Summary
トランスミトコンドリア・シブリッドは、ミトコンドリアDNA(mtDNA)枯渇細胞(rho0 細胞)と、ミトコンドリア障害に罹患した患者由来の細胞プラスト(除核細胞)とを融合させたハイブリッド細胞である。それらは、疾患の核またはミトコンドリア起源の決定、生化学的活性の評価、およびmtDNA関連変異体の病原性役割の確認を可能にする。
Abstract
酸化的リン酸化(OXPHOS)を行うミトコンドリア呼吸鎖複合体の欠損は、ヒトミトコンドリア障害の生化学的マーカーである。遺伝的観点から見ると、OXPHOSは、核DNA(nDNA)とミトコンドリアDNA(mtDNA)の2つの異なる遺伝子系の相補から生じるため、ユニークな例を表しています。したがって、OXPHOS欠損は、核およびミトコンドリアにコードされる遺伝子に影響を及ぼす変異に起因する可能性がある。
1989年に発表されたKingとAttardiによる画期的な研究は、mtDNA(rho0と名付けられた)を枯渇させたヒト細胞株が、いわゆる「トランスミトコンドリアサイブリッド」を得るために外因性ミトコンドリアによって再移入され得ることを示した。これらのシブリッドは、ミトコンドリア障害患者由来のミトコンドリア(MDs)とrho0 細胞由来の核を含むため、欠損がmtDNA関連かnDNA関連かを検証することができる。これらのサイブリッドはまた、突然変異の病原性を検証し、生化学的レベルでその影響を研究するための強力なツールです。この論文では、サイブリッドの生成、選択、および特性評価を記述する詳細なプロトコルを提示する。
Introduction
ミトコンドリア障害(MD)は、核(nDNA)またはミトコンドリア(mtDNA)DNAのいずれかの変異によるミトコンドリア機能の障害によって引き起こされる多系統症候群のグループである1。それらは最も一般的な遺伝性代謝疾患の1つであり、有病率は1:5,000である。mtDNA関連疾患は、ミトコンドリア遺伝学の規則に従う:母体遺伝、ヘテロプラスミーおよび閾値効果、および有糸分裂分離2。ヒトmtDNAは16.6 kbの二本鎖DNA円であり、複製および転写に必要な配列を有する短い制御領域、13のタンパク質コード遺伝子(呼吸鎖のすべてのサブユニット)、22のtRNA、および2つのrRNA遺伝子3を含む。
健常者では、単一のmtDNA遺伝子型(ホモプラスミー)が存在するが、病理学的状態においては複数の遺伝子型が共存(ヘテロプラスミー)する。有害な異質体変異は、OXPHOSを破壊し、任意の年齢で任意の臓器に影響を与える可能性のある疾患を引き起こすために、臨界閾値を克服しなければならない4.OXPHOSの二重遺伝学は遺伝を指示する:常染色体劣性または優性およびX連鎖性nDNA変異の場合、母体性はmtDNA変異の場合、および散発的な症例はnDNAおよびmtDNAの両方である。
ミトコンドリア医学時代の初めに、キングとアタルディ5による画期的な実験は、mtDNAが完全に枯渇した腫瘍細胞株(rho0細胞)とMD患者からのミトコンドリアからの核を含むハイブリッド細胞を作成することによって、MDの原因となる突然変異の起源を理解するための基礎を確立しました。 そして、核ゲノムまたはミトコンドリアゲノムに変異が存在するかどうかを判断することは容易ではなかった。1989年に記載されたこの方法は、その後、ミトコンドリア医学の分野で働くいくつかの研究者によって使用されました6,7,8,9;詳細なプロトコルが最近公開されました10, しかし、ビデオはまだ作られていません.NGSが突然変異がどこにあるかを正確かつ迅速に特定できるのに、なぜそのようなプロトコルが今日関連しているのでしょうか?その答えは、サイブリッド生成が、新規mtDNA変異の病原性役割を理解し、ヘテロプラスミーの割合を疾患の重症度と相関させ、患者の自生核バックグラウンドの寄与が存在しない均質核系において生化学的調査を行うための最先端のプロトコルである11、12,13。
このプロトコールは、35mmペトリ皿中で増殖したコンフルエントな患者由来の線維芽細胞から細胞プラストを得る方法を記載している。サイトカラシンBの存在下でのディッシュの遠心分離は、除核サイトプラストの単離を可能にし、次いで、ポリエチレングリコール(PEG)の存在下でrho0 細胞と融合させる。得られたシブリッドは、クローンが発生するまで選択培地で培養される。代表的な結果のセクションは、mtDNAがドナー患者の線維芽細胞のそれと同一であり、nDNAが腫瘍性rho0 細胞株の核DNAと同一であることを証明するために、得られたシブリッドの分子特性評価の例を示す。
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Protocol
