Summary
Transmitokondrielle cybrider er hybridceller opnået ved at fusionere mitokondrie-DNA (mtDNA)-udtømte celler (rho0-celler ) med cytoplaster (enukleerede celler) afledt af patienter, der er ramt af mitokondrieforstyrrelser. De tillader bestemmelse af sygdommens nukleare eller mitokondrielle oprindelse, evaluering af biokemisk aktivitet og bekræftelse af den patogenetiske rolle af mtDNA-relaterede varianter.
Abstract
Mangel på mitokondrielle respiratoriske kædekomplekser, der udfører oxidativ phosphorylering (OXPHOS), er den biokemiske markør for humane mitokondrielle lidelser. Fra et genetisk synspunkt repræsenterer OXPHOS et unikt eksempel, fordi det skyldes komplementering af to forskellige genetiske systemer: nukleart DNA (nDNA) og mitokondrie-DNA (mtDNA). Derfor kan OXPHOS-defekter skyldes mutationer, der påvirker nukleare og mitokondrielle kodede gener.
Det banebrydende arbejde af King og Attardi, der blev offentliggjort i 1989, viste, at menneskelige cellelinjer udtømt for mtDNA (kaldet rho0) kunne genbefolkes af eksogene mitokondrier for at opnå de såkaldte "transmitokondrielle cybrider". Takket være disse cybrider, der indeholder mitokondrier afledt af patienter med mitokondrielle lidelser (MD'er) og kerner fra rho0-celler , er det muligt at kontrollere, om en defekt er mtDNA- eller nDNA-relateret. Disse cybrider er også et kraftfuldt værktøj til at validere patogeniciteten af en mutation og studere dens indvirkning på et biokemisk niveau. Dette papir præsenterer en detaljeret protokol, der beskriver cybridgenerering, udvælgelse og karakterisering.
Introduction
Mitokondrielle lidelser (MD'er) er en gruppe af multisystemsyndromer forårsaget af en svækkelse i mitokondrielle funktioner på grund af mutationer i enten nukleart (nDNA) eller mitokondrielt (mtDNA) DNA1. De er blandt de mest almindelige arvelige metaboliske sygdomme med en forekomst på 1:5.000. mtDNA-associerede sygdomme følger reglerne for mitokondriel genetik: moderens arv, heteroplasmi og tærskeleffekt og mitotisk adskillelse2. Humant mtDNA er en dobbeltstrenget DNA-cirkel på 16,6 kb, som indeholder en kort kontrolregion med sekvenser, der er nødvendige for replikation og transkription, 13 proteinkodende gener (alle underenheder i åndedrætskæden), 22 tRNA og 2 rRNA-gener3.
Hos raske individer er der en enkelt mtDNA-genotype (homoplasmi), mens mere end en genotype sameksisterer (heteroplasmi) under patologiske tilstande. Skadelige heteroplasmatiske mutationer skal overvinde en kritisk tærskel for at forstyrre OXPHOS og forårsage sygdomme, der kan påvirke ethvert organ i enhver alderaf 4 år. Den dobbelte genetik af OXPHOS dikterer arv: autosomal recessiv eller dominerende og X-bundet til nDNA-mutationer, moderlig for mtDNA-mutationer plus sporadiske tilfælde både for nDNA og mtDNA.
