBS.
- Skrap kjernene og overfør dem til et passende kommentert 1,5 ml rør. Hold rørene på is hele tiden.
MERK: Vellykket løsrivelse av kjerner kan kontrolleres under et brightfield-mikroskop. - Pellet kjernen: sentrifuge ved ~ 4600 x g i 5 min, ved 4 °C.
MERK: Forskjellig fra standard DNA-fiberanalyse, kan ikke kjernen telles, så vurder det første antall celler belagt. Alternativt kan en ekstra brønn som ikke ble utsatt for permeabilisering brukes til å estimere celleantallet ved hjelp av et hemocytometer eller en celleteller. - Resuspend pellets godt i PBS i en konsentrasjon på ~ 1500 celler / μL, plasser rørene på is og fortsett til DNA fiber forberedelse ved å spre (avsnitt 4) protokoll umiddelbart
3. Gap-fylling (PRR) eksperimentelt oppsett (3 dager)
- Dag 1: Plate 2 brønner for hver cellelinje: ± UVC med celler ved ~ 70% samløp.
- Dag 2: Forbered fersk IDU ved 20 μM i forvarmede (37 °C) cellekulturmedier.
- Bestråle cellene med 20 J/m2 UVC.
- Tilsett umiddelbart mediet med 20 μM IdU og inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO2 (celleinkubator) i nøyaktig 60 minutter.
- Vask cellene med forvarmet (37 °C) PBS to ganger.
- Tilsett umiddelbart media med 200 ng/ml nokodazol og inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO2 (celleinkubator) i 12-24 timer (tidspunktet for dette trinnet må holdes konsistent mellom eksperimenter).
MERK: Konsentrasjonen av nokodazol må kanskje tilpasses i henhold til cellelinjen som brukes. Hvis du bruker et gentoksisk stoff, inkuber cellene med IdU ± legemiddel28. - Dag 3: Aspirer kulturmediene, legg til media med 20 μM CldU + nocodazole, og inkuber for de siste 4 t nokodazolbehandling, ved 37 °C, 5 % CO2 (celleinkubator).
- Vask cellene med forvarmet (37 °C) PBS.
- Tilsett trypsin og inkuber i 1-2 min ved 37 °C, 5 % CO2 (celleinkubator) for å løsne celler.
- Legg til samme volum cellekulturmedier og samle celler (media + trypsin) i et passende kommentert 1,5 ml rør. Hold rørene på is hele tiden.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en celleteller.
- Pellet cellene: sentrifuge ved ~ 350 x g i 5 min, ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspend cellene i PBS ved ~ 1500 celler / μL. Hold cellene på is og start DNA fiber forberedelse ved å spre protokollen umiddelbart (Dag 3 eller 4).
4. DNA fiber forberedelse ved spredning (~ 1 t for 12 lysbilder)
- Kommenter mikroskopet med en karbonblyant og legg dem flatt på et brett.
- Trykk på bunnen av røret for å sikre homogenisering.
- Legg til 2 μL celler på toppen av det tilsvarende lysbildet.
MERK: To dråper kan legges til, en på toppen av lysbildet og en annen midt i lysbildet. - Tilsett 6 μL av lysisbufferen og lyse cellene ved å pipettere opp og ned ca 5 ganger (unngå å lage bobler).
- Trekk dråpen litt mot bunnen av lysbildet med pipettespissen (for å lede banen til dråpespredningen).
- Inkuber i 5 min på RT for å lyse kjernene.
MERK: Volumet av lysisbuffer og lysistid kan justeres hvis lysatet tørker for raskt eller alternativt ikke tørker nok. Lysis buffervolum kan variere fra 5-7 μL og timing kan falle mellom 4-10 min. - Vipp lysbildet rundt 20-40° og la dråpen spre seg til bunnen av lysbildet med konstant lav hastighet.
- La lysbildet tørke ved RT i mørket (10-15 min).
