Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genanvendelig enkeltcelle til iterative epigenomiske analyser

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

Denne protokol beskriver en enkeltcellemetode til iterative epigenomiske analyser ved hjælp af en genanvendelig enkeltcelle. Den genanvendelige enkeltcelle muliggør analyser af flere epigenetiske mærker i samme enkeltcelle og statistisk validering af resultaterne.

Abstract

Nuværende enkeltcelle epigenomanalyser er designet til engangsbrug. Cellen kasseres efter en enkelt brug, hvilket forhindrer analyse af flere epigenetiske mærker i en enkelt celle og kræver data fra andre celler for at skelne signal fra eksperimentel baggrundsstøj i en enkelt celle. Dette papir beskriver en metode til at genbruge den samme enkelte celle til iterative epigenomiske analyser.

I denne eksperimentelle metode er cellulære proteiner først forankret til en polyacrylamidpolymer i stedet for at krydsbinde dem til protein og DNA, hvilket lindrer strukturel bias. Dette kritiske trin tillader gentagne eksperimenter med den samme enkeltcelle. Derefter udglødes en tilfældig primer med en stilladssekvens til nærhedsligering til det genomiske DNA, og den genomiske sekvens tilsættes primeren i forlængelse heraf under anvendelse af en DNA-polymerase. Derefter er et antistof mod en epigenetisk markør og kontrol IgG, hver mærket med forskellige DNA-sonder, bundet til de respektive mål i den samme enkeltcelle.

Nærhedsligering induceres mellem den tilfældige primer og antistoffet ved at tilføje et forbindelses-DNA med komplementære sekvenser til stilladssekvensen af den tilfældige primer og antistof-DNA-sonden. Denne tilgang integrerer antistofinformation og nærliggende genomsekvenser i et enkelt DNA-produkt af nærhedsligering. Ved at muliggøre gentagne eksperimenter med den samme enkeltcelle tillader denne metode en stigning i datatæthed fra en sjælden celle og statistisk analyse ved kun at bruge IgG- og antistofdata fra den samme celle. De genanvendelige enkeltceller fremstillet ved denne metode kan opbevares i mindst et par måneder og genbruges senere for at udvide epigenetisk karakterisering og øge datatætheden. Denne metode giver fleksibilitet til forskere og deres projekter.

Introduction

Enkeltcelleteknologi går ind i æraen med enkeltcelle multiomics, som integrerer individuelle enkeltcelle omics-teknologier1. For nylig er enkeltcelletranskriptomik blevet kombineret med metoder til påvisning af kromatintilgængelighed (scNMT-seq2 og SHARE-seq3) eller histonmodifikationer (Paired-seq4 og Paired-Tag5). For nylig blev enkeltcelletranskriptomik og proteomik integreret med kromatintilgængelighed (DOGMA-seq6). Disse metoder bruger transposasebaseret tagging til påvisning af kromatintilgængelighed eller histonmodifikationer.

Transposasebaserede tilgange spalter genomisk DNA og tilføjer en DNA-stregkode i slutningen af det genomiske DNA-fragment. Hvert spaltet genomisk fragment kan kun acceptere op til to DNA-stregkoder (= et epigenetisk mærke pr. spaltningssted), og det genomiske DNA på spaltningsstedet går tabt. Derfor har spaltningsbaserede tilgange en afvejning mellem antallet af testede epigenetiske mærker og signaltætheden. Dette hæmmer analysen af flere epigenetiske mærker i samme enkeltcelle. En enkeltcelle epigenomisk metode, der ikke spalter det genomiske DNA, blev udviklet for at overvinde dette problem 7,8.

Ud over det spaltningsafledte problem, der er nævnt ovenfor, har transposasebaserede tilgange andre begrænsninger. I enkeltcelle epigenomanalyse er det afgørende at kende placeringen af histoner og DNA-associerede proteiner på genomet. I nuværende tilgange opnås dette ved at bruge ikke-fikserede enkeltceller og tilbageholdelse af protein-DNA og protein-proteininteraktioner. Dette genererer imidlertid stærk bias til tilgængelige kromatinregioner, selv i analysen af histonmodifikationer 9. Placeringen af histoner og genomassocierede proteiner på genomet kan bevares uden tværbinding af protein-DNA og proteinprotein ved hjælp af et polyacrylamidstillads 7,8. Denne tilgang reducerer den strukturelle bias, der observeres i nuværende tilgange, der afhænger af protein-DNA og protein-proteininteraktioner.

Transposasebaserede tilgange kan kun erhverve signaler én gang fra en enkelt celle. Derfor er det vanskeligt at afgrænse det komplette epigenom af en enkelt celle på grund af signalernes drop-off. Genanvendelige enkeltceller er udviklet til at overvinde de nuværende begrænsninger ved at tillade iterativ epigenomisk analyse i den samme enkeltcelle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: En skematisk gengivelse af metoden er vist i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af protokolarbejdsprocessen. Trin 7.2-13 forklares gennem skematiske repræsentationer. Hver række angiver et trin i protokollen. Et cellulært protein farvet i grønt er et humant nukleosom, der genereres baseret på en krystalstruktur (PDB: 6M4G). Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Ligevægt af afsaltningskolonner

BEMÆRK: Afsaltning af centrifugeringskolonner er ekvilibrerede som beskrevet i de følgende trin. De ekvilibrerede afsaltningskolonner anvendes i trin 2.1, 3.4 og 4.6.

  1. Fjern den nederste lukning af en afsaltningssøjle (7 kDa afskæring, 0,5 ml harpiksperlevolumen, se materialetabellen), og løsn hætten øverst på afsaltningskolonnen.
  2. Kolonnen anbringes i et 1,5 ml proteinrør med lav binding (et opsamlingsrør, se materialetabellen) og centrifugeres ved 1.500 × g i 1 min ved stuetemperatur for at fjerne opbevaringsopløsningen i kolonnen.
    BEMÆRK: Brug en svingrotorcentrifuge til at flade toppen af perlelejet.
  3. Gennemstrømningen i 1,5 ml røret fjernes, og der tilsættes 300 μL 150 mM NaCl/100 mM fosfatbuffer, pH 8,0 (se tabel 1), oven på harpiksbunden.
  4. Der centrifugeres ved 1.500 × g i 1 min ved stuetemperatur, og gennemstrømningen i opsamlingsrøret fjernes.
  5. Gentag trin 1.3-1.4 yderligere tre gange.
  6. Kassér bufferen fra opsamlingsrøret, og anbring søjlen i et nyt opsamlingsrør.
  7. Brug den ekvilibrerede afsaltningskolonne i trin 2.1, 3.4 og 4.4.