I begyndelsen af mitokondriemedicinens æra etablerede et skelsættende eksperiment af King og Attardi5 grundlaget for at forstå oprindelsen af en mutation, der er ansvarlig for en MD ved at skabe hybridceller indeholdende kerner fra tumorcellelinjer, hvor mtDNA var helt udtømt (rho0-celler) og mitokondrier fra patienter med MD'er. Næste generations sekventeringsteknikker (NGS) var ikke tilgængelige på det tidspunkt, og det var ikke let at afgøre, om en mutation var til stede i det nukleare eller mitokondrielle genom. Metoden, der blev beskrevet i 1989, blev derefter brugt af flere forskere, der arbejdede inden for mitokondriemedicin 6,7,8,9; en detaljeret protokol er for nylig blevet offentliggjort10, men der er endnu ikke lavet nogen video. Hvorfor skulle en sådan protokol være relevant i dag, når NGS præcist og hurtigt kunne identificere, hvor en mutation er placeret? Svaret er, at cybridgenerering stadig er den nyeste protokol til at forstå den patogene rolle af enhver ny mtDNA-mutation, korrelere procentdelen af heteroplasma med sygdommens sværhedsgrad og udføre en biokemisk undersøgelse i et homogent nukleart system, hvor bidraget fra patientens autoktone nukleare baggrund er fraværende11, 12,13.
Denne protokol beskriver, hvordan man opnår cytoplaster fra sammenflydende, patientafledte fibroblaster dyrket i 35 mm petriskåle. Centrifugering af opvasken i nærvær af cytochalasin B tillader isolering af enukleerede cytoplaster, som derefter smeltes sammen med rho0-celler i nærvær af polyethylenglycol (PEG). De resulterende cybrider dyrkes derefter i selektivt medium, indtil kloner opstår. Afsnittet om repræsentative resultater viser et eksempel på molekylær karakterisering af de resulterende cybrider for at bevise, at mtDNA'et er identisk med donorpatienternes fibroblaster, og at nDNA'et er identisk med det nukleare DNA i den tumorale rho 0-cellelinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Brug af humane fibroblaster kan kræve etisk godkendelse. Fibroblaster, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev afledt af MS-patienter og opbevaret i den institutionelle biobank i overensstemmelse med etiske krav. Der blev givet informeret samtykke til brugen af cellerne. Udfør alle cellekulturprocedurer under et sterilt laminært flowskab ved stuetemperatur (RT, 22-25 °C). Brug sterilfiltrerede opløsninger, der er egnede til cellekultur og sterilt udstyr. Dyrk alle cellelinjer i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Mycoplasma-test bør udføres ugentligt for at sikre mycoplasmafrie kulturer. 143BTK- rho0 celler kan genereres som tidligere beskrevet5.
1. Dyrkning af celler
- Inden en procedure påbegyndes, skal tilstedeværelsen af mutationen i fibroblaster afledt af MS-patient(er) verificeres, og procentdelen af heteroplasma eller homoplasmi ved hjælp af RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) og/eller hele mtDNA-sekventeringsanalyser14.
- Frøfibroblaster i fire 35 mm petriskåle, der hver indeholder 2 ml komplet kulturmedium (tabel 1). Lad cellerne vokse indtil 80% sammenflydende (48 timer).
- Dyrk 143BTK- rho0 celler i 8 ml suppleret kulturmedium (tabel 1) i en 100 mm petriskål.
- Cellerne i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Kontroller fraværet af mtDNA i rho0-celler ved hjælp af sekventeringsteknikker14.
2. Enukleation af fibroblaster
- Steriliser fire 250 ml centrifugeegnede flasker ved autoklavestilisering ved 121 °C i en cyklus på 20 minutter. Tør dem i en laboratorieovn eller ved RT.
- Førvarm centrifugen ved 37 °C.
- Vask de 35 mm fade, der indeholder fibroblasterne, to gange med 2 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) uden (w/o) calcium og magnesium.
- Rengør den ydre overflade af opvasken med 70% ethanol og vent, indtil alkoholen fordamper.
- Fjern lågene fra opvasken og skruelågene fra flaskerne. Læg hver skål uden låg på hovedet på bunden af hver 250 ml centrifugeflaske.
- Tilsæt langsomt 32 ml enukleationsmedium til hver flaske (tabel 1), så mediet kan komme ind i fadet og komme i kontakt med cellerne. Fjern eventuelle bobler fra opvasken ved hjælp af en lang pasteurpipette af glas, og bue spidsen i en Bunsen-flamme.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne boblerne for at lade mediet komme ind i fadet og komme i kontakt med cellerne. - Luk hver flaske med skruelåget og overfør dem til centrifugen.