- Forbered festeløsningen på nytt: Bland metanol: glasial eddiksyre med et forhold på 3:1.
- Senk skliene ned i en krukke som inneholder festeløsningen, og inkuber i 5 minutter ved RT for å fikse DNA på lysbildene.
FORSIKTIG: Metanol er svært giftig og bør holdes under en kjemisk hette. Kast i en passende beholder. - Tørk skliene ved RT i mørket og oppbevar dem ved 4 °C beskyttet mot lys til de er farget.
5. Immunostaining av DNA-fibre (~6 h)
- Vask lysbildene med PBS to ganger i 5 minutter.
- Denature DNA med nylaget 2,5 M HCl i 40-60 min på RT.
FORSIKTIG: For å tilberede 2,5 M HCl, hell syre i vann og aldri det motsatte. Dette er en eksotermisk reaksjon, så den vil varme opp litt. - Vask lysbildene med PBS tre ganger i 5 min.
- Blokk med 5% BSA (kan lagres ved 20 °C i opptil tre bruksområder) som tidligere ble varmet opp ved 37 °C i 30–60 minutter ved 37 °C.
- Fjern overflødig væske fra lysbilder ved å trykke forsiktig på et papir.
- Tilsett 30 μL primærantistoffer (mus anti-BrdU 1/20 (for IdU) og rotte anti-BrdU 1/100 (for CldU) fortynnet i PBS-T-BSA) til lysbildene dropwise og legg en dekslelip på toppen. Inkuber i 1-1,5 timer ved RT i et mørkt, fuktig kammer.
- Legg lysbildene i en krukke med PBS i 1-2 min, og fjern deretter dekslene forsiktig.
- Vask med PBS-T i en krukke tre ganger i 5 min, og plasser deretter lysbildene i PBS.
- Fjern overflødig væske ved å trykke forsiktig på et papir.
- Tilsett 30 μL sekundære antistoffer (antimus Alexa Fluor 594 og anti-rotte Alexa Fluor 488 fortynnet ved 1/75 i PBS-T-BSA.) til lysbildene dropwise og legg en dekslelip på toppen. Inkuber i 45-60 min på RT i et mørkt, fuktig kammer.
- Legg lysbildene i en krukke med PBS i 1-2 min, og fjern deretter dekslene forsiktig.
- Vask med PBS-T i en krukke tre ganger i 5 min, og plasser deretter lysbildene i PBS.
- Fjern overflødig væske ved å trykke forsiktig på et papir.
- Tilsett 20 μL av monteringsreagenset dråpevis på lysbildene og legg en dekslelip på toppen. Unngå bobler.
- La lysbildene tørke ved RT i mørket, og oppbevar deretter ved 4 °C (eller -20 °C for lengre bevaring).
6. Bildeanskaffelse og analyse (~ 1 t per prøve)
MERK: Et epifluorescensmikroskop kan brukes til begge protokollene. For gapfyllingsanalysen (PRR) anbefales det imidlertid på det sterkeste å bruke et konfokalt mikroskop for den økte oppløsningen til bildene.
- Plasser en dråpe nedsenkningsolje (mikroskopspesifikk) nær toppen av lysbildet der cellene ble lysnet og finn fokus ved hjelp av den grønne kanalen ved å søke i grønne prikker i bakgrunnen (40x, 63x og 100x mål kan brukes).
- Finn hovedkonsentrasjonen av fibre og flytt til kantene for å finne godt spredte ikke-overlappende individuelle fibre ved hjelp av bare en kanal for å velge regionene for bildene og unngå potensielle skjevheter.
- Ta rundt 15-20 bilder per lysbilde ved siden av hele lysbildet på de grønne og røde kanalene og slå sammen de to kanalene for å få bicolor DNA-fibre.
MERK: Hvis du bruker et konfokalt mikroskop, ta bilder med høy oppløsning (1024 x 1024 piksler) og bruk pinhole-verdier nær 1 for både rød og grønn fluorescens. - Bruk ImageJ (gratis programvare levert av NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) for IdU- og CldU-målinger.
