Summary
cybrids المتنقلة هي خلايا هجينة يتم الحصول عليها عن طريق دمج الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) - الخلايا المستنفدة (خلايا rho0 ) مع الخلايا الخلوية (الخلايا المنوحة) المشتقة من المرضى المصابين باضطرابات الميتوكوندريا. فهي تسمح بتحديد الأصل النووي أو الميتوكوندريا للمرض ، وتقييم النشاط الكيميائي الحيوي ، وتأكيد الدور الممرض للمتغيرات المرتبطة ب mtDNA.
Abstract
نقص مجمعات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا التي تنفذ الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) هو العلامة الكيميائية الحيوية لاضطرابات الميتوكوندريا البشرية. من وجهة نظر وراثية ، يمثل OXPHOS مثالا فريدا لأنه ينتج عن استكمال نظامين وراثيين متميزين: الحمض النووي النووي (nDNA) والحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA). لذلك ، يمكن أن تكون عيوب OXPHOS ناتجة عن طفرات تؤثر على الجينات المشفرة النووية والميتوكوندريا.
أظهر العمل الرائد الذي قام به كينغ وأتاردي ، الذي نشر في عام 1989 ، أن خطوط الخلايا البشرية المستنفدة من mtDNA (المسماة rho0) يمكن إعادة توطينها بواسطة الميتوكوندريا الخارجية للحصول على ما يسمى ب "cybrids transmitochondrial". بفضل هذه السيبريدات التي تحتوي على الميتوكوندريا المشتقة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات الميتوكوندريا (MDs) والنوى من خلايا rho0 ، من الممكن التحقق مما إذا كان العيب مرتبطا ب mtDNA أو nDNA. هذه السايبريدات هي أيضا أداة قوية للتحقق من صحة إمراض الطفرة ودراسة تأثيرها على المستوى الكيميائي الحيوي. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا يصف توليد السايبرد واختياره وتوصيفه.
Introduction
اضطرابات الميتوكوندريا (MDs) هي مجموعة من المتلازمات متعددة الأنظمة الناجمة عن ضعف في وظائف الميتوكوندريا بسبب طفرات في الحمض النووي (nDNA) أو الميتوكوندريا (mtDNA)1. وهي من بين الأمراض الأيضية الموروثة الأكثر شيوعا ، مع انتشار 1: 5000. تتبع الأمراض المرتبطة ب mtDNA قواعد علم الوراثة الميتوكوندريا: وراثة الأم ، وتأثير الغيرية والعتبة ، والفصل الانقسامي2. mtDNA البشري هو دائرة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل من 16.6 كيلو بايت ، والتي تحتوي على منطقة تحكم قصيرة مع تسلسلات اللازمة للتكرار والنسخ ، و 13 جينا ترميز البروتين (جميع الوحدات الفرعية للسلسلة التنفسية) ، و 22 tRNA ، و 2 rRNA الجينات3.
في الأفراد الأصحاء ، هناك نمط وراثي واحد mtDNA (homoplasmy) ، في حين أن أكثر من نمط وراثي واحد يتعايش (heteroplasmy) في الحالات المرضية. يجب أن تتغلب الطفرات غير المتجانسة الضارة على عتبة حرجة لتعطيل OXPHOS والتسبب في أمراض يمكن أن تؤثر على أي عضو في أي عمر4. تملي الوراثة المزدوجة ل OXPHOS الميراث: صبغي جسدي متنحي أو مهيمن ومرتبط ب X لطفرات nDNA ، والأم لطفرات mtDNA ، بالإضافة إلى حالات متفرقة لكل من nDNA و mtDNA.
