Summary
Los cibridos transmitocondiales son células híbridas obtenidas mediante la fusión de células agotadas de ADN mitocondrial (ADNmt) (células rho0 ) con citólogos (células enucleadas) derivadas de pacientes afectados por trastornos mitocondriales. Permiten la determinación del origen nuclear o mitocondrial de la enfermedad, la evaluación de la actividad bioquímica y la confirmación del papel patogénico de las variantes relacionadas con el ADNmt.
Abstract
La deficiencia de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial que llevan a cabo la fosforilación oxidativa (OXPHOS) es el marcador bioquímico de los trastornos mitocondriales humanos. Desde un punto de vista genético, el OXPHOS representa un ejemplo único porque resulta de la complementación de dos sistemas genéticos distintos: el ADN nuclear (nDNA) y el ADN mitocondrial (ADNmt). Por lo tanto, los defectos de OXPHOS pueden deberse a mutaciones que afectan a genes codificados nucleares y mitocondriales.
El trabajo innovador de King y Attardi, publicado en 1989, mostró que las líneas celulares humanas agotadas de ADNmt (llamadas rho0) podrían ser repobladas por mitocondrias exógenas para obtener los llamados "cibridas transmitocondriales". Gracias a estos cibridos que contienen mitocondrias derivadas de pacientes con trastornos mitocondriales (DM) y núcleos de células rho0 , es posible verificar si un defecto está relacionado con el ADNmt o el ADNm. Estos cibridos también son una poderosa herramienta para validar la patogenicidad de una mutación y estudiar su impacto a nivel bioquímico. Este artículo presenta un protocolo detallado que describe la generación, selección y caracterización de cibridas.
Introduction
Los trastornos mitocondriales (DM) son un grupo de síndromes multisistémicos causados por un deterioro en las funciones mitocondriales debido a mutaciones en el ADN nuclear (nDNA) o mitocondrial (ADNmt)1. Se encuentran entre las enfermedades metabólicas hereditarias más comunes, con una prevalencia de 1:5.000. Las enfermedades asociadas al ADNmt siguen las reglas de la genética mitocondrial: herencia materna, heteroplasmia y efecto umbral, y segregación mitótica2. El ADNmt humano es un círculo de ADN de doble cadena de 16,6 kb, que contiene una región de control corta con secuencias necesarias para la replicación y transcripción, 13 genes codificantes de proteínas (todas las subunidades de la cadena respiratoria), 22 ARNt y 2 genes de ARNr3.
En individuos sanos, hay un solo genotipo de ADNmt (homoplasmia), mientras que coexiste más de un genotipo (heteroplasmia) en condiciones patológicas. Las mutaciones heteroplásmicas perjudiciales deben superar un umbral crítico para interrumpir OXPHOS y causar enfermedades que pueden afectar a cualquier órgano a cualquier edad4 años. La genética dual de OXPHOS dicta la herencia: autosómica recesiva o dominante y ligada al cromosoma X para las mutaciones del ADNn, materna para las mutaciones del ADNmt, además de casos esporádicos tanto para el ADNmt como para el ADNmt.
Al comienzo de la era de la medicina mitocondrial, un experimento histórico de King y Attardi5 estableció la base para comprender el origen de una mutación responsable de un MD mediante la creación de células híbridas que contienen núcleos de líneas celulares tumorales en las que el ADNmt estaba completamente agotado (células rho0) y mitocondrias de pacientes con DM. Las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) no estaban disponibles en ese momento, y no fue fácil determinar si una mutación estaba presente en el genoma nuclear o mitocondrial. El método, descrito en 1989, fue utilizado por varios investigadores que trabajaban en el campo de la medicina mitocondrial 6,7,8,9; recientemente se ha publicado un protocolo detallado10, pero aún no se ha realizado ningún video. ¿Por qué un protocolo de este tipo debería ser relevante hoy en día cuando NGS podría identificar con precisión y rapidez dónde se encuentra una mutación? La respuesta es que la generación de cíbridos sigue siendo el protocolo de última generación para comprender el papel patogénico de cualquier nueva mutación de ADNmt, correlacionar el porcentaje de heteroplasmia con la gravedad de la enfermedad y realizar una investigación bioquímica en un sistema nuclear homogéneo en el que la contribución del fondo nuclear autóctono del paciente está ausente11, 12,13.
