El presente protocolo describe un método de una sola célula para análisis epigenómicos iterativos utilizando una sola célula reutilizable. La célula única reutilizable permite el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula única y la validación estadística de los resultados.
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Artículo de método
Célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los análisis actuales del epigenoma unicelular están diseñados para un solo uso. La célula se descarta después de un solo uso, evitando el análisis de múltiples marcas epigenéticas en una sola célula y requiriendo datos de otras células para distinguir la señal del ruido de fondo experimental en una sola célula. Este artículo describe un método para reutilizar la misma célula individual para análisis epigenómicos iterativos.
En este método experimental, las proteínas celulares se anclan primero a un polímero de poliacrilamida en lugar de entrecruzarlas a proteínas y ADN, aliviando el sesgo estructural. Este paso crítico permite repetir experimentos con la misma célula. A continuación, un cebador aleatorio con una secuencia de andamio para la ligadura de proximidad se recoce al ADN genómico, y la secuencia genómica se agrega al cebador por extensión utilizando una ADN polimerasa. Posteriormente, un anticuerpo contra un marcador epigenético y control IgG, cada uno marcado con diferentes sondas de ADN, se unen a los respectivos objetivos en la misma célula individual.
La ligadura de proximidad se induce entre el cebador aleatorio y el anticuerpo mediante la adición de un ADN conector con secuencias complementarias a la secuencia de andamio del cebador aleatorio y la sonda de anticuerpo-ADN. Este enfoque integra información de anticuerpos y secuencias genómicas cercanas en un solo producto de ADN de ligadura de proximidad. Al permitir experimentos repetidos con la misma célula única, este método permite un aumento en la densidad de datos de una célula rara y un análisis estadístico utilizando solo datos de IgG y anticuerpos de la misma célula. Las células individuales reutilizables preparadas por este método pueden almacenarse durante al menos unos meses y reutilizarse más tarde para ampliar la caracterización epigenética y aumentar la densidad de datos. Este método proporciona flexibilidad a los investigadores y sus proyectos.
Introducción
La tecnología unicelular está entrando en la era de la multiómica unicelular, que integra tecnologías ómicas unicelulares individuales1. Recientemente, la transcriptómica unicelular se ha combinado con métodos para detectar la accesibilidad a la cromatina (scNMT-seq2 y SHARE-seq3) o modificaciones de histonas (Paired-seq4 y Paired-Tag5). Más recientemente, la transcriptómica y la proteómica unicelular se integraron con la accesibilidad a la cromatina (DOGMA-seq6). Estos métodos utilizan el etiquetado basado en transposasa para....
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Protocolo
NOTA: En la figura 1 se muestra una representación esquemática del método.
Figura 1: Representación esquemática del flujo de trabajo del protocolo. Los pasos 7.2-13 se explican a través de representaciones esquemáticas. Cada fila indica un paso en el protocolo. Una proteína celular coloreada en verde es un nucleosoma humano generado en base a una estructura cristalina (PDB: 6M4G).
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Resultados
Las celdas individuales K562 se generaron utilizando el protocolo descrito en el paso 8 (consulte la figura 5). Las células individuales se incrustaron en la capa externa de la perla de poliacrilamida. El ADN celular se tiñó y visualizó utilizando un tinte intercalador para la tinción del ADN.
Figura 5: Células.......
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Discusión
Este artículo describe el protocolo paso a paso para el análisis multiepigenómico unicelular recientemente reportado utilizando células individuales reutilizables7. En los párrafos siguientes, discutimos puntos críticos, enfatizando las posibles limitaciones en el protocolo.
Uno de los puntos críticos a lo largo del protocolo (de los pasos 7.2-13) es evitar la contaminación por DNasa. Una sola célula solo tiene dos copias de ADN genómico. Por lo tanto, el ADN genómico .......
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Divulgaciones
Ohnuki y Tosato son coinventores de una patente titulada "Métodos para preparar una sola célula reutilizable y métodos para analizar el epigenoma, el transcriptoma y el genoma de una sola célula" (EP3619307 y US20200102604). La solicitud de patente se presentó en parte sobre la base de los resultados preliminares relacionados con la tecnología descrita en el manuscrito actual. La invención o invenciones descritas y reivindicadas en esta solicitud de patente se realizaron mientras los inventores eran empleados a tiempo completo del Gobierno de los Estados Unidos. Por lo tanto, bajo 45 Código de Regulaciones Federales Parte 7, todos los derechos, títulos e intereses de esta solicitud de patente han sido o deben ser asignados por ley al Gobierno de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos transfiere una parte de las regalías que recibe a sus empleados inventores en virtud del artículo 3710c del Código de los Estados Unidos.
