Summary
Den foreliggende protokollen beskriver en enkeltcellemetode for iterative epigenomiske analyser ved bruk av en gjenbrukbar enkeltcelle. Den gjenbrukbare enkeltcellen tillater analyser av flere epigenetiske merker i samme enkeltcelle og statistisk validering av resultatene.
Abstract
Dagens encellede epigenomanalyser er designet for engangsbruk. Cellen kasseres etter en enkelt bruk, noe som forhindrer analyse av flere epigenetiske merker i en enkelt celle og krever data fra andre celler for å skille signal fra eksperimentell bakgrunnsstøy i en enkelt celle. Denne artikkelen beskriver en metode for å gjenbruke den samme enkeltcellen for iterative epigenomiske analyser.
I denne eksperimentelle metoden blir cellulære proteiner først forankret til en polyakrylamidpolymer i stedet for å kryssbinde dem til protein og DNA, og lindre strukturell skjevhet. Dette kritiske trinnet tillater gjentatte eksperimenter med samme enkeltcelle. Deretter annealed en tilfeldig primer med en stillassekvens for nærhetsligering til det genomiske DNA, og den genomiske sekvensen blir tilsatt primeren ved forlengelse ved bruk av en DNA-polymerase. Deretter er et antistoff mot en epigenetisk markør og kontroll-IgG, hver merket med forskjellige DNA-prober, bundet til de respektive målene i samme enkeltcelle.
Nærhetsligering induseres mellom den tilfeldige primeren og antistoffet ved å legge til et kontakt-DNA med komplementære sekvenser til stillassekvensen til den tilfeldige primeren og antistoff-DNA-sonden. Denne tilnærmingen integrerer antistoffinformasjon og nærliggende genomsekvenser i et enkelt DNA-produkt av nærhetsligering. Ved å muliggjøre gjentatte eksperimenter med samme enkeltcelle, tillater denne metoden en økning i datatetthet fra en sjelden celle og statistisk analyse ved bruk av bare IgG og antistoffdata fra samme celle. De gjenbrukbare enkeltcellene fremstilt ved denne metoden kan lagres i minst noen måneder og gjenbrukes senere for å utvide epigenetisk karakterisering og øke datatettheten. Denne metoden gir fleksibilitet til forskere og deres prosjekter.
Introduction
Enkeltcelleteknologi går inn i epoken med enkeltcelle multiomikk, som integrerer individuelle enkeltcelle-omics-teknologier1. Nylig har enkeltcelletranskriptomikk blitt kombinert med metoder for å oppdage kromatintilgjengelighet (scNMT-seq2 og SHARE-seq3) eller histonmodifikasjoner (Paired-seq4 og Paired-Tag5). Mer nylig ble encellet transkriptomikk og proteomikk integrert med kromatintilgjengelighet (DOGMA-seq6). Disse metodene bruker transposasebasert merking for å oppdage kromatintilgjengelighet eller histonmodifikasjoner.
Transposase-baserte tilnærminger spalter genomisk DNA og legger til en DNA-strekkode på slutten av det genomiske DNA-fragmentet. Hvert spaltet genomisk fragment kan bare akseptere opptil to DNA-strekkoder (= ett epigenetisk merke per spaltningssted), og det genomiske DNA på spaltningsstedet går tapt. Derfor har spaltningsbaserte tilnærminger en avveining mellom antall epigenetiske merker som er testet og signaltettheten. Dette hemmer analysen av flere epigenetiske merker i samme enkeltcelle. En encellet epigenomisk metode som ikke spalter det genomiske DNA ble utviklet for å overvinne dette problemet 7,8.
I tillegg til det spaltningsavledede problemet nevnt ovenfor, har transposasebaserte tilnærminger andre begrensninger. I enkeltcelleepigenomanalyse er det viktig å vite plasseringen av histoner og DNA-assosierte proteiner på genomet. I dagens tilnærminger oppnås dette ved å bruke ufikserte enkeltceller og retensjon av protein-DNA og protein-protein-interaksjoner. Dette genererer imidlertid sterk skjevhet mot tilgjengelige kromatinregioner, selv i analysen av histonmodifikasjoner 9. Plasseringen av histoner og genomassosierte proteiner på genomet kan bevares uten kryssbinding av protein-DNA og protein-protein, ved bruk av et polyakrylamidstillas 7,8. Denne tilnærmingen reduserer strukturell skjevhet observert i nåværende tilnærminger som avhenger av protein-DNA og protein-protein-interaksjoner.
Transposase-baserte tilnærminger kan bare skaffe signaler en gang fra en enkelt celle. Derfor er det vanskelig å avgrense hele epigenomet til en enkelt celle på grunn av frafallet av signalene. Gjenbrukbare enkeltceller er utviklet for å overvinne nåværende begrensninger ved å tillate iterativ epigenomisk analyse i samme enkeltcelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: En skjematisk fremstilling av metoden er vist i figur 1.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av protokollarbeidsflyten. Trinn 7.2-13 forklares gjennom skjematiske fremstillinger. Hver rad indikerer et trinn i protokollen. Et cellulært protein farget i grønt er et humant nukleosom generert basert på en krystallstruktur (PDB: 6M4G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Likevekt av avsaltingskolonner
MERK: Avsalting av spinnkolonner er likevekter som beskrevet i trinnene nedenfor. De likevektede avsaltingskolonnene brukes i trinn 2.1, 3.4 og 4.6.
- Fjern bunnlukningen av en avsaltingskolonne (7 kDa cut-off, 0,5 ml harpiksdråpevolum, se materialfortegnelsen) og løsne hetten øverst på avsaltingskolonnen.
- Plasser kolonnen i et 1,5 ml protein lavbindingsrør (et oppsamlingsrør, se materialtabellen) og sentrifuge ved 1 500 × g i 1 min ved romtemperatur for å fjerne lagringsløsningen i kolonnen.
MERK: Bruk en svingrotorsentrifuge for å flate ut toppen av perlebunnen. - Fjern gjennomstrømningen i 1,5 ml røret og tilsett 300 μL 150 mM NaCl/100 mM fosfatbuffer, pH 8,0 (se tabell 1), på toppen av harpiksbunnen.
- Sentrifuge ved 1 500 × g i 1 min ved romtemperatur og fjern gjennomstrømningen i oppsamlingsrøret.
- Gjenta trinn 1.3-1.4 tre ganger til.
- Kast bufferen fra oppsamlingsrøret og plasser kolonnen i et nytt oppsamlingsrør.
- Bruk den likevektede avsaltingskolonnen i trinn 2.1, 3.4 og 4.4.
2. Bufferutveksling av antistoffer
MERK: Fjern glyserol, arginin og natriumazid fra anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 og anti-Pol II10 (se buffersammensetning vist i tabell 1). Alle følgende prosedyrer utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 1 t
- Påfør antistoffoppløsningen (100 μL, se tabell 2) på en ekvilibrert avsaltingskolonne fremstilt i trinn 1.
- Sentrifuger ved 1 500 × g i 2 minutter ved 4 °C og overfør gjennomstrømningen fra oppsamlingsrøret til et 1,5 ml protein lavbindingsrør.
- Mål IgG-konsentrasjonen ved hjelp av absorbans ved 280 nm12 (bruk et mikrovolumspektrofotometer).
- Overfør antistoffoppløsningen til en ultrafiltreringskassett (molekylvektgrense 100 kDa, 0,5 ml, se materialtabellen) og sentrifuge ved 12 000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Mål IgG-konsentrasjonen ved hjelp av absorbansen ved 280 nm.