注:ヒト線維芽細胞の使用には、倫理的承認が必要な場合があります。この研究で使用された線維芽細胞は、MD患者に由来し、倫理的要件に従ってインスティテューショナルバイオバンクに保存された。細胞の使用についてインフォームドコンセントが提供された。室温(RT、22-25°C)の滅菌層流キャビネット下ですべての細胞培養手順を実行します。細胞培養および滅菌装置に適した滅菌ろ過溶液を使用してください。5%CO2で37°Cの加湿インキュベーター内ですべての細胞株を増殖させる。マイコプラズマ検査は、マイコプラズマを含まない培養物を確保するために毎週実施されるべきである。143BTK−rho0細胞は、先に記載した5のように生成することができる。
1. 細胞の培養
- 何らかの手順を開始する前に、MD患者由来の線維芽細胞における変異の存在を検証し、制限フラグメント長多型(RFLP)および/またはmtDNAシーケンシング解析全体によってヘテロプラズムまたはホモプラジーの割合を定量する14。
- 種子線維芽細胞を4つの35mmシャーレに入れ、それぞれ2mLの完全培養培地を含有する(表1)。細胞を80%コンフルエント(48時間)まで成長させます。
- 143BTK− rho0 細胞を8mLの補充培養液(表1)中で100mmシャーレ中で増殖させる。
- 細胞を5%CO2で37°Cのインキュベーター内に維持する。
- rho0 細胞におけるmtDNAの不在をシークエンシング技術によって確認する14。
2. 線維芽細胞の核生成
- 250 mL 遠心分離に適したボトル 4 本をオートクレーブ滅菌で 121 °C で 20 分間サイクルで滅菌します。実験室オーブンまたはRTで乾燥させる。
- 遠心分離機を37°Cで予温する。
- 線維芽細胞を含む35 mmディッシュを2回洗浄し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない2mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用した。
- 70%エタノールで皿の外表面をきれいにし、アルコールが蒸発するまで待ちます。
- 蓋を皿から、スクリューキャップをボトルから取り外します。各ディッシュを、蓋なしで、各250mL遠心分離ボトルの底に逆さまに置く。
- 各ボトルに32mLの核生成培地をゆっくりと加え(表1)、培地がディッシュに入り、細胞と接触するようにする。長いガラスのパスツールピペットを使用して皿から泡を取り除き、ブンゼンの炎で先端を湾曲させます。
注:培地が皿に入り、細胞と接触するように気泡を除去することが重要です。 - 各ボトルをスクリューキャップで閉じ、遠心分離機に移します。
- 37°C、8,000× gで20分間遠心分離し、加速最大、減速減速。遠心分離機のバランスをとるために注意を払う:各ボトルをカウンターウェイトします。必要に応じて、適当な量の脱核培地を加えて重量を調整する。
- 遠心分離中は、真空または10 mL血清学的ピペットを使用して、143BTK-rho0培養プレートから培地を吸引および廃棄し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない4 mLの1x PBSを使用して2回洗浄します。
- 2mLのトリプシンを加えて、細胞単層を完全に覆う。
- ディッシュを37°Cのインキュベーターに約2分間置きます。
- 培養器からディッシュを取り出し、生細胞(目的4xまたは10x)について倒立顕微鏡を用いて細胞剥離を観察し、2mLの補充培養液を加えることによって酵素活性を阻害する。
- ディッシュ内の細胞懸濁液4 mLを10 mLピペットで吸引し、15 mL円錐管に移す。
- バーカー血球計チャンバーまたは自動カウンターを使用して細胞をカウントします。
- 遠心分離の最後に(ステップ2.8)、ボトルから培地を吸引し、それを廃棄する。
- 以前に70%エタノールを噴霧した滅菌ガーゼ上のボトルを反転させて皿を取り除く。皿とその蓋の外面を70%エタノールできれいにしてください。アルコールが蒸発するまで待ってから、皿を閉じます。
- 先に進む前に、生細胞(対物レンズ4倍または10倍)の倒立顕微鏡を用いて細胞芽細胞(ゴースト)の形成を確認してください。サイトカラシンBによって誘導されるそれらの核の押し出しのために、非常に細長い線維芽細胞を探す。
- 各35 mmディッシュに、1×106個の143BTK−rho 0細胞を5%ウシ胎児血清(FBS)を添加した2mLの143BTK−rho0培養培地に再懸濁して加える。
- ディッシュを37°Cおよび5%CO2 の加湿インキュベーターに3時間放置し、143BTK− rho0 細胞をゴースト上に沈降させる。皿を乱さないでください。
3. 除核線維芽細胞とrho 0 細胞との融合