Este protocolo describe cómo obtener citoplastos a partir de fibroblastos confluentes derivados del paciente cultivados en placas de Petri de 35 mm. La centrifugación de los platos en presencia de citocalasina B permite el aislamiento de citoplastos enucleados, que luego se fusionan con células rho0 en presencia de polietilenglicol (PEG). Los cibridos resultantes se cultivan en medio selectivo hasta que surgen los clones. La sección de resultados representativos muestra un ejemplo de caracterización molecular de los cibridos resultantes para demostrar que el ADNmt es idéntico al de los fibroblastos de los pacientes donantes y que el ADNn es idéntico al ADN nuclear de la línea celular tumoral rho0 .
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Protocol
NOTA: El uso de fibroblastos humanos puede requerir aprobación ética. Los fibroblastos utilizados en este estudio se derivaron de pacientes con MD y se almacenaron en el biobanco institucional de conformidad con los requisitos éticos. Se dio consentimiento informado para el uso de las celdas. Realizar todos los procedimientos de cultivo celular bajo un gabinete de flujo laminar estéril a temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Utilice soluciones filtradas estériles adecuadas para cultivo celular y equipos estériles. Cultive todas las líneas celulares en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2. Las pruebas de micoplasma deben realizarse semanalmente para garantizar cultivos libres de micoplasma. Se pueden generar 143 celdasBTK-rho 0 como se describió anteriormente5.
1. Cultivo de células
- Antes de iniciar cualquier procedimiento, verificar la presencia de la mutación en fibroblastos derivados de paciente(s) con DM y cuantificar el porcentaje de heteroplasmia u homoplasmia mediante polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y/o análisis de secuenciación de ADNmt completo14.
- Fibroblastos de semillas en cuatro placas de Petri de 35 mm, cada una con 2 ml de medio de cultivo completo (Tabla 1). Deja que las células crezcan hasta que el 80% se confluya (48 h).
- Cultivar 143 célulasBTK- rho0 en 8 mL de Medio de Cultivo Suplementado (Tabla 1) en una placa de Petri de 100 mm.
- Mantenga las células en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
- Comprobar la ausencia de ADNmt en células rho0 mediante técnicas de secuenciación14.
2. Enucleación de fibroblastos
- Esterilice cuatro biberones aptos para centrífugas de 250 ml mediante esterilización en autoclave a 121 °C durante un ciclo de 20 minutos. Sécalos en un horno de laboratorio o en RT.
- Precalentar la centrífuga a 37 °C.
- Lave los platos de 35 mm que contienen los fibroblastos dos veces, usando 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin (sin) calcio y magnesio.
- Limpie la superficie exterior de los platos con etanol al 70% y espere hasta que el alcohol se evapore.
- Retire las tapas de los platos y los tapones de rosca de las botellas. Coloque cada plato, sin tapa, boca abajo en el fondo de cada botella centrífuga de 250 ml.
- Agregue lentamente 32 ml de medio de enucleación a cada botella (Tabla 1), permitiendo que el medio entre en el plato y entre en contacto con las células. Retire las burbujas de los platos con una pipeta Pasteur de vidrio largo, curvando la punta en una llama Bunsen.
NOTA: Es importante eliminar las burbujas para permitir que el medio entre en el plato y entre en contacto con las células. - Cierre cada botella con el tapón de rosca y transfiéralas a la centrífuga.
- Centrifugación durante 20 min a 37 °C y 8.000 × g, aceleración máx., desaceleración lenta. Preste atención para equilibrar la centrífuga: contrapese cada botella. Si es necesario, ajuste el peso agregando un volumen adecuado de Medio de enucleación.
- Durante la centrifugación, use vacío o una pipeta serológica de 10 ml para aspirar y desechar el medio de las placas de cultivo 143BTK-rho 0 y lávelas dos veces con 4 ml de 1 pbS sin calcio y magnesio.
- Agregue 2 ml de tripsina para cubrir completamente la monocapa celular.
- Coloque los platos en una incubadora de 37 °C durante ~2 min.
- Retire los platos de la incubadora, observe el desprendimiento celular utilizando un microscopio invertido para células vivas (objetivos 4x o 10x), e inhiba la actividad enzimática agregando 2 ml de medio de cultivo suplementado.
- Aspire los 4 mL de la suspensión celular en el plato con una pipeta de 10 mL y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL.
- Cuente las células utilizando una cámara hemocitómetro Burker o un contador automatizado.
- Al final de la centrifugación (paso 2.8), aspire el medio de las botellas y deséchelo.
- Retirar los platos invirtiendo los frascos sobre una gasa estéril previamente rociada con etanol al 70%. Limpie la superficie exterior de los platos y sus tapas con etanol al 70%. Espere hasta que el alcohol se evapore y luego cierre los platos.
- Antes de continuar, verifique la formación de citoplastos (fantasmas) utilizando un microscopio invertido para células vivas (objetivo 4x o 10x). Busque fibroblastos extremadamente alargados debido a la extrusión de sus núcleos inducida por la citocalasina B.