في بداية عصر طب الميتوكوندريا ، وضعت تجربة تاريخية أجراها كينغ وأتاردي5 الأساس لفهم أصل الطفرة المسؤولة عن MD عن طريق إنشاء خلايا هجينة تحتوي على نوى من خطوط الخلايا السرطانية التي تم فيها استنفاد mtDNA بالكامل (خلايا rho0) والميتوكوندريا من المرضى الذين يعانون من MDs. لم تكن تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) متاحة في ذلك الوقت ، ولم يكن من السهل تحديد ما إذا كانت هناك طفرة موجودة في الجينوم النووي أو الميتوكوندريا. ثم تم استخدام الطريقة ، الموصوفة في عام 1989 ، من قبل العديد من الباحثين العاملين في مجال طب الميتوكوندريا6،7،8،9. تم نشر بروتوكول مفصل مؤخرا10 ، ولكن لم يتم إنشاء أي فيديو حتى الآن. لماذا يجب أن يكون مثل هذا البروتوكول ذا صلة في الوقت الحاضر عندما يمكن ل NGS تحديد مكان وجود الطفرة بدقة وسرعة؟ الجواب هو أن توليد cybrid لا يزال البروتوكول الحديث لفهم الدور الممرض لأي طفرة جديدة في mtDNA ، وربط النسبة المئوية للتباين مع شدة المرض ، وإجراء تحقيق كيميائي حيوي في نظام نووي متجانس تكون فيه مساهمة الخلفية النووية الأصلية للمريض غائبة11 ، 12,13.
يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على البلاستيدات الخلوية من الخلايا الليفية المتقاربة المشتقة من المريض والتي تزرع في أطباق بتري 35 ملم. يسمح الطرد المركزي للأطباق في وجود cytochalasin B بعزل الخلايا الخلوية المنوية ، والتي يتم دمجها بعد ذلك مع خلايا rho0 في وجود البولي إيثيلين جلايكول (PEG). ثم تزرع السيبريدات الناتجة في وسط انتقائي حتى تنشأ المستنسخات. يظهر قسم النتائج التمثيلية مثالا على التوصيف الجزيئي للسيبريدات الناتجة لإثبات أن mtDNA مطابق للخلايا الليفية للمرضى المتبرعين وأن nDNA مطابق للحمض النووي لخط خلية rho0 الوراثي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: قد يتطلب استخدام الخلايا الليفية البشرية موافقة أخلاقية. تم اشتقاق الخلايا الليفية المستخدمة في هذه الدراسة من مرضى MD وتخزينها في البنك الحيوي المؤسسي وفقا للمتطلبات الأخلاقية. وقدمت الموافقة المستنيرة على استخدام الخلايا. قم بإجراء جميع إجراءات زراعة الخلايا تحت خزانة تدفق صفائحي معقمة في درجة حرارة الغرفة (RT ، 22-25 درجة مئوية). استخدم محاليل مفلترة معقمة مناسبة لزراعة الخلايا والمعدات المعقمة. تنمو جميع خطوط الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. يجب إجراء اختبارات الميكوبلازما أسبوعيا لضمان وجود مزارع خالية من الميكوبلازما. يمكن إنشاء خلايا 143BTK- rho0 كما هو موضح سابقا5.
1. زراعة الخلايا
- قبل البدء في أي إجراء ، تحقق من وجود طفرة في الخلايا الليفية المشتقة من مريض (مرضا) MD وتحديد النسبة المئوية للبلازما المتغايرة أو المتماثلة عن طريق تقييد تعدد الأشكال طول الشظايا (RFLP) و / أو تحليلات تسلسل mtDNA الكامل14.
- الخلايا الليفية البذرية في أربعة أطباق بتري 35 ملم ، يحتوي كل منها على 2 مل من وسط الثقافة الكاملة (الجدول 1). دع الخلايا تنمو حتى تلتقي بنسبة 80٪ (48 ساعة).
- تنمو خلايا 143BTK- rho0 في 8 مل من وسط الثقافة المكمل (الجدول 1) في طبق بتري 100 مم.
- الحفاظ على الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- تحقق من عدم وجود mtDNA في خلايا rho0 عن طريق تقنيات التسلسل14.
2. استئصال الخلايا الليفية
- قم بتعقيم أربع زجاجات مناسبة لأجهزة الطرد المركزي سعة 250 مل عن طريق تعقيم الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. جففها في فرن المختبر أو في RT.
- قم بتسخين جهاز الطرد المركزي عند 37 درجة مئوية.
