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Genetics

Célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

El presente protocolo describe un método de una sola célula para análisis epigenómicos iterativos utilizando una sola célula reutilizable. La célula única reutilizable permite el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula única y la validación estadística de los resultados.

Abstract

Los análisis actuales del epigenoma unicelular están diseñados para un solo uso. La célula se descarta después de un solo uso, evitando el análisis de múltiples marcas epigenéticas en una sola célula y requiriendo datos de otras células para distinguir la señal del ruido de fondo experimental en una sola célula. Este artículo describe un método para reutilizar la misma célula individual para análisis epigenómicos iterativos.

En este método experimental, las proteínas celulares se anclan primero a un polímero de poliacrilamida en lugar de entrecruzarlas a proteínas y ADN, aliviando el sesgo estructural. Este paso crítico permite repetir experimentos con la misma célula. A continuación, un cebador aleatorio con una secuencia de andamio para la ligadura de proximidad se recoce al ADN genómico, y la secuencia genómica se agrega al cebador por extensión utilizando una ADN polimerasa. Posteriormente, un anticuerpo contra un marcador epigenético y control IgG, cada uno marcado con diferentes sondas de ADN, se unen a los respectivos objetivos en la misma célula individual.

La ligadura de proximidad se induce entre el cebador aleatorio y el anticuerpo mediante la adición de un ADN conector con secuencias complementarias a la secuencia de andamio del cebador aleatorio y la sonda de anticuerpo-ADN. Este enfoque integra información de anticuerpos y secuencias genómicas cercanas en un solo producto de ADN de ligadura de proximidad. Al permitir experimentos repetidos con la misma célula única, este método permite un aumento en la densidad de datos de una célula rara y un análisis estadístico utilizando solo datos de IgG y anticuerpos de la misma célula. Las células individuales reutilizables preparadas por este método pueden almacenarse durante al menos unos meses y reutilizarse más tarde para ampliar la caracterización epigenética y aumentar la densidad de datos. Este método proporciona flexibilidad a los investigadores y sus proyectos.

Introduction

La tecnología unicelular está entrando en la era de la multiómica unicelular, que integra tecnologías ómicas unicelulares individuales1. Recientemente, la transcriptómica unicelular se ha combinado con métodos para detectar la accesibilidad a la cromatina (scNMT-seq2 y SHARE-seq3) o modificaciones de histonas (Paired-seq4 y Paired-Tag5). Más recientemente, la transcriptómica y la proteómica unicelular se integraron con la accesibilidad a la cromatina (DOGMA-seq6). Estos métodos utilizan el etiquetado basado en transposasa para detectar la accesibilidad de la cromatina o las modificaciones de histonas.

Los enfoques basados en transposasa escinden el ADN genómico y agregan un código de barras de ADN al final del fragmento de ADN genómico. Cada fragmento genómico escindido solo puede aceptar hasta dos códigos de barras de ADN (= una marca epigenética por sitio de escisión), y el ADN genómico en el sitio de escisión se pierde. Por lo tanto, los enfoques basados en la escisión tienen una compensación entre el número de marcas epigenéticas probadas y la densidad de la señal. Esto dificulta el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula. Para superar este problemase desarrolló un método epigenómico unicelular que no escinde el ADN genómico 7,8.

Además del problema derivado de la escisión mencionado anteriormente, los enfoques basados en la transposasa tienen otras limitaciones. En el análisis del epigenoma unicelular, es fundamental conocer la ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al ADN en el genoma. En los enfoques actuales, esto se logra mediante el uso de células individuales no fijadas y la retención de interacciones proteína-ADN y proteína-proteína. Sin embargo, esto genera un fuerte sesgo a las regiones de cromatina accesibles, incluso en el análisis de modificaciones de histonas 9. La ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al genoma en el genoma se puede preservar sin reticulación proteína-ADN y proteína-proteína, utilizando un andamio de poliacrilamida 7,8. Este enfoque reduce el sesgo estructural observado en los enfoques actuales que dependen de las interacciones proteína-ADN y proteína-proteína.

Los enfoques basados en transposasa pueden adquirir señales solo una vez de una sola célula. Por lo tanto, es difícil delinear el epigenoma completo de una sola célula debido a la caída de las señales. Las células individuales reutilizables se han desarrollado para superar las limitaciones actuales al permitir el análisis epigenómico iterativo en la misma célula individual.

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Protocol

NOTA: En la figura 1 se muestra una representación esquemática del método.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del flujo de trabajo del protocolo. Los pasos 7.2-13 se explican a través de representaciones esquemáticas. Cada fila indica un paso en el protocolo. Una proteína celular coloreada en verde es un nucleosoma humano generado en base a una estructura cristalina (PDB: 6M4G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Equilibrio de las columnas de desalinización

NOTA: Las columnas de centrifugado de desalinización están equilibradas como se describe en los pasos siguientes. Las columnas de desalinización equilibradas se utilizan en los pasos 2.1, 3.4 y 4.6.

  1. Retire el cierre inferior de una columna de desalinización (corte de 7 kDa, volumen de perlas de resina de 0,5 ml, consulte la Tabla de materiales) y afloje la tapa en la parte superior de la columna de desalinización.
  2. Coloque la columna en un tubo de baja unión de proteína de 1,5 ml (un tubo de recolección, consulte la Tabla de materiales) y centrifugar a 1.500 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente para eliminar la solución de almacenamiento en la columna.
    NOTA: Utilice una centrífuga de rotor oscilante para aplanar la parte superior del lecho de cuentas.
  3. Retire el flujo en el tubo de 1,5 ml y agregue 300 μL de tampón fosfato de NaCl/100 mM de 150 mM, pH 8,0 (ver Tabla 1), encima del lecho de resina.
  4. Centrifugar a 1.500 × g durante 1 min a temperatura ambiente y retirar el flujo en el tubo de recogida.
  5. Repita los pasos 1.3-1.4 tres veces más.
  6. Deseche el tampón del tubo de recolección y coloque la columna en un nuevo tubo de recolección.
  7. Utilice la columna de desalinización equilibrada de los pasos 2.1, 3.4 y 4.4.

2. Intercambio amortiguador de anticuerpos

NOTA: Elimine el glicerol, la arginina y la azida sódica de anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 y anti-Pol II10 (ver composición tampón que se muestra en la Tabla 1). Todos los siguientes procedimientos se realizan bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1 h

  1. Aplicar la solución de anticuerpos (100 μL, ver tabla 2) a una columna de desalinización equilibrada preparada después de la etapa 1.
  2. Centrifugar a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C y transferir el flujo desde el tubo de recolección a un tubo de baja unión de proteína de 1,5 ml.
  3. Mida la concentración de IgG usando absorbancia a 280 nm12 (use un espectrofotómetro de microvolumen).
  4. Transfiera la solución de anticuerpos a un casete de ultrafiltración (límite de peso molecular 100 kDa, 0,5 ml, consulte la tabla de materiales) y centrifugar a 12.000 × g durante 5 min a 4 °C.
  5. Mida la concentración de IgG utilizando la absorbancia a 280 nm.
  6. Repita los pasos 2.4-2.5 hasta que la concentración de IgG alcance 1 mg/ml.