- Gjenta trinn 2,4-2,5 til IgG-konsentrasjonen når 1 mg/ml.
3. Antistoff aktivering
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 2,5 t
- Løs opp 1 mg succinimidyl 6-hydrazinonicotinate aceton hydrazon (S-HyNic, se materialtabellen) med 100 μL vannfritt N,N-dimetylformamid (DMF, se materialtabellen).
MERK: DMF er et brennbart organisk løsningsmiddel og et kraftig levertoksin absorbert gjennom huden. Bruk hansker, vernebriller og en laboratoriefrakk. Følg institusjonelle sikkerhetsretningslinjer. Kast det brukte labware i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Tilsett 0,6 μL S-HyNic/DMF til 100 μL av antistoffoppløsningen (1 mg/ml i 150 mM NaCl/100 mM natriumfosfat, pH8,0. Se tabell 2 for brukte antistoffer og kontroll IgG.
- Inkuber ved romtemperatur i 2 timer (beskytter mot lys).
- Påfør 100 μL S-HyNic-reagert antistoff på toppen av den likevektede avsaltingskolonnen (se trinn 1) og sentrifuge ved 1 500 × g i 2 minutter ved 4 °C for å ta prøven.
- Kast avsaltingskolonnen etter bruk.
MERK: Stabiliteten til HyNic-grupper på proteiner og andre biomolekyler varierer. Det anbefales å konjugere HyNic-modifiserte biomolekyler umiddelbart.
4. Aktivering av DNA-sonde
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 2,5 t
- Løs opp en pellet av en aminmodifisert DNA-sonde for antistoff eller kontroll IgG (antistoffprobe, tabell 3) med 20 μL 150 mM NaCl/100 mM natriumfosfatbuffer, pH 8,0.
MERK: Se etter en tynn, gjennomsiktig pellet/film i bunnen av røret. Påfør bufferen direkte på pelleten. Hvis pelleten ikke er synlig, kan pelleten ha løsnet og festet seg til veggen eller lokket. I dette tilfellet, sentrifuge røret og se etter en pellet i bunnen av røret. - Løs opp 1 mg succinimidyl 4-formylbenzoat (S-4FB, se materialtabellen) med 50 μL vannfri DMF, og tilsett 10 μL DMF til den oppløste antistoffsonden.
- Tilsett 4 μL S-4FB/DMF fremstilt i trinn 4.2, bland og inkuber ved romtemperatur i 2 timer (beskytter mot lys).
- Påfør 34 μL S-4FB-reagert antistoffsonde på toppen av den likevektede avsaltingskolonnen (se trinn 1).
- Påfør 15 μL 150 mM NaCl / 100 mM natriumfosfatbuffer, pH 8,0, på toppen av gelsengen etter at prøven er fullstendig absorbert, og sentrifuge ved 1,500 × g i 2 minutter ved 4 ° C for å samle S-4FB-modifisert antistoffprobe.
- Bruk gjennomstrømningen for den påfølgende konjugeringen; måle absorbansen ved 260 nm; og beregne gjenvinningsgraden for antistoffsonden.
5. Konjugering av S-HyNic-modifisert antistoff og S-4FB-modifisert antistoffprobe
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 2 t
- Bland det S-HyNic-modifiserte antistoffet og den S-4FB-modifiserte antistoffsonden, og pipetter oppløsningen opp og ned for å blande.
- Inkubere i 2 timer ved romtemperatur (beskytter mot lys).
- For å slukke reaksjonen, tilsett 478,8 μL slukke- og lagringsløsning (se tabell 1).
- Overfør antistoff-sonde-konjugert antistoffoppløsning til en ultrafiltreringskassett (molekylvekt cut-off 100 kDa).
- Sentrifuge i 5 min ved 12 000 × g, 4 °C.
- Kontroller volumet av løsningen inne i kassetten ved pipettering.
- Gjenta trinn 5,5–5,6 til volumet når 100 μL og oppbevares ved -20 °C.
MERK: IgG-konsentrasjon måles med sandwich ELISA13,14,15 ved hjelp av en IgG-standard.
6. Fremstilling av kjernemagnetiske perler
MERK: I denne metoden er en enkelt celle innebygd i en tolags akrylamidperle (se figur 2). Kjernen er en magnetisk polyakrylamidperle. Det ytre laget er polyakrylamid alene. Kjernen magnetiske perler genereres i denne delen. Denne delen er ikke avgjørende for eksperimentet. Tid: 3 t
Figur 2: Struktur av en tolags polyakrylamidperle for synlighet og enkel håndtering i REpi-seq-eksperimenter . (A) Magnetiske nanopartikler fra trinn 6.6 etter sentrifugering. De magnetiske nanopartiklene er modifisert med monomer akrylamid og integrert i polyakrylamidmagnetisk perle vist i B. (B) Skjematisk fremstilling av en gjenbrukbar enkeltcelle med en polyakrylamidmagnetisk perle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Bland 50 μL 1 M natriumbikarbonatbuffer, pH 8,5 og 450 μL 40 % akrylamidoppløsning.
MERK: Akrylamid er et nevrotoksin. Bruk hansker, øyevern og laboratoriefrakk. Følg institusjonelle sikkerhetsretningslinjer. Kast det brukte labware i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Suspender 1 g NHS esterfunksjonalisert 30 nm jernoksidpulver (se materialtabellen) i akrylamid/natriumbikarbonatbufferen og inkuber ved 4 °C over natten.
MERK: Fordi akrylamidkuler er gjennomsiktige, kan det være vanskelig å se og manipulere posisjonen til perlene. Inkluderingen av en kjerneperle laget av jernoksid forbedrer synligheten og letter manipulering fordi posisjonen til perlene kan styres ved hjelp av en magnet. Imidlertid, hvis brukerne er kjent med REpi-seq-eksperimentene, kan bruk av kjernemagnetiske polyakrylamidperler hoppes over. - Overfør nanoperleopphenget til 2 rør (1,5 ml), sentrifuge ved 21,300 × g i 1 time (bruk en vinklet rotor) ved 4 ° C, og fjern supernatanten.
- Oppheng bunnslammet med 1 ml 40 % akrylamid/bis-akrylamid (19:1, se materialfortegnelsen).
MERK: Bis-akrylamid er et nevrotoksin. Bruk hansker og laboratoriefrakk. Følg institusjonelle sikkerhetsretningslinjer. Kast det brukte labware i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Sentrifuge ved 21 300 × g i 1 time (bruk en vinklet rotor) ved 4 °C.
- Sentrifuge ved 5000 × g i 30 min (bruk svingrotor uten brems) ved 4 °C.
- Fjern supernatanten med en P1000-pipette med aspirasjon i lav hastighet.
- Juster volumet til 400 μL på 40 % akrylamid/bis-akrylamid (19:1, se materialfortegnelsen).
- Tilsett 25 μL 10 % ammoniumpersulfatoppløsning (se tabell 1).
MERK: Ammoniumpersulfat er et sterkt oksidasjonsmiddel. Luftbårent støv som inneholder ammoniumpersulfat kan irritere øyet, nesen, halsen, lungene og huden ved kontakt. Bruk hansker, vernebriller og en laboratoriefrakk. Følg institusjonelle sikkerhetsretningslinjer. Kast det brukte labware i henhold til institusjonelle retningslinjer. - For å generere magnetiske polyakrylamidperler i kjernen, overfør 0,5 μL av den akrylamidmodifiserte jernoksidsuspensjonen til et PCR-rør.