- اغسل الأطباق مقاس 35 مم التي تحتوي على الخلايا الليفية مرتين ، باستخدام 2 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون (مع / س) الكالسيوم والمغنيسيوم.
- نظف السطح الخارجي للأطباق بنسبة 70٪ من الإيثانول وانتظر حتى يتبخر الكحول.
- قم بإزالة الأغطية من الأطباق والأغطية اللولبية من الزجاجات. ضع كل طبق ، بدون غطاء ، رأسا على عقب في الجزء السفلي من كل زجاجة طرد مركزي سعة 250 مل.
- أضف ببطء 32 مل من Enucleation Medium إلى كل زجاجة (الجدول 1) ، مما يسمح للوسط بدخول الطبق وملامسة الخلايا. قم بإزالة أي فقاعات من الأطباق باستخدام ماصة باستور الزجاجية الطويلة ، مع تقويس الطرف في لهب بنسن.
ملاحظة: من المهم إزالة الفقاعات للسماح للوسط بدخول الطبق وملامسته للخلايا. - أغلق كل زجاجة بغطاء المسمار وانقلها إلى جهاز الطرد المركزي.
- جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 8000 × جم ، أقصى تسارع ، تباطؤ بطيء. انتبه لتحقيق التوازن بين جهاز الطرد المركزي: ثقل موازن كل زجاجة. إذا لزم الأمر ، اضبط الوزن عن طريق إضافة حجم مناسب من Enucleation Medium.
- أثناء الطرد المركزي ، استخدم فراغا أو ماصة مصلية سعة 10 مل لشفط والتخلص من الوسط من ألواح زراعة 143BTK- rho0 وغسلها مرتين باستخدام 4 مل من 1x PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم.
- أضف 2 مل من التربسين لتغطية الطبقة الأحادية للخلية بالكامل.
- ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تقريبا.
- قم بإزالة الأطباق من الحاضنة ، وراقب انفصال الخلايا باستخدام مجهر مقلوب للخلايا الحية (الأهداف 4x أو 10x) ، وتمنع نشاط الإنزيم بإضافة 2 مل من وسط الثقافة المكملة.
- استنشاق 4 مل من تعليق الخلية في الطبق باستخدام ماصة 10 مل ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام غرفة مقياس الدم Burker أو عداد آلي.
- في نهاية الطرد المركزي (الخطوة 2.8) ، قم بشفط الوسط من الزجاجات وتخلص منه.
- قم بإزالة الأطباق عن طريق عكس الزجاجات على شاش معقم تم رشه مسبقا بالإيثانول بنسبة 70٪. نظف السطح الخارجي للأطباق وأغطيتها بالإيثانول بنسبة 70٪. انتظر حتى يتبخر الكحول ، ثم أغلق الأطباق.
- قبل المتابعة ، تحقق من تكوين cytoplast (شبح) باستخدام مجهر مقلوب للخلايا الحية (الهدف 4x أو 10x). ابحث عن الخلايا الليفية الممدودة للغاية بسبب بثق نواتها التي يسببها السيتوكالاسين B.
- إلى كل طبق 35 مم ، أضف 1 × 106 من 143BTK- rho 0 خلية معاد تعليقها في 2 مل من 143BTK- rho0 وسط ثقافة مكمل بمصل بقري جنيني 5٪ (FBS).
- اترك الأطباق لمدة 3 ساعات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 واترك خلايا 143BTK- rho0 تستقر على الأشباح. لا تزعج الأطباق.
3. اندماج الخلايا الليفية المنوية مع خلايا رو 0
- بعد 3 ساعات من الحضانة ، استنشق وتجاهل الوسط من الأطباق.
- اغسل الخلايا الملتصقة مرتين باستخدام 2 مل من مصل Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) عالي الجلوكوز مع مصل / أو مع الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM).
- استنشاق وتجاهل الوسيط.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول PEG (انظر جدول المواد) إلى الخلايا واحتضنها لمدة 1 دقيقة بالضبط.
- استنشق حل PEG وتخلص منه.
- اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 2 مل من DMEM عالي الجلوكوز مع مصل DMEM أو مع MEM.