3. Activación de anticuerpos

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2.5 h

  1. Disuelva 1 mg de succinimidil 6-hidrazinonicotinato acetona hidrazona (S-HyNic, consulte la Tabla de materiales) con 100 μL de N,N-dimetilformamida anhidra (DMF, consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El DMF es un disolvente orgánico inflamable y una potente toxina hepática absorbida a través de la piel. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  2. Añadir 0,6 μL de S-HyNic/DMF a 100 μL de la solución de anticuerpos (1 mg/ml en 150 mM NaCl/100 mM fosfato sódico, pH 8,0. Ver Tabla 2 para los anticuerpos utilizados y el control de IgG.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h (protegiendo de la luz).
  4. Aplicar 100 μL de anticuerpo reaccionado por S-HyNic en la parte superior de la columna de desalinización equilibrada (ver paso 1) y centrifugar a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C para recoger la muestra.
  5. Deseche la columna de desalinización después de su uso.
    NOTA: La estabilidad de los grupos HyNic en proteínas y otras biomoléculas varía. Se recomienda conjugar biomoléculas modificadas con HyNic inmediatamente.

4. Activación de la sonda de ADN

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2.5 h

  1. Disuelva una bolita de una sonda de ADN modificada con amina para anticuerpos o control IgG (sonda de anticuerpos, Tabla 3) con 20 μL de tampón de fosfato de sodio de 150 mM NaCl/100 mM, pH 8.0.
    NOTA: Busque un pellet/película delgada y transparente en la parte inferior del tubo. Aplicar el tampón directamente al pellet. Si el pellet no es visible, el pellet puede haberse desprendido y adherido a la pared o a la tapa. En este caso, centrifuga el tubo y busca un pellet en el fondo del tubo.
  2. Disuelva 1 mg de 4-formilbenzoato de succinimidil (S-4FB, consulte la Tabla de materiales) con 50 μL de DMF anhidro y agregue 10 μL de DMF a la sonda de anticuerpos disuelta.
  3. Añadir 4 μL de S-4FB/DMF preparado en el paso 4.2, mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 h (protegiendo de la luz).
  4. Aplique 34 μL de sonda de anticuerpos reaccionada por S-4FB en la parte superior de la columna de desalinización equilibrada (consulte el paso 1).
  5. Aplicar 15 μL de tampón fosfato sódico de 150 mM, pH 8,0, en la parte superior del lecho de gel después de que la muestra se haya absorbido completamente, y centrifugar a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C para recoger la sonda de anticuerpos modificada con S-4FB.
  6. Utilice el flujo para la conjugación posterior; medir la absorbancia a 260 nm; y calcular la tasa de recuperación de la sonda de anticuerpos.

5. Conjugación del anticuerpo modificado con S-HyNic y la sonda de anticuerpos modificados con S-4FB

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2 h

  1. Mezcle el anticuerpo modificado con S-HyNic y la sonda de anticuerpos modificada con S-4FB, y pipete la solución hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
  2. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente (protegiendo de la luz).
  3. Para apagar la reacción, agregue 478.8 μL de solución de enfriamiento y almacenamiento (ver Tabla 1).
  4. Transfiera la solución de anticuerpos conjugada con la sonda de anticuerpos a un casete de ultrafiltración (límite de peso molecular de 100 kDa).
  5. Centrifugar durante 5 min a 12.000 × g, 4 °C.
  6. Compruebe el volumen de la solución dentro del casete pipeteando.
  7. Repita los pasos 5.5-5.6 hasta que el volumen alcance los 100 μL y guárdelo a -20 °C.
    NOTA: La concentración de IgG se mide mediante el ELISA sándwich13,14,15 utilizando un estándar de IgG.

6. Preparación de perlas magnéticas de núcleo

NOTA: En este método, una sola célula se incrusta en una cuenta de acrilamida bicapa (ver Figura 2). El núcleo es una perla magnética de poliacrilamida. La capa externa es poliacrilamida sola. Las perlas magnéticas centrales se generan en esta sección. Esta sección no es esencial para el experimento. Tiempo: 3 h

Figure 2
Figura 2: Estructura de un cordón de poliacrilamida bicapa para visibilidad y fácil manejo en experimentos REpi-seq . (A) Nanopartículas magnéticas del paso 6.6 después de la centrifugación. Las nanopartículas magnéticas se modifican con acrilamida monomérica y se integran en el cordón magnético de poliacrilamida que se muestra en B. (B) Representación esquemática de una sola celda reutilizable con una perla magnética de poliacrilamida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Mezclar 50 μL de tampón de bicarbonato de sodio 1 M, pH 8,5, y 450 μL de solución de acrilamida al 40%.
    NOTA: La acrilamida es una neurotoxina. Use guantes, un protector ocular y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  2. Suspender 1 g de polvo de óxido de hierro funcionalizado con éster NHS (consulte la Tabla de materiales) en el tampón acrilamida/bicarbonato de sodio e incubar a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Debido a que las perlas de acrilamida son transparentes, puede ser difícil ver y manipular la posición de las perlas. La inclusión de un cordón de núcleo hecho de óxido de hierro mejora la visibilidad y facilita la manipulación porque la posición de las perlas se puede controlar con un imán. Sin embargo, si los usuarios están familiarizados con los experimentos REpi-seq, se puede omitir el uso de las perlas de poliacrilamida magnética central.
  3. Transfiera la suspensión de nanoperlas a 2 tubos (1,5 ml), centrifugar a 21.300 × g durante 1 h (use un rotor en ángulo) a 4 °C y retire el sobrenadante.
  4. Suspenda la suspensión inferior con 1 ml de acrilamida/bis-acrilamida al 40% (19:1, consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: La bis-acrilamida es una neurotoxina. Use guantes y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  5. Centrífuga a 21.300 × g durante 1 h (utilizar un rotor en ángulo) a 4 °C.
  6. Centrífuga a 5.000 × g durante 30 min (utilice un rotor de giro sin freno) a 4 °C.
  7. Retire el sobrenadante con una pipeta P1000 con aspiración a baja velocidad.
  8. Ajuste el volumen a 400 μL de acrilamida/bis-acrilamida al 40% (19:1, véase la Tabla de materiales).
  9. Añadir 25 μL de solución de persulfato de amonio al 10% (ver Tabla 1).
    NOTA: El persulfato de amonio es un agente oxidante fuerte. El polvo en el aire que contiene persulfato de amonio puede irritar los ojos, la nariz, la garganta, los pulmones y la piel al contacto. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  10. Para generar perlas de poliacrilamida magnética central, transfiera 0,5 μL de la suspensión de óxido de hierro modificada con acrilamida a un tubo de PCR.
  11. Añadir 50 μL de N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina/aceite mineral al 4% (TEMED, ver Tabla 1) e incubar durante la noche a temperatura ambiente.
    NOTA: TEMED es un disolvente inflamable. Trabaja bajo una capucha. No inhale. Manténgase alejado de llamas abiertas, superficies calientes y fuentes de ignición. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.

