Summary
Transmitocrodiale cybriden zijn hybride cellen die worden verkregen door mitochondriaal DNA (mtDNA)-uitgeputte cellen (rho0-cellen ) te fuseren met cytoplasten (enucleated cells) afgeleid van patiënten die zijn getroffen door mitochondriale aandoeningen. Ze maken het mogelijk om de nucleaire of mitochondriale oorsprong van de ziekte te bepalen, biochemische activiteit te evalueren en de pathogenetische rol van mtDNA-gerelateerde varianten te bevestigen.
Abstract
Deficiëntie van de mitochondriale respiratoire ketencomplexen die oxidatieve fosforylering (OXPHOS) uitvoeren, is de biochemische marker van menselijke mitochondriale aandoeningen. Vanuit genetisch oogpunt is het OXPHOS een uniek voorbeeld omdat het het resultaat is van de aanvulling van twee verschillende genetische systemen: nucleair DNA (nDNA) en mitochondriaal DNA (mtDNA). Daarom kunnen OXPHOS-defecten te wijten zijn aan mutaties die nucleaire en mitochondriale gecodeerde genen beïnvloeden.
Het baanbrekende werk van King en Attardi, gepubliceerd in 1989, toonde aan dat menselijke cellijnen uitgeput van mtDNA (genaamd rho0) opnieuw kunnen worden bevolkt door exogene mitochondriën om de zogenaamde "transmitochondrial cybrids" te verkrijgen. Dankzij deze cybriden die mitochondriën bevatten die afkomstig zijn van patiënten met mitochondriale aandoeningen (MD's) en kernen van rho0-cellen , is het mogelijk om te verifiëren of een defect mtDNA- of nDNA-gerelateerd is. Deze cybriden zijn ook een krachtig hulpmiddel om de pathogeniciteit van een mutatie te valideren en de impact ervan op biochemisch niveau te bestuderen. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol dat cybridegeneratie, selectie en karakterisering beschrijft.
Introduction
Mitochondriale aandoeningen (MD's) zijn een groep multisysteemsyndromen veroorzaakt door een aantasting van mitochondriale functies als gevolg van mutaties in nucleair (nDNA) of mitochondriaal (mtDNA) DNA1. Ze behoren tot de meest voorkomende erfelijke stofwisselingsziekten, met een prevalentie van 1:5.000. mtDNA-geassocieerde ziekten volgen de regels van mitochondriale genetica: maternale overerving, heteroplasmie en drempeleffect, en mitotische segregatie2. Menselijk mtDNA is een dubbelstrengs DNA-cirkel van 16,6 kb, die een kort controlegebied bevat met sequenties die nodig zijn voor replicatie en transcriptie, 13 eiwitcoderende genen (alle subeenheden van de ademhalingsketen), 22 tRNA en 2 rRNA-genen3.
Bij gezonde personen is er één enkel mtDNA-genotype (homoplasmie), terwijl meer dan één genotype naast elkaar bestaat (heteroplasmie) in pathologische omstandigheden. Schadelijke heteroplasmatische mutaties moeten een kritische drempel overwinnen om OXPHOS te verstoren en ziekten te veroorzaken die elk orgaan op elke leeftijdvan 4 jaar kunnen beïnvloeden. De dubbele genetica van OXPHOS dicteert overerving: autosomaal recessief of dominant en X-gebonden voor nDNA-mutaties, maternale voor mtDNA-mutaties, plus sporadische gevallen zowel voor nDNA als mtDNA.
Aan het begin van het mitochondriale geneeskundetijdperk legde een baanbrekend experiment van King en Attardi5 de basis om de oorsprong van een mutatie die verantwoordelijk is voor een MD te begrijpen door hybride cellen te maken die kernen bevatten uit tumorcellijnen waarin mtDNA volledig was uitgeput (rho0-cellen) en mitochondriën van patiënten met MD's. Next-generation sequencing (NGS) -technieken waren op dat moment niet beschikbaar, en het was niet eenvoudig om te bepalen of een mutatie aanwezig was in het nucleaire of mitochondriale genoom. De methode, beschreven in 1989, werd vervolgens gebruikt door verschillende onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van mitochondriale geneeskunde 6,7,8,9; een gedetailleerd protocol is onlangs gepubliceerd10, maar er is nog geen video gemaakt. Waarom zou zo'n protocol tegenwoordig relevant zijn als NGS precies en snel kan identificeren waar een mutatie zich bevindt? Het antwoord is dat cybridegeneratie nog steeds het state-of-the-art protocol is om de pathogene rol van elke nieuwe mtDNA-mutatie te begrijpen, het percentage heteroplasmie te correleren met de ernst van de ziekte en een biochemisch onderzoek uit te voeren in een homogeen nucleair systeem waarin de bijdrage van de autochtone nucleaire achtergrond van de patiënt afwezig is11, 12,13.