- أضف 2 مل من Fusion Medium (الجدول 1) واحتضنه بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
4. اختيار Cybrid والتوسع
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة ، وقم بتربسين الخلايا كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.9-2.13) ، وانقل محتوى كل طبق 35 مم إلى طبق 100 مم.
- أضف 8 مل من وسط الاختيار (الجدول 1) وضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- تغيير الوسط كل 2-3 أيام.
- انتظر لمدة 10-15 يوما من التحديد حتى تظهر مستعمرات الخلايا.
- قم بتجميد أحد أطباق بتري الأربعة من خلال جمع جميع الحيوانات المستنسخة وتوليد ثقافة "ضخمة" كنسخة احتياطية من السايبرد ، والتي يمكن استنساخها في النهاية واستخدامها لمزيد من التحقيقات.
- التربسين الخلايا في أطباق الثقافة المتبقية ، عد ، والبذور في واحد أو أكثر من أطباق بتري في 50-100 خلية / طبق في وسط الثقافة المكمل (الجدول 1) حتى تظهر المستنسخات. دعهم ينموون لبضعة أيام.
- قم بتكوير الخلايا المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 1200 × غرام لمدة 3 دقائق في RT وتخلص من السوبرناتانت.
- استخراج الحمض النووي من الكريات (انظر جدول المواد).
- إجراء التنميط الجيني عن طريق عدد متغير من التحليل المتكرر جنبا إلى جنب (VNTR) كما تم الإبلاغ عنه سابقا15.
- التقط الحيوانات المستنسخة من طبق بتري باستخدام أسطوانات استنساخ أو طرف ماصة ، باستخدام مجهر ستيريو لتجنب تجميع الحيوانات المستنسخة المختلفة ، ونقلها إلى طبق من 96 بئرا ، يحتوي كل بئر على 200 ميكرولتر من وسط الثقافة المكمل (الجدول 1).
- قم بتوسيع كل استنساخ حتى يكون هناك ما يكفي من الخلايا لتجميد واستخراج الحمض النووي.
- تحقق من نسبة الطفرة لكل استنساخ بواسطة RFLP أو طرق التسلسل الأخرى. من الناحية المثالية ، حاول الحصول على كل من المستنسخات ذات mtDNA من النوع البري (طفرة 0٪) والمستنسخات ذات نسب الطفرات المختلفة ، وكلاهما يضيف ما يصل إلى mtDNA المتحور المتجانس (طفرة 100٪). انظر الشكل 1 للحصول على رسم تخطيطي لبروتوكول توليد cybrid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتطلب توليد cybrids 3 أيام من العمل المختبري بالإضافة إلى فترة اختيار (~ 2 أسابيع) و 1-2 أسابيع إضافية لنمو الحيوانات المستنسخة. الخطوات الحاسمة هي جودة cytoplasts وفترة الاختيار. يشبه مورفولوجيا cybrids تلك الموجودة في الخلايا المانحة rho0. تعيين mtDNA الصحيح و nDNA في cybrids إلزامي لتأكيد هوية الخلايا. ويرد مثال على ذلك في الشكل 2. في هذه الحالة ، قمنا بتوليد cybrids بدءا من الخلايا الليفية المشتقة من مريض يحمل m.3243A>G غير المتجانسة ، وهي واحدة من أكثر طفرات mtDNA شيوعا المرتبطة باعتلال عضلي الميتوكوندريا ، واعتلال الدماغ ، والحماض اللبني ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية (MELAS). أظهر تحليل VNTR أن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (nDNA) مطابق لخلايا rho0 (الشكل 2A) ، مما يؤكد استبدال nDNA للمريض بجينوم 143B. يمكن استخدام تحليلات RFLP و / أو التسلسل لتقييم وجود طفرة mtDNA والنسبة المئوية غير المتجانسة (الشكل 2B ، C).