- Centrifuge i 20 minutter ved 37 °C og 8.000 × g, acceleration max, deceleration langsom. Vær opmærksom på at afbalancere centrifugen: modvægt hver flaske. Juster om nødvendigt vægten ved at tilføje et passende volumen enukleationsmedium.
- Under centrifugering skal du bruge vakuum eller en 10 ml serologisk pipette til at aspirere og kassere mediet fra 143BTK- rho 0-dyrkningspladerne og vaske dem to gange med 4 ml 1x PBS med calcium og magnesium.
- Tilsæt 2 ml trypsin for at dække cellemonolaget fuldstændigt.
- Læg opvasken i en 37 °C inkubator i ~2 min.
- Fjern opvasken fra inkubatoren, observer celleløsning ved hjælp af et omvendt mikroskop til levende celler (mål 4x eller 10x), og hæmning af enzymaktiviteten ved at tilsætte 2 ml suppleret kulturmedium.
- Aspirer 4 ml af cellesuspensionen i fadet med en 10 ml pipette og overfør den til et 15 ml konisk rør.
- Tæl cellerne ved hjælp af et Burker hæmocytometerkammer eller en automatiseret tæller.
- Ved afslutningen af centrifugeringen (trin 2.8) aspireres mediet fra flaskerne og kasseres.
- Fjern opvasken ved at vende flaskerne på en steril gasbind, der tidligere er sprøjtet med 70% ethanol. Rengør den ydre overflade af opvasken og deres låg med 70% ethanol. Vent, indtil alkoholen fordamper, og luk derefter opvasken.
- Før du fortsætter, skal du kontrollere for cytoplast (spøgelse) dannelse ved hjælp af et omvendt mikroskop for levende celler (mål 4x eller 10x). Kig efter ekstremt aflange fibroblaster på grund af ekstrudering af deres kerner induceret af cytochalasin B.
- Til hver 35 mm skål tilsættes 1 × 106 af 143BTK- rho0 celler resuspended i 2 ml 143BTK- rho0 kulturmedium suppleret med 5% føtalt kvægserum (FBS).
- Lad opvasken stå i 3 timer i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2, og lad cellerne på 143BTK-rho0 sætte sig på spøgelserne. Forstyr ikke opvasken.
3. Fusion af de enukleerede fibroblaster med rho 0-celler
- Efter 3 timers inkubation aspirerer og kasseres mediet fra opvasken.
- Vask de klæbende celler to gange med 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) højt glucose uden serum eller med Minimum Essential Medium (MEM).
- Aspirer og kassér mediet.
- Tilsæt 500 μL PEG-opløsning (se tabellen over materialer) til cellerne og inkuber i nøjagtigt 1 minut.
- Aspirer og kassér PEG-opløsningen.
- Vask cellerne tre gange med 2 ml DMEM højglukose uden serum eller med MEM.
- Tilsæt 2 ml fusionsmedium (tabel 1) og inkuber natten over i inkubatoren ved 37 °C med 5 % CO2.
4. Cybrid udvælgelse og udvidelse
- Efter inkubation natten over skal du fjerne pladerne fra inkubatoren, trypsinisere cellerne som beskrevet ovenfor (trin 2,9-2,13) og overføre indholdet af hver 35 mm skål til en 100 mm skål.
- Der tilsættes 8 ml udvælgelsesmedium (tabel 1), og pladerne anbringes i inkubatoren ved 37 °C med 5 % CO2.
- Skift medium hver 2-3 dage.
- Vent i ~ 10-15 dages udvælgelse, indtil kolonier af celler vises.