- Åpne et bilde ved å dra det inn i ImageJ -boksen.
- Bruk skalalinjen som genereres av mikroskopprogramvaren (riktig kalibrert) til å konvertere lengden til mikrometre. Bruk rettlinjeverktøyet ved å velge detfemte ikonet fra venstre mot høyre i ImageJ-boksen for å måle skalalinjen i de angitte mikrometrene og oppnå et mål i piksler. Klikk på Analyser > Angi skala og erstatt "avstanden i piksler" med riktig nummer og "lengdeenheten" til μm.
- I ImageJ-boksen velger du Segmentert linje-verktøyet ved å venstreklikke på detfemte ikonet fra venstre mot høyre og deretter velge det andre alternativet fra topp til bunn.
- Tegn den nøyaktige banen til den røde (IdU) eller grønne (CldU) kanalen ved å venstreklikke og stoppe tegningen ved å høyreklikke. Trykk på M-knappen på tastaturet for å måle lengden.
- For S1 Fiber, analyser bare rødgrønne (bicolor fibre)16. Mål røde og grønne traktlengder fra minst 150 fibre fra forskjellige bilder ved å holde oversikt over de røde og grønne tracts-målingene for hver enkelt fiber.
- For gapfyllingsanalysen måler du bare lengden på IdU (røde) traktater som inneholder minst 1 CldU (grønn) patch, men ingen kontinuerlig CldU-farging. Score minst 10-15 IdU traktater fra forskjellige bilder med minst 1 CldU patch.
MERK: Annen programvare kan brukes til analysene, for eksempel Zeiss LSM Image Browser.
- For S1 Fibres, plotte IdU-traktatene lengde, CldU-traktater lengde, og forhold (CldU / IdU eller omvendt) i separat grafikk som scatter punktplott med medianer.
- Mål gapfyllingshendelser som enheter med "per kilobasetetthet", del det totale antallet CldU-flekker (PRR, grønn) på en gitt lengde på IdU (rød) kanal med den totale lengden på den røde kanalen i kilobaser (med tanke på 1 μm = 2,59 kilobaser31). Deretter tegner du inn dataene som punktpunktplott med medianer.
- I begge forsøkene utfører du statistisk analyse mellom to prøver ved hjelp av Mann-Whitney (ikke-parametrisk test) og mellom mer enn to prøver ved hjelp av Kruskal-Wallis etterfulgt av Dunns multippel sammenligningstest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I S1 Fiber-analysen, hvis behandling med et gentoksisk middel fører til postrepliktive ssDNA-hull, vil de totale lengdene på DNA-fibre fra S1-behandlede kjerner bli kortere ved behandling med DNA-skade sammenlignet med ubehandlede prøver, samt til prøver som ble behandlet med gentoksisk middel, men ikke ble sendt til S1 spalting (figur 1).
Alternativt, hvis behandling med S1-kjernen ikke påvirker lengden på DNA-fibre i forhold til ubehandlede celler, er forskjellige tolkninger mulig: (1) Det er ingen dannelse av postrepliktive ssDNA-hull ved behandling med det gentoksiske middelet som brukes, og/eller i den spesifikke genetiske bakgrunnen som undersøkes. Faktisk har vi tidligere vist at UV-induserte 6-4 fotoprodukter (6-4PP), men ikke cyklobutan pyrimidin dimers (CPD) fører til dannelse av ssDNA hull i celler mangelfull for nukleotid eksisjonsreparasjon (NER, XP-C celler)14. (2) SsDNA-hullene ble reparert og kan ikke lenger oppdages. (3) Forkortelsen forårsaket av behandling med gentoksisk middel alene er for uttalt til å tillate påvisning av en ytterligere forkortelse via S1 spalting.