الشكل 1: رسم تخطيطي لبروتوكول توليد السايبريد. يتم التعامل مع الخلايا الليفية المشتقة من المريض باستخدام cytochalasin B ويتم طردها مركزيا للحصول على الخلايا الخلوية (الخلايا المنوية). يسمح الانصهار السيتوبلازمي للخلايا الخلوية والخلايا المستنفدة من mtDNA (143BTk- rho0) بتوليد cybrids التي يمكن عزلها بعد الاختيار في الوسط المناسب. ينتج عن التقاط وتضخيم الحيوانات المستنسخة المفردة نسب مئوية مختلفة من البلازما غير المتجانسة ، والتي يمكن أن تختلف نظريا من النوع البري بنسبة 100٪ إلى 100٪ متحورة. اختصار: mtDNA = الحمض النووي للميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التوصيف الجزيئي للسيبريد. (أ) يظهر تحليل السواتل الدقيقة Apo-B أن الحمض النووي nDNA المستخرج من السيبريدات المتولدة مطابق للحمض النووي لخط خلية rho0 . (ب) خرائط تقييد HaeIII لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تغطي m.3243A>G المرتبطة ب MELAS، والمستخدمة لتحديد كمية WT) وأنواع Mut mtDNA. (ج) النتائج التمثيلية لتحليل RFLP التي تبين مستويات m.3243A>G غير المتجانسة في مختلف المستنسخات الدورية (c1 و c2 و c3). الاختصارات: M = علامة; bp = أزواج الأساس; WT = نوع البرية; كتم الصوت = متحور. RFLP = تعدد الأشكال طول جزء التقييد; MELAS = اعتلال عضلي الميتوكوندريا ، اعتلال الدماغ ، الحماض اللبني ، والنوبات الشبيهة بالسكتة الدماغية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تكوين وسائل الإعلام | |
| وسيط ثقافي كامل | المخروط النهائي. |
| DMEM ارتفاع الجلوكوز (ث / س L-الجلوتامين ث / بيروفات الصوديوم) | [1:1] |
| FetalClone III (منتج مصل البقر) | 10% |
| بيروفات الصوديوم 100 mM | 1 مللي متر |
| البنسلين-ستربتومايسين (محلول 100x) | 1% |
| L-الجلوتامين 200 ملليمتر (100x) | 2 مللي متر |
| وسط الثقافة المكملة | المخروط النهائي. |
| DMEM ارتفاع الجلوكوز (ث / س L-الجلوتامين ث / بيروفات الصوديوم) | [1:1] |
| FetalClone III (منتج مصل البقر) | 10% |
| بيروفات الصوديوم 100 mM | 1 مللي متر |
| البنسلين-ستربتومايسين (محلول 100x) | 1% |
| L-الجلوتامين 200 ملليمتر (100x) | 4 مللي متر |
| يوريدين | 50 ميكروغرام/مل |
| وسط الاستئصال | المخروط النهائي. |
| DMEM ارتفاع الجلوكوز (ث / س L-الجلوتامين ث / بيروفات الصوديوم) | [1:1] |
| FetalClone III (منتج مصل البقر) | 5% |
| بيروفات الصوديوم 100 mM | 1 مللي متر |
| البنسلين-ستربتومايسين (محلول 100x) | 1% |
| L-الجلوتامين 200 ملليمتر (100x) | 2 مللي متر |
| سيتوكالاسين ب من دريشسليرا ديماتيويديا | 10 ميكروغرام/مل |
| وسط الانصهار | المخروط النهائي. |
| DMEM ارتفاع الجلوكوز (ث / س L-الجلوتامين ث / بيروفات الصوديوم) | [1:1] |
| FetalClone III (منتج مصل البقر) | 5% |
| بيروفات الصوديوم 100 mM | 1 مللي متر |
| البنسلين-ستربتومايسين (محلول 100x) | 1% |