- 3時間のインキュベーション後、皿から培地を吸引して捨てる。
- 付着細胞を、2 mL のダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 高グルコース (血清使用不可解) または最小必須培地 (MEM) で 2 回洗浄します。
- メディアを吸引して破棄します。
- 500 μLのPEG溶液( 材料表を参照)を細胞に加え、正確に1分間インキュベートする。
- PEG溶液を吸引して破棄します。
- 血清を含まない2 mLのDMEM高グルコースまたはMEMを用いて細胞を3回洗浄する。
- 2mLの融合培地(表1)を加え、5%CO2と共に37°Cのインキュベーター内で一晩インキュベートする。
4. サイブリッドの選択と拡張
- 一晩インキュベーションした後、インキュベーターからプレートを取り出し、上記のように細胞をトリプシン処理し(ステップ2.9〜2.13)、各35mmディッシュの内容物を100mmディッシュに移す。
- 8mLの選択培地(表1)を加え、プレートを5%CO2と共に37°Cのインキュベーターに入れた。
- 2〜3日ごとに培地を交換してください。
- 細胞のコロニーが現れるまで、選択の〜10〜15日間待つ。
- すべてのクローンを収集し、サイブリッドのバックアップとして「大規模な」培養物を生成することによって、4つのペトリ皿のうちの1つを凍結し、最終的に再クローン化してさらなる調査に使用することができる。
- 残りの培養皿中の細胞をトリプシン処理し、数え、クローンが現れるまで、補充培養培地中の50〜100細胞/皿で1つ以上のペトリ皿に播種する(表1)。数日間成長させてください。
- RTで3分間、1,200× g で遠心分離することにより残りの細胞をペレット化し、上清を捨てた。
- ペレットからDNAを抽出する( 材料表を参照)。
- 以前に報告されたようにタンデム反復(VNTR)分析の可変数によるジェノタイピングを行う15.
- クローニングシリンダーまたはピペットチップでシャーレからクローンを拾い上げ、実体顕微鏡を使用して異なるクローンのプールを避け、各ウェルに200 μLの補充培養液を含む96ウェルプレートに移します(表1)。
- DNAを凍結して抽出するのに十分な細胞があるまで、すべてのクローンを展開します。
- RFLPまたは他のシーケンシング法により各クローンの変異率を検証します。理想的には、野生型mtDNA(0%変異)を持つクローンと異なる変異パーセンテージを持つクローンの両方を取得し、どちらもホモプラスム変異mtDNA(100%変異)に加算してみてください。サイブリッド生成プロトコルの概略図については、 図1 を参照してください。
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Representative Results
サイブリッドを生成するには、3日間の実験室作業に加えて、選択期間(〜2週間)とクローンの成長のための追加の1〜2週間が必要です。重要なステップは、細胞プラストの質と選択期間です。サイブリッドの形態は、rho0 ドナー細胞の形態に類似している。サイブリッドにおける正しいmtDNAおよびnDNAの割り当ては、細胞の同一性を確認するために必須である。その一例を 図 2 に示します。このケースでは、ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス、脳卒中様エピソード(MELAS)に関連する最も一般的なmtDNA変異の1つであるヘテロプラズムm.3243A>Gを有する患者由来の線維芽細胞からシブリッドを生成しました。VNTRの解析により、サイブリッドnDNAがrho0 細胞のそれと同一であることが示され(図2A)、患者のnDNAが143Bゲノムで置き換えられたことが確認された。RFLPおよび/またはシーケンシング解析を使用して、mtDNA変異の存在およびヘテロプラズムの割合を評価することができます(図2B、C)。
図1:サイブリッド生成プロトコルの概略図。患者由来の線維芽細胞をサイトカラシンBで処理し、遠心分離してサイトプラスト(除核細胞)を得る。細胞質融合およびmtDNA枯渇細胞(143BTk−rho0)は、適切な培地での選択後に単離することができるシブリッドの生成を可能にする。単一クローンのピックアップと増幅は、異なるヘテロプラズムパーセンテージを生じ、理論的には100%野生型から100%変異型まで変化し得る。略語:mtDNA=ミトコンドリアDNA。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:シブリッドの分子特性評価 (A)Apo-Bマイクロサテライトの分析は、生成されたシブリッドから抽出されたnDNAがrho0 細胞株の核DNAと同一であることを示している。(b)MELAS関連m.3243A>GにまたがるPCR産物の HaeIII 制限マップ、WT)およびMut mtDNA種の量を定量するために用いられる。(c)異なるシブリッドクローン(c1、c2、c3)におけるm.3243A>Gヘテロプラジーレベルを示すRFLP分析の代表的な結果。略語: M = マーカー;bp = 塩基対;WT = 野生型;マット = ミュータント;RFLP = 制限フラグメント長多型;MELAS=ミトコンドリアミオパチー、脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| メディアコンポジション | |