2. Bufferudveksling af antistoffer

BEMÆRK: Fjern glycerol, arginin og natriumazid fra anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 og anti-Pol II10 (se buffersammensætning vist i tabel 1). Alle følgende procedurer udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 1 time

  1. Antistofopløsningen (100 μL, se tabel 2) påføres en ligevægtig afsaltningskolonne fremstillet efter trin 1.
  2. Der centrifugeres ved 1.500 × g i 2 minutter ved 4 °C, og gennemstrømningen overføres fra opsamlingsrøret til et 1,5 ml proteinrør med lav binding.
  3. IgG-koncentrationen måles ved hjælp af absorbans ved 280 nm12 (brug et mikrovolumenspektrofotometer).
  4. Antistofopløsningen overføres til en ultrafiltreringskassette (molekylvægt afskåret 100 kDa, 0,5 ml, se materialetabellen) og centrifugeres ved 12.000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
  5. IgG-koncentrationen måles ved hjælp af absorbansen ved 280 nm.
  6. Gentag trin 2.4-2.5, indtil IgG-koncentrationen når 1 mg/ml.

3. Aktivering af antistof

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 2,5 timer

  1. 1 mg succinimidyl-6-hydrazinonicotinatacetonehydrazon (S-HyNic, se materialetabellen) opløses med 100 μL vandfrit N,N-dimethylformamid (DMF, se materialetabellen).
    BEMÆRK: DMF er et brandfarligt organisk opløsningsmiddel og et potent levertoksin absorberet gennem huden. Brug handsker, sikkerhedsbriller og en laboratoriefrakke. Følg de institutionelle sikkerhedsretningslinjer. Kassér det brugte labware i henhold til de institutionelle retningslinjer.
  2. Der tilsættes 0,6 μL S-HyNic/DMF til 100 μL af antistofopløsningen (1 mg/ml i 150 mM NaCl/100 mM natriumphosphat, pH8,0. Se tabel 2 for de anvendte antistoffer og kontrol IgG.
  3. Inkuber ved stuetemperatur i 2 timer (beskytter mod lys).
  4. Der påføres 100 μL S-HyNic-reageret antistof øverst på den ækvilibrerede afsaltningskolonne (se trin 1), og centrifugeres ved 1.500 × g i 2 minutter ved 4 °C for at opsamle prøven.
  5. Afsaltningskolonnen kasseres efter brug.
    BEMÆRK: Stabiliteten af HyNic-grupper på proteiner og andre biomolekyler varierer. Det anbefales straks at konjugere HyNic-modificerede biomolekyler.

4. Aktivering af DNA-sonde

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 2,5 timer

  1. En pellet af en aminmodificeret DNA-sonde opløses til antistof eller kontrol IgG (antistofsonde, tabel 3) med 20 μL 150 mM NaCl/100 mM natriumphosphatbuffer, pH 8,0.
    BEMÆRK: Se efter en tynd, gennemsigtig pille / film i bunden af røret. Påfør bufferen direkte på pelleten. Hvis pillen ikke er synlig, kan pillen have løsnet sig og klæbet til væggen eller låget. I dette tilfælde centrifugeres røret og ser efter en pellet i bunden af røret.
  2. 1 mg succinimidyl-4-formylbenzoat (S-4FB, se materialetabellen) opløses med 50 μL vandfri DMF, og der tilsættes 10 μL DMF til sonden mod opløste antistoffer.
  3. Der tilsættes 4 μL S-4FB/DMF fremstillet i trin 4.2, blandes og inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer (beskytter mod lys).
  4. Påfør 34 μL S-4FB-reageret antistofsonde øverst på den ekvilibrerede afsaltningskolonne (se trin 1).
  5. Påfør 15 μL 150 mM NaCl/100 mM natriumphosphatbuffer, pH 8,0, øverst på gellejet, når prøven er fuldt absorberet, og centrifuger ved 1.500 × g i 2 minutter ved 4 °C for at opsamle den S-4FB-modificerede antistofsonde.
  6. Brug gennemstrømningen til den efterfølgende konjugering; absorbansen måles ved 260 nm og beregne genvindingshastigheden for antistofsonden.

5. Konjugering af S-HyNic-modificeret antistof og S-4FB-modificeret antistofsonde

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 2 timer

  1. Bland det S-HyNic-modificerede antistof og den S-4FB-modificerede antistofsonde, og pipette opløsningen op og ned for at blande.
  2. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur (beskytter mod lys).
  3. For at slukke reaktionen tilsættes 478,8 μL Quenching & Storage opløsning (se tabel 1).
  4. Antistofsondens konjugerede antistofopløsning overføres til en ultrafiltreringskassette (molekylvægtsafskæring 100 kDa).
  5. Der centrifugeres i 5 minutter ved 12.000 × g, 4 °C.
  6. Kontroller opløsningens volumen inde i kassetten ved pipettering.
  7. Gentag trin 5.5-5.6, indtil lydstyrken når 100 μL, og opbevar ved -20 °C.
    BEMÆRK: IgG-koncentration måles ved sandwich ELISA13,14,15 ved hjælp af en IgG-standard.

6. Forberedelse af kernemagnetiske perler

BEMÆRK: I denne metode er en enkelt celle indlejret i en tolags acrylamidperle (se figur 2). Kernen er en magnetisk polyacrylamidperle. Det ydre lag er polyacrylamid alene. De magnetiske kerneperler genereres i dette afsnit. Dette afsnit er ikke afgørende for eksperimentet. Tid: 3 timer