Dit protocol beschrijft hoe cytoplasten kunnen worden verkregen uit confluente, patiënt-afgeleide fibroblasten gekweekt in 35 mm petrischalen. Centrifugering van de schotels in aanwezigheid van cytochalasine B maakt de isolatie van enucleated cytoplasten mogelijk, die vervolgens worden gefuseerd met rho0-cellen in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG). De resulterende cybriden worden vervolgens gekweekt in selectief medium totdat er klonen ontstaan. De sectie met representatieve resultaten toont een voorbeeld van moleculaire karakterisering van de resulterende cybriden om te bewijzen dat het mtDNA identiek is aan dat van de fibroblasten van de donorpatiënten en dat het nDNA identiek is aan het nucleaire DNA van de tumorale rho 0-cellijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het gebruik van menselijke fibroblasten kan ethische goedkeuring vereisen. Fibroblasten die in deze studie werden gebruikt, werden afgeleid van MD-patiënten en opgeslagen in de institutionele biobank in overeenstemming met ethische vereisten. Er werd geïnformeerde toestemming gegeven voor het gebruik van de cellen. Voer alle celkweekprocedures uit onder een steriele laminaire flowkast bij kamertemperatuur (RT, 22-25 °C). Gebruik steriel gefilterde oplossingen die geschikt zijn voor celkweek en steriele apparatuur. Kweek alle cellijnen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Mycoplasma-tests moeten wekelijks worden uitgevoerd om mycoplasmavrije culturen te garanderen. 143BTK- rho0 cellen kunnen worden gegenereerd zoals eerder beschreven5.
1. Kweek van cellen
- Controleer voordat u een procedure start de aanwezigheid van de mutatie in fibroblasten afgeleid van MD-patiënt(en) en kwantificeer het percentage heteroplasmie of homoplasmie door Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) en/of hele mtDNA-sequencinganalyses14.
- Zaadfibroblasten in vier petrischalen van 35 mm, elk met 2 ml compleet kweekmedium (tabel 1). Laat de cellen groeien tot 80% confluent (48 uur).
- Kweek 143BTK- rho0 cellen in 8 ml supplemented culture medium (tabel 1) in een petrischaaltje van 100 mm.
- Houd de cellen in een incubator op 37 °C met 5% CO2.
- Controleer de afwezigheid van mtDNA in rho0-cellen door sequencingtechnieken14.
2. Enucleatie van fibroblasten
- Steriliseer vier centrifuge-geschikte flessen van 250 ml door autoclaafsterilisatie bij 121 °C gedurende een cyclus van 20 minuten. Droog ze in een laboratoriumoven of bij RT.
- Verwarm de centrifuge voor op 37 °C.
- Was de 35 mm vaat met de fibroblasten tweemaal, met 2 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder (zonder) calcium en magnesium.
- Reinig het buitenoppervlak van de vaat met 70% ethanol en wacht tot de alcohol verdampt.
- Verwijder de deksels van de vaat en de schroefdoppen van de flessen. Plaats elke schaal, zonder deksel, ondersteboven op de bodem van elke centrifugefles van 250 ml.
- Voeg langzaam 32 ml enucleatiemedium toe aan elke fles (tabel 1), zodat het medium in de schaal kan komen en in contact kan komen met de cellen. Verwijder eventuele bubbels uit de gerechten met een lange glazen Pasteur-pipet en krom de punt in een Bunsen-vlam.
OPMERKING: Het is belangrijk om de bubbels te verwijderen zodat het medium de schaal kan binnendringen en in contact kan komen met de cellen. - Sluit elke fles met de schroefdop en breng ze over naar de centrifuge.
- Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 37 °C en 8.000 × g, versnelling max, vertraging langzaam. Let op het balanceren van de centrifuge: contragewicht elke fles. Pas indien nodig het gewicht aan door een geschikt volume Enucleation Medium toe te voegen.
- Gebruik tijdens het centrifugeren vacuüm of een serologische pipet van 10 ml om het medium van de 143BTK- rho0 kweekplaten op te zuigen en weg te gooien en was ze tweemaal met 4 ml 1x PBS zonder calcium en magnesium.
- Voeg 2 ml trypsine toe om de celmonolaag volledig te bedekken.
- Plaats de gerechten in een incubator van 37 °C gedurende ~2 min.
- Verwijder de schotels uit de couveuse, observeer celloslating met behulp van een omgekeerde microscoop voor levende cellen (doelstellingen 4x of 10x) en rem de enzymactiviteit door 2 ml supplemented culture medium toe te voegen.
- Zuig de 4 ml van de celsuspensie in de schotel op met een pipet van 10 ml en breng deze over in een conische buis van 15 ml.
- Tel de cellen met behulp van een Burker hemocytometer kamer of een geautomatiseerde teller.
- Zuig aan het einde van de centrifugatie (stap 2.8) het medium uit de flessen en gooi het weg.
- Verwijder de gerechten door de flessen om te keren op een steriel gaasje dat eerder met 70% ethanol is besproeid. Reinig het buitenoppervlak van de vaat en hun deksels met 70% ethanol. Wacht tot de alcohol verdampt en sluit dan de gerechten.
- Controleer voordat u verder gaat op cytoplast (spookvorming) met behulp van een omgekeerde microscoop voor levende cellen (objectief 4x of 10x). Zoek naar extreem langwerpige fibroblasten als gevolg van de extrusie van hun kernen geïnduceerd door cytochalasine B.
- Voeg aan elke schaal van 35 mm 1 × 106 van 143BTK- rho0-cellen toe die zijn geresuspendeerd in 2 ml 143BTK- rho0 kweekmedium aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS).
- Laat de schotels 3 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 staan en laat de 143BTK- rho0 cellen op de spoken bezinken. Verstoor de gerechten niet.
3. Fusie van de enucleated fibroblasten met rho 0 cellen
- Na 3 uur incubatie, aspirateer en gooi het medium uit de gerechten.
- Was de hechtende cellen tweemaal met 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose zonder serum of met Minimum Essential Medium (MEM).
- Aspirateer en gooi het medium weg.
- Voeg 500 μL PEG-oplossing (zie de tabel met materialen) toe aan de cellen en incubeer gedurende precies 1 minuut.
- Aspirateer en gooi de PEG-oplossing weg.
- Was de cellen driemaal met 2 ml DMEM hoge glucose zonder serum of met MEM.
- Voeg 2 ml Fusion Medium (tabel 1) toe en incubeer een nacht in de incubator bij 37 °C met 5% CO2.
4. Cybrid selectie en uitbreiding
- Verwijder na de incubatie 's nachts de platen uit de incubator, trypsiniseer de cellen zoals hierboven beschreven (stappen 2.9-2.13) en breng de inhoud van elke schaal van 35 mm over in een schaal van 100 mm.
- Voeg 8 ml selectiemedium toe (tabel 1) en plaats de platen in de incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Vervang het medium om de 2-3 dagen.
- Wacht op ~10-15 dagen selectie totdat kolonies cellen verschijnen.
- Vries een van de vier petrischalen in door alle klonen te verzamelen en een "enorme" cultuur te genereren als back-up van de cybriden, die uiteindelijk kan worden teruggewonnen en gebruikt voor verder onderzoek.
- Trypsiniseer de cellen in de resterende kweekschalen, tel en zaai in een of meer petrischalen met 50-100 cellen / schaal in het supplemented culture medium (tabel 1) totdat klonen verschijnen. Laat ze een paar dagen groeien.
- Pellet de resterende cellen door centrifugering bij 1.200 × g gedurende 3 minuten bij RT en gooi het supernatant weg.
- Extraheer DNA uit de pellet (zie de tabel met materialen).
- Voer genotypering uit door variabel aantal gelijktijdig herhaalde (VNTR) analyses zoals eerder gerapporteerd15.