- Tilsett 50 μL 4 % N,N,N ', N'-tetrametyletylendiamin/mineralolje (TEMED, se tabell 1) og inkuber over natten ved romtemperatur.
MERK: TEMED er et brannfarlig løsningsmiddel. Arbeid under en hette. Skal ikke inhaleres. Holdes borte fra åpen ild, varme overflater og antennelseskilder. Bruk hansker, vernebriller og en laboratoriefrakk. Følg institusjonelle sikkerhetsretningslinjer. Kast det brukte labware i henhold til institusjonelle retningslinjer.
7. Modifisering av aminogruppen av cellulære proteiner med monomer akrylamid
MERK: REpi-seq ble designet for å analysere epigenomet til mus og humane celler på enkeltcellenivå. Hvert trinn må optimaliseres når du bruker denne metoden på celler av andre arter enn mus eller menneske.
- Høsting av cellene
MERK: Tid: 30 min- Mål cellekonsentrasjonen og levedyktigheten ved hjelp av en celleteller (se materialtabellen).
MERK: Levedyktigheten til cellene på dette trinnet påvirker hvor mange celler som er levende celler i dataanalysen. - Juster cellekonsentrasjonen til 1 × 105 celler/ml med dyrkningsmedium (*) inneholdende 10% føtalt bovint serum.
MERK: * Kulturmedium er et optimalt kulturmedium for cellene av interesse. - Overfør 1 ml av cellesuspensjonen til et 1,5 ml rør.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten.
- Tilsett 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS), bland cellene ved forsiktig pipettering, og sentrifuger cellesuspensjonen ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten.
MERK: Alle trinnene ovenfor skal utføres i en laminær hette for rengjøring av luftstrømmen for å forhindre forurensning.
- Mål cellekonsentrasjonen og levedyktigheten ved hjelp av en celleteller (se materialtabellen).
- Modifisering av aminogruppen av cellulære proteiner med monomer akrylamid
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 1,5 t- Tilsett 1 ml aminogruppemodifikasjonsløsning (se tabell 1) til cellepelleten og suspender cellepelleten ved forsiktig pipettering.
- Inkuber røret på is i 1 time og sentrifuger cellesuspensjonen ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene med 100 ml 4 % akrylamid/1 mM EDTA/PBS som inneholder et interkalatorfargestoff for DNA (se tabell 1, 1 celle/μL).
8. Fremstilling av gjenbrukbare enkeltceller
- Fremstilling av gjenbrukbare enkeltceller (manuell versjon)
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 9 t/96 celler- Bland 1 ml av cellesuspensjonen (1 celle/μL) og 199 ml 1 mM EDTA/PBS inneholdende et interkalatorfargestoff for DNA (se tabell 1).
- Overfør 200 μL av cellesuspensjonen til hver brønn med flatbunnede 96-brønnsplater (totalt 10 plater, se materialfortegnelsen).
- Sett dekselet på 96-brønnplaten og skann de 10 platene ved hjelp av et skanningsmikroskop (se materialtabellen) for å identifisere brønner som inneholder en enkelt celle.
- Overfør innholdet i brønnen som inneholder en enkelt celle til et PCR-rør.
- Vipp platen (mot operatøren), og vent noen minutter til enkeltcellen har sunket til den nedre kanten av brønnen.
- Plasser pipettespissen i nederste hjørne og overfør enkeltcellen og bufferen (aspirat 210 μL/brønn = 200 μL buffer + 10 μL luft) til et PCR-rør.
MERK: Sørg for å bruke et P200-tips med lav oppbevaring. - Kontroller brønnen ved hjelp av et fluorescensmikroskop for å bekrefte overføringen.
- Hvis en enkelt celle fortsatt er i brønnen, tilsett 200 μL / brønn på 1 mM EDTA / PBS som inneholder et interkalatorfargestoff for DNA.
- Gjenta deretter overføringen.
- Sentrifuger PCR-røret ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C ved bruk av en svingrotor uten brems.
MERK: Bremsing forårsaker en virvlende strøm av vann i røret, noe som forstyrrer nedbøren til enkeltcellen. Ved sentrifugering med en svingende rotor uten brems, vil enkeltcellen alltid synke til bunnen av røret. Imidlertid, hvis en vinklet rotor brukes, festes enkeltcellen til sideveggen til PCR-røret og kan gå tapt. - Fjern 195 mikrol av supernatanten med svært lav pipetteringshastighet.
- Tilsett 195 μL/tube akrylamid/bis-akrylamid/APS-oppløsning (se tabell 1).
- Sentrifuger PCR-røret ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C ved bruk av en svingrotor uten brems.
- Fjern 195 mikrol av supernatanten med svært lav pipetteringshastighet.
- Overfør de nederste 3 μL til PCR-røret som inneholder 4% TEMED/mineralolje og en magnetisk polyakrylamidperle (generert i trinn 6).
MERK: Sørg for å bruke en P10 tips med lav retensjon. Dispenser cellen nær den magnetiske polyakrylamidperlen. I mineraloljen fester væsken som inneholder enkeltcellen overflaten av den magnetiske polyakrylamidperlen ved overflatespenning. - Inkuber over natten ved romtemperatur.
MERK: Denne prosessen genererer en tolags akrylamidgelperle. Kjernen er en magnetisk gelperle. Det ytre laget er polyakrylamidgel som inneholder en enkelt celle. Enkeltcellen er innebygd i det ytre laget av gelen. Trygt stoppested: Etter vask av gjenbrukbare enkeltceller med 50% glyserol / 1 mM EDTA / 0,05% mellom 20/0,5% BSA / TBS buffer, kan de gjenbrukbare enkeltcellene lagres ved -20 ° C i opptil 6 måneder.
- Fremstilling av gjenbrukbare enkeltceller (semiautomatisert versjon)
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 3 t/96 celler- Bland 1 ml cellesuspensjon (1 celle/μL) og 199 ml 1 mM EDTA/PBS inneholdende et interkalatorfargestoff for DNA (se tabell 1).
- Overfør 200 μL av cellesuspensjonen til hver brønn på en 4 nL nanowell-plate (se figur 3 og materialfortegnelsen) og plasser 4 nL nanowell-platen på en automatisert encelleplukkingsrobot (se materialfortegnelsen).
- Plasser en 96-brønns PCR-plate som destinasjonsplate på den automatiserte encelleplukkingsroboten. Sørg for at hver brønn inneholder 200 μL/brønnakrylamid/bis-akrylamid/APS-løsning (se tabell 1).
- Overfør en enkelt celle fra en 4 nL nanowell til en brønn på 96-brønns PCR-platen (se Supplerende video S1).
- Sett et deksel på toppen av 96-brønns PCR-platen og sentrifuge 96-brønnsplaten ved 240 × g i 5 minutter ved 4 ° C ved hjelp av en svingrotor uten brems.
- Plasser PCR-platen med 96 brønner på dekket av en automatisk væskehåndteringsrobot (se materialfortegnelsen, figur 4 og tilleggskode 1).
- Dra og slipp tilleggskoden 1 til programvarevinduet (se materialfortegnelsen) til væskehåndteringsroboten.
- Kjør programmet på den automatiske væskehåndteringsroboten (se Supplemental Video S2 og Supplemental Video S3).
- Fjern 195 mikrol av supernatanten med svært lav pipetteringshastighet.