Figure 2
Figur 2: Struktur af en dobbeltlags polyacrylamidperle for synlighed og nem håndtering i REpi-seq-eksperimenter. (A) Magnetiske nanopartikler fra trin 6.6 efter centrifugering. De magnetiske nanopartikler modificeres med monomere acrylamid og integreres i den magnetiske polyacrylamidperle vist i B. B) Skematisk gengivelse af en genanvendelig enkeltcelle med en magnetisk polyacrylamidperle. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Bland 50 μL 1 M natriumbicarbonatbuffer, pH 8,5 og 450 μL 40% acrylamidopløsning.
    BEMÆRK: Acrylamid er et neurotoksin. Brug handsker, øjenbeskytter og laboratoriefrakke. Følg de institutionelle sikkerhedsretningslinjer. Kassér det brugte labware i henhold til de institutionelle retningslinjer.
  2. 1 g NHS-esterfunktionaliseret 30 nm jernoxidpulver suspenderes (se materialetabellen) i acrylamid/natriumbicarbonatbufferen og inkuberes ved 4 °C natten over.
    BEMÆRK: Da akrylamidperler er gennemsigtige, kan det være svært at se og manipulere perlernes placering. Inkluderingen af en kerneperle lavet af jernoxid forbedrer synligheden og letter manipulation, fordi perlernes position kan styres ved hjælp af en magnet. Men hvis brugerne er bekendt med REpi-seq-eksperimenterne, kan brugen af kernemagnetiske polyacrylamidperler springes over.
  3. Nanoperlesuspensionen overføres til 2 glas (1,5 ml), centrifugeres ved 21.300 × g i 1 time (brug en vinklet rotor) ved 4 °C, og supernatanten fjernes.
  4. Ophæng bundslammyllen med 1 ml 40% acrylamid/bis-acrylamid (19:1, se materialetabellen).
    BEMÆRK: Bis-acrylamid er et neurotoksin. Brug handsker og en laboratoriefrakke. Følg de institutionelle sikkerhedsretningslinjer. Kassér det brugte labware i henhold til de institutionelle retningslinjer.
  5. Der centrifugeres ved 21.300 × g i 1 time (brug en vinklet rotor) ved 4 °C.
  6. Der centrifugeres ved 5.000 × g i 30 minutter (brug en svingrotor uden bremse) ved 4 °C.
  7. Supernatanten fjernes med en P1000-pipette med langsom aspiration.
  8. Juster lydstyrken til 400 μL 40% acrylamid/bis-acrylamid (19:1, se materialetabellen).
  9. Der tilsættes 25 μL 10% ammoniumpersulfatopløsning (se tabel 1).
    BEMÆRK: Ammoniumpersulfat er et stærkt oxidationsmiddel. Luftbårent støv indeholdende ammoniumpersulfat kan irritere øjne, næse, hals, lunge og hud ved kontakt. Brug handsker, sikkerhedsbriller og en laboratoriefrakke. Følg de institutionelle sikkerhedsretningslinjer. Kassér det brugte labware i henhold til de institutionelle retningslinjer.
  10. For at generere kernemagnetiske polyacrylamidperler overføres 0,5 μL af den acrylamidmodificerede jernoxidsuspension til et PCR-rør.
  11. Der tilsættes 50 μL 4% N,N,N' ,N'-tetramethylethylendiamin/mineralolie (TEMED, se tabel 1) og inkuberes natten over ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: TEMED er et brandfarligt opløsningsmiddel. Arbejd under en hætte. Indånd ikke. Holdes væk fra åben ild, varme overflader og antændelseskilder. Brug handsker, sikkerhedsbriller og en laboratoriefrakke. Følg de institutionelle sikkerhedsretningslinjer. Kassér det brugte labware i henhold til de institutionelle retningslinjer.

7. Ændring af aminogruppen af cellulære proteiner med monomeracrylamid

BEMÆRK: REpi-seq blev designet til at analysere epigenomet af mus og humane celler på enkeltcelleniveau. Hvert trin skal optimeres, når denne metode anvendes på celler af andre arter end mus eller menneske.

  1. Høstning af cellerne
    BEMÆRK: Tid: 30 min
    1. Mål cellekoncentrationen og levedygtigheden ved hjælp af en celletæller (se materialetabellen).
      BEMÆRK: Cellernes levedygtighed på dette trin påvirker, hvor mange celler der er levende celler i dataanalysen.
    2. Cellekoncentrationen justeres til 1 × 105 celler/ml med dyrkningsmedium (*) indeholdende 10% føtalt bovint serum.
      BEMÆRK: *Kulturmedium er et optimalt dyrkningsmedium for de celler, der er af interesse.
    3. Overfør 1 ml af cellesuspensionen til et 1,5 ml rør.
    4. Cellesuspensionen centrifugeres ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes.
    5. Der tilsættes 1 ml fosfatbufret saltvand (PBS), cellerne blandes forsigtigt med pipettering, og cellesuspensionen centrifugeres ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C.
    6. Supernatanten fjernes.
      BEMÆRK: Alle ovenstående trin skal udføres i en laminar flow ren hætte for at forhindre forurening.
  2. Ændring af aminogruppen af cellulære proteiner med monomert acrylamid
    BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 1,5 time
    1. Der tilsættes 1 ml aminogruppemodifikationsopløsning (se tabel 1) til cellepelleten, og cellepelleten suspenderes ved forsigtig pipettering.
    2. Reagensglasset inkuberes på is i 1 time og centrifugeres cellesuspensionen ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C.
    3. Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes med 100 ml 4 % acrylamid/1 mM EDTA/PBS indeholdende et interkalatorfarvestof for DNA (se tabel 1, 1 celle/μL).

8. Fremstilling af genanvendelige enkeltceller

  1. Fremstilling af genanvendelige enkeltceller (manuel version)
    BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 9 t/96 celler
    1. Der blandes 1 ml cellesuspension (1 celle/μl) og 199 ml 1 mM EDTA/PBS indeholdende et interkalatorfarvestof til DNA (se tabel 1).
    2. Overfør 200 μL af cellesuspensionen til hvert hul med fladbundede plader med 96 brønde (i alt 10 plader, se materialetabellen).
    3. Sæt dækslet på 96-brøndpladen og scan de 10 plader ved hjælp af et scanningsmikroskop (se materialetabellen) for at identificere brønde, der indeholder en enkelt celle.
    4. Overfør indholdet af brønden, der indeholder en enkelt celle, til et PCR-rør.
      1. Vip pladen (mod operatøren), og vent et par minutter, indtil den enkelte celle er sunket til brøndens nederste kant.
      2. Placer pipettespidsen i nederste hjørne, og overfør den enkelte celle og bufferen (aspirer 210 μL/hul = 200 μL buffer + 10 μL luft) til et PCR-rør.
        BEMÆRK: Sørg for at bruge en P200-spids med lav fastholdelse.
      3. Kontroller brønden ved hjælp af et fluorescensmikroskop for at bekræfte overførslen.
      4. Hvis en enkelt celle stadig er i brønden, tilsættes 200 μL / hul på 1 mM EDTA / PBS indeholdende et interkalatorfarvestof til DNA.
      5. Gentag derefter overførslen.
    5. PCR-røret centrifugeres ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C ved hjælp af en svingrotor uden bremse.
      BEMÆRK: Bremsning forårsager en hvirvlende strøm af vand i røret, hvilket forstyrrer udfældningen af den enkelte celle. Ved centrifugering med en svingende rotor uden bremse vil den enkelte celle altid synke til bunden af røret. Men hvis der anvendes en vinklet rotor, fastgøres den enkelte celle til PCR-rørets sidevæg og kan gå tabt.
    6. 195 μL supernatant fjernes med en meget langsom pipetteringshastighed.
    7. Der tilsættes 195 μL/tube acrylamid/bis-acrylamid/APS-opløsning (se tabel 1).
    8. PCR-røret centrifugeres ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C ved hjælp af en svingrotor uden bremse.
    9. 195 μL supernatant fjernes med meget langsom pipettering.
    10. Overfør de nederste 3 μL til PCR-røret, der indeholder 4% TEMED/mineralolie og en magnetisk polyacrylamidperle (genereret i trin 6).
      BEMÆRK: Sørg for at bruge en P10-spids med lav fastholdelse. Dispenser cellen nær den magnetiske polyacrylamidperle. I mineralolien klæber væsken indeholdende enkeltcellen til overfladen af den magnetiske polyacrylamidperle ved overfladespænding.
    11. Inkuber natten over ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Denne proces genererer en tolags acrylamidgelperle. Kernen er en magnetisk gelperle. Det ydre lag er polyacrylamidgel indeholdende en enkelt celle. Den enkelte celle er indlejret i det ydre lag af gelen. Sikkert stoppunkt: Efter vask af de genanvendelige enkeltceller med 50% glycerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% BSA/TBS buffer kan de genanvendelige enkeltceller opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
  2. Fremstilling af genanvendelige enkeltceller (semiautomatiseret version)
    BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 3 t/96 celler
    1. Bland 1 ml cellesuspension (1 celle/μL) og 199 ml 1 mM EDTA/PBS indeholdende et interkalatorfarvestof til DNA (se tabel 1).
    2. Overfør 200 μL af cellesuspensionen til hver brønd i en 4 nL nanobrøndplade (se figur 3 og materialetabellen), og anbring 4 nL nanobrøndpladen på en automatiseret enkeltcelleplukkerobot (se materialetabellen).
    3. Placer en 96-brønds PCR-plade som destinationsplade på den automatiserede enkeltcelleplukkerobot. Sørg for, at hvert hul indeholder 200 μL/brønd acrylamid/bis-acrylamid/APS-opløsning (se tabel 1).
    4. Overfør en enkelt celle fra en 4 nL nanobrønd til en brønd på 96-brønds PCR-pladen (se supplerende video S1).
    5. Sæt et dæksel oven på PCR-pladen med 96 brønde, og centrifuger 96-brøndspladen ved 240 × g i 5 minutter ved 4 °C ved hjælp af en svingrotor uden bremse.
    6. Placer PCR-pladen med 96 brønde på dækket af en automatisk væskehåndteringsrobot (se materialetabellen, figur 4 og supplerende kode 1).
    7. Træk og slip den supplerende kode 1 til softwarevinduet (se materialetabellen) på væskehåndteringsrobotten.
    8. Kør programmet på den automatiske væskehåndteringsrobot (se Supplerende Video S2 og Supplerende Video S3).
      1. 195 μL supernatant fjernes med en meget langsom pipetteringshastighed.
      2. Tilsæt 50 μL 4% TEMED/mineralolie.
        BEMÆRK: Trin 8.2.8.1-8.2.8.2 kan udføres ved manuel pipettering.
    9. Der inkuberes natten over ved stuetemperatur (figur 5). Sikkert stoppunkt: Efter vask af de genanvendelige enkeltceller med 50% glycerol/1 mM EDTA/0,05% Tween 20/0,5% BSA/TBS buffer, opbevares de genanvendelige enkeltceller ved -20 °C i op til 6 måneder.