- Pak klonen uit de petrischaal met klooncilinders of een pipetpunt, gebruik een stereomicroscoop om te voorkomen dat verschillende klonen worden samengevoegd en breng ze over naar een plaat met 96 putten, elk met 200 μL supplemented culture medium (tabel 1).
- Breid elke kloon uit totdat er voldoende cellen zijn om DNA te bevriezen en te extraheren.
- Controleer het mutatiepercentage van elke kloon met RFLP of andere sequencingmethoden. Probeer idealiter zowel klonen met wild-type mtDNA (0% mutatie) als klonen met verschillende mutatiepercentages te verkrijgen, beide opgeteld tot homoplasmatisch mutant mtDNA (100% mutatie). Zie figuur 1 voor een schematisch diagram van het cybridegeneratieprotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het genereren van cybriden vereist 3 dagen laboratoriumwerk plus een selectieperiode (~ 2 weken) en extra 1-2 weken voor de groei van klonen. De kritische stappen zijn de kwaliteit van cytoplasten en de selectieperiode. De morfologie van cybriden lijkt op die van de rho0 donorcellen. Toewijzing van het juiste mtDNA en nDNA in de cybriden is verplicht om de identiteit van de cellen te bevestigen. Een voorbeeld is te zien in figuur 2. In dit geval genereerden we cybriden vanaf fibroblasten afgeleid van een patiënt die de heteroplasmatische m.3243A>G droeg, een van de meest voorkomende mtDNA-mutaties geassocieerd met mitochondriale myopathie, encefalopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes (MELAS). Analyse van VNTR toonde aan dat cybride nDNA identiek is aan die van de rho0-cellen (figuur 2A), wat de vervanging van het nDNA van de patiënt door het 143B-genoom bevestigt. RFLP- en/of sequencinganalyses kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van de mtDNA-mutatie en het heteroplasmiepercentage te beoordelen (figuur 2B,C).
Figuur 1: Schematisch diagram van het cybridegeneratieprotocol. Patiënt-afgeleide fibroblasten worden behandeld met cytochalasine B en gecentrifugeerd om cytoplasten (enucleated cellen) te verkrijgen. Cytoplasmatische fusie van cytoplasten en mtDNA-uitgeputte cellen (143BTk- rho0) maakt het mogelijk om cybriden te genereren die na selectie in het juiste medium kunnen worden geïsoleerd. Het oppakken en versterken van enkele klonen levert verschillende heteroplasmiepercentages op, die in theorie kunnen variëren van 100% wild-type tot 100% gemuteerd. Afkorting: mtDNA = mitochondriaal DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Moleculaire karakterisering van cybriden. (A) Analyse van Apo-B microsatellieten toont aan dat het nDNA geëxtraheerd uit de gegenereerde cybriden identiek is aan het nucleaire DNA van de rho0 cellijn. (B) HaeIII-beperkingskaarten van het PCR-product over de MELAS-geassocieerde m.3243A>G, gebruikt om de hoeveelheid WT) en Mut mtDNA-soorten te kwantificeren. (C) Representatieve resultaten van RFLP-analyse die m.3243A>G heteroplasmiespiegels in verschillende cybrideklonen (c1, c2, c3) laten zien. Afkortingen: M = marker; bp = basenparen; WT = wild-type; Mut = mutant; RFLP = restrictiefragmentlengte polymorfisme; MELAS = mitochondriale myopathie, encefalopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Media compositie | |
| Compleet cultuurmedium | Slotconc. |
| DMEM Hoge Glucose (zonder L-Glutamine W/Natriumpyruvaat) | [1:1] |
| Foetaleclone III (Runderserumproduct) | 10% |
| Natriumpyruvaat 100 mM | 1mm |
| Penicilline-Streptomycine (oplossing 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200m (100x) | 2 meter |
| Aangevuld kweekmedium | Slotconc. |
| DMEM Hoge Glucose (zonder L-Glutamine W/Natriumpyruvaat) | [1:1] |
| Foetaleclone III (Runderserumproduct) | 10% |
| Natriumpyruvaat 100 mM | 1mm |
| Penicilline-Streptomycine (oplossing 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200m (100x) | 4 meter |