- Tilsett 50 μL 4% TEMED/mineralolje.
MERK: Trinn 8.2.8.1–8.2.8.2 kan utføres ved manuell pipettering.
- Inkuber over natten ved romtemperatur (figur 5). Trygt stoppested: Etter vask av de gjenbrukbare enkeltcellene med 50 % glyserol/1 mM EDTA/0,05 % mellom 20/0,5 % BSA/TBS-buffer, oppbevar de gjenbrukbare enkeltcellene ved -20 °C i opptil 6 måneder.
Figur 3: Automatisk encelleplukking og overføring til en 96-brønns PCR-plate i trinn 8.2 . (A) Oversikt over et enkelt celleplukksystem. En enkelt celleplukkende robot er i en laminær flytrens hette for å unngå forurensning. (B) En 24-brønns plate med 4 nL nanobrønner inne i brønnen. (C) Cellefordeling i en brønn fra 24-brønnplaten. Grønne prikker er celler identifisert som en enkelt celle i hver 4 nL nanowell. Magenta prikker er celler identifisert som dubletter eller multipletter av celler. (D) Brightfield-bilde av brønnen i 24-brønnplaten. En grønn firkant er en 4 nL nanowell som inneholder en enkelt celle. En magenta firkant er en 4 nL nanowell som inneholder flere celler. (E) Forstørret felt på rundt 4 nL nanobrønner. Lyse prikker er enkeltceller i 4 nL nanobrønner. Enkeltcelleplukkingssystemet identifiserer nanobrønner som inneholder en enkelt celle ved å anskaffe lysfelt- og fluorescensbilder av celler med DAPI-farging. Identifiserte enkeltceller overføres fra 4 nL nanowell til en brønn på en 96-brønns PCR-plate. Skalastenger = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Forkortelse = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Generering av gjenbrukbare enkeltceller ved hjelp av en væskehåndteringsrobot . (A) Et dekk på væskehåndteringsroboten. Dekket har 11 spor for pipettespissstativer (P300-spiss: Spor 1-3, P20-spiss: Spor 5-6), 2 ml dypbrønnsplate med 96 brønner (spor 4), to 96-brønns PCR-plater som inneholder en enkelt celle per brønn (spor 7 og 10), og to flatbunnede 96-brønnsplater for flytende avfall (spor 8 og 11). (B) Dekket etter plassering av labware. (C) Skjematisk fremstilling av robotpipettering i trinn 8.8.1. Programmet fjerner supernatanten uten å aspirere en eneste celle fra bunnen av PCR-platen med 96 brønner. (D) Gjenbrukbare enkeltceller generert ved hjelp av tilleggskoden 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
9. Tilfeldig primer glødning og forlengelse
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Stjerner (*) ved de følgende trinnene indikerer at en magnetisk separator kan brukes til å kontrollere posisjonen til polyakrylamidkulene som inneholder en gjenbrukbar enkeltcelle i røret. Bruken av magnetseparatoren er imidlertid ikke avgjørende. Ved å bevege pipettespissen sakte nedover langs veggen av røret, skyves perlene opp for vask eller bufferbytte. Tid: 9 t
- Fjern mineraloljen ved å pipettere(*) og vask (*) 5 ganger med 200 μL 1x TP Mg(-)buffer (fortynn 10x TP Mg(-)buffer til 1x buffer med ultrarent vann, se tabell 1).
- Fjern supernatanten (*) og tilsett 15 μL annealingbuffer (se tabell 1).
- Inkuber i 1 time på is.
MERK: Formålet med denne inkubasjonen er å permeabilisere plasma- og nukleærmembranene og levere den tilfeldige primeren til cellekjernen. - Plasser PCR-rørene på en termisk syklist og varm opp ved 94 °C i 3 minutter.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er ca. 20 μL, inkludert volumet av polyakrylamidperlen. Temperaturen på lokket på termosyklisten er 105 °C. - Overfør rørene til en iskjølt metallblokk og inkuber i 2 minutter.
- Tilsett 4 μL MgSO4 / NaCl / dNTP-blanding (se tabell 1) og bland med en hvirvelblander på middels hastighet.
- Tilsett 1 μL Bst-polymerase, stort fragment (se materialfortegnelsen) og bland ved å bruke en hvirvelblander med middels hastighet.
- Inkuber i 4 timer på en shaker (600 rpm ved 4 °C).
MERK: Formålet med denne inkubasjonen er å levere Bst-polymerasen til cellekjernen. - Plasser PCR-røret på en termisk syklist og kjør ett av følgende programmer.
- Kjør et 4 t program: 10 °C i 30 minutter, 20 °C i 30 minutter og 25 °C i 180 minutter.
- Alternativt kan du kjøre et overnattingsprogram: 4 °C i 4 timer, 10 °C i 2 timer, 20 °C i 2 timer, 25 °C i 4 timer og hold ved 4 °C.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er ca. 25 μL, inkludert volumet av polyakrylamidperlen. Temperaturen på lokket på termisk syklist er 105 °C. Trygt stoppested: Stopp eksperimentet her i opptil 1 dag ved å lagre de gjenbrukbare enkeltcellene ved 4 °C.
10. Antistoffbinding
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 1,5 t
- Tilsett 1,625 mikroliter NaCl/EDTA/BSA-oppløsning (se tabell 1) og bland ved vortexing ved lav hastighet.
MERK: Dette trinnet tar sikte på å 1) lette kelering av Mg 2 + av EDTA,2 ) stabilisere bindingen av den utvidede 1st tilfeldig primer med 300 mM NaCl, og 3) blokkere uspesifikk binding av antistoffer ved bruk av storfe serum albumin (BSA) i den påfølgende reaksjonen. - Inkuber i 1 time på is og tilsett 0,1 μg/ml hver antistoff og kontroller IgG konjugert med antistoffprobe (tilberedt i trinn 5).
- Inkuber over natten på is med forsiktig risting på en shaker.
11. Nærhetsligering av antistoffsonde og proksimalt utvidet tilfeldig primer
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Stjerner (*) i de følgende trinnene indikerer hvor en magnetisk separator kan brukes til å kontrollere posisjonen til polyakrylamidkuler som inneholder en gjenbrukbar enkeltcelle i røret. Bruken av magnetseparatoren er imidlertid ikke avgjørende. Ved å bevege pipettespissen sakte nedover langs rørveggen, kan kulene skyves opp for vask eller bufferbytte. Tid: 6 t
- Vask (*) to ganger med 200 μL 1x TPM-T buffer (20 min inkubasjon i hver vask) på is. Fortynn 10x TPM-T-buffer (Tris-HCl / kaliumklorid / magnesiumsulfat / Triton X-100) til 1x med ultrarent vann).
- Fjern (*) supernatanten og vask (*) én gang med 1x T4 DNA-ligasebuffer (se materialfortegnelsen).
- Fjern (*) supernatanten og tilsett 19 mikroliter ligeringsadapteroppløsning (se tabell 1).
- Inkuber i 1 time ved 25 °C.
- Tilsett 1 μL T4 DNA-ligase (se materialtabellen) og bland røret på en virvelblander på middels hastighet.
- Plasser røret på en termisk syklist og kjør følgende program: nærhetsligeringsprogram, 4 t ved 16 °C og 30 minutter ved 25 °C.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er ca. 25 μL, inkludert volumet av polyakrylamidperlen. Temperaturen på lokket på termisk syklist er romtemperatur. - Vask (*) to ganger kort med 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(+)buffer (se tabell 1; klargjør 1x buffer fra 10x lagerbuffer) og oppbevar cellen ved 4 °C, over natten. Trygt stoppested: Stopp eksperimentet her i opptil 1 dag ved å lagre de gjenbrukbare enkeltcellene ved 4 °C.