Figure 3
Figur 3: Automatisk enkeltcelleplukning og overførsel til en 96-brønds PCR-plade i trin 8.2 . (A) Oversigt over et enkelt celleplukkesystem. En enkelt celleplukkerobot er i en laminar flow ren hætte for at undgå forurening. (B) En plade med 24 brønde med 4 nL nanobrønde inde i brønden. C) Cellefordeling i en brønd fra 24-brøndpladen. Grønne prikker er celler, der identificeres som en enkelt celle i hver 4 nL nanobrønd. Magenta prikker er celler identificeret som dubletter eller multiplaletter af celler. (D) Brightfield-billede af brønden i 24-brøndspladen. En grøn firkant er en 4 nL nanobrønd, der indeholder en enkelt celle. En magenta firkant er en 4 nL nanobrønd indeholdende flere celler. (E) Forstørret felt af ca. 4 nL nanobrønde. Lyse prikker er enkeltceller i 4 nL nanobrønde. Det enkelte celleplukningssystem identificerer nanobrønde, der indeholder en enkelt celle, ved at erhverve brightfield- og fluorescensbilleder af celler med DAPI-farvning. Identificerede enkeltceller overføres fra 4 nL nanobrønden til en brønd i en 96-brønds PCR-plade. Skalastænger = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Forkortelse = DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Generering af genanvendelige enkeltceller ved hjælp af en væskehåndteringsrobot . A) Et dæk til væskehåndteringsrobotten. Dækket har 11 åbninger til rørlederstativer (P300-spids: Slot 1-3, P20-spids: Slot 5-6), 2 ml dyb brøndplade med 96 brønde (slot 4), to 96-brønds PCR-plader indeholdende en enkelt celle pr. brønd (slot 7 og 10) og to fladbundede 96-brøndsplader til flydende affald (slot 8 og 11). (B) Dækket efter placering af labware. C) Skematisk gengivelse af robotpipettering i trin 8.8.1. Programmet fjerner supernatanten uden at opsuge en eneste celle fra bunden af PCR-pladen med 96 brønde. (D) Genanvendelige enkeltceller genereret ved hjælp af den supplerende kode 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

9. Tilfældig grundglødning og forlængelse

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Stjerner (*) ved de følgende trin indikerer, at en magnetisk separator kan bruges til at styre placeringen af polyacrylamidperlerne, der indeholder en genanvendelig enkeltcelle i røret. Imidlertid er brugen af den magnetiske separator ikke afgørende. Ved at bevæge pipettespidsen langsomt ned langs rørets væg skubbes perlerne op til vask eller bufferudskiftning. Tid: 9 timer

  1. Mineralolien fjernes ved pipettering(*) og vask (*) 5 gange med 200 μL 1x TP Mg(-) buffer (fortynd 10x TP Mg(-) buffer til 1x buffer med ultrarent vand, se tabel 1).
  2. Supernatanten (*) fjernes, og der tilsættes 15 μl udglødningsbuffer (se tabel 1).
  3. Inkuber i 1 time på is.
    BEMÆRK: Formålet med denne inkubation er at permeabilisere plasma og nukleare membraner og levere den tilfældige primer til cellekernen.
  4. Sæt PCR-rørene på en termisk cyklist og opvarm ved 94 °C i 3 minutter.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er ca. 20 μL, inklusive volumenet af polyacrylamidperlen. Temperaturen på det termiske låg er 105 °C.
  5. Overfør rørene til en iskølet metalblok og inkuber i 2 min.
  6. Der tilsættes 4 μLMgSO4/NaCl/dNTP-blanding (se tabel 1) og blandes med en hvirvelblander ved medium hastighed.
  7. Der tilsættes 1 μL Bst-polymerase, stort fragment (se materialetabellen) og blandes ved hjælp af en hvirvelblander med medium hastighed.
  8. Der inkuberes i 4 timer på en ryster (600 o/min ved 4 °C).
    BEMÆRK: Formålet med denne inkubation er at levere Bst-polymerasen til cellekernen.
  9. Placer PCR-røret på en termisk cyklist, og kør et af følgende programmer.
    1. Kør et 4 timers program: 10 ° C i 30 minutter, 20 ° C i 30 minutter og 25 ° C i 180 minutter.
    2. Alternativt kan du køre et overnatningsprogram: 4 °C i 4 timer, 10 °C i 2 timer, 20 °C i 2 timer, 25 °C i 4 timer og holde ved 4 °C.
      BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er ca. 25 μL, inklusive volumenet af polyacrylamidperlen. Temperaturen på låget til termisk cykler er 105 °C. Sikkert stoppunkt: Stop eksperimentet her i op til 1 dag ved at opbevare de genanvendelige enkeltceller ved 4 °C.