7. Modificación del grupo amino de proteínas celulares con acrilamida monómera

NOTA: REpi-seq fue diseñado para analizar el epigenoma de células de ratón y humanas a nivel de una sola célula. Cada paso debe optimizarse cuando se utiliza este método en células de especies distintas del ratón o el ser humano.

  1. Cosechando las células
    NOTA: Tiempo: 30 min
    1. Mida la concentración y viabilidad de la celda usando un contador de celdas (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La viabilidad de las celdas en este paso afecta a cuántas células son células vivas en el análisis de datos.
    2. Ajustar la concentración celular a 1 × 105 células/ml con medio de cultivo (*) que contenga un 10% de suero fetal bovino.
      NOTA: *El medio de cultivo es un medio de cultivo óptimo para las células de interés.
    3. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml.
    4. Centrifugar la suspensión celular a 240 × g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.
    5. Añadir 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), mezclar las células mediante un pipeteo suave y centrifugar la suspensión celular a 240 × g durante 5 min a 4 °C.
    6. Retire el sobrenadante.
      NOTA: Todos los pasos anteriores deben realizarse en una campana de limpieza de flujo laminar para evitar la contaminación.
  2. Modificación del grupo amino de proteínas celulares con acrilamida monomérica
    NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1.5 h
    1. Agregue 1 ml de solución de modificación de grupos amino (ver Tabla 1) a la gránula celular y suspenda la gránula celular con un pipeteo suave.
    2. Incubar el tubo en hielo durante 1 h y centrifugar la suspensión celular a 240 × g durante 5 min a 4 °C.
    3. Retire el sobrenadante y resuspenda las células con 100 ml de acrilamida/1 mM EDTA/PBS al 4% que contenga un colorante intercalador para el ADN (ver Tabla 1, 1 célula/μL).

8. Preparación de células individuales reutilizables

  1. Preparación de celdas individuales reutilizables (versión manual)
    NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 9 h/96 celdas
    1. Mezclar 1 ml de la suspensión celular (1 célula/μL) y 199 ml de 1 mM EDTA/PBS que contenga un colorante intercalador para ADN (ver Tabla 1).
    2. Transfiera 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de placas de fondo plano de 96 pocillos (total 10 placas, consulte la Tabla de materiales).
    3. Coloque la cubierta en la placa de 96 pocillos y escanee las 10 placas con un microscopio de barrido (consulte la Tabla de materiales) para identificar pozos que contengan una sola celda.
    4. Transfiera el contenido del pozo que contiene una sola célula a un tubo de PCR.
      1. Incline la placa (hacia el operador) y espere unos minutos hasta que la celda individual se haya hundido en el borde inferior del pozo.
      2. Coloque la punta de la pipeta en la esquina inferior y transfiera la célula individual y el tampón (aspirar 210 μL/pocillo = 200 μL de tampón + 10 μL de aire) a un tubo de PCR.
        NOTA: Asegúrese de utilizar una punta de baja retención P200.
      3. Verifique el pozo con un microscopio de fluorescencia para confirmar la transferencia.
      4. Si todavía hay una sola célula en el pozo, agregue 200 μL/pocillo de 1 mM EDTA/PBS que contenga un colorante intercalador para el ADN.
      5. Luego, repita la transferencia.
    5. Centrifugar el tubo de PCR a 240 × g durante 5 min a 4 °C utilizando un rotor de giro sin freno.
      NOTA: El frenado provoca un flujo arremolinado de agua en el tubo, lo que interrumpe la precipitación de la celda individual. Al centrifugar con un rotor oscilante sin freno, la celda única siempre se hundirá hasta el fondo del tubo. Sin embargo, si se utiliza un rotor en ángulo, la celda única se une a la pared lateral del tubo de PCR y podría perderse.
    6. Eliminar 195 μL del sobrenadante con una velocidad de pipeteo muy lenta.
    7. Añadir 195 μL/tubo de solución de acrilamida/bis-acrilamida/APS (ver tabla 1).
    8. Centrifugar el tubo de PCR a 240 × g durante 5 min a 4 °C utilizando un rotor de giro sin freno.
    9. Eliminar 195 μL del sobrenadante con una velocidad de pipeteo muy lenta.
    10. Transfiera los 3 μL inferiores al tubo de PCR que contiene un 4% de TEMED/aceite mineral y un cordón magnético de poliacrilamida (generado en el paso 6).
      NOTA: Asegúrese de utilizar una punta de baja retención P10. Dispense la celda cerca de la perla magnética de poliacrilamida. En el aceite mineral, el líquido que contiene la célula única se adhiere a la superficie del cordón de poliacrilamida magnética por tensión superficial.
    11. Incubar durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: Este proceso genera una perla de gel de acrilamida bicapa. El núcleo es una cuenta de gel magnética. La capa externa es un gel de poliacrilamida que contiene una sola célula. La célula individual está incrustada en la capa externa del gel. Punto de parada seguro: Después de lavar las células individuales reutilizables con 50% de glicerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% de tampón BSA/TBS, las células individuales reutilizables se pueden almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
  2. Preparación de celdas individuales reutilizables (versión semiautomatizada)
    NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 3 h/96 celdas
    1. Mezclar 1 ml de suspensión celular (1 célula/μL) y 199 ml de 1 mM EDTA/PBS que contenga un colorante intercalador para ADN (ver Tabla 1).
    2. Transfiera 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de nanopocillos de 4 nL (consulte la Figura 3 y la Tabla de materiales) y coloque la placa de nanopocillos de 4 nL en un robot automatizado de recolección de células individuales (consulte la Tabla de materiales).
    3. Coloque una placa de PCR de 96 pocillos como placa de destino en el robot automatizado de recolección de células individuales. Asegúrese de que cada pocillo contenga 200 μL/pocillo de solución de acrilamida/bis-acrilamida/APS (ver Tabla 1).
    4. Transfiera una sola célula de un nanopocillo de 4 nL a un pocillo de la placa de PCR de 96 pocillos (consulte el video suplementario S1).
    5. Coloque una tapa encima de la placa de PCR de 96 pocillos y centrifugar la placa de 96 pocillos a 240 × g durante 5 minutos a 4 °C utilizando un rotor de giro sin freno.
    6. Coloque la placa de PCR de 96 pocillos en la plataforma de un robot automático de manejo de líquidos (consulte la Tabla de materiales, Figura 4 y el Código suplementario 1).
    7. Arrastre y suelte el Código suplementario 1 en la ventana del software (consulte la Tabla de materiales) del robot de manipulación de líquidos.
    8. Ejecute el programa en el robot automático de manipulación de líquidos (consulte el vídeo suplementario S2 y el vídeo suplementario S3).
      1. Eliminar 195 μL del sobrenadante con una velocidad de pipeteo muy lenta.
      2. Añadir 50 μL de TEMED/aceite mineral al 4%.
        NOTA: Los pasos 8.2.8.1-8.2.8.2 se pueden realizar mediante pipeteo manual.
    9. Incubar durante la noche a temperatura ambiente (Figura 5). Punto de parada seguro: Después de lavar las células individuales reutilizables con 50% de glicerol/1 mM EDTA/0,05% de tween 20/0,5% de tampón BSA/TBS, guarde las células individuales reutilizables a -20 °C durante un máximo de 6 meses.