- Frys en af de fire petriskåle ved at samle alle klonerne og generere en "massiv" kultur som backup af cybriderne, som til sidst kan genslones og bruges til yderligere undersøgelser.
- Trypsiniser cellerne i de resterende dyrkningsretter, tæl og frø i en eller flere petriskåle ved 50-100 celler/fad i det supplerede kulturmedium (tabel 1), indtil kloner vises. Lad dem vokse i nogle dage.
- Pellet de resterende celler ved centrifugering ved 1.200 × g i 3 minutter ved RT og kassér supernatanten.
- Uddrag DNA fra pillen (se materialetabellen).
- Udfør genotypning ved variabelt antal tandemly gentagne (VNTR) analyser som tidligere rapporteret15.
- Saml kloner op fra petriskålen med kloningscylindre eller en pipettespids ved hjælp af et stereomikroskop for at undgå pooling af forskellige kloner, og overfør dem til en plade med 96 brønde, der hver indeholder 200 μL suppleret kulturmedium (tabel 1).
- Udvid hver klon, indtil der er nok celler til at fryse og ekstrahere DNA.
- Bekræft mutationsprocenten for hver klon ved hjælp af RFLP eller andre sekventeringsmetoder. Ideelt set skal du prøve at opnå både kloner med vildtype mtDNA (0% mutation) og kloner med forskellige mutationsprocenter, der begge tilføjer homoplasmatisk mutant mtDNA (100% mutation). Se figur 1 for et skematisk diagram over cybridgenereringsprotokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering af cybrider kræver 3 dages laboratoriearbejde plus en udvælgelsesperiode (~ 2 uger) og yderligere 1-2 uger til vækst af kloner. De kritiske trin er kvaliteten af cytoplaster og udvælgelsesperioden. Morfologien af cybrider ligner den af rho0 donorcellerne. Tildeling af det korrekte mtDNA og nDNA i cybriderne er obligatorisk for at bekræfte cellernes identitet. Et eksempel er angivet i figur 2. I dette tilfælde genererede vi cybrider startende fra fibroblaster afledt af en patient, der bærer den heteroplasmatiske m.3243A>G, en af de mest almindelige mtDNA-mutationer forbundet med mitokondriel myopati, encefalopati, mælkesyreacidose og slagtilfældelignende episoder (MELAS). Analyse af VNTR viste, at cybrid nDNA er identisk med rho0-cellernes (figur 2A), hvilket bekræfter udskiftningen af patientens nDNA med 143B-genomet. RFLP- og/eller sekventeringsanalyser kan anvendes til at vurdere tilstedeværelsen af mtDNA-mutationen og heteroplasmiprocenten (figur 2B,C).
Figur 1: Skematisk diagram over cybridgenereringsprotokollen. Patientafledte fibroblaster behandles med cytochalasin B og centrifugeres for at opnå cytoplaster (enukleerede celler). Cytoplasmatisk fusion af cytoplaster og mtDNA-udtømte celler (143BTk- rho0) tillader generering af cybredder, der kan isoleres efter udvælgelse i det relevante medium. Opsamling og forstærkning af enkelte kloner giver forskellige heteroplasmiprocenter, som i teorien kan variere fra 100% vildtype til 100% muteret. Forkortelse: mtDNA = mitokondrie-DNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Molekylær karakterisering af cybrider. (A) Analyse af Apo-B-mikrosatellitter viser, at nDNA ekstraheret fra de genererede cybrider er identisk med det nukleare DNA i rho0-cellelinjen . B) HaeIII-begrænsningskort over PCR-produktet, der spænder over de MELAS-associerede m.3243A>G, der anvendes til at kvantificere mængden af WT) og Mut mtDNA-arter. (C) Repræsentative resultater af RFLP-analyse, der viser m.3243A>G heteroplasminiveauer i forskellige cybridkloner (c1, c2, c3). Forkortelser: M = markør; bp = basepar; WT = vildtype; Mut = mutant; RFLP = begrænsningsfragmentlængde polymorfisme; MELAS = mitokondriel myopati, encefalopati, mælkesyreacidose og slagtilfælde-lignende episoder. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Medie sammensætning | |
| Komplet kulturmedium | Endelig konc. |