| Uridine | 50 μg/ml |
| Enucleatie medium | Slotconc. |
| DMEM Hoge Glucose (zonder L-Glutamine W/Natriumpyruvaat) | [1:1] |
| Foetaleclone III (Runderserumproduct) | 5% |
| Natriumpyruvaat 100 mM | 1mm |
| Penicilline-Streptomycine (oplossing 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200m (100x) | 2 meter |
| Cytochalasine B uit Drechslera dematioidea | 10 μg/ml |
| Fusie medium | Slotconc. |
| DMEM Hoge Glucose (zonder L-Glutamine W/Natriumpyruvaat) | [1:1] |
| Foetaleclone III (Runderserumproduct) | 5% |
| Natriumpyruvaat 100 mM | 1mm |
| Penicilline-Streptomycine (oplossing 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200m (100x) | 2 meter |
| Selectie medium | Slotconc. |
| DMEM Hoge Glucose (zonder L-Glutamine W/Natriumpyruvaat) | [1:1] |
| Gedialyseerde FBS | 5% |
| Natriumpyruvaat 100 mM | 1mm |
| Penicilline-Streptomycine (oplossing 100x) | 1% |
| L-Glutamine 200m (100x) | 2 meter |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | 100 μg/ml |
Tabel 1: Gegevens over de media die worden gebruikt voor de productie van cybriden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het mtDNA heeft een zeer hoge mutatiesnelheid in vergelijking met nDNA vanwege het ontbreken van beschermende histonen en de locatie dicht bij de ademhalingsketen, waardoor het molecuul wordt blootgesteld aan schadelijke oxidatieve effecten die niet efficiënt worden tegengegaan door de reparatiesystemen16. De eerste pathogene mtDNA-mutaties werden geïdentificeerd in 1988 17,18, en sindsdien is een groot aantal mutaties beschreven. NGS-technologie is een relevante benadering om het volledige mitochondriale genoom te screenen en varianten gemakkelijk te identificeren14. Het beoordelen van de pathogene rol van een nooit beschreven mtDNA-mutatie kan echter een uitdaging zijn en is nog steeds afhankelijk van "ouderwetse" methoden zoals het genereren van cybridecellen beschreven in dit protocol 11,12,13. De cybridegeneratie die hier wordt beschreven, vat de oorspronkelijke methoden samen die door King en Attardi5 zijn beschreven. Andere protocollen bevatten echter kleine wijzigingen die voornamelijk betrekking hebben op systemen voor cel-enucleatie10. In andere gevallen is enucleatie niet nodig, bijvoorbeeld wanneer het van de patiënt afgeleide biologische materiaal bestaat uit bloedplaatjes, die geen kern19 bevatten.
Transmitchondrial cybriden bezitten verschillende belangrijke kenmerken, waardoor ze een relevant onderzoeksinstrument zijn, zelfs wanneer moleculaire technologieën met hoge doorvoer DNA en RNA op het niveau van één cel kunnen profileren. In baanbrekend werk werden cybriden gebruikt om de genetische oorsprong van aandoeningen klinisch en biochemisch gedefinieerd als mitochondriale aandoeningen vast te stellen of te bevestigen 6,7,8,9,20. Inderdaad, het systeem maakt uitsluitend de studie van de bijdrage van de mtDNA-mutatie mogelijk zonder de invloed van de nucleaire genen van de proband en in een homogene nucleaire achtergrond van de rho0-cellen.
Bovendien kan een kwantitatieve genotype-tot-fenotype correlatie worden uitgevoerd, dankzij de isolatie van verschillende cybrideklonen met verschillende percentages van de mutaties. De verschillende klonen werden geselecteerd met behulp van Selection Medium (tabel 1) aangevuld met gedialyseerd FBS en zonder uridine en pyruvaat, waardoor de groei van rho0-cellen alleen met cytoplasten kon worden gefuseerd. Rho0-cellen die niet waren gefuseerd of waren gefuseerd met intacte fibroblasten (bi- of polynucleated cellen), evenals alle resterende niet-enucleated intacte fibroblasten, worden geëlimineerd. Rho0-cellen zijn inderdaad volledig uitgeput van mtDNA door langdurige blootstelling aan lage concentraties ethidiumbromide, een krachtige remmer van het mitochondriale gamma-polymerase21.