Agradecimientos
Agradecemos a los doctores David Sánchez-Martin y Christopher B. Buck por sus comentarios durante la etapa de conceptualización del proyecto. También agradecemos al Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health por su ayuda en experimentos preliminares, y al Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH por su asesoramiento en análisis computacional. Anna Word por ayudar con la optimización de las ADN polimerasas utilizadas en el método. Este trabajo utilizó los recursos computacionales del clúster Biowulf (http://hpc.nih.gov) de NIHHPC. Este proyecto es apoyado por el Programa Intramuros del Centro de Inves....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x Tampón CutSmart | New England BioLabs | B6004 | 10x Tampón de digestión |
| Etanol de 200 grados | Warner-Graham Company | Anticuerpo | |
| monoclonal de etanol 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) de etanol de 200 pruebas [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Tinción de naranja/yoduro de propidina | Logos | Biosystems F23001 | Contador de células |
| Solución de acrilamida, 40% en H2O, para biología molecular | MilliporeSigma | 01697-500ML | Solución de acrilamida al 40% |
| Microscopio de fluorescencia todo en uno BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Microscopio de barrido |
| Amicon Ultra-0.5 Unidad de filtro centrífugo | MilliporeSigma | UFC510024 | Casete de ultrafiltración |
| Persulfato de amonio para biología | molecularMilliporeSigma | A3678-100G | Polvo de persulfato de amonio |
| DMF anhidro | Laboratorios | S-4001-005 | N,N-dimetilformamida anhidra (DMF) |
| Anti-ARN polimerasa II CTD repetición YSPTSPS (fosfo S5) anticuerpo [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457) | anticuerpo Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Solución de albúmina sérica bovina, 20 mg/ml en H2O, baja biocarga, sin proteasa, para biología molecular | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Tabla 7) |
| Bst ADN polimerasa, fragmento grande | New England BioLabs | M0275L | Bst ADN polimerasa |
| BT10 Serie 10 y micro; l Punta de barrera | NEPTUNE | BT10 | P10 punta de baja retención |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Robot automatizado de selección de una sola célula |
| CellCelector 4 nl placas de nanopocillos para clonación de una sola célula, placa S200-100 100K, 24 pocillos,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL placa de nanopocillos |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar de 96 pocillos, tratado con cultivo celular, microplaca de fondo plano | Corning | 3596 | Placas de fondo plano de 96 pocillos |
| Deep Vent (exo-) ADN polimerasa | New England BioLabs | M0259L | Exo- ADN polimerasa |
| Tubos LoBind de ADN, 0,5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0,5 mL Tubo de baja unión |
| ADN Oligo, 1ª cebadora aleatoria | Tecnologías de ADN integradas | N/ A, ver Tabla 3 | 1º cebador aleatorio |
| ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#04 | Tecnologías de ADN integradas | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#05 | Tecnologías de ADN integradas | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#06 | Tecnologías de ADN integradas | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| DNA Oligo, 2º cebador aleatorio Cell#10 | Tecnologías de ADN Integradas | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#11 | Tecnologías de ADN integradas | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| ADN Oligo, 2º cebador aleatorio Célula#12 | Tecnologías de ADN integradas | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador aleatorio |
| ADN Oligo, 2º cebador de síntesis | Tecnologías de ADN integradas | N/A, ver Tabla 3 | 2º cebador |
| de síntesisDNA Oligo, Adaptador de Ligadura | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | Adaptador de Ligadura |
| DNA Oligo, Clonación Inversa Integrated | DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | Clonación Inversa Imprimación |
| DNasa I (sin RNasa) | New England BioLabs | M0303L | DNasa I (sin RNasa, 4 U). |
| Tampón de reacción de DNasa I | New England BioLabs | B0303S | 10x Tampón de DNasa I (NEB) |
| Mezcla dNTP (10 mM cada uno) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Suero fetal bovino, origen de EE. UU., | MilliporeSigma | F4135-500ML | Suero fetal bovino |
| HiScribe T7 Kit de síntesis de ARN de alto rendimiento | New England BioLabs | E2040S | Mezcla maestra de transcripción in vitro |
| Anticuerpo de histona H3K27ac | Motivo activo | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Anticuerpo de histona H3K27me3 | Motivo activo | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG de suero de conejo | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG Nanopolvo |