| L-الجلوتامين 200 ملليمتر (100x) | 2 مللي متر |
| اختيار الوسط | المخروط النهائي. |
| DMEM ارتفاع الجلوكوز (ث / س L-الجلوتامين ث / بيروفات الصوديوم) | [1:1] |
| FBS منزوع الهوية | 5% |
| بيروفات الصوديوم 100 mM | 1 مللي متر |
| البنسلين-ستربتومايسين (محلول 100x) | 1% |
| L-الجلوتامين 200 ملليمتر (100x) | 2 مللي متر |
| 5-برومو-2'-ديوكسي يوريدين | 100 ميكروغرام/مل |
الجدول 1: تفاصيل الوسائط المستخدمة لتوليد السايبريد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحتوي mtDNA على معدل طفرة مرتفع جدا مقارنة ب nDNA بسبب عدم وجود هيستون واقية وموقعه بالقرب من السلسلة التنفسية ، مما يعرض الجزيء لتأثيرات أكسدية ضارة لا تتصدى لها أنظمة الإصلاح بكفاءة16. تم تحديد أول طفرات mtDNA المسببة للأمراض في عام 1988 17,18 ، ومنذ ذلك الحين ، تم وصف عدد كبير من الطفرات. تقنية NGS هي نهج ذي صلة لفحص جينوم الميتوكوندريا بأكمله وتحديد المتغيرات14 بسهولة. ومع ذلك ، فإن تقييم الدور الممرض لطفرة mtDNA التي لم يتم وصفها أبدا يمكن أن يكون تحديا ولا يزال يعتمد على طرق "قديمة الطراز" مثل توليد الخلايا السايبريدية الموصوفة في هذا البروتوكول11،12،13. يلخص الجيل السايبرد الموصوف هنا الطرق الأصلية التي وصفها كينغ وأتاردي5. ومع ذلك ، تحتوي البروتوكولات الأخرى على تعديلات طفيفة تتعلق أساسا بأنظمة استئصال الخلايا10. في حالات أخرى ، يكون الاستئصال غير ضروري ، على سبيل المثال ، عندما تتكون المادة البيولوجية المشتقة من المريض من صفائح دموية ، والتي لا تحتوي على نواة19.
تمتلك السيمبريدات الإرسالية العديد من الميزات المهمة ، مما يجعلها أداة بحثية ذات صلة حتى عندما تتمكن التقنيات الجزيئية عالية الإنتاجية من تحديد ملامح الحمض النووي والحمض النووي الريبي على مستوى الخلية الواحدة. في الأعمال الرائدة ، تم استخدام cybrids لتحديد أو تأكيد الأصل الوراثي للاضطرابات المعرفة سريريا وكيميائيا حيويا على أنها اضطرابات الميتوكوندريا6،7،8،9،20. في الواقع ، يسمح النظام حصريا بدراسة مساهمة طفرة mtDNA دون تأثير الجينات النووية للبروباند وفي خلفية نووية متجانسة لخلايا رو0.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء ارتباط كمي بين النمط الوراثي والنمط الظاهري ، وذلك بفضل عزل المستنسخات الدورية المختلفة التي تحمل نسبا مختلفة من الطفرات. تم اختيار النسخ المستنسخة المختلفة باستخدام Selection Medium (الجدول 1) المكمل ب FBS المحلل ولا يحتوي على اليوريدين والبيروفات ، مما يسمح بنمو خلايا rho0 المنصهرة مع cytoplasts فقط. وبالتالي ، يتم التخلص من خلايا rho0 التي لم تندمج أو اندمجت مع الخلايا الليفية السليمة (الخلايا ثنائية أو متعددة النوى) ، وكذلك أي خلايا ليفية سليمة غير متقطعة متبقية. في الواقع ، يتم استنفاد خلايا rho0 تماما من mtDNA عن طريق التعرض على المدى الطويل لتركيزات منخفضة من بروميد الإيثيديوم ، وهو مثبط قوي للميتوكوندريا غاما بوليميراز21.