Figure 3
Figura 3: Selección automática de células individuales y transferencia a una placa de PCR de 96 pocillos en el paso 8.2 . (A) Descripción general de un sistema de recolección de células únicas. Un solo robot de recolección de células está en una campana de limpieza de flujo laminar para evitar la contaminación. (B) Una placa de 24 pocillos con 4 nL nanopocillos dentro del pozo. (C) Distribución de celdas en un pozo de la placa de 24 pocillos. Los puntos verdes son células identificadas como una sola célula en cada nanopocillo de 4 nL. Los puntos magenta son células identificadas como dobletes o multipletes de células. (D) Imagen de campo claro del pozo en la placa de 24 pocillos. Un cuadrado verde es un nanopozo de 4 nL que contiene una sola célula. Un cuadrado magenta es un nanopozo de 4 nL que contiene múltiples células. (E) Campo magnificado de unos nanopocillos de 4 nL. Los puntos brillantes son células individuales en nanopocillos de 4 nL. El sistema de selección de células individuales identifica nanopozos que contienen una sola célula mediante la adquisición de imágenes de campo claro y fluorescencia de células con tinción DAPI. Las células individuales identificadas se transfieren del nanopocillo de 4 nL a un pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Barras de escala = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Abreviatura = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Generación de celdas individuales reutilizables utilizando un robot de manejo de líquidos. (A) Una cubierta del robot de manejo de líquidos. La plataforma tiene 11 ranuras para bastidores de punta de pipeta (punta P300: ranuras 1-3, punta P20: ranuras 5-6), placa de 96 pocillos de pozo profundo de 2 ml (ranura 4), dos placas de PCR de 96 pocillos que contienen una sola celda por pocillo (ranuras 7 y 10) y dos placas de fondo plano de 96 pocillos para residuos líquidos (ranuras 8 y 11). (B) La cubierta después de colocar los artículos de laboratorio. (C) Representación esquemática del pipeteo robótico en el paso 8.8.1. El programa elimina el sobrenadante sin aspirar una sola célula de la parte inferior de la placa de PCR de 96 pocillos. (D) Celdas individuales reutilizables generadas utilizando el Código Suplementario 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9. Recocido y extensión aleatorios de cebador

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Los asteriscos (*) en los pasos siguientes indican que se puede utilizar un separador magnético para controlar la posición de las perlas de poliacrilamida que contienen una sola celda reutilizable en el tubo. Sin embargo, el uso del separador magnético no es esencial. Al bajar lentamente la punta de la pipeta a lo largo de la pared del tubo, las perlas se empujan hacia arriba para el lavado o el intercambio de tampón. Tiempo: 9 h

  1. Eliminar el aceite mineral por pipeteo (*) y lavar (*) 5 veces con 200 μL de tampón 1x TP Mg(-) (diluir 10x TP Mg(-) tampón a 1x tampón con agua ultrapura, ver Tabla 1).
  2. Retirar el sobrenadante (*) y añadir 15 μL de tampón recocido (véase la tabla 1).
  3. Incubar durante 1 h en hielo.
    NOTA: El propósito de esta incubación es permeabilizar las membranas plasmáticas y nucleares y entregar el cebador aleatorio al núcleo celular.
  4. Coloque los tubos de PCR en un termociclador y caliente a 94 °C durante 3 min.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 20 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  5. Transfiera los tubos a un bloque de metal refrigerado por hielo e incube durante 2 minutos.
  6. Añadir 4 μL de mezcla de MgSO4/NaCl/dNTP (ver Tabla 1) y mezclar con un mezclador de vórtice a velocidad media.
  7. Añadir 1 μL de Bst polimerasa, fragmento grande (ver la Tabla de materiales) y mezclar utilizando un mezclador de vórtice a velocidad media.
  8. Incubar durante 4 h en una agitadora (600 rpm a 4 °C).
    NOTA: El propósito de esta incubación es entregar la polimerasa Bst al núcleo celular.
  9. Coloque el tubo de PCR en un termociclador y ejecute uno de los siguientes programas.
    1. Ejecute un programa de 4 h: 10 °C durante 30 min, 20 °C durante 30 min y 25 °C durante 180 min.
    2. Alternativamente, ejecute un programa nocturno: 4 ° C durante 4 h, 10 ° C durante 2 h, 20 ° C durante 2 h, 25 ° C durante 4 h y mantener a 4 ° C.
      NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 25 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C. Punto de parada seguro: Detenga el experimento aquí hasta 1 día almacenando las celdas individuales reutilizables a 4 °C.

10. Unión de anticuerpos

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1.5 h

  1. Añadir 1,625 μL de solución de NaCl/EDTA/BSA (ver Tabla 1) y mezclar por vórtice a baja velocidad.
    NOTA: Este paso tiene como objetivo 1) facilitar la quelación de Mg2+ por EDTA, 2) estabilizar la unión del1er cebador aleatorio extendido por 300 mM NaCl, y 3) bloquear la unión inespecífica de anticuerpos utilizando albúmina sérica bovina (BSA) en la reacción posterior.
  2. Incubar durante 1 h en hielo y añadir 0,1 μg/ml de cada uno de anticuerpos y control de IgG conjugada con la sonda de anticuerpos (preparada en el paso 5).
  3. Incubar durante la noche en hielo con una suave agitación en una coctelera.

11. Ligadura de proximidad de la sonda de anticuerpos y cebador aleatorio extendido proximalmente

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Los asteriscos (*) en los pasos siguientes indican dónde se puede utilizar un separador magnético para controlar la posición de las perlas de poliacrilamida que contienen una sola celda reutilizable en el tubo. Sin embargo, el uso del separador magnético no es esencial. Al bajar lentamente la punta de la pipeta a lo largo de la pared del tubo, las perlas se pueden empujar hacia arriba para el lavado o el intercambio de tampón. Tiempo: 6 h

  1. Lavar (*) dos veces con 200 μL de 1x tampón TPM-T (20 min de incubación en cada lavado) sobre hielo. Diluir 10x TPM-T tampón (Tris-HCl/cloruro de potasio/sulfato de magnesio/Triton X-100) a 1x con agua ultrapura).
  2. Retire (*) el sobrenadante y lave (*) una vez con 1x tampón de ADN ligasa T4 (consulte la Tabla de materiales).
  3. Retire (*) el sobrenadante y añada 19 μL de solución adaptadora para ligaduras (ver Tabla 1).
  4. Incubar durante 1 h a 25 °C.
  5. Agregue 1 μL de ADN ligasa T4 (consulte la Tabla de materiales) y mezcle el tubo en un mezclador de vórtice a velocidad media.
  6. Coloque el tubo en un termociclador y ejecute el siguiente programa: programa de ligadura de proximidad, 4 h a 16 °C y 30 min a 25 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 25 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es la temperatura ambiente.
  7. Lavar (*) dos veces brevemente con 200 μL de 1x tampón Bst Mg(-) EDTA(+) (ver Tabla 1; preparar 1x tampón a partir de 10x tampón madre) y conservar la celda a 4 °C, durante toda la noche. Punto de parada seguro: Detenga el experimento aquí hasta 1 día almacenando las celdas individuales reutilizables a 4 °C.