12. Full utvidelse av 1ste tilfeldig primer
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 4,5 t
- Vask to ganger med 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-)buffer (se tabell 1, klargjør 1x buffer fra 10x stambuffer), fjern supernatanten og tilsett 20 μL Bst/dNTP/MgSO4-blanding (se tabell 1).
- Bland med en virvelblander på middels hastighet og inkuber i 4 timer på en orbital shaker (ved 6 ° C og 500 o / min).
- Plasser røret på en termisk syklist og kjør følgende program: full forlengelsesprogram: 10 °C i 1 time, 20 °C i 1 time, 30 °C i 1 time, 40 °C i 1 time, 50 °C i 1 time, 65 °C i 1 time, 94 °C i 10 minutter og hold ved 4 °C.
MERK: Trygt stoppested: Forsøket kan stoppes her i opptil 1 dag ved å lagre de gjenbrukbare enkeltcellene ved 4 °C.
13. Forsterkning av flere forskyvninger
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 2,5 t (trinn 13.1-13.2) + 15 min (trinn 13.3-13.4) + 1 dag (trinn 13.5-13.10)
- Tilsett 0,4 μL 100 μM 2nd tilfeldig primer (se tabell 3) og bland med en virvelblander ved middels hastighet.
- Inkuber i 2 timer ved 6 °C og 500 o / min på en orbital shaker, og plasser røret på en termisk syklist og varm opp ved 94 °C i 3 minutter.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er ca. 25,4 μL, inkludert volumet av polyakrylamidperlen. Temperaturen på lokket på termosyklisten er 105 °C. - Plasser rørene i en iskjølt metallblokk og tilsett 1 μL / rør av Bst DNA-polymerase.
- Vortex ved sakte hastighet, plasser rørene på en termisk syklist, og kjør følgende program:
4 °C i 4 timer, 10 °C i 30 minutter, 20 °C i 30 minutter, 30 °C i 30 minutter, 40 °C i 30 minutter, 50 °C i 30 minutter, 65 °C i 60 minutter, 94 °C i 3 minutter og hold ved 4 °C.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er ca. 26,4 μL, inkludert volumet av polyakrylamidperlen. Temperaturen på lokket på termisk syklist er 105 °C. Trygt stoppested: Stopp eksperimentet her i opptil 1 dag ved å lagre de gjenbrukbare enkeltcellene ved 4 °C. - Samle supernatanten (ca. 20 μL), og overfør den til et PCR-rør.
- Oppbevar den oppsamlede supernatanten ved -80 °C.
- Tilsett 20 μL/rør med 0,05 % Tween 20/0,1x TE-buffer til et PCR-rør som inneholder den gjenbrukbare enkeltcellen (se tabell 1) og inkuber den gjenbrukbare enkeltcellen ved 4 °C over natten. Trygt stoppested: Stopp eksperimentet her i noen dager ved å forlenge inkubasjonstiden.
- Samle supernatanten og kombiner supernatanten med prøven tatt i trinn 13.5.
- Gjenta trinn 13.7-13.8 en gang til. Bløtlegg den gjenbrukbare enkeltcellen i 50% glyserol / 5 mM EDTA / 0,5% BSA / 0,05% Tween20 / TBS buffer og inkuber den i 30 minutter på en orbital shaker (4 ° C, 600 rpm). Oppbevar den gjenbrukbare enkeltcellen ved -20 °C til neste eksperiment.
- Tilsett 40 μL Exo-masterblanding (se tabell 1) og plasser røret på en termisk syklist og kjør følgende program: i) 95 °C i 5 minutter, ii) 95 °C i 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C i 30 s, v) gjenta trinn ii-iv 19 ganger, vi) 72 °C i 5 minutter, vii) hold ved 4 °C.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er ca. 45 μL, inkludert volumet av polyakrylamidperlen. Temperaturen på lokket på termosyklisten er 105 °C. Trygt stoppested: Her kan forsøket stoppes i minst noen dager ved å lagre prøven ved -80 °C.
14. Fenol-kloroformrensing og polyetylenglykolutfelling
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 1,5 t
- Overfør produktet til et 0,5 ml DNA lavbindingsrør og tilsett 100 μl fenol: kloroform: isoamylalkohol.
MERK: Fenol: Kloroform: Isoamylalkohol forårsaker irritasjon og muligens brenner ved kontakt. Bruk hansker, vernebriller og en laboratoriefrakk. Bruk kun med tilstrekkelig ventilasjon, eller bruk åndedrettsvern. Følg institusjonelle sikkerhetsretningslinjer. Kast det brukte labware i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Rist i 30 s for hånd og sentrifuge ved 12 000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
- Samle den vandige fasen (80 μL) i et 0,5 ml DNA lavbindingsrør, og tilsett 40,84 μL / rør av lineær akrylamid/MgCl2-blanding (se tabell 1).
- Tilsett 47,06 μL/rør med 50 % (w/v) PEG8000 (RNase-fri) og bland ved pipettering.
- Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur og sentrifuge ved 240 × g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsett 400 μL/rør med 80 % etanol (EtOH).
- Vask med 80 % EtOH, fjern supernatanten med en aspirator og lufttørk pelleten.
- Suspender pelleten med 20 μL 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7,4 buffer, og oppbevar oppløsningen ved -80 °C.
MERK: Mål DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et dobbeltstrenget DNA-spesifikt interkalatorfargestoff (se materialfortegnelsen). Trygt stoppested: Forsøket kan trygt stoppes her i minst en uke.
15. In vitro transkripsjon
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase- og RNase-forurensning. Tid: 5 t
- Tine DNA fra enkeltcellederiverte produkter (fra trinn 14) og fremstille et blandet bibliotek med enkeltcellederiverte produkter ved å blande 2 μL/celle av DNA-produktene (totalvolum 20 μL).
- Tilsett 26 mikrol in vitro transkripsjon mastermix (se materialfortegnelsen og produsentens protokoll) og bland ved pipettering.
- Plasser PCR-røret på en termisk syklist og inkuber i 4 timer ved 37 °C.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er 46 μL. Temperaturen på lokket på termosyklisten er 105 °C. - Legg til 5 μL med 10x DNase I-buffer (se materialtabellen) og tilsett 4 μL DNase I (RNase-fri, 4 U, se materialtabellen).
- Bland og inkuber i 15 minutter ved 37 °C, og overfør prøven til et 0,5 ml rør.
- Tilsett 300 μL / rør av Guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform (se materialtabellen) og bland med mild vortexing.
MERK: Guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform kan føre til alvorlige kjemiske forbrenninger ved kontakt. Bruk hansker, vernebriller og en laboratoriefrakk. Bruk kun med tilstrekkelig ventilasjon eller bruk åndedrettsvern. Følg institusjonelle sikkerhetsretningslinjer. Kast det brukte labware i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Inkuber i 5 min ved R.T. på en shaker og oppbevar deretter prøver ved -80 °C i opptil 3 dager.
MERK: Trygt stoppested: Eksperimentet kan trygt stoppes her i opptil 3 dager.
16. RNA-rensing
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase- og RNase-forurensning. Tid: 2 t
- Tilsett 80 μL/tube kloroform til prøven fra trinn 15.7 og rist røret kraftig for hånd i 15 s.