10. Antistofbinding

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 1,5 time

  1. Der tilsættes 1,625 μL NaCl/EDTA/BSA-opløsning (se tabel 1) og blandes ved hvirvelstrøm ved lav hastighed.
    BEMÆRK: Dette trin sigter mod at 1) lette chelation af Mg2+ ved EDTA, 2) stabilisere bindingen af den udvidede 1. tilfældige primer med 300 mM NaCl og 3) blokere uspecifik binding af antistoffer ved anvendelse af bovint serumalbumin (BSA) i den efterfølgende reaktion.
  2. Der inkuberes i 1 time på isen, og der tilsættes 0,1 μg/ml hver antistof og kontrol-IgG konjugeret med antistofsonde (fremstillet i trin 5).
  3. Inkuber natten over på is med blid omrystning på en ryster.

11. Nærhedsligering af antistofsonde og proximalt udvidet tilfældig primer

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Stjerner (*) i de følgende trin angiver, hvor en magnetisk separator kan bruges til at styre placeringen af polyacrylamidperler, der indeholder en genanvendelig enkeltcelle i røret. Imidlertid er brugen af den magnetiske separator ikke afgørende. Ved at bevæge pipettespidsen langsomt ned langs rørets væg kan perlerne skubbes op til vask eller bufferudskiftning. Tid: 6 timer

  1. Vask (*) to gange med 200 μL 1x TPM-T-buffer (20 min inkubation i hver vask) på is. Fortynd 10x TPM-T-buffer (Tris-HCI / kaliumchlorid / magnesiumsulfat / Triton X-100) til 1x med ultrarent vand ).
  2. Supernatanten fjernes (*) og vaskes (*) én gang med 1x T4 DNA-ligasebuffer (se materialetabellen).
  3. Supernatanten fjernes (*), og der tilsættes 19 μL ligationsadapteropløsning (se tabel 1).
  4. Der inkuberes i 1 time ved 25 °C.
  5. Tilsæt 1 μL T4 DNA-ligase (se materialetabellen) og bland røret på en hvirvelblander ved medium hastighed.
  6. Placer røret på en termisk cyklist og kør følgende program: nærhedsligeringsprogram, 4 timer ved 16 ° C og 30 minutter ved 25 ° C.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er ca. 25 μL, inklusive volumenet af polyacrylamidperlen. Temperaturen på det termiske cyklerlåg er stuetemperatur.
  7. Der vaskes (*) to gange kortvarigt med 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(+) buffer (se tabel 1; klargør 1x buffer fra 10x stambuffer) og opbevar cellen ved 4 °C natten over. Sikkert stoppunkt: Stop eksperimentet her i op til 1 dag ved at opbevare de genanvendelige enkeltceller ved 4 °C.

12. Fuld udvidelse af den 1. tilfældige primer

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 4,5 timer

  1. Der vaskes to gange med 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-)buffer (se tabel 1, tilbered 1x buffer fra 10x stambuffer), fjern supernatanten, og tilsæt 20 μL Bst/dNTP/MgSO4-blanding (se tabel 1).
  2. Bland med en hvirvelblander ved medium hastighed og inkuber i 4 timer på en orbitalryster (ved 6 °C og 500 omdr./min.).
  3. Placer røret på en termisk cyklist og kør følgende program: fuldt forlængelsesprogram: 10 °C i 1 time, 20 °C i 1 time, 30 °C i 1 time, 40 °C i 1 time, 50 °C i 1 time, 65 °C i 1 time, 94 °C i 10 minutter, og hold ved 4 °C.
    BEMÆRK: Sikkert stoppunkt: Forsøget kan stoppes her i op til 1 dag ved at opbevare de genanvendelige enkeltceller ved 4 °C.

13. Forstærkning af flere forskydninger

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 2,5 timer (trin 13.1-13.2) + 15 min (trin 13.3-13.4) + 1 dag (trin 13.5-13.10)

  1. Tilsæt 0,4 μL 100 μM 2nd tilfældig primer (se tabel 3) og bland med en hvirvelblander ved medium hastighed.
  2. Der inkuberes i 2 timer ved 6 °C og 500 o/min på en orbitalryster, og røret anbringes på en termisk cyklist og opvarmes ved 94 °C i 3 minutter.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er ca. 25,4 μL, inklusive volumenet af polyacrylamidperlen. Temperaturen på det termiske låg er 105 °C.
  3. Rørene anbringes i en iskølet metalblok, og der tilsættes 1 μL/rør Bst-DNA-polymerase.
  4. Vortex ved langsom hastighed, placer rørene på en termisk cyklist, og kør følgende program:
    4 °C i 4 timer, 10 °C i 30 minutter, 20 °C i 30 minutter, 30 °C i 30 minutter, 40 °C i 30 minutter, 50 °C i 30 minutter, 65 °C i 60 minutter, 94 °C i 3 minutter, og hold ved 4 °C.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er ca. 26,4 μL, inklusive volumenet af polyacrylamidperlen. Temperaturen på låget til termisk cykler er 105 °C. Sikkert stoppunkt: Stop eksperimentet her i op til 1 dag ved at opbevare de genanvendelige enkeltceller ved 4 °C.
  5. Supernatanten (ca. 20 μl) opsamles, og den overføres til et PCR-glas.
  6. Opbevar den opsamlede supernatant ved -80 °C.
  7. Der tilsættes 20 μL/tube 0,05% Tween 20/0,1x TE-buffer til et PCR-rør, der indeholder den genanvendelige enkeltcelle (se tabel 1), og den genanvendelige enkeltcelle inkuberes ved 4 °C natten over. Sikkert stoppunkt: Stop eksperimentet her i et par dage ved at forlænge inkubationstiden.
  8. Supernatanten opsamles, og supernatanten kombineres med prøven indsamlet i trin 13.5.
  9. Gentag trin 13.7-13.8 igen. Den genanvendelige enkeltcelle lægges i blød i 50 % glycerol/5 mM EDTA/0,5 % BSA/0,05 % Tween20/TBS-buffer, og den inkuberes i 30 minutter på en orbitalryster (4 °C, 600 omdr./min.). Den genanvendelige enkeltcelle opbevares ved -20 °C indtil næste forsøg.
  10. Der tilsættes 40 μL Exomaster-blanding (se tabel 1), og glasset anbringes på en termisk cyklist, og følgende program køres: i) 95 °C i 5 min. ii) 95 °C i 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C i 30 sek. v) trin ii-iv gentages 19 gange, vi) 72 °C i 5 minutter vii) opbevares ved 4 °C.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er ca. 45 μL, inklusive volumenet af polyacrylamidperlen. Temperaturen på det termiske låg er 105 °C. Sikkert stoppunkt: Forsøget kan stoppes her i mindst et par dage ved at opbevare prøven ved -80 °C.