12. Extensión completa del 1er cebador aleatorio

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 4.5 h

  1. Lavar dos veces con 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) tampón (ver Tabla 1, preparar 1x tampón de 10x tampón madre), quitar el sobrenadante y añadir 20 μL de mezcla Bst/dNTPs/MgSO4 (ver Tabla 1).
  2. Mezclar con un mezclador de vórtice a velocidad media e incubar durante 4 h en un agitador orbital (a 6 °C y 500 rpm).
  3. Coloque el tubo en un termociclador y ejecute el siguiente programa: programa de extensión completa: 10 °C durante 1 h, 20 °C durante 1 h, 30 °C durante 1 h, 40 °C durante 1 h, 50 °C durante 1 h, 65 °C durante 1 h, 94 °C durante 10 min, y mantener a 4 °C.
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener aquí hasta 1 día almacenando las celdas individuales reutilizables a 4 °C.

13. Amplificación de desplazamiento múltiple

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2.5 h (pasos 13.1-13.2) + 15 min (pasos 13.3-13.4) + 1 día (pasos 13.5-13.10)

  1. Añadir 0,4 μL de 100 μM2º cebador aleatorio (ver Tabla 3) y mezclar con un mezclador de vórtice a velocidad media.
  2. Incubar durante 2 h a 6 °C y 500 rpm en un agitador orbital, colocar el tubo en un termociclador y calentar a 94 °C durante 3 min.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 25,4 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  3. Coloque los tubos en un bloque de metal refrigerado por hielo y agregue 1 μL/tubo de ADN polimerasa Bst.
  4. Vortex a baja velocidad, coloque los tubos en un termociclador y ejecute el siguiente programa:
    4 °C durante 4 h, 10 °C durante 30 min, 20 °C durante 30 min, 30 °C durante 30 min, 40 °C durante 30 min, 50 °C durante 30 min, 65 °C durante 60 min, 94 °C durante 3 min, y mantener a 4 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 26,4 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C. Punto de parada seguro: Detenga el experimento aquí hasta 1 día almacenando las celdas individuales reutilizables a 4 °C.
  5. Recoja el sobrenadante (aproximadamente 20 μL) y transfiéralo a un tubo de PCR.
  6. Conservar el sobrenadante recogido a -80 °C.
  7. Añadir 20 μL/tubo de tampón Tween 20/0,1x TE al 0,05% a un tubo de PCR que contenga la célula individual reutilizable (ver Tabla 1) e incubar la célula individual reutilizable a 4 °C, durante la noche. Punto de parada seguro: Detenga el experimento aquí durante unos días extendiendo el tiempo de incubación.
  8. Recoger el sobrenadante y combinarlo con la muestra recogida en el paso 13.5.
  9. Repita los pasos 13.7-13.8 una vez más. Remoje la célula individual reutilizable en un tampón 50% de glicerol/5 mM EDTA/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS e incubarlo durante 30 min en un agitador orbital (4 °C, 600 rpm). Almacene la celda individual reutilizable a -20 °C hasta el siguiente experimento.
  10. Añadir 40 μL de mezcla Exo-master (ver Tabla 1) y colocar el tubo en un termociclador y ejecutar el siguiente programa: i) 95 °C durante 5 min, ii) 95 °C durante 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C durante 30 s, v) repetir los pasos ii-iv 19 veces, vi) 72 °C durante 5 min, vii) mantener a 4 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de aproximadamente 45 μL, incluido el volumen de la perla de poliacrilamida. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C. Punto de parada seguro: El experimento puede detenerse aquí durante al menos unos días almacenando la muestra a -80 °C.

14. Purificación de fenol-cloroformo y precipitación de polietilenglicol

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1.5 h

  1. Transfiera el producto a un tubo de baja unión de ADN de 0,5 ml y agregue 100 μL de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico.
    NOTA: Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílico causa irritación y posiblemente quemaduras por contacto. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Use solo con ventilación adecuada o use un respirador apropiado. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  2. Agitar durante 30 s a mano y centrifugar a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
  3. Recolectar la fase acuosa (80 μL) en un tubo de baja unión de ADN de 0,5 ml y añadir 40,84 μL/tubo de mezcla lineal de acrilamida/MgCl2 (ver Tabla 1).
  4. Añadir 47,06 μL/tubo de PEG8000 al 50% (p/v) (sin RNasa) y mezclar por pipeteo.
  5. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente y centrifugar a 240 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
  6. Retire el sobrenadante y agregue 400 μL/tubo de etanol al 80% (EtOH).
  7. Lave con EtOH al 80%, retire el sobrenadante con un aspirador y seque al aire el pellet.
  8. Suspender el pellet con 20 μL de 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, tampón pH 7.4, y almacenar la solución a -80 °C.
    NOTA: Mida la concentración de ADN utilizando un tinte intercalador específico de ADN bicatenario (consulte la Tabla de materiales). Punto de parada seguro: El experimento se puede detener aquí de forma segura durante al menos una semana.

15. Transcripción in vitro

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa y RNasa. Tiempo: 5 h

  1. Descongelar el ADN de productos derivados de una sola célula (a partir del paso 14) y preparar una biblioteca mixta de productos derivados de una sola célula mezclando 2 μL/célula de los productos de ADN (volumen total 20 μL).
  2. Añadir 26 μL de mezcla maestra de transcripción in vitro (véase la Tabla de materiales y el protocolo del fabricante) y mezclar por pipeteo.
  3. Colocar el tubo de PCR en un termociclador e incubar durante 4 h a 37 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de 46 μL. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  4. Agregue 5 μL de tampón 10x DNasa I (consulte la Tabla de materiales) y agregue 4 μL de DNasa I (libre de RNasa, 4 U, consulte la Tabla de materiales).
  5. Mezclar e incubar durante 15 min a 37 °C, y transferir la muestra a un tubo de 0,5 ml.
  6. Añadir 300 μL/tubo de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio (véase la tabla de materiales) y mezclar mediante un vórtice suave.
    NOTA: El tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio puede provocar quemaduras químicas graves por contacto. Use guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Use solo con ventilación adecuada o use un respirador apropiado. Siga las pautas de seguridad institucionales. Deseche los materiales de laboratorio usados de acuerdo con las directrices institucionales.
  7. Incubar durante 5 minutos en R.T. en un agitador y luego almacenar muestras a -80 °C durante un máximo de 3 días.
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener de forma segura aquí hasta por 3 días.