| 完全培養培地 | 最終的なコンク。 |
| DMEM高グルコース(L-グルタミンW/ピルビン酸ナトリウムなし) | [1:1] |
| フェタルクローンIII(ウシ血清製品) | 10% |
| ピルビン酸ナトリウム 100 mM | 1 ミリオン |
| ペニシリン - ストレプトマイシン(溶液100x) | 1% |
| L-グルタミン 200 mM (100x) | 2ミリオンユーロ |
| 補充培養液 | 最終的なコンク。 |
| DMEM高グルコース(L-グルタミンW/ピルビン酸ナトリウムなし) | [1:1] |
| フェタルクローンIII(ウシ血清製品) | 10% |
| ピルビン酸ナトリウム 100 mM | 1 ミリオン |
| ペニシリン - ストレプトマイシン(溶液100x) | 1% |
| L-グルタミン 200 mM (100x) | 4ミリオン |
| ウリジン | 50 μg/mL |
| 核生成培地 | 最終的なコンク。 |
| DMEM高グルコース(L-グルタミンW/ピルビン酸ナトリウムなし) | [1:1] |
| フェタルクローンIII(ウシ血清製品) | 5% |
| ピルビン酸ナトリウム 100 mM | 1 ミリオン |
| ペニシリン - ストレプトマイシン(溶液100x) | 1% |
| L-グルタミン 200 mM (100x) | 2ミリオンユーロ |
| Drechslera dematioidea からのサイトカラシンB | 10 μg/mL |
| 融合媒体 | 最終的なコンク。 |
| DMEM高グルコース(L-グルタミンW/ピルビン酸ナトリウムなし) | [1:1] |
| フェタルクローンIII(ウシ血清製品) | 5% |
| ピルビン酸ナトリウム 100 mM | 1 ミリオン |
| ペニシリン - ストレプトマイシン(溶液100x) | 1% |
| L-グルタミン 200 mM (100x) | 2ミリオンユーロ |
| 選択媒体 | 最終的なコンク。 |
| DMEM高グルコース(L-グルタミンW/ピルビン酸ナトリウムなし) | [1:1] |
| 透析FBS | 5% |
| ピルビン酸ナトリウム 100 mM | 1 ミリオン |
| ペニシリン - ストレプトマイシン(溶液100x) | 1% |
| L-グルタミン 200 mM (100x) | 2ミリオンユーロ |
| 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン | 100 μg/mL |
表1:サイブリッド生成に使用される培地の詳細。
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Discussion
mtDNAは、保護ヒストンの欠如および呼吸鎖に近いその位置のためにnDNAと比較して非常に高い突然変異率を有し、これは修復系16によって効率的に打ち消されない有害な酸化効果に分子をさらす。最初の病原性mtDNA変異は1988年17、18年に同定され、それ以来、多数の変異が記載されている。NGS技術は、ミトコンドリアゲノム全体をスクリーニングし、バリアント14を簡単に同定するための適切なアプローチです。しかし、一度も記載されていないmtDNA変異の病原性役割を評価することは困難な場合があり、このプロトコル11、12、13に記載されているシブリッド細胞の生成などの「昔ながらの」方法に依存しています。ここで説明するサイブリッドの生成は、キングとアタルディ5によって記述された元の方法を要約しています。しかしながら、他のプロトコルは、主に細胞摘出のための系に関連する軽微な修正10を含む。他の例において、除核は、例えば、患者由来の生物学的物質が核19を含まない血小板からなる場合、不要である。