14. Phenol-chloroform-rensning og udfældning af polyethylenglycol

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 1,5 time

  1. Overfør produktet til et 0,5 ml DNA-lavbindende rør, og tilsæt 100 μL phenol: chloroform: isoamylalkohol.
    BEMÆRK: Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol forårsager irritation og muligvis forbrændinger ved kontakt. Brug handsker, sikkerhedsbriller og en laboratoriefrakke. Brug kun med tilstrækkelig ventilation, eller brug en passende åndedrætsværn. Følg de institutionelle sikkerhedsretningslinjer. Kassér det brugte labware i henhold til de institutionelle retningslinjer.
  2. Omrystes i 30 sek. i hånden og centrifugeres ved 12.000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
  3. Den vandige fase (80 μL) samles i et 0,5 ml DNA-lavbindingsglas, og der tilsættes 40,84 μL/tube lineær acrylamid/MgCl2-blanding (se tabel 1).
  4. Der tilsættes 47,06 μL/tube 50% (w/v) PEG8000 (RNase-fri) og blandes ved pipettering.
  5. Inkuber i 20 min ved stuetemperatur og centrifuger ved 240 × g i 10 min ved stuetemperatur.
  6. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 400 μL/tube 80% ethanol (EtOH).
  7. Der vaskes med 80% EtOH, supernatanten fjernes med en aspirator, og pelletsen lufttørres.
  8. Pellet suspenderes med 20 μL 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, pH 7,4 buffer, og opløsningen opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et dobbeltstrenget DNA-specifikt interkalatorfarvestof (se materialetabellen). Sikkert stoppested: Eksperimentet kan sikkert stoppes her i mindst en uge.

15. In vitro transkription

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase- og RNase-kontaminering. Tid: 5 timer

  1. Optø DNA fra enkeltcelleafledte produkter (fra trin 14) og forbered et blandet bibliotek af enkeltcelleafledte produkter ved at blande 2 μL/celle af DNA-produkterne (samlet volumen 20 μL).
  2. Der tilsættes 26 μL in vitro transkriptionsmasterblanding (se materialetabellen og fabrikantens protokol) og blandes ved pipettering.
  3. PCR-røret anbringes på en termisk cyklist og inkuberes i 4 timer ved 37 °C.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er 46 μL. Temperaturen på det termiske låg er 105 °C.
  4. Tilføj 5 μL 10x DNase I-buffer (se materialetabellen) og tilføj 4 μL DNase I (RNasefri, 4 U, se materialetabellen).
  5. Bland og inkuber i 15 minutter ved 37 °C, og overfør prøven til et 0,5 ml rør.
  6. Der tilsættes 300 μL/tube Guanidiniumthiocyanat-phenolchloroform (se materialetabellen) og blandes med forsigtig hvirvelstrøm.
    BEMÆRK: Guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform kan føre til alvorlige kemiske forbrændinger ved kontakt. Brug handsker, sikkerhedsbriller og en laboratoriefrakke. Brug kun med tilstrækkelig ventilation eller brug passende åndedrætsværn. Følg institutionernes sikkerhedsretningslinjer. Kassér det brugte labware i henhold til de institutionelle retningslinjer.
  7. Der inkuberes i 5 minutter ved R.T. på en ryster, og prøverne opbevares derefter ved -80 °C i op til 3 dage.
    BEMÆRK: Sikkert stoppunkt: Eksperimentet kan sikkert stoppes her i op til 3 dage.

16. RNA-oprensning

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase- og RNase-kontaminering. Tid: 2 timer

  1. Der tilsættes 80 μl/tube chloroform til prøven fra trin 15.7, og glasset rystes kraftigt med hånden i 15 sekunder.
  2. Der inkuberes i 2-15 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres prøven ved 12.000 × g i 15 minutter ved 4 °C.
  3. Den vandige fase af prøven (~200 μL) opsamles og overføres til et nyt 1,5 ml rør.
  4. Der tilsættes 600 μL/tube Guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform og overføres prøven til et 1,5 ml glas.
  5. Der tilsættes 180 μL/tube chloroform, og glasset rystes kraftigt i hånden i 15 sekunder.
  6. Prøven centrifugeres ved 12.000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
  7. Den vandige fase af prøven (~450 μL) opsamles og overføres til et 1,5 ml glas.
  8. Der tilsættes 60 μL/tube lineært acrylamid (5 μg/μL), og der tilsættes 400 μL/tube 100% isopropanol til den vandige fase.
  9. Inkuber glasset ved stuetemperatur i 10 minutter og centrifuger det ved 12.000 × g i 10 minutter ved 4 °C.
  10. Supernatanten fjernes forsigtigt.
  11. RNA-pelleten vaskes 3 gange med 200 μL 75% ethanol (EtOH/RNase-frit vand), supernatanten fjernes, og RNA-pelleten lufttørres.
    BEMÆRK: Lad ikke RNA'et tørre helt, fordi pelleten kan miste opløselighed.
  12. RNA-pellet resuspenderes i 20 μL RNasefrit vand indeholdende en RNAse-hæmmer (1 μL/20 μL), og pelleten opløses ved pipettering.
  13. Absorbansen måles ved 260 nm.

17. Omvendt transkription

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 1 time

  1. Der tilsættes 7 μL/rør omvendt transkriptionsprimer + dNTP-blanding (se tabel 1 og tabel 3), og anbring rørene på en termisk cyklist.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er 27 μL. Temperaturen på det termiske låg er 105 °C.
  2. Opvarm ved 65 °C i 5 minutter og læg rørene på is i mindst 1 min.
  3. Der tilsættes 14 μL/tube Reverse transcriptase Master Mix (se tabel 1) og blandes ved pipettering.
  4. Anbring rørene på en termisk cyklist, og inkuber dem ved 55 °C i 10 minutter og derefter ved 80 °C i 10 minutter.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er 60 μL. Temperaturen på det termiske låg er 105 °C.

18. Anden streng syntese

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 2,5 timer

  1. Tilsæt 40 μL/tube ultrarent vand og del 100 μL opløsningen i to 0,2 ml PCR-rør (50 μL/rør).
  2. Der tilsættes 60 μL/tube Second Strand Synthesis-blanding (se tabel 1), og glassene anbringes på en termisk cyklist, og følgende program køres: i) 95 °C i 5 min, ii) 95 °C i 30 s, iii) 60 °C i 30 s, iv) 72 °C i 30 s, v) trin ii-iv gentages 20 gange, og vi) holdes ved 4 °C.
    BEMÆRK: Rørstørrelsen er 0,2 ml. Opløsningens volumen er 110 μL. Temperaturen på det termiske låg er 105 °C.
  3. Der tilsættes 4,4 μL/tube 0,5 M EDTA (sidste 20 mM), og opbevar ved -80 °C natten over.
    BEMÆRK: Sikkert stoppested: Eksperimentet kan sikkert stoppes her i op til et par dage.
  4. DNA renses ved phenol-chloroformoprensning og polyethylenglycoludfældning (beskrevet i trin 14).
    BEMÆRK: Sikkert stoppested: Eksperimentet kan sikkert stoppes her i mindst en uge.