| DMEM høj glucose (uden L-glutamin m / natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (Serumprodukt fra kvæg) | 10% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (opløsning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Suppleret kulturmedium | Endelig konc. |
| DMEM høj glucose (uden L-glutamin m / natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (Serumprodukt fra kvæg) | 10% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (opløsning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 4 mM |
| Uridin | 50 μg/ml |
| Enukleationsmedium | Endelig konc. |
| DMEM høj glucose (uden L-glutamin m / natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (Serumprodukt fra kvæg) | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (opløsning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Cytochalasin B fra Drechslera dematioidea | 10 μg/ml |
| Fusion medium | Endelig konc. |
| DMEM høj glucose (uden L-glutamin m / natriumpyruvat) | [1:1] |
| FetalClone III (Serumprodukt fra kvæg) | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (opløsning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| Udvælgelse medium | Endelig konc. |
| DMEM høj glucose (uden L-glutamin m / natriumpyruvat) | [1:1] |
| Dialyseret FBS | 5% |
| Natriumpyruvat 100 mM | 1 mM |
| Penicillin-Streptomycin (opløsning 100x) | 1% |
| L-glutamin 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridin | 100 μg/ml |
Tabel 1: Detaljer om medier, der anvendes til cybridgenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mtDNA har en meget høj mutationshastighed sammenlignet med nDNA på grund af manglen på beskyttende histoner og dets placering tæt på åndedrætskæden, hvilket udsætter molekylet for skadelige oxidative virkninger, der ikke effektivt modvirkes af reparationssystemerne16. De første patogene mtDNA-mutationer blev identificeret i 198817,18, og siden da er et stort antal mutationer blevet beskrevet. NGS-teknologi er en relevant tilgang til at screene hele mitokondriegenomet og let identificere varianter14. Imidlertid kan vurdering af den patogene rolle af en aldrig beskrevet mtDNA-mutation være udfordrende og er stadig afhængig af "gammeldags" metoder såsom generering af cybridceller beskrevet i denne protokol 11,12,13. Den her beskrevne cybridgeneration rekapitulerer de oprindelige metoder, der er beskrevet af King og Attardi5. Andre protokoller indeholder dog mindre ændringer, der hovedsageligt er relateret til systemer til celleenukleation10. I andre tilfælde er enukleation unødvendig, for eksempel når det patientafledte biologiske materiale består af blodplader, som ikke indeholder en kerne19.
Transmitokondrielle cybredder besidder flere vigtige funktioner, hvilket gør dem til et relevant forskningsværktøj, selv når molekylære teknologier med høj kapacitet kan profilere DNA og RNA på enkeltcelleniveau. I banebrydende værker blev cybrider brugt til at fastslå eller bekræfte den genetiske oprindelse af lidelser klinisk og biokemisk defineret som mitokondrielle lidelser 6,7,8,9,20. Faktisk tillader systemet udelukkende undersøgelsen af bidraget fra mtDNA-mutationen uden indflydelse fra probandens nukleare gener og i en homogen nuklear baggrund af rho0-cellerne.
Derudover kan en kvantitativ genotype-til-fænotype korrelation udføres takket være isoleringen af forskellige cybridkloner, der bærer forskellige procentdele af mutationerne. De forskellige kloner blev udvalgt ved hjælp af selection Medium (tabel 1) suppleret med dialyseret FBS og ikke indeholdende uridin og pyruvat, hvilket kun tillod vækst af rho0-celler smeltet sammen med cytoplaster. Således elimineres rho0-celler , der ikke var smeltet sammen eller havde smeltet sammen med intakte fibroblaster (bi- eller polynukleerede celler) såvel som eventuelle resterende ikke-enukleerede intakte fibroblaster. Faktisk er rho0-celler fuldstændigt udtømt for mtDNA ved langvarig eksponering for lave koncentrationer af ethidiumbromid, en potent hæmmer af mitokondriel gammapolymerase21.