- Inkuber i 2-15 min ved romtemperatur og sentrifuger prøven ved 12 000 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Samle inn og overfør den vandige fasen av prøven (~200 μL) til et nytt 1,5 ml rør.
- Tilsett 600 μL / rør av Guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform og overfør prøven til et 1,5 ml rør.
- Tilsett 180 μL / rør kloroform og rist røret kraftig for hånd i 15 s.
- Sentrifuger prøven ved 12 000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
- Samle og overfør den vandige fasen av prøven (~ 450 μL) til et 1,5 ml rør.
- Tilsett 60 μL/rør lineær akrylamid (5 μg/μL) og tilsett 400 μL/rør med 100 % isopropanol til vannfasen.
- Inkuber røret ved romtemperatur i 10 minutter og sentrifuger det ved 12 000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten forsiktig.
- Vask RNA-pelleten 3 ganger med 200 μL 75% etanol (EtOH / RNase-fritt vann), fjern supernatanten og lufttørk RNA-pelleten.
MERK: Ikke la RNA tørke helt fordi pelleten kan miste løselighet. - Resuspender RNA-pelleten i 20 μL RNase-fritt vann som inneholder en RNAse-hemmer (1 μL/20 μL) og løs opp pelleten ved pipettering.
- Mål absorbansen ved 260 nm.
17. Omvendt transkripsjon
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 1 t
- Tilsett 7 μL / rør av Reverse Transcription primer + dNTP-blanding (se tabell 1 og tabell 3) og legg rørene på en termisk syklist.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er 27 μL. Temperaturen på lokket på termosyklisten er 105 °C. - Varm opp ved 65 °C i 5 min og legg slangene på is i minst 1 min.
- Tilsett 14 mikrol/rør revers transkriptasemasterblanding (se tabell 1) og bland med pipettering.
- Plasser rørene på en termisk syklist, og inkuber dem ved 55 °C i 10 minutter og deretter ved 80 °C i 10 minutter.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er 60 μL. Temperaturen på lokket på termosyklisten er 105 °C.
18. Andre strengsyntese
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 2,5 t
- Tilsett 40 μL/rør ultrarent vann og del 100 μL-oppløsningen i to 0,2 ml PCR-rør (50 μL/rør).
- Tilsett 60 μL/rør med Second Strand Synthesis mix (se tabell 1) og plasser rørene på en termisk syklist og kjør følgende program: i) 95 °C i 5 minutter, ii) 95 °C i 30 s, iii) 60 °C i 30 s, iv) 72 °C i 30 s, v) gjenta trinn ii-iv 20 ganger, og vi) hold ved 4 °C.
MERK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Volumet av løsningen er 110 μL. Temperaturen på lokket på termosyklisten er 105 °C. - Tilsett 4,4 μL/rør på 0,5 M EDTA (siste 20 mM) og oppbevar ved -80 °C, over natten.
MERK: Trygt stoppested: Eksperimentet kan trygt stoppes her i opptil noen dager. - Rens DNA ved fenol-kloroformrensing og polyetylenglykolutfelling (beskrevet i trinn 14).
MERK: Trygt stoppested: Eksperimentet kan trygt stoppes her i minst en uke.
19. Begrensningsenzymfordøyelse og størrelsesvalg
MERK: Følgende prosedyre utføres under en ren hette for å unngå DNase-forurensning. Tid: 3 t (trinn 19.1-19.7)
- Mål DNA-konsentrasjonen av det rensede DNA (fra trinn 18.4) ved å måle absorbansen ved 260 nm.
- Overfør 6 μg DNA til et PCR-rør, tilsett 30 μL 10x fordøyelsesbuffer, og juster volumet til 294 μL med ultrarent vann.
- Tilsett 6 μL BciVI-restriksjonsenzym og inkuber ved 37 °C i 1 time.
- Utfør EtOH-utfelling med lineær polyakrylamid.
- Tilsett 60 μL/rør med 3 M natriumacetat (pH 5,2) og tilsett deretter 40 μL/rør lineært akrylamid (5 mg/ml, se materialtabellen).
- Tilsett 400 μL/tube EtOH og rug over natten ved -20 °C.
MERK: Trygt stoppested: Eksperimentet kan trygt stoppes her i en dag. - Sentrifuge 12 000 × g i 10 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten.
- Vask pelleten to ganger med 80% EtOH og tørk pelleten.
- Løs opp pelleten med 20 μL 1xTE buffer og tilsett 4 μL/rør fersk 6x Gel Loading buffer.
- Legg prøven i en 5% agarosegel / 0,5x TAE-buffer og utfør elektroforese (50 V i 40 minutter).
- Klipp og samle gelen over 50 bp (se figur 6) og trekk ut DNA ved hjelp av et gelekstraksjonssett.
MERK: Trygt stoppested: Eksperimentet kan trygt stoppes her i minst en uke. - Konstruer sekvenseringsbiblioteket ved hjelp av et DNA-bibliotekforberedelsessett (se materialtabellen)16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
K562-enkeltceller ble generert ved hjelp av protokollen beskrevet i trinn 8 (se figur 5). Enkeltceller ble innebygd i det ytre laget av polyakrylamidperlen. Celle-DNA ble farget og visualisert ved hjelp av et interkalatorfargestoff for DNA-farging.
Figur 5: Genererte enkeltceller som kan brukes på nytt. Cellene er farget med et interkalatorfargestoff for DNA (grønn fluorescens). Hvite piler indikerer enkeltceller innebygd i det ytre laget av polyakrylamidperler. Den gjenbrukbare enkeltcellen er plassert i en 96-brønns flatbunnsplate. Bildene ble tatt med et skanningsmikroskop, BZ-X710. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Resultatene vist i figur 6 støttet genereringen av de ønskede DNA-produktene. DNA-produkter fra trinn 19.7 ble spaltet av BciVI-restriksjonsenzymet i 19-20 bp, 31-32 bp, 49 bp og >49 bp-fragmenter. Disse resultatene støttet konklusjonen om at de fleste produkter inneholder antistoffprobe-avledede sekvenser og 2. tilfeldige primer-avledede sekvenser. DNA-produktene ble deretter ligert med Illumina-adapteren ved hjelp av et TruSeq Nano-sett og sekvensert ved hjelp av en Illumina NovaSeq6000-sekvenser.
Figur 6: DNA-produkter før og etter BciVI-restriksjonsenzymfordøyelse . (A) BciVI-fordøyelsen genererte de forventede 19-20 bp-fragmentene, 31-32 bp-fragmentene og de ønskede produktene (>49 bp) som inneholder antistoffstrekkode, ligert sekvens, genomisk DNA og cellestrekkode. (B) Størrelsesfordeling av sluttproduktene på slutten av trinn 19.7. Konstruert DNA-bibliotek ble analysert ved kapillær elektroforese. Den lyserosa linjen indikerer de ønskede produktene som inneholder sekvenseringsadaptere, antistoffstrekkode og cellestrekkode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Sekvenseringsresultatene indikerte at produktene generert ved å følge trinn 7-19 inneholder antistoffprobe, ligert sekvens, genomsekvens og cellestrekkode. Unike kartleste avlesninger fra anti-H3K27ac og anti-H3K27me3 var signifikant flere enn fra kontroll-IgG (se figur 7A). Dette indikerer at den spesifikke bindingen av anti-H3K27ac og anti-H3K27me3 øker antallet av de ønskede produktene. Den mest avanserte teknologien for enkeltcelle epigenomanalyse, Paired-Tag, kjøper rundt 2,000 unike avlesninger av H3K27ac og 1,500 unike avlesninger av H3K27me3 per kjerne. Våre resultater viste et mye høyere antall unike avlesninger (gjennomsnittlig 699 398 H3K27ac signaler / celle og 505 433 H3K27me3 signaler / celle). Resultatene støttet også konklusjonen om at gjentatte eksperimenter med samme gjenbrukbare enkeltcelle reduserer tap av signal og øker signaltettheten.