19. Restriktionsenzymfordøjelse og størrelsesvalg

BEMÆRK: Følgende procedure udføres under en ren hætte for at undgå DNase-kontaminering. Tid: 3 timer (trin 19.1-19.7)

  1. DNA-koncentrationen af det oprensede DNA måles (fra trin 18.4) ved måling af absorbansen ved 260 nm.
  2. Overfør 6 μg DNA til et PCR-rør, tilsæt 30 μL 10x fordøjelsesbuffer, og juster lydstyrken til 294 μL med ultrarent vand.
  3. Der tilsættes 6 μl BciVI-restriktionsenzym og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
  4. Udfør EtOH-udfældning med lineært polyacrylamid.
    1. Der tilsættes 60 μL/tube 3 M natriumacetat (pH 5,2) og derefter 40 μL/tube lineær acrylamid (5 mg/ml, se materialetabellen).
    2. Der tilsættes 400 μL/tube EtOH og inkuberes natten over ved -20 °C.
      BEMÆRK: Sikkert stoppested: Eksperimentet kan sikkert stoppes her i en dag.
    3. 12.000 × g centrifugeres i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes.
    4. Vask pillen to gange med 80% EtOH og tør pillen.
    5. Opløs pellet med 20 μL 1xTE buffer og tilsæt 4 μL / tube frisk 6x Gel Loading buffer.
  5. Læg prøven i en 5% agarosegel/0,5x TAE-buffer og udfør elektroforese (50 V i 40 min).
  6. Skær og saml gelen over 50 bp (se figur 6) og ekstraher DNA'et ved hjælp af et gelekstraktionssæt.
    BEMÆRK: Sikkert stoppested: Eksperimentet kan sikkert stoppes her i mindst en uge.
  7. Konstruer sekventeringsbiblioteket ved hjælp af et DNA-biblioteksforberedelsessæt (se materialetabellen)16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

K562-enkeltceller blev genereret ved hjælp af protokollen beskrevet i trin 8 (se figur 5). Enkeltceller blev indlejret i det ydre lag af polyacrylamidperlen. Celle-DNA blev farvet og visualiseret ved hjælp af et interkalatorfarvestof til DNA-farvning.

Figure 5
Figur 5: Genererede genanvendelige enkeltceller. Celler farves med et interkalatorfarvestof til DNA (grøn fluorescens). Hvide pile angiver enkeltceller indlejret i det ydre lag af polyacrylamidperler. Den genanvendelige enkeltcelle placeres i en 96-brønds fladbundet plade. Billeder blev taget af et scanningsmikroskop, BZ-X710. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Resultaterne vist i figur 6 understøttede dannelsen af de ønskede DNA-produkter. DNA-produkter fra trin 19.7 blev spaltet af BciVI-restriktionsenzymet i 19-20 bp, 31-32 bp, 49 bp og >49 bp fragmenter. Disse resultater understøttede konklusionen om, at de fleste produkter indeholder antistofsondeafledte sekvenser og 2. tilfældige primerafledte sekvenser. DNA-produkterne blev efterfølgende ligeret med Illumina-adapteren ved hjælp af et TruSeq Nano-sæt og sekventeret ved hjælp af en Illumina NovaSeq6000-sequencer.

Figure 6
Figur 6: DNA-produkter før og efter BciVI-restriktionsenzymfordøjelse. (A) BciVI-fordøjelse genererede de forventede 19-20 bp-fragmenter, 31-32 bp-fragmenter og de ønskede produkter (>49 bp) indeholdende antistofstregkode, ligeret sekvens, genomisk DNA og cellestregkode. (B) Størrelsesfordeling af de færdige produkter ved udgangen af trin 19.7. Konstrueret DNA-bibliotek blev analyseret ved kapillærelektroforese. Den lyserøde linje angiver de ønskede produkter, der indeholder sekventeringsadaptere, antistofstregkode og cellestregkode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Sekventeringsresultaterne indikerede, at de produkter, der genereres ved at følge trin 7-19, indeholder antistofsonden, ligeret sekvens, genomsekvens og cellestregkode. Unikke kortlagte aflæsninger fra anti-H3K27ac og anti-H3K27me3 var signifikant mere talrige end fra kontrol IgG (se figur 7A). Dette indikerer, at den specifikke binding af anti-H3K27ac og anti-H3K27me3 øger antallet af de ønskede produkter. Den mest avancerede teknologi til enkeltcelle epigenomanalyse, Paired-Tag, erhverver omkring 2.000 unikke læsninger af H3K27ac og 1.500 unikke læsninger af H3K27me3 pr. Kerne. Vores resultater viste et meget højere antal unikke aflæsninger (gennemsnitlig 699.398 H3K27ac-signaler/celle og 505.433 H3K27me3-signaler/celle). Resultaterne understøttede også konklusionen om, at gentagne eksperimenter med den samme genanvendelige enkeltcelle reducerer signaltab og øger signaltætheden.

REpi-seq-signalerne vist i figur 7A blev evalueret ved at sammenligne REpi-seq-dataene med bulk-ChIP-seq-data. I figur 7B overlappede i gennemsnit 91% ± 3,24% af H3K27ac-signalerne fra REpi-seq med H3K27ac-toppe i bulk ChIP-seq. Denne analyse måler niveauet af "præcision" i enkeltcelle epigenomanalyse18. Præcisionen af nuværende enkeltcelle epigenomiske metoder til det aktive histonmærke H3K4me3 er 53% (Drop-ChIP; H3K4me3)18, 50% (scChIC-seq; H3K4me3)19 og 60 % (ACT-seq; H3K4me3)20. Derudover var præcisionen af REpi-seq for det inaktive histonmærke H3K27me3 i gennemsnit 52,09% ± 3,71% (figur 7C), mens præcisionen for H3K27me3 var 47% i enkeltcelle ChIC-seq19. Afslutningsvis viser REpi-seq høj præcision til detektering af H3K27ac og H3K27me3.

Vi analyserede også "følsomheden"18 af REpi-seq, som måler, hvor mange toppe af bulk ChIP-seq der blev detekteret af REpi-seq reproducerede aflæsninger (figur 7D, E). Følsomheden af REpi-seq var 55,30% i H3K27ac og 50,94% i H3K27me3. I andre enkeltcellede epigenommetoder er følsomheden 5% i Drop-ChIP (H3K4me3)18, 5% i ACT-seq (H3K4me3)20 og 9,5% i scChIC-seq (H3K27me3)19. Disse resultater indikerer, at REpi-seq er følsom ved at detektere epigenetiske signaler.