16. Purificación de ARN

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa y RNasa. Tiempo: 2 h

  1. Añadir 80 μL/tubo de cloroformo a la muestra del paso 15.7 y agitar vigorosamente el tubo a mano durante 15 s.
  2. Incubar durante 2-15 min a temperatura ambiente y centrifugar la muestra a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C.
  3. Recoger y transferir la fase acuosa de la muestra (~200 μL) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  4. Añadir 600 μL/tubo de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio y transferir la muestra a un tubo de 1,5 ml.
  5. Añadir 180 μL/tubo de cloroformo y agitar el tubo vigorosamente a mano durante 15 s.
  6. Centrifugar la muestra a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
  7. Recoger y transferir la fase acuosa de la muestra (~450 μL) a un tubo de 1,5 ml.
  8. Añadir 60 μL/tubo de acrilamida lineal (5 μg/μL) y añadir 400 μL/tubo de isopropanol al 100% a la fase acuosa.
  9. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 10 min y centrifugarlo a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
  10. Retire el sobrenadante con cuidado.
  11. Lave el pellet de ARN 3 veces con 200 μL de etanol al 75% (agua libre de EtOH/RNasa), retire el sobrenadante y seque al aire el pellet de ARN.
    NOTA: No permita que el ARN se seque completamente porque el pellet puede perder solubilidad.
  12. Resuspender el pellet de ARN en 20 μL de agua libre de RNasa que contenga un inhibidor de la ARNasa (1 μL/20 μL) y disolver el pellet por pipeteo.
  13. Mida la absorbancia a 260 nm.

17. Transcripción inversa

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 1 h

  1. Añadir 7 μL/tubo de cebador de transcripción inversa + mezcla de dNTP (ver Tabla 1 y Tabla 3) y colocar los tubos en un termociclador.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de 27 μL. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  2. Calentar a 65 °C durante 5 min y colocar los tubos sobre hielo durante al menos 1 min.
  3. Añadir 14 μL/tubo de mezcla maestra de transcriptasa inversa (ver Tabla 1) y mezclar por pipeteo.
  4. Colocar los tubos en un termociclador e incubarlos a 55 °C durante 10 min y luego a 80 °C durante 10 min.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de 60 μL. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.

18. Síntesis de la segunda cadena

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 2.5 h

  1. Añadir 40 μL/tubo de agua ultrapura y dividir la solución de 100 μL en dos tubos de PCR de 0,2 ml (50 μL/tubo).
  2. Añadir 60 μL/tubo de mezcla de síntesis de segunda hebra (ver Tabla 1) y colocar los tubos en un termociclador y ejecutar el siguiente programa: i) 95 °C durante 5 min, ii) 95 °C durante 30 s, iii) 60 °C durante 30 s, iv) 72 °C durante 30 s, v) repetir los pasos ii-iv 20 veces, y vi) mantener a 4 °C.
    NOTA: El tamaño del tubo es de 0,2 ml. El volumen de la solución es de 110 μL. La temperatura de la tapa del termociclador es de 105 °C.
  3. Añadir 4,4 μL/tubo de EDTA 0,5 M (20 mM finales) y conservar a -80 °C, durante toda la noche.
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener de forma segura aquí hasta por unos pocos días.
  4. Purificar el ADN mediante purificación de fenol-cloroformo y precipitación de polietilenglicol (descrito en el paso 14).
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener de forma segura aquí durante al menos una semana.

19. Digestión de enzimas de restricción y selección de tamaño

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza bajo una campana limpia para evitar la contaminación por DNasa. Tiempo: 3 h (pasos 19.1-19.7)

  1. Mida la concentración de ADN del ADN purificado (a partir del paso 18.4) midiendo la absorbancia a 260 nm.
  2. Transfiera 6 μg de ADN a un tubo de PCR, agregue 30 μL de tampón de digestión 10x y ajuste el volumen a 294 μL con agua ultrapura.
  3. Añadir 6 μL de enzima de restricción BciVI e incubar a 37 °C durante 1 h.
  4. Realizar precipitación de EtOH con poliacrilamida lineal.
    1. Añadir 60 μL/tubo de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y añadir a continuación 40 μL/tubo de acrilamida lineal (5 mg/ml, ver la tabla de materiales).
    2. Añadir 400 μL/tubo de EtOH e incubar durante la noche a -20 °C.
      NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener aquí de forma segura por un día.
    3. Centrifugar 12.000 × g durante 10 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.
    4. Lave el pellet dos veces con 80% de EtOH y séquelo.
    5. Disuelva el pellet con 20 μL de tampón 1xTE y agregue 4 μL/tubo de tampón de carga de gel 6x fresco.
  5. Cargue la muestra en un gel de agarosa al 5% / tampón TAE 0.5x y realice la electroforesis (50 V durante 40 min).
  6. Corte y recoja el gel a más de 50 pb (ver Figura 6) y extraiga el ADN usando un kit de extracción en gel.
    NOTA: Punto de parada seguro: El experimento se puede detener de forma segura aquí durante al menos una semana.
  7. Construir la biblioteca de secuenciación utilizando un kit de preparación de bibliotecas de ADN (ver la Tabla de Materiales)16,17.

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Representative Results

Las celdas individuales K562 se generaron utilizando el protocolo descrito en el paso 8 (consulte la figura 5). Las células individuales se incrustaron en la capa externa de la perla de poliacrilamida. El ADN celular se tiñó y visualizó utilizando un tinte intercalador para la tinción del ADN.

Figure 5
Figura 5: Células individuales reutilizables generadas. Las células se tiñen con un tinte intercalador para el ADN (fluorescencia verde). Las flechas blancas indican celdas individuales incrustadas en la capa externa de perlas de poliacrilamida. La celda individual reutilizable se coloca en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Las imágenes fueron tomadas por un microscopio de barrido, BZ-X710. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados mostrados en la Figura 6 apoyaron la generación de los productos de ADN deseados. Los productos de ADN del paso 19.7 fueron escindidos por la enzima de restricción BciVI en fragmentos de 19-20 pb, 31-32 pb, 49 pb y >49 pb. Estos resultados apoyaron la conclusión de que la mayoría de los productos contienen secuencias derivadas de la sonda de anticuerpos y secuencias derivadas del2º cebador aleatorio. Los productos de ADN se ligaron posteriormente con el adaptador Illumina utilizando un kit TruSeq Nano y se secuenciaron utilizando un secuenciador Illumina NovaSeq6000.

Figure 6
Figura 6: Productos de ADN antes y después de la digestión de la enzima de restricción BciVI. (A) La digestión BciVI generó los fragmentos esperados de 19-20 pb, 31-32 pb y los productos deseados (>49 pb) que contienen código de barras de anticuerpos, secuencia ligada, ADN genómico y código de barras celular. (B) Distribución por tamaños de los productos finales al final de la etapa 19.7. La biblioteca de ADN construida se analizó mediante electroforesis capilar. La línea rosa claro indica los productos deseados que contienen adaptadores de secuenciación, código de barras de anticuerpos y código de barras celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados de la secuenciación indicaron que los productos generados siguiendo los pasos 7-19 contienen la sonda de anticuerpos, la secuencia ligada, la secuencia del genoma y el código de barras celular. Las lecturas mapeadas únicas de anti-H3K27ac y anti-H3K27me3 fueron significativamente más numerosas que las de IgG de control (ver Figura 7A). Esto indica que la unión específica de anti-H3K27ac y anti-H3K27me3 aumenta el número de productos deseados. La tecnología más avanzada para el análisis del epigenoma unicelular, Paired-Tag, adquiere alrededor de 2.000 lecturas únicas de H3K27ac y 1.500 lecturas únicas de H3K27me3 por núcleo. Nuestros resultados mostraron un número mucho mayor de lecturas únicas (promedio de 699,398 señales H3K27ac / celda y 505,433 señales H3K27me3 / célula). Los resultados también apoyaron la conclusión de que los experimentos repetidos utilizando la misma célula individual reutilizable reducen la pérdida de señal y aumentan la densidad de la señal.