トランスミトコンドリアシブリッドはいくつかの重要な特徴を有しており、ハイスループットの分子技術が単一細胞レベルでDNAおよびRNAをプロファイリングできる場合でも、それらを関連する研究ツールにしている。先駆的な研究において、シブリッドは、臨床的および生化学的にミトコンドリア障害6,7,8,9,20として定義された障害の遺伝的起源を確立または確認するために使用された。実際、このシステムは、プロバンドの核遺伝子の影響を及ぼさず、かつrho0細胞の均質な核バックグラウンドにおいて、mtDNA突然変異の寄与の研究を排他的に可能にする。
さらに、異なる割合の変異を有する異なるサイブリッドクローンの単離のおかげで、定量的遺伝子型対表現型相関を行うことができる。異なるクローンを、ウリジンおよびピルビン酸を含まない透析FBSを補充した選択培地(表1)を用いて選択し、細胞プラストのみと融合させたrho0 細胞の増殖を可能にした。したがって、融合していなかった、または融合していたrho0 細胞、または無傷の線維芽細胞(双核または多核細胞)、ならびに残存する非脱核無傷の線維芽細胞は、排除される。実際、rho0 細胞は、ミトコンドリアガンマポリメラーゼ21の強力な阻害剤である低濃度の臭化エチジウムへの長期曝露によってmtDNAを完全に枯渇させる。
機能的な呼吸鎖を欠いているrho0 細胞は、そのエネルギー要件のために解糖系にのみ依存し、ピルビン酸依存性になる。さらに、ρ0 細胞は、ミトコンドリア内で機能し、ピリミジン生合成に関与する酵素であるジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼの欠損のために、ピリミジン(ウリジンはピリミジン前駆体である)の栄養要求性となっている。rho0 細胞はヒト骨肉腫143Bチミジンキナーゼ欠損(TK−)細胞に由来するが、線維芽細胞、細胞プラスト、および多核ハイブリッドはTK+である。したがって、TK+ 細胞は、5-ブロモ-2'-デオキシウリジンへの曝露により除去される。実際、このウリジン類似体は、デオキシチミジンのリン酸化を触媒するTKによって認識され、次いでDNA生合成に使用される。このプロセスは、細胞死を引き起こす致命的な突然変異をもたらす。サイブリッドのもう一つの利点は、改変することなく、それらを凍結および/または長い培養時間にわたって再利用する可能性である。さらに、腫瘍細胞と同様に、それらの高い増殖速度は実験的研究期間を減少させる。
このシステムを有用で信頼できるものにするための分子的前提条件は、核およびミトコンドリアDNAの正しい遺伝的寄与と、再移入されたシブリッドにおけるmtDNA量を検証することである。今日では、NGS技術を使用してmtDNA分子全体の分析を行い、ハプログループを定義し、調査中のバリアントに加えて、他の望ましくない病原性バリアントの存在を継続的に検証することで、これを簡単に行うことができます。ヘテロプラズマ条件の場合、理想的には0%から100%の範囲の異なる変異負荷を有するクローンの単離は、変異率をミトコンドリア障害の重症度と相関させるために使用することができる。
これらのサイブリッド生成手順に隠された可能性のある落とし穴は、核ドナーとして使用されるrho0 細胞の腫瘍起源に関連している。これらの細胞は異数性であり、これが最終的にミトコンドリア機能および核DNAおよびミトコンドリアDNAによってコードされる異なる呼吸鎖サブユニットの翻訳および集合にどのように影響するかは明らかではない。一般に、異なる起源のrho0 細胞を用いてサイブリッドを生成し、得られたクローンが同等の表現型を示すことを確認することが推奨されるであろう。さらに別の制限は、腫瘍細胞が主に解糖系であるのに対し、ミトコンドリア障害はOXPHOSに大きく依存していることです。したがって、解糖系核(rho0 細胞)がmtDNA変異の結果に与える影響を慎重に確立する必要があります。
上記の制限にもかかわらず、シブリッドの生成はミトコンドリア医学分野に革命をもたらし、依然として新しいmtDNA変異の病原性役割を確立するために使用されている。さらに、サイブリッド技術は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病22、23、24、25、26などの一般的な神経変性疾患から、癌および抗癌治療27、28に至るまで、さまざまな疾患へのミトコンドリアの寄与を調査するために使用されます。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、マリアニ財団の資金提供を受けたミトコンドリア小児疾患研究センター(http://www.mitopedia.org)で実施されました。VTは、希少神経筋疾患のための欧州参照ネットワーク(ERN EURO-NMD)のメンバーです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
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