REpi-seq-signalene vist i figur 7A ble evaluert ved å sammenligne REpi-seq-dataene med bulk ChIP-seq-data. I figur 7B overlappet i gjennomsnitt 91 % ± 3,24 % av H3K27ac-signalene fra REpi-seq med H3K27ac-topper i bulk ChIP-seq. Denne analysen måler nivået av "presisjon" i encellet epigenomanalyse18. Presisjonen til dagens encellede epigenomiske metoder for det aktive histonmerket H3K4me3 er 53% (Drop-ChIP; H3K4me3)18, 50 % (scChIC-seq; H3K4me3)19, og 60 % (ACT-seq; H3K4me3)20. I tillegg var presisjonen til REpi-seq for det inaktive histonmerket H3K27me3 i gjennomsnitt 52,09 % ± 3,71 % (figur 7C), mens presisjonen for H3K27me3 var 47 % i enkeltcelle ChIC-seq19. Avslutningsvis viser REpi-seq høy presisjon ved å oppdage H3K27ac og H3K27me3.
Vi analyserte også "sensitiviteten"18 av REpi-seq, som måler hvor mange topper av bulk ChIP-seq som ble detektert av REpi-seq reproduserte avlesninger (figur 7D,E). Sensitiviteten til REpi-seq var 55,30 % i H3K27ac og 50,94 % i H3K27me3. I andre enkeltcelleepigenommetoder er sensitiviteten 5% i Drop-ChIP (H3K4me3)18, 5% i ACT-seq (H3K4me3)20 og 9,5% i scChIC-seq (H3K27me3)19. Disse resultatene indikerer at REpi-seq er følsom ved å oppdage epigenetiske signaler.
Figur 7: Signaltall, presisjon og følsomhet i REpi-seq. De samme forsøkene ble gjentatt 3 ganger med samme gjenbrukbare enkeltcelle (en K562-celle). (A) Innhentede signaler fra de samme åtte enkeltcellene. Hver prikk representerer en gjenbrukbar enkeltcelle. Unike signaler fra kontroll-IgG (svart), anti-H3K27me3 (blå) og anti-H3K27ac (rød) i samme enkeltceller ble telt. Anti-H3K27me3- og anti-H3K27ac-signaler var signifikant høyere enn kontroll-IgG, noe som indikerer at spesifikk binding av antistoffer genererer signaler mer effektivt enn kontroll-IgG. Bar: gjennomsnitt, feillinje: standardavvik. (B, C) Presisjon av REpi-seq H3K27ac (B) og H3K27me3 (C) unike leser. Presisjonen av unike avlesninger avledet fra REpi-seq var basert på overlapping med kjente ChIP-seq-topper fra K562 bulkcelleanalyse (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). Prosentandelene av REpi-seq H3K27ac og H3K27me3 leser bekreftet av ChIP-seq topper ble beregnet i hver enkelt celle. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig prosent av 8 enkeltceller. (D, E) Sensitivitet av REpi-seq ved påvisning av H3K27ac (D) og H3K27me3 (E) kjente topper. Unike lesninger av REpi-seq ble brukt. H3K27ac- og H3K27me3-topper identifisert av ChIP-seq av K562-bulkceller i ECODE-prosjektet (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) ble anerkjent av REpi-seq unike leser. Resultatene uttrykkes som den gjennomsnittlige prosentandelen ChIP-seq-topper anerkjent av REpi-seq unike avlesninger. Panelene B-E ble gjengitt fra Ohnuki et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Buffere brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Antistoffer og IgG-kontroll brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Oligonukleotid-DNA brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsvideo S1: Automatisert enkeltcelleplukking og overføring til en 96-brønns PCR-plate (trinn 8.2.4). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo S2: Supernatant fjerning fra en brønn som inneholder en enkelt celle ved hjelp av en væskehåndteringsrobot (trinn 8.2.8.1). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo S3: Tilsetning av 4% TEMED / mineralolje til en brønn som inneholder en enkelt celle ved hjelp av en væskehåndteringsrobot (trinn 8.2.8.2). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggskode 1: Automatisert program for væskehåndteringsroboten fra trinn 8.2.8.1-8.2.8.2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver trinn-for-trinn-protokollen for den nylig rapporterte enkeltcellede multiepigenomiske analysen ved bruk av gjenbrukbare enkeltceller7. I de påfølgende avsnittene diskuterer vi kritiske punkter, med vekt på potensielle begrensninger i protokollen.
Et av de kritiske punktene i hele protokollen (fra trinn 7.2-13) er å unngå DNase-forurensning. En enkelt celle har bare to kopier av genomisk DNA. Derfor reduserer skadelig genomisk DNA kritisk signalnummeret. Å unngå forurensning med DNase er viktig for å beskytte integriteten til genomisk DNA.
Permeabilitet av reagensene over cellemembranen / celleveggen er også kritisk gjennom hele protokollen. REpi-seq ble designet for å analysere epigenomet til mus og humane celler på enkeltcellenivå. De optimale forholdene for denne eksperimentelle metoden forventes å variere avhengig av permeabiliteten til celletyper og kjernemembran for hvert reagens. Derfor, når metoden brukes på andre celler enn mus og humane celler, som planteceller, gjær og bakterier, må forholdene på hvert trinn optimaliseres.
Vi tror at et kritisk punkt spesifikt for trinn 9.5 (glødning av den første tilfeldige primeren) er den raske nedkjølingshastigheten etter denaturering av genomisk DNA. Langsom og gradvis avkjøling etter denaturering kan redusere glødeeffektiviteten til de tilfeldige primerne som binder seg til det genomiske DNA. Videre, i trinn 11 (nærhetsligering), er et kritisk punkt buffersammensetningen. Buffere som inneholder polyetylenglykol (PEG) er mye brukt for raskere ligeringsmetoder i molekylærbiologiske applikasjoner. En lav konsentrasjon av PEG (f.eks. <7,5%) fremmer rask dannelse av dobbeltstrenget DNA uten DNA-utfelling. Imidlertid observerte vi at ligeringsbufferen som inneholdt PEG induserer krymping av encellet gelperle som inneholder enkeltcellen (gjenbrukbar enkeltcelle), noe som tyder på at maskestørrelsen på polyakrylamidstillaset hadde krympet. Siden denne krympingen kan føre til redusert tilgjengelighet av T4 DNA-ligase, bestemte vi oss for ikke å bruke den raskere ligeringsprotokollen for REpi-seq.
I REpi-seq kan resultatene evalueres ved redeteksjonsfrekvensen av signaler i de samme enkeltcellene. Redeteksjonsfrekvensen er nyttig for å overvåke reaksjoner, inkludert nærhetsligering med antistoffsonden og første tilfeldige primer. Virapporterte tidligere 7 at 62,03% av H3K27ac-avlesningene i ett eksperiment ble bekreftet i to replikasjonseksperimenter, noe som tyder på at effektiviteten av nærhetsligering i individuelle eksperimenter er høyere enn den totale redeteksjonsprosenten i gjentatte eksperimenter.