Las señales REpi-seq que se muestran en la Figura 7A se evaluaron comparando los datos de REpi-seq con datos ChIP-seq masivos. En la Figura 7B, en promedio, el 91% ± el 3,24% de las señales H3K27ac de REpi-seq se superpusieron con los picos H3K27ac en ChIP-seq a granel. Este análisis mide el nivel de "precisión" en el análisis del epigenoma unicelular18. La precisión de los métodos epigenómicos unicelulares actuales para la marca de histona activa H3K4me3 es del 53% (Drop-ChIP; H3K4me3)18, 50% (scChIC-seq; H3K4me3)19, y 60% (ACT-seq; H3K4me3)20. Además, la precisión de REpi-seq para la marca de histonas inactivas H3K27me3 fue, en promedio, 52.09% ± 3.71% (Figura 7C), mientras que la precisión para H3K27me3 fue 47% en ChIC-seq19 de una sola célula. En conclusión, REpi-seq muestra una alta precisión en la detección de H3K27ac y H3K27me3.

También analizamos la "sensibilidad"18 de REpi-seq, que mide cuántos picos de ChIP-seq masivo fueron detectados por las lecturas reproducidas de REpi-seq (Figura 7D,E). La sensibilidad de REpi-seq fue del 55,30% en H3K27ac y del 50,94% en H3K27me3. En otros métodos de epigenoma unicelular, la sensibilidad es del 5% en Drop-ChIP (H3K4me3)18, del 5% en ACT-seq (H3K4me3)20 y del 9,5% en scChIC-seq (H3K27me3)19. Estos resultados indican que REpi-seq es sensible en la detección de señales epigenéticas.

Figure 7
Figura 7: Números de señal, precisión y sensibilidad en REpi-seq. Los mismos experimentos se repitieron 3 veces con la misma celda individual reutilizable (una célula K562). (A) Señales adquiridas de las mismas ocho celdas individuales. Cada punto representa una sola celda reutilizable. Se contaron las señales únicas de control IgG (negro), anti-H3K27me3 (azul) y anti-H3K27ac (rojo) en las mismas celdas individuales. Las señales anti-H3K27me3 y anti-H3K27ac fueron significativamente más altas que la IgG de control, lo que indica que la unión específica de anticuerpos genera señales de manera más eficiente que la IgG de control. Bar: media, barra de error: desviación estándar. (B, C) Precisión de lecturas únicas REpi-seq H3K27ac (B) y H3K27me3 (C). La precisión de las lecturas únicas derivadas de REpi-seq se basó en la superposición con picos ChIP-seq conocidos del análisis de celdas masivas K562 (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). Los porcentajes de lecturas REpi-seq H3K27ac y H3K27me3 confirmados por los picos ChIP-seq se calcularon en cada celda individual. Los resultados se expresan como el porcentaje promedio de 8 células individuales. (D, E) Sensibilidad de REpi-seq en la detección de picos conocidos H3K27ac (D) y H3K27me3 (E). Se utilizaron lecturas únicas de REpi-seq. Picos H3K27ac y H3K27me3 identificados por ChIP-seq de células a granel K562 en el Proyecto ECODE (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) fueron reconocidos por lecturas únicas REpi-seq. Los resultados se expresan como el porcentaje promedio de picos ChIP-seq reconocidos por las lecturas únicas de REpi-seq. Los paneles B-E fueron reproducidos de Ohnuki et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Buffers utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Control de anticuerpos e IgG utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: ADN oligonucleótido utilizado en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Video complementario S1: Selección automatizada de una sola célula y transferencia a una placa de PCR de 96 pocillos (paso 8.2.4). Haga clic aquí para descargar este video.

Video suplementario S2: Extracción de sobrenadante de un pozo que contiene una sola celda utilizando un robot de manejo de líquidos (paso 8.2.8.1). Haga clic aquí para descargar este video.

Video suplementario S3: Adición de un 4% de TEMED/aceite mineral a un pocillo que contiene una sola celda utilizando un robot de manejo de líquidos (paso 8.2.8.2). Haga clic aquí para descargar este video.

Código suplementario 1: Programa automatizado del robot de manipulación de líquidos de los pasos 8.2.8.1-8.2.8.2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este artículo describe el protocolo paso a paso para el análisis multiepigenómico unicelular recientemente reportado utilizando células individuales reutilizables7. En los párrafos siguientes, discutimos puntos críticos, enfatizando las posibles limitaciones en el protocolo.

Uno de los puntos críticos a lo largo del protocolo (de los pasos 7.2-13) es evitar la contaminación por DNasa. Una sola célula solo tiene dos copias de ADN genómico. Por lo tanto, el ADN genómico dañino reduce críticamente el número de señales. Evitar la contaminación con DNasa es esencial para proteger la integridad del ADN genómico.

La permeabilidad de los reactivos a través de la membrana celular / pared celular también es crítica en todo el protocolo. REpi-seq fue diseñado para analizar el epigenoma de células de ratón y humanas a nivel de una sola célula. Se espera que las condiciones óptimas para este método experimental varíen dependiendo de la permeabilidad de los tipos de células y la membrana nuclear a cada reactivo. Por lo tanto, cuando el método se aplica a células distintas de las células de ratón y humanas, como células vegetales, levaduras y bacterias, las condiciones en cada paso necesitan optimización.

Creemos que un punto crítico específico del paso 9.5 (recocido del primer cebador aleatorio) es la rápida velocidad de enfriamiento después de desnaturalizar el ADN genómico. El enfriamiento lento y gradual después de la desnaturalización puede reducir la eficiencia de recocido de los cebadores aleatorios que se unen al ADN genómico. Además, en el paso 11 (ligadura de proximidad), un punto crítico es la composición del tampón. Los tampones que contienen polietilenglicol (PEG) son ampliamente utilizados para métodos de ligadura más rápidos en aplicaciones de biología molecular. Una baja concentración de PEG (por ejemplo, <7,5%) promueve la formación rápida de ADN bicatenario sin precipitación de ADN. Sin embargo, observamos que el tampón de ligadura que contiene PEG induce la contracción del cordón de gel unicelular que contiene la célula única (célula única reutilizable), lo que sugiere que el tamaño de malla del andamio de poliacrilamida se había reducido. Como esta contracción puede causar una accesibilidad reducida de la ligasa de ADN T4, decidimos no usar el protocolo de ligadura más rápido para REpi-seq.

En REpi-seq, los resultados pueden evaluarse mediante la frecuencia de redetección de señales en las mismas células individuales. La frecuencia de redetección es útil para monitorear las reacciones, incluida la ligadura de proximidad con la sonda de anticuerpos y el primer cebador aleatorio. Anteriormente informamos7 que el 62.03% de las lecturas de H3K27ac en un experimento se confirmó en dos experimentos replicados, lo que sugiere que la eficiencia de la ligadura de proximidad en experimentos individuales es mayor que el porcentaje general de redetección en experimentos repetidos.