- A cada plato de 35 mm, agregue 1 × 106 de 143BTK- rho0 células resuspendidas en 2 ml de medio de cultivo 143BTK- rho0 suplementado con suero bovino fetal al 5% (FBS).
- Deje los platos durante 3 h en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2 y deje que las células 143BTK- rho0 se asienten en los fantasmas. No moleste los platos.
3. Fusión de los fibroblastos enucleados con células rho 0
- Después de 3 h de incubación, aspire y deseche el medio de los platos.
- Lave las células adherentes dos veces con 2 ml de glucosa alta sin suero de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) o con Minimum Essential Medium (MEM).
- Aspirar y desechar el medio.
- Agregue 500 μL de solución de PEG (consulte la Tabla de materiales) a las células e incube durante exactamente 1 min.
- Aspire y deseche la solución peg.
- Lave las células tres veces usando 2 ml de DMEM alto en glucosa sin suero o con MEM.
- Añadir 2 ml de medio de fusión (Tabla 1) e incubar durante la noche en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
4. Selección y expansión de Cybrid
- Después de la incubación durante la noche, retire las placas de la incubadora, tripsinice las células como se describió anteriormente (pasos 2.9-2.13) y transfiera el contenido de cada plato de 35 mm a un plato de 100 mm.
- Añadir 8 ml de medio de selección (Tabla 1) y colocar las placas en la incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
- Cambie el medio cada 2-3 días.
- Espere ~ 10-15 días de selección hasta que aparezcan colonias de células.
- Congelar una de las cuatro placas de Petri recogiendo todos los clones y generando un cultivo "masivo" como respaldo de los cibridos, que eventualmente puede ser recloned y utilizado para futuras investigaciones.
- Tripsinizar las células en las placas de cultivo restantes, contar y sembrar en una o más placas de Petri a 50-100 células / plato en el Medio de cultivo suplementado (Tabla 1) hasta que aparezcan clones. Déjalos crecer durante algunos días.
- Granular las células restantes por centrifugación a 1.200 × g durante 3 min a RT y desechar el sobrenadante.
- Extraer ADN del pellet (ver la Tabla de Materiales).
- Realizar genotipado por número variable de análisis repetidos en tándem (VNTR) como se informó anteriormente15.
- Recoger clones de la placa de Petri con cilindros de clonación o una punta de pipeta, utilizando un estereomicroscopio para evitar la agrupación de diferentes clones, y transferirlos a una placa de 96 pocillos, cada uno de los cuales contiene 200 μL de medio de cultivo suplementado (Tabla 1).
- Expanda cada clon hasta que haya suficientes células para congelar y extraer ADN.
- Verificar el porcentaje de mutación de cada clon mediante RFLP u otros métodos de secuenciación. Lo ideal es tratar de obtener tanto clones con ADNmt de tipo salvaje (mutación del 0%) como clones con diferentes porcentajes de mutación, ambos sumando al ADNmt mutante homoplásmico (mutación del 100%). Consulte la Figura 1 para obtener un diagrama esquemático del protocolo de generación de cibridas.
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Representative Results
La generación de cibridas requiere 3 días de trabajo de laboratorio más un período de selección (~ 2 semanas) y 1-2 semanas adicionales para el crecimiento de clones. Los pasos críticos son la calidad de los citoplastos y el período de selección. La morfología de los cibridos se asemeja a la de las células donantes rho0. La asignación del ADNmt y el ADNn correctos en los cibridas es obligatoria para confirmar la identidad de las células. Un ejemplo se da en la Figura 2. En este caso, generamos cibridas a partir de fibroblastos derivados de un paciente portador de la heteroplásmica m.3243A>G, una de las mutaciones más comunes del ADNmt asociada con miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS). El análisis de VNTR mostró que el nDNA cibrido es idéntico al de las células rho0 (Figura 2A), confirmando el reemplazo del nDNA del paciente con el genoma 143B. Los análisis de RFLP y/o secuenciación se pueden utilizar para evaluar la presencia de la mutación del ADNmt y el porcentaje de heteroplasmia (Figura 2B,C).