| magnético de óxido de hierro (II,III), tamaño medio de la pieza de 30 nm (TEM), éster NHS funcionalizado | MilliporeSigma | 747467-1G | Polvo de óxido de hierro funcionalizado con éster NHS de 30 nm |
| K-562 | Colección de cultivos tipo americano (ATCC) | Células CCL-243 | |
| Acrilamida lineal (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Acrilamida lineal |
| LUNA-FL Contador de células de fluorescencia dual | Logos | Biosystems L20001 | Contador |
| de células LUNA Portaobjetos de recuento de células, 50 portaobjetos Logos | Biosystems | L12001 | Contador de células |
| Aceite mineral, BioReactivo, para biología molecular, aceite ligero | MilliporeSigma | M5904-500ML | Aceite mineral |
| N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiamina para biología molecular | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiamina |
| NaCl (5 M), sin RNasa | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | espectrofotómetro de microvolumen |
| NEST 2 mL Placa de pocillos profundos de 96 pocillos, | Opentrons | N/A | 2 mL de pocillo profundo Placa de 96 |
| pocillos sin faldón Placa de PCR de 96 pocillos | Genesee Scientific | 27-405 | Placa de PCR de 96 pocillos |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | |
| Acrilamida OmniPur de Agarose: Bis-acrilamida 19:1, solución al 40% | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrilamida/Bis-acrilamida |
| Robot de laboratorio OT-2 | Opentrons | OT2 | Robot automatizado de manipulación de líquidos |
| Paraformaldehído, grado EM, purificado, solución acuosa al 20% | Microscopía electrónica Ciencias 15713 | 20% Pararmadrenehído | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | Pipeta GILSON | F123602 | A P1000 |
| Tubos LoBind de proteínas, 1,5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1,5 mL Tubo de baja unión a proteínas |
| QIAgen Kit de extracción de gel | Qiagen | 28706 | A P1000 pipeta |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | Colorante intercalador específico de dsDNA |
| Kit de ligadura rápida | New England BioLabs | M2200L | T4 ADN ligasa (NEB) |
| RNaseOUT Inhibidor recombinante de la ribonucleasa | Thermo Fisher | 10777019 | Inhibidor de la ARNasa |
| S-4FB Reticulante (soluble en DMF) | Laboratorios de vectores | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formilbenzoato (S-4FB) |
| S-HyNic | Laboratorios de vectores | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hidrazinonicotinato acetona hidrazona (S-HyNic) |
| Acetato de sodio, 3 M, pH 5.2, grado de biología molecular | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M acetato de sodio (pH 5.2) |
| Bicarbonato de sodio, 1M tampón soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M tampón de bicarbonato de sodio, pH 8.5 |
| Fosfato de sodio dibásico para biología molecular | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Fosfato de sodio monobásico para biología molecular | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV transcriptasa inversa | Thermo Fisher | 18090050 | Transcriptasa inversa |
| SYBR Gold Tinción de gel de ácido nucleico (concentrado 10,000x en DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | Un colorante intercalador para ADN |
| T4 Tampón de reacción de ADN ligasa | New England BioLabs | B0202S | 10x Tampón de reacción de ADN ligasa T4 |
| Paquete de tampón de reacción ThermoPol | England BioLabs | B9004S | 10x tampón TPM-T (Tris-HCl/Cloruro de potasio/Sulfato de magnesio/Triton X-100) |
| Reactivo TRIzol LS | Thermo Fisher | 10296-028 | Extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio |
| Kit de preparación de la biblioteca de ADN TruSeq Nano | Illumina | 20015965 Un kit de preparación de la biblioteca de ADN (consulte también las instrucciones del fabricante) | |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, consulte la Tabla 3 | Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, consulte la Tabla 3 | Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos |
| Oligo de ADN Ultramer, Anti-H3K27me3_Ab#003 Tecnologías de | ADN Integradas | N/A, ver Tabla 3 | Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, ver Tabla 3 | Una sonda de ADN modificada con aminas para anticuerpos |
| Oligonucleótidos de ADN ultramero, control IgG_Ab#001 | Tecnologías integradas de ADN | N/A, ver Tabla 3 | Una sonda de ADN modificada con aminas para el control IgG |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0,5M EDTA, pH 8,0 |
| Agua destilada UltraPure DNasa/sin RNasa | Thermo Fisher | 10977023 | Agua ultrapura |
| Zeba Splin Columnas de desalinización, 7K MWCO, 0,5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Columna de desalinización |
Referencias
- Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
- Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Com....
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Reimpresiones y permisos