Spesielt kan mangelen på effekt av S1 også gjenspeile tekniske problemer som svekkede forhold for S1-aktiviteten, inkludert upassende pH i S1-bufferen eller begrenset mengde sink.
Figur 1: Påvisning av postrepliktive ssDNA-hull på pågående gafler av S1 Fiber-analyse. (A) Skjematisk representasjon av DNA-fiberanalyser med ssDNA-spesifikke S1-kjernease (S1 Fiber). Progresjonsgafler er merket med tymidanaloger (IdU, CldU) og kan måles etter DNA-spredning og immunstaining. Venstre, standard fremdrift gafler uten hull er ikke utsatt for spalting av S1-kjernen. Høyre, hull i nascent DNA som er konvensjonelt uoppdagelig vil bli målrettet av S1 nuklease og vil bli visualisert som kortere CldU-traktater. (B) Ordningen med S1 Fiber-protokollen. (C) Representative bilder av S1 Fiber. Topp, kontroller nascent DNA-kanal uten hull, ugjennomtrengelig for spalting av S1-kjernen. Bunn, DNA-kanal positiv for hull spaltet av S1-kjernen, noe som resulterer i en kortere CldU (grønn) kanallengde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I gapfyllingsanalysen (PRR) er en betydelig økning i tettheten av korte CldU-patcher på IdU-traktater en indikasjon på økte gapfyllingshendelser (figur 2). En høy tetthet av PRR-hendelser kan gjenspeiles av 1 PRR-hendelse (grønn/CldU-oppdatering) i en kort IdU-kanal samt av flere PRR-hendelser i en lang periode (se representative bilder Figur 2C). Analysen må utføres grundig ved å score bare CldU-oppdateringer som er på toppen av IdU-traktater med tanke på at CldU-oppdateringene er små og lett kan forveksles som fargebakgrunn (se representative bilder Figur 2C).
Figur 2: Påvisning av postreplikativ reparasjon ved gapfylling. (A) Skjema for rød (IdU) kanal med grønn (CldU) patch som indikerer en gap-fylling hendelse. (B) Skjema for protokollen som brukes til å oppdage gapfylling. (C) Representative bilder fra gap-fylling (PRR) analyse. Venstre, lengre IdU-traktater med minst én CldU-patch og/eller færre CldU-patcher tilsvarer den lave gapfyllingstettheten (færre gapfyllingshendelser). Høyre, kortere IdU-traktater med minst en CldU-patch og lengre IdU-traktater med flere CldU-patcher totalt tilsvarer høy gapfyllingstetthet (flere gapfyllingshendelser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i standard DNA fiberanalyseprotokoll ble diskutert i en tidligere publikasjon32. Her beskriver vi modifiserte versjoner av standard DNA fiberanalyse for å undersøke tilstedeværelsen av postrepliktive ssDNA-hull samt reparasjon ved gapfylling, opprinnelig beskrevet i14. I sammenheng med postreplikativ ssDNA-gaptilstedeværelse vil bruken av S1-kjernen i S1 Fiber-protokollen mest sannsynlig være egnet etter eksponering av et gentoksisk middel i minst 1 time for å gi tid til gapdannelse og påfølgende deteksjon. Det er imidlertid viktig å merke seg at i noen cellelinjer eller genetisk bakgrunn kan bruken av S1-kjernen generere kortere trakter selv uten ytterligere behandling med gentoksiske midler33,34. Derfor er det viktig å inkludere alle kontrollene for å sikre riktig konklusjon om behandling med et gentoksisk middel fører til gapakkumulering. I tillegg er det viktig å validere S1 Fiber-resultatet ytterligere ved å gjenta analysen under forhold der ssDNA-hull ikke lenger dannes eller repareres.