También hemos informado previamente7 la detección exitosa de la ARN polimerasa II (Pol II) que se une al ADN en células individuales reutilizables. La unión a Pol II es difícil de capturar con los métodos actuales de epigenoma unicelular debido a la naturaleza temporal e inestable de esta unión.

Los enfoques actuales de CUT & Tag basados en transposasa para el análisis del epigenoma unicelular requieren la preservación de la interacción nucleosoma-ADN. Un anticuerpo específico se une a una modificación de histonas; luego, la transposasa unida al anticuerpo escinde el ADN genómico e inserta un código de barras de ADN en el sitio de escisión del ADN. Esta reacción depende de la interacción nucleosoma (histona)-ADN. Por lo tanto, es esencial que las interacciones nucleosoma-ADN y la estructura de las proteínas celulares y la cromatina permanezcan intactas. Por lo tanto, los enfoques CUT&Tag están inevitablemente sesgados a las regiones accesibles de la estructura de la cromatina en el análisis de las modificaciones de histonas.

El inevitable sesgo hacia las regiones de cromatina accesibles dificulta el aumento del número de señales epigenéticas en el análisis del epigenoma unicelular. Las estructuras de cromatina están formadas por múltiples tipos de interacciones moleculares, incluidas las interacciones ADN-nucleosoma y nucleosoma-nucleosoma a través de proteínas asociadas a nucleosomas. Por lo tanto, optamos por no preservar las interacciones ADN-proteína y proteína-proteína en las células individuales reutilizables mientras preservamos la ubicación de las proteínas celulares. Esta característica se logra con el uso de acrilamida monomérica y una mezcla de paraformaldehído (paso 7 del protocolo), que modifica el grupo amino en las proteínas celulares en lugar de entrecruzar proteína a proteína o proteína a ADN.

La ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al genoma se retiene mediante la conexión al polímero de poliacrilamida. Los nucleosomas se desnaturalizan alrededor de 71-74 °C21. Por lo tanto, en la célula única reutilizable, las histonas probablemente se desnaturalizan y se relajan / disocian entre sí después del paso de recocido del1er cebador aleatorio (94 ° C). Esto puede relajar la estructura de la heterocromatina y mejorar la accesibilidad de los anticuerpos y otras moléculas a las regiones de heterocromatina. Esta conclusión está respaldada por nuestros resultados reportados7 que muestran que el sesgo asociado con la estructura de la cromatina se reduce en células individuales reutilizables en comparación con los enfoques CUT&Tag9.

La conexión de la histona H3 a la poliacrilamida se mantiene después de al menos 3 rondas de desnaturalización por calor, ya que la ubicación de las histonas en la célula individual reutilizable se conserva durante experimentos repetidos7. Esta característica permite la repetición del mismo experimento utilizando la misma celda única. Los experimentos repetidos contribuyen a aumentar el número de señales de una sola célula en comparación con los enfoques CUT&Tag.

La verificabilidad es un principio fundamental en la ciencia. Sin embargo, verificar los resultados experimentales de una sola célula no es factible en los enfoques CUT&Tag, ya que no es posible repetir experimentos con las mismas células. El ADN genómico es escindido por transposasa y recibe el código de barras de ADN para una marca epigenética. El ADN genómico escindido se libera de su ubicación original. Por lo tanto, el enfoque CUT&Tag está en desventaja para el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula individual. Esta característica de los métodos CUT&Tag subyace a la compensación de la disminución de la densidad de señal con un mayor número de marcas epigenéticas por célula individual.

Para evitar este problema, copiamos el ADN genómico en lugar de cortar el genoma y luego etiquetamos el ADN genómico copiado con una sonda de ADN de anticuerpos. REpi-seq permite el análisis de las mismas células individuales y aumenta la densidad de la señal. También proporciona un medio para la verificabilidad de los resultados experimentales, la multiplexación del análisis epigenómico y la resolución del problema de compensación en los enfoques CUT & Tag. Aunque el método supera las limitaciones del análisis epigenómico basado en transposasa, todavía no es capaz de analizar un gran número de células a nivel de una sola célula. Se necesita un mayor desarrollo.

En conclusión, REpi-seq copia el ADN genómico en lugar de cortar el genoma y luego etiqueta el ADN genómico copiado con una sonda de ADN de anticuerpos. REpi-seq todavía está en la infancia y necesita aumentar el rendimiento de las células. Sin embargo, REpi-seq tiene fortalezas, que superan las limitaciones en los métodos actuales de epigenoma unicelular: 1) aumentar la densidad de la señal al reducir las caídas de señales a través de experimentos repetidos en las mismas células individuales; 2) reducir el sesgo estructural mediante la reducción de regiones inaccesibles basadas en la estructura de la cromatina; 3) proporcionar verificabilidad de los resultados experimentales mediante experimentos repetidos en la misma célula, 4) identificación de señales basada en la probabilidad de redetección de la misma señal en cada célula; 5) analizar múltiples marcas epigenéticas en la misma célula sin competencia entre marcas epigenéticas. Estos avances permiten analizar los mecanismos epigenéticos en una sola célula, lo cual es una aplicación importante y no factible con los otros métodos epigenómicos unicelulares.

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Disclosures

Ohnuki y Tosato son coinventores de una patente titulada "Métodos para preparar una sola célula reutilizable y métodos para analizar el epigenoma, el transcriptoma y el genoma de una sola célula" (EP3619307 y US20200102604). La solicitud de patente se presentó en parte sobre la base de los resultados preliminares relacionados con la tecnología descrita en el manuscrito actual. La invención o invenciones descritas y reivindicadas en esta solicitud de patente se realizaron mientras los inventores eran empleados a tiempo completo del Gobierno de los Estados Unidos. Por lo tanto, bajo 45 Código de Regulaciones Federales Parte 7, todos los derechos, títulos e intereses de esta solicitud de patente han sido o deben ser asignados por ley al Gobierno de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos transfiere una parte de las regalías que recibe a sus empleados inventores en virtud del artículo 3710c del Código de los Estados Unidos.

Acknowledgments

Agradecemos a los doctores David Sánchez-Martin y Christopher B. Buck por sus comentarios durante la etapa de conceptualización del proyecto. También agradecemos al Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health por su ayuda en experimentos preliminares, y al Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH por su asesoramiento en análisis computacional. Anna Word por ayudar con la optimización de las ADN polimerasas utilizadas en el método. Este trabajo utilizó los recursos computacionales del clúster Biowulf (http://hpc.nih.gov) de NIHHPC. Este proyecto es apoyado por el Programa Intramuros del Centro de Investigación del Cáncer, el Instituto Nacional del Cáncer, los Institutos Nacionales de Salud, el Premio a la Innovación del Director del NCI (#397172) y fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer bajo el Contrato No. HHSN261200800001E. Agradecemos a los doctores Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy y a todos los miembros del Laboratorio de Oncología Celular por sus comentarios productivos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

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References

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Retractación Número 180
Célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos
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Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

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