Bij gebrek aan een functionele ademhalingsketen vertrouwen rho0-cellen uitsluitend op glycolyse voor hun energiebehoeften en worden ze pyruvaatafhankelijk. Bovendien zijn rho0-cellen auxotrofisch geworden voor pyrimidines (uridine is een pyrimidinevoorloper) vanwege het tekort aan het dihydroorotaatdehydrogenase, een enzym dat functioneert in mitochondriën en betrokken is bij de pyrimidinebiosynthese. Terwijl rho 0-cellen zijn afgeleid van menselijke osteosarcoom 143B thymidinekinase-deficiënte (TK-) cellen, fibroblasten, cytoplasten en polynucleated hybriden zijn TK +. Daarom worden TK + -cellen verwijderd als gevolg van blootstelling aan 5-broom-2 '-deoxyuridine. In feite wordt dit uridine-analoog herkend door TK dat de fosforylering van deoxythymidine katalyseert, die vervolgens wordt gebruikt bij DNA-biosynthese. Dit proces resulteert in dodelijke mutaties die celdood veroorzaken. Een ander voordeel van cybriden is de mogelijkheid om ze lange kweektijden in te vriezen en/of te hergebruiken zonder aanpassingen. Bovendien vermindert hun hoge groeisnelheid, net als tumorcellen, de experimentele studieduur.
De moleculaire voorwaarde om dit systeem bruikbaar en betrouwbaar te maken, is het verifiëren van de juiste genetische bijdrage van het nucleaire en mitochondriale DNA en de mtDNA-hoeveelheid in de herbevolkte cybriden. Tegenwoordig kan dit eenvoudig worden uitgevoerd door gebruik te maken van NGS-technieken die de analyse van het hele mtDNA-molecuul mogelijk maken om haplogroepen te definiëren en continu de aanwezigheid van andere ongewenste pathogene varianten naast de onderzochte variant te verifiëren. In het geval van heteroplasmatische aandoeningen kan de isolatie van klonen met verschillende mutatiebelastingen, idealiter variërend van 0% tot 100%, worden gebruikt om het mutatiepercentage te correleren met de ernst van de mitochondriale stoornis.
Mogelijke valkuilen verborgen in deze cybridegeneratieprocedures zijn gekoppeld aan de tumoroorsprong van de rho0-cellen die als nucleaire donoren worden gebruikt. Deze cellen zijn aneuploïde en het is niet duidelijk hoe dit uiteindelijk mitochondriale functies en de translatie en assemblage van de verschillende subeenheden van de ademhalingsketen gecodeerd door respectievelijk het nucleaire en mitochondriale DNA zou kunnen beïnvloeden. Over het algemeen zou het raadzaam zijn om cybriden te genereren met behulp van rho0-cellen van verschillende oorsprong en te controleren of de verkregen klonen vergelijkbare fenotypen vertonen. Nog een andere beperking is dat tumorcellen voornamelijk glycolytisch zijn, terwijl mitochondriale aandoeningen massaal afhankelijk zijn van OXPHOS. Daarom moet de impact van een glycolytische kern (rho0-cellen ) op de gevolgen van een mtDNA-mutatie zorgvuldig worden vastgesteld.
Ondanks de bovenstaande beperkingen heeft de generatie van cybriden een revolutie teweeggebracht in het mitochondriale medicijnveld en wordt het nog steeds gebruikt om de pathogene rol van nieuwe mtDNA-mutaties vast te stellen. Bovendien wordt cybridetechnologie gebruikt om de mitochondriale bijdrage aan verschillende ziekten te onderzoeken, variërend van veel voorkomende neurodegeneratieve aandoeningen zoals Parkinson, Alzheimer en de Ziekte van Huntington 22,23,24,25,26, tot kanker en behandeling tegen kanker 27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd uitgevoerd in het Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), gefinancierd door de Mariani Foundation. VT is lid van het European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva - HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
- Gorman, G. S., et al.
- DiMauro, S., Davidzon, G.
- El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F.
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
- Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
- Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
- Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95 (2006).
- Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
- Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
- Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749 (2021).
- Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364 (2021).
- Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
- Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
- Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061 (2020).
- Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
- Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
- Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
- Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214 (2018).
- Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
- Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
- Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
- Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591 (2020).
- Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
- Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
- Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
- Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640 (2019).