تفتقر خلايا rho0 إلى سلسلة تنفسية وظيفية ، وتعتمد حصريا على تحلل السكر لتلبية احتياجاتها من الطاقة وتصبح معتمدة على البيروفات. بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت خلايا rho0 مساعدة للبيريميدين (اليوريدين هو سلائف البيريميدين) بسبب نقص نازعة هيدروجيناز ثنائي هيدروروتات ، وهو إنزيم يعمل داخل الميتوكوندريا ويشارك في التخليق الحيوي للبيريميدين. في حين أن خلايا رو0 مشتقة من الساركوما العظمية البشرية 143B ثيميدين كيناز ناقصة (TK-) الخلايا ، فإن الخلايا الليفية ، والخلايا الخلوية ، والهجينة متعددة النوى هي TK +. لذلك ، تتم إزالة خلايا TK+ بسبب التعرض ل 5-bromo-2'-deoxyuridine. في الواقع ، يتم التعرف على هذا التناظرية اليوريدين من خلال المعارف التقليدية التي تحفز فسفرة ديوكسي ثيميدين ، والتي تستخدم بعد ذلك في التخليق الحيوي للحمض النووي. هذه العملية تؤدي إلى طفرات قاتلة تسبب موت الخلايا. ميزة أخرى من cybrids هي إمكانية تجميدها و / أو إعادة استخدامها لأوقات طويلة من الثقافة دون تغييرات. علاوة على ذلك ، مثل الخلايا السرطانية ، فإن معدل نموها المرتفع يقلل من مدة الدراسة التجريبية.
الشرط الجزيئي لجعل هذا النظام مفيدا وموثوقا به هو التحقق من المساهمة الجينية الصحيحة للحمض النووي والميتوكوندريا وكمية mtDNA في cybrids المعاد توطينها. في الوقت الحاضر ، يمكن إجراء ذلك بسهولة باستخدام تقنيات NGS مما يسمح بتحليل جزيء mtDNA بأكمله لتحديد المجموعات الفردية والتحقق باستمرار من وجود أي متغيرات ممرضة أخرى غير مرغوب فيها بالإضافة إلى المتغير قيد التحقيق. في حالة الظروف غير المتجانسة ، يمكن استخدام عزل الحيوانات المستنسخة ذات أحمال طفرة مختلفة ، تتراوح بشكل مثالي من 0٪ إلى 100٪ ، لربط نسبة الطفرة مع شدة ضعف الميتوكوندريا.
ترتبط المزالق المحتملة المخبأة في إجراءات توليد السيبرد هذه بأصل الورم لخلايا rho0 المستخدمة كمتبرعين نوويين. هذه الخلايا هي اختلال الصيغة الصبغية ، وليس من الواضح كيف يمكن أن يؤثر ذلك في نهاية المطاف على وظائف الميتوكوندريا وترجمة وتجميع الوحدات الفرعية المختلفة للسلسلة التنفسية المشفرة بواسطة الحمض النووي والميتوكوندريا ، على التوالي. بشكل عام ، سيكون من المستحسن توليد cybrids باستخدام خلايا rho0 من أصول مختلفة والتحقق من أن الحيوانات المستنسخة التي تم الحصول عليها تعرض أنماطا ظاهرية مماثلة. لا يزال هناك قيد آخر هو أن الخلايا السرطانية هي أساسا تحلل السكر في حين أن اضطرابات الميتوكوندريا تعتمد بشكل كبير على OXPHOS. لذلك ، يجب تحديد تأثير النواة المحللة للسكر (خلايا rho0 ) على عواقب طفرة mtDNA بعناية.
على الرغم من القيود المذكورة أعلاه ، فقد أحدث جيل cybrids ثورة في مجال طب الميتوكوندريا ولا يزال يستخدم لإنشاء الدور الممرض لطفرات mtDNA الجديدة. علاوة على ذلك ، يتم استخدام تقنية cybrid للتحقيق في مساهمة الميتوكوندريا في أمراض مختلفة ، بدءا من الاضطرابات العصبية التنكسية الشائعة مثل باركنسون والزهايمر ومرض هنتنغتون 22،23،24،25،26 ، إلى السرطان والعلاج المضاد للسرطان 27،28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
أجريت هذه الدراسة في مركز دراسة أمراض الميتوكوندريا لدى الأطفال (http://www.mitopedia.org)، بتمويل من مؤسسة مارياني. VT هي عضو في الشبكة المرجعية الأوروبية للأمراض العصبية العضلية النادرة (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al.
- DiMauro, S., Davidzon, G.
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