Når det gjelder gapfyllingsanalysen (PRR), er det viktig å optimalisere en UVC-dose / legemiddelkonsentrasjon som ikke påvirker den totale lengden på DNA-fibrene, da resultatene beregnes som en per kilobasetetthet. Hvis du bruker en konsentrasjon som induserer tract-forkortelse, kan resultatene kunstig forskyves mot en økt gapfyllingstetthet, noe som gjør datatolkning vanskelig. For å motvirke denne begrensningen kan gapfyllingshendelser visualiseres på toppen av ikke-merket DNA ved å fargelegge totalt DNA ved hjelp av et anti-ssDNA-antistoff, som tidligere beskrevet14,16. Videre kan et kinetisk eksperiment utføres for å sikre maksimal deteksjon av gapfyllingshendelser.
Vær oppmerksom på at gapfyllingshendelser også kan overvåkes ved hjelp av S1 Fiber-analysen når celler får lov til å gjenopprette før behandling med S1-kjernen. Spesielt når postrepliktive hull er fylt, blir DNA-fibre ufølsomme for spalting av S1-kjernen, og DNA-fiberlengde kan derfor brukes som en avlesning for gapfylling i denne sammenhengen28. Dermed kan denne tilnærmingen brukes til å studere gapfylling gjennom hele cellesyklusen, forskjellig fra PRR-analysen som er begrenset til undersøkelsen av gapfylling i G2 / M.
Til slutt ble data innhentet med PRR-analysen validert ved hjelp av S1 Fiber28, noe som tyder på at nokodazol og kunstig blokkering av celler i G2/M under PRR-analysen ikke påvirker gapfyllingen. Andre midler som induserer G2/M faseblokkering kan potensielt brukes i denne analysen
S1 Fiber har i økende grad blitt brukt av laboratorier over hele verden, og gir ny innsikt i mekanismene for ssDNA-hulldannelse og avslører tidligere ikke verdsatte forhold der disse hullene kan dannes 14,29,34,35,36. For fremtidige undersøkelser ville det være interessant å kombinere disse modifiserte protokollene med kvanteprikk-tilnærmingen som gjør det mulig for direkte visualisering av DNA-lesjonen37 å belyse krysspraten mellom postreplikativ ssDNA-gapdannelse og DNA-reparasjon, samt hvordan skadens natur definerer mekanismen for replikeringsstressresponsen. Som et alternativ til S1 Fiber-analysen kan S1-kjernen også brukes til å studere gapfyllingsprosessen i en modifisert nøytral kometanalyse. Kort sagt, hvis hull er til stede, fører behandling av kometer med S1-kjernen til dannelsen av dobbeltstrengede pauser, detekterbar av nøytral kometanalyse. Protokoller for nøytral kometanalyse samt enzymmodifisert kometanalyse ble tidligere publisert38,39. Spesielt tillater denne tilnærmingen ssDNA-gapdeteksjon i alle faser av cellesyklusen, uten behov for å arrestere celler i G2-fase. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kombinert med S1 Fiber and gap-filling (PRR)-protokollene som er beskrevet her, fant vi ut at REV3L (DNA polymerase zeta katalytisk enhet) er ansvarlig for å fylle hull dannet når UV-induserte 6-4PPs er til stede i det menneskelige genomet14.
Med den begrensede tilgjengelige tekniske tilnærmingen har postrepliktive ssDNA-gapdannelse og spesielt gapfyllingshendelser stort sett vært uutforsket i menneskelige celler. Til sammen gir disse modifiserte teknikkene (S1 Fiber, gap-filling (PRR) analyse og S1 Comet) nye strategier for å undersøke tilstedeværelsen av ssDNA-hull og hvordan disse hullene til slutt fylles i det menneskelige genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet i C.F.M.M. laboratoriet støttes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasil, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 og 2017/05680-0) under International Collaboration Research fra FAPESP og Nederland Organization for Scientific Research (NWO, Nederland); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasil, Grants # 308868/2018-8] og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasil, Finanskode 001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
- Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
- Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
- Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
- García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
- Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
- Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
- Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
- Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
- Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
- Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
- Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
- Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
- Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
- Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
- Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
- Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
- Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
- Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
- Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
- Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
- Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
- Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).