Figura 1: Diagrama esquemático del protocolo de generación de cilindros. Los fibroblastos derivados del paciente se tratan con citocalasina B y se centrifugan para obtener citoplastos (células enucleadas). La fusión citoplasmática de citólogos y células agotadas de ADNmt (143BTk- rho0) permite la generación de cibridas que pueden aislarse después de la selección en el medio apropiado. La recolección y amplificación de clones individuales produce diferentes porcentajes de heteroplasmia, que en teoría pueden variar de 100% de tipo salvaje a 100% mutado. Abreviatura: ADNmt = ADN mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización molecular de los cibridos. (A) El análisis de los microsatélites Apo-B muestra que el ADNn extraído de los cibridos generados es idéntico al ADN nuclear de la línea celular rho0 . (B) Mapas de restricción HaeIII del producto de PCR que abarcan las especies m.3243A>G asociadas a MELAS, utilizadas para cuantificar la cantidad de WT) y Mut mtDNA. (C) Resultados representativos del análisis RFLP que muestran niveles de heteroplasmia m.3243A>G en diferentes clones cibridos (c1, c2, c3). Abreviaturas: M = marcador; bp = pares de bases; WT = tipo salvaje; Mut = mutante; RFLP = polimorfismo de longitud de fragmento de restricción; MELAS = miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica y episodios similares a los accidentes cerebrovasculares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Composición de medios | |
| Medio de cultivo completo | Final conc. |
| DMEM Glucosa Alta (sin L-Glutamina W/Piruvato de Sodio) | [1:1] |
| FetalClone III (Producto de suero bovino) | 10% |
| Piruvato de sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicilina-Estreptomicina (solución 100x) | 1% |
| L-Glutamina 200 mM (100x) | 2 mM |
| Medio de cultivo suplementado | Final conc. |
| DMEM Glucosa Alta (sin L-Glutamina W/Piruvato de Sodio) | [1:1] |
| FetalClone III (Producto de suero bovino) | 10% |
| Piruvato de sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicilina-Estreptomicina (solución 100x) | 1% |
| L-Glutamina 200 mM (100x) | 4 mM |
| Uridina | 50 μg/ml |
| Medio de enucleación | Final conc. |
| DMEM Glucosa Alta (sin L-Glutamina W/Piruvato de Sodio) | [1:1] |
| FetalClone III (Producto de suero bovino) | 5% |
| Piruvato de sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicilina-Estreptomicina (solución 100x) | 1% |
| L-Glutamina 200 mM (100x) | 2 mM |
| Citocalasina B de Drechslera dematioidea | 10 μg/ml |
| Medio de fusión | Final conc. |
| DMEM Glucosa Alta (sin L-Glutamina W/Piruvato de Sodio) | [1:1] |
| FetalClone III (Producto de suero bovino) | 5% |
| Piruvato de sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicilina-Estreptomicina (solución 100x) | 1% |
| L-Glutamina 200 mM (100x) | 2 mM |
| Medio de selección | Final conc. |
| DMEM Glucosa Alta (sin L-Glutamina W/Piruvato de Sodio) | [1:1] |
| FBS dializado | 5% |
| Piruvato de sodio 100 mM | 1 mM |
| Penicilina-Estreptomicina (solución 100x) | 1% |
| L-Glutamina 200 mM (100x) | 2 mM |
| 5-Bromo-2'-Desoxiuridina | 100 μg/ml |
Tabla 1: Detalles de los medios utilizados para la generación de cibridas.
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Discussion
El ADNmt tiene una tasa de mutación muy alta en comparación con el ADNnm debido a la falta de histonas protectoras y su ubicación cerca de la cadena respiratoria, lo que expone a la molécula a efectos oxidativos dañinos no contrarrestados eficientemente por los sistemas de reparación16. Las primeras mutaciones patógenas del ADNmt se identificaron en 1988 17,18, y desde entonces, se han descrito un gran número de mutaciones. La tecnología NGS es un enfoque relevante para examinar todo el genoma mitocondrial e identificar fácilmente las variantes14. Sin embargo, evaluar el papel patógeno de una mutación de ADNmt nunca descrita puede ser un desafío y aún se basa en métodos "anticuados" como la generación de células cibridas descritas en este protocolo 11,12,13. La generación cibrida descrita aquí recapitula los métodos originales descritos por King y Attardi5. Sin embargo, otros protocolos contienen modificaciones menores relacionadas principalmente con los sistemas de enucleación celular10. En otros casos, la enucleación es innecesaria, por ejemplo, cuando el material biológico derivado del paciente consiste en plaquetas, que no contienen un núcleo19.
Los cibridos transmitocondriales poseen varias características importantes, lo que los convierte en una herramienta de investigación relevante incluso cuando las tecnologías moleculares de alto rendimiento pueden perfilar el ADN y el ARN a nivel de una sola célula. En trabajos pioneros, se utilizaron cíbridos para establecer o confirmar el origen genético de trastornos definidos clínica y bioquímicamente como trastornos mitocondriales 6,7,8,9,20. De hecho, el sistema permite exclusivamente el estudio de la contribución de la mutación del ADNmt sin la influencia de los genes nucleares de la probanda y en un fondo nuclear homogéneo de las células rho0.