Vi har også tidligere rapportert7 den vellykkede påvisningen av RNA-polymerase II (Pol II) binding til DNA i gjenbrukbare enkeltceller. Pol II-binding er vanskelig å fange med dagens encellede epigenommetoder på grunn av den tidsmessige og ustabile naturen til denne bindingen.
Nåværende transposasebaserte CUT&Tag-tilnærminger for enkeltcelleepigenomanalyse krever bevaring av nukleosom-DNA-interaksjon. Et spesifikt antistoff binder seg til en histonmodifikasjon; deretter spalter transposase festet til antistoffet det genomiske DNA og setter inn en DNA-strekkode på DNA-spaltningsstedet. Denne reaksjonen avhenger av nukleosom (histon)-DNA-interaksjon. Derfor er det viktig at nukleosom-DNA-interaksjoner og strukturen av cellulære proteiner og kromatin forblir intakte. Derfor er CUT&Tag-tilnærminger uunngåelig partisk til tilgjengelige regioner av kromatinstruktur i analysen av histonmodifikasjoner.
Den uunngåelige forspenningen mot de tilgjengelige kromatinområdene hindrer økningen av antall epigenetiske signaler i enkeltcelleepigenomanalyse. Kromatinstrukturer dannes av flere typer molekylære interaksjoner, inkludert DNA-nukleosom- og nukleosom-nukleosominteraksjoner gjennom nukleosomaksosierte proteiner. Derfor valgte vi ikke å bevare DNA-protein- og protein-protein-interaksjoner i de gjenbrukbare enkeltcellene samtidig som vi opprettholdt plasseringen av cellulære proteiner. Denne egenskapen oppnås ved bruk av monomert akrylamid og en paraformaldehydblanding (protokoll trinn 7), som modifiserer aminogruppen på cellulære proteiner i stedet for å kryssbinde protein til protein eller protein til DNA.
Plasseringen av histoner og genomassosierte proteiner beholdes ved forbindelsen til polyakrylamidpolymeren. Nukleosomer denatureres rundt 71-74 ° C21. Derfor, i den gjenbrukbare enkeltcellen, er histoner sannsynligvis denaturert og avslappet / dissosiert fra hverandre etter glødningstrinnet til 1st tilfeldig primer (94 ° C). Dette kan slappe av heterokromatinstrukturen og forbedre tilgjengeligheten av antistoffer og andre molekyler til heterokromatinregioner. Denne konklusjonen støttes av våre rapporterte resultater7 som viser at skjevhet assosiert med kromatinstruktur er redusert i gjenbrukbare enkeltceller sammenlignet med CUT&Tag-tilnærminger9.
Forbindelsen mellom histon H3 og polyakrylamid opprettholdes etter minst 3 runder med varmedenaturering, da plasseringen av histoner i den gjenbrukbare enkeltcellen bevares over gjentatte eksperimenter7. Denne funksjonen tillater repetisjon av det samme eksperimentet ved hjelp av samme enkeltcelle. Gjentatte eksperimenter bidrar til å øke antall signaler fra en enkelt celle sammenlignet med CUT&Tag-tilnærminger.
Etterprøvbarhet er et grunnleggende prinsipp i vitenskapen. Imidlertid er verifisering av eksperimentelle resultater av en enkelt celle ikke mulig i CUT&Tag-tilnærminger, da gjentatte eksperimenter med de samme cellene ikke er mulige. Det genomiske DNA spaltes av transposase og mottar DNA-strekkoden for ett epigenetisk merke. Det spaltede genomiske DNA frigjøres fra sin opprinnelige plassering. Derfor har CUT&Tag-tilnærmingen en ulempe for analysen av flere epigenetiske merker i samme enkeltcelle. Denne egenskapen til CUT&Tag-metoder ligger til grunn for avveiningen av redusert signaltetthet med et økt antall epigenetiske merker per enkelt celle.
For å unngå dette problemet kopierte vi genomisk DNA i stedet for å kutte genomet og merket deretter det kopierte genomiske DNA med en antistoff-DNA-probe. REpi-seq tillater analyse av de samme enkeltcellene og øker signaltettheten. Det gir også et middel for verifiserbarhet av eksperimentelle resultater, multipleksing epigenomisk analyse, og løse avveiningsproblemet i CUT &Tag tilnærminger. Selv om metoden overvinter begrensningene ved transposasebasert epigenomisk analyse, er den ennå ikke i stand til å analysere et stort antall celler på enkeltcellenivå. Videre utvikling er nødvendig.
Avslutningsvis kopierer REpi-seq genomisk DNA i stedet for å kutte genomet og merker deretter det kopierte genomiske DNA med en antistoff-DNA-sonde. REpi-seq er fortsatt i barndom og trenger å øke gjennomstrømningen av celler. Imidlertid har REpi-seq styrker, som overvinner begrensningene i dagens encellede epigenommetoder: 1) økende signaltetthet ved å redusere frafall av signaler gjennom gjentatte eksperimenter i de samme enkeltcellene; 2) redusere strukturell skjevhet ved å redusere utilgjengelige regioner basert på kromatinstruktur; 3) gi verifiserbarhet av eksperimentelle resultater ved gjentatte eksperimenter i samme enkelt celle, 4) signalidentifikasjon basert på redeteksjonssannsynlighet for det samme signalet i hver enkelt celle; 5) analysere flere epigenetiske merker i samme enkeltcelle uten konkurranse mellom epigenetiske merker. Disse fremskrittene tillater analyse av epigenetiske mekanismer i en enkelt celle, noe som er en viktig applikasjon og ikke mulig med de andre enkeltcellede epigenomiske metodene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Ohnuki og Tosato er medoppfinnere på et patent med tittelen "Metoder for å forberede en gjenbrukbar enkeltcelle og metoder for å analysere epigenomet, transkriptomet og genomet til en enkelt celle" (EP3619307 og US20200102604). Patentsøknaden ble innlevert delvis basert på foreløpige resultater knyttet til teknologien beskrevet i det aktuelle manuskriptet. Oppfinnelsen eller oppfinnelsene beskrevet og hevdet i denne patentsøknaden ble gjort mens oppfinnerne var heltidsansatte i den amerikanske regjeringen. Derfor, under 45 Code of Federal Regulations Part 7, har alle rettigheter, tittel og interesse for denne patentsøknaden blitt eller bør ved lov tildeles den amerikanske regjeringen. Den amerikanske regjeringen overfører en del av royalties den mottar til sine ansatte oppfinnere under 15 US Code § 3710c.
Acknowledgments
Vi takker Dr. David Sanchez-Martin og Christopher B. Buck for kommentarer under konseptualiseringsfasen av prosjektet. Vi takker også Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health for hjelp i foreløpige eksperimenter, og Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH for råd i beregningsanalyse. Vi takker Anna Word for å hjelpe til med optimalisering av DNA-polymeraser som brukes i metoden. Dette arbeidet utnyttet beregningsressursene til NIHHPC Biowulf-klyngen (http://hpc.nih.gov). Dette prosjektet støttes av Intramural Program av Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, NCI Director's Innovation Award (# 397172), og føderale midler fra National Cancer Institute under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Vi takker Dr. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy, og alle medlemmer av Laboratory of Cellular Oncology for produktive kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo- DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
- Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
- Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
- Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
- Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
- Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
- Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
- Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
- Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
- Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
- Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
- Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
- Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