Manglende en funktionel åndedrætskæde er rho0-celler udelukkende afhængige af glykolyse for deres energibehov og bliver pyruvatafhængige. Derudover er rho0-celler blevet auxotrofiske for pyrimidiner (uridin er en pyrimidinprækursor) på grund af manglen på dihydroorotatdehydrogenase, et enzym, der fungerer inden for mitokondrier og er involveret i pyrimidinbiosyntesen. Mens rho0-celler er afledt af humant osteosarkom 143B thymidinkinase-mangelfulde (TK-) celler, fibroblaster, cytoplaster og polynukleerede hybrider er TK +. Derfor fjernes TK + - celler på grund af eksponering for 5-brom-2'-deoxyuridin. Faktisk genkendes denne uridinalog ved TK, der katalyserer fosforyleringen af deoxythymidin, som derefter anvendes i DNA-biosyntese. Denne proces resulterer i dødelige mutationer, der forårsager celledød. En anden fordel ved cybrider er muligheden for at fryse og/eller genbruge dem til lange kulturtider uden ændringer. Desuden reducerer deres høje væksthastighed ligesom tumorceller den eksperimentelle undersøgelsesvarighed.
Den molekylære forudsætning for at gøre dette system nyttigt og pålideligt er at verificere det korrekte genetiske bidrag fra det nukleare og mitokondrielle DNA og mtDNA-mængden i de genbefolkede cybrider. I dag kan dette let udføres ved hjælp af NGS-teknikker, der gør det muligt at analysere hele mtDNA-molekylet for at definere haplogrupper og løbende verificere tilstedeværelsen af andre uønskede patogene varianter ud over den undersøgte variant. I tilfælde af heteroplasmatiske tilstande kan isoleringen af kloner med forskellige mutationsbelastninger, der ideelt set spænder fra 0% til 100%, anvendes til at korrelere mutationsprocenten med sværhedsgraden af mitokondrieforringelsen.
Mulige faldgruber skjult i disse cybridgenereringsprocedurer er knyttet til tumoroprindelsen af rho0-cellerne , der anvendes som nukleare donorer. Disse celler er aneuploide, og det er ikke klart, hvordan dette i sidste ende kan påvirke mitokondriefunktioner og oversættelsen og samlingen af de forskellige respiratoriske kædeunderenheder kodet af henholdsvis det nukleare og mitokondrielle DNA. Generelt ville det være tilrådeligt at generere cybredder ved hjælp af rho0-celler af forskellig oprindelse og kontrollere, at de opnåede kloner viser sammenlignelige fænotyper. Endnu en anden begrænsning er, at tumorceller hovedsageligt er glykolytiske, mens mitokondrielle lidelser er massivt afhængige af OXPHOS. Derfor skal virkningen af en glykolytisk kerne (rho0-celler ) på konsekvenserne af en mtDNA-mutation omhyggeligt fastslås.
På trods af ovenstående begrænsninger har genereringen af cybrider revolutioneret mitokondriemedicinområdet og bruges stadig til at fastslå den patogene rolle af nye mtDNA-mutationer. Desuden bruges cybridteknologi til at undersøge mitokondriebidraget til forskellige sygdomme, lige fra almindelige neurodegenerative lidelser som Parkinsons, Alzheimers og Huntingtons Sygdom 22,23,24,25,26 til kræft- og kræftbehandling 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev udført i Center for Studiet af Mitokondrielle Pædiatriske Sygdomme (http://www.mitopedia.org), finansieret af Mariani Foundation. VT er medlem af European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al.
- DiMauro, S., Davidzon, G.
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