Además, se puede realizar una correlación cuantitativa genotipo-fenotipo, gracias al aislamiento de diferentes clones cibridos portadores de diferentes porcentajes de las mutaciones. Los diferentes clones se seleccionaron utilizando El Medio de Selección (Tabla 1) suplementado con FBS dializado y no contiene uridina y piruvato, permitiendo el crecimiento de células rho0 fusionadas con citólogos solamente. Por lo tanto, se eliminan las células rho0 que no se habían fusionado o se habían fusionado con fibroblastos intactos (células bi o polinucleadas), así como cualquier fibroblasto intacto residual no enucleado. De hecho, las células rho0 están completamente agotadas de ADNmt por la exposición a largo plazo a bajas concentraciones de bromuro de etidio, un potente inhibidor de la gammapolimerasamitocondrial 21.
Al carecer de una cadena respiratoria funcional, las células rho0 dependen exclusivamente de la glucólisis para sus necesidades energéticas y se vuelven dependientes del piruvato. Además, las células rho0 se han vuelto auxotróficas para las pirimidinas (la uridina es un precursor de la pirimidina) debido a la deficiencia de la dihidroorotato deshidrogenasa, una enzima que funciona dentro de las mitocondrias e implicada en la biosíntesis de pirimidina. Mientras que las células rho0 se derivan de células con deficiencia de timidina quinasa (TK-) de osteosarcoma humano 143B, los fibroblastos, citólogos e híbridos polinucleados son TK +. Por lo tanto, las células TK+ se eliminan debido a la exposición a 5-bromo-2'-desoxiuridina. De hecho, este análogo de la uridina es reconocido por TK catalizando la fosforilación de la desoxitimidina, que luego se utiliza en la biosíntesis de ADN. Este proceso resulta en mutaciones letales que causan la muerte celular. Otra ventaja de los cibridos es la posibilidad de congelarlos y/o reutilizarlos durante largos tiempos de cultivo sin alteraciones. Además, al igual que las células tumorales, su alta tasa de crecimiento reduce la duración del estudio experimental.
El requisito previo molecular para hacer que este sistema sea útil y confiable es verificar la contribución genética correcta del ADN nuclear y mitocondrial y la cantidad de ADNmt en los cibridos repoblados. Hoy en día, esto se puede realizar fácilmente mediante el uso de técnicas NGS que permiten el análisis de toda la molécula de ADNmt para definir haplogrupos y verificar continuamente la presencia de cualquier otra variante patógena no deseada además de la variante bajo investigación. En el caso de condiciones heteroplásmicas, el aislamiento de clones con diferentes cargas de mutación, que oscilan idealmente entre el 0% y el 100%, se puede utilizar para correlacionar el porcentaje de mutación con la gravedad del deterioro mitocondrial.
Las posibles trampas ocultas en estos procedimientos de generación de cilindros están relacionadas con el origen tumoral de las células rho0 utilizadas como donantes nucleares. Estas células son aneuploides, y no está claro cómo esto podría afectar eventualmente las funciones mitocondriales y la traducción y el ensamblaje de las diferentes subunidades de la cadena respiratoria codificadas por el ADN nuclear y mitocondrial, respectivamente. Generalmente, sería recomendable generar cibridas utilizando células rho0 de diferentes orígenes y verificar que los clones obtenidos muestren fenotipos comparables. Otra limitación es que las células tumorales son principalmente glucolíticas, mientras que los trastornos mitocondriales dependen masivamente de OXPHOS. Por lo tanto, el impacto de un núcleo glicolítico (células rho0 ) en las consecuencias de una mutación de ADNmt debe establecerse cuidadosamente.
A pesar de las limitaciones anteriores, la generación de cíbridos ha revolucionado el campo de la medicina mitocondrial y todavía se utiliza para establecer el papel patógeno de las nuevas mutaciones de ADNmt. Además, la tecnología cibrida se utiliza para investigar la contribución mitocondrial a diferentes enfermedades, que van desde trastornos neurodegenerativos comunes como el Parkinson, el Alzheimer y la enfermedad de Huntington 22,23,24,25,26, hasta el tratamiento del cáncer y el cáncer 27,28.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este estudio se llevó a cabo en el Centro para el Estudio de las Enfermedades Pediátricas Mitocondriales (http://www.mitopedia.org), financiado por la Fundación Mariani. VT es miembro de la Red Europea de Referencia para Enfermedades Neuromusculares Raras (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
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