Figure 7
Figur 7: Signaltal, præcision og følsomhed i REpi-seq. De samme eksperimenter blev gentaget 3 gange med den samme genanvendelige enkeltcelle (en K562-celle). (A) Erhvervede signaler fra de samme otte enkeltceller. Hver prik repræsenterer en genanvendelig enkelt celle. Unikke signaler fra kontrol IgG (sort), anti-H3K27me3 (blå) og anti-H3K27ac (rød) i de samme enkeltceller blev talt. Anti-H3K27me3- og anti-H3K27ac-signaler var signifikant højere end kontrol-IgG, hvilket indikerer, at specifik binding af antistoffer genererer signaler mere effektivt end kontrol-IgG. Bar: middelværdi, fejllinje: standardafvigelse. (B, C) Præcision af REpi-seq H3K27ac (B) og H3K27me3 (C) unikke læsninger. Præcisionen af unikke aflæsninger afledt af REpi-seq var baseret på overlapning med kendte ChIP-seq-toppe fra K562 bulkcelleanalyse (H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083). Procentdelene af REpi-seq H3K27ac og H3K27me3 læsninger bekræftet af ChIP-seq toppe blev beregnet i hver enkelt celle. Resultaterne udtrykkes som den gennemsnitlige procent af 8 enkeltceller. (D, E) REpi-seqs følsomhed ved detektering af kendte toppe af H3K27ac (D) og H3K27me3 (E). Unikke læsninger af REpi-seq blev brugt. H3K27ac og H3K27me3 toppe identificeret ved ChIP-seq af K562 bulkceller i ECODE-projektet (H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3: ENCFF031FSF) blev genkendt af REpi-seq unikke læsninger. Resultaterne udtrykkes som den gennemsnitlige procent ChIP-seq-toppe anerkendt af REpi-seq unikke læsninger. Panelerne B-E blev gengivet fra Ohnuki et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Buffere anvendt i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Antistoffer og IgG-kontrol anvendt i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Oligonukleotid-DNA anvendt i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende video S1: Automatisk enkeltcelleplukning og overførsel til en 96-brønds PCR-plade (trin 8.2.4). Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S2: Udtagning af supernatant fra et hul, der indeholder en enkelt celle, ved hjælp af en væskehåndteringsrobot (trin 8.2.8.1). Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S3: Tilsætning af 4% TEMED/mineralolie til en brønd, der indeholder en enkelt celle, ved hjælp af en væskehåndteringsrobot (trin 8.2.8.2). Klik her for at downloade denne video.

Supplerende kode 1: Automatiseret program for væskehåndteringsrobotten fra trin 8.2.8.1-8.2.8.2. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel beskriver den trinvise protokol for den nyligt rapporterede enkeltcellede multiepigenomiske analyse ved hjælp af genanvendelige enkeltceller7. I de efterfølgende afsnit diskuterer vi kritiske punkter og understreger potentielle begrænsninger i protokollen.

Et af de kritiske punkter i hele protokollen (fra trin 7.2-13) er at undgå DNase-kontaminering. En enkelt celle har kun to kopier af genomisk DNA. Derfor reducerer skadeligt genomisk DNA signalantallet kritisk. Det er vigtigt at undgå forurening med DNase for at beskytte integriteten af genomisk DNA.

Reagensernes permeabilitet over cellemembranen/cellevæggen er også kritisk i hele protokollen. REpi-seq blev designet til at analysere epigenomet af mus og humane celler på enkeltcelleniveau. De optimale betingelser for denne eksperimentelle metode forventes at variere afhængigt af permeabiliteten af celletyper og nuklear membran til hvert reagens. Derfor, når metoden anvendes på andre celler end mus og humane celler, såsom planteceller, gær og bakterier, skal forholdene på hvert trin optimeres.

Vi mener, at et kritisk punkt, der er specifikt for trin 9.5 (udglødning af den første tilfældige primer), er den hurtige afkølingshastighed efter denaturering af det genomiske DNA. Langsom og gradvis afkøling efter denaturering kan reducere udglødningseffektiviteten af de tilfældige primere, der binder til det genomiske DNA. Desuden er et kritisk punkt i trin 11 (nærhedsligering) buffersammensætningen. Buffere indeholdende polyethylenglycol (PEG) anvendes i vid udstrækning til hurtigere ligeringsmetoder i molekylærbiologiske applikationer. En lav koncentration af PEG (f.eks. <7,5%) fremmer hurtig dannelse af dobbeltstrenget DNA uden DNA-udfældning. Vi observerede imidlertid, at ligeringsbufferen indeholdende PEG inducerer krympning af enkeltcellegelperlen indeholdende enkeltcellen (genanvendelig enkeltcelle), hvilket tyder på, at maskestørrelsen på polyacrylamidstilladset var krympet. Da denne krympning kan medføre reduceret tilgængelighed af T4 DNA-ligase, besluttede vi ikke at bruge den hurtigere ligeringsprotokol til REpi-seq.

I REpi-seq kan resultaterne evalueres ved hjælp af gendetekteringsfrekvensen af signaler i de samme enkeltceller. Gendetekteringsfrekvensen er nyttig til overvågning af reaktioner, herunder nærhedsligering med antistofsonden og den første tilfældige primer. Vi rapporterede tidligere7 , at 62.03% af H3K27ac-læsninger i et eksperiment blev bekræftet i to replikate eksperimenter, hvilket tyder på, at effektiviteten af nærhedsligering i individuelle eksperimenter er højere end den samlede gendetekteringsprocent i gentagne eksperimenter.

Vi har også tidligere rapporteret7 den vellykkede påvisning af RNA-polymerase II (Pol II) binding til DNA i genanvendelige enkeltceller. Pol II-binding er vanskelig at fange med de nuværende enkeltcellede epigenommetoder på grund af den tidsmæssige og ustabile karakter af denne binding.

Nuværende transposasebaserede CUT&Tag-tilgange til enkeltcelle epigenomanalyse kræver bevarelse af nukleosom-DNA-interaktion. Et specifikt antistof binder til en histonmodifikation; derefter spalter transposase, der er fastgjort til antistoffet, det genomiske DNA og indsætter en DNA-stregkode på DNA-spaltningsstedet. Denne reaktion afhænger af nukleosom-(histon)-DNA-interaktion. Derfor er det vigtigt, at nukleosom-DNA-interaktioner og strukturen af cellulære proteiner og kromatin forbliver intakte. Derfor er CUT &Tag-tilgange uundgåeligt forudindtaget til tilgængelige regioner af kromatinstruktur i analysen af histonmodifikationer.

Den uundgåelige bias mod de tilgængelige kromatinregioner hæmmer forøgelsen af antallet af epigenetiske signaler i enkeltcelle epigenomanalyse. Kromatinstrukturer dannes af flere typer molekylære interaktioner, herunder DNA-nukleosom- og nukleosom-nukleosominteraktioner gennem nukleosomassocierede proteiner. Derfor valgte vi ikke at bevare DNA-protein og protein-protein interaktioner i de genanvendelige enkeltceller, samtidig med at placeringen af cellulære proteiner blev bevaret. Denne funktion opnås ved anvendelse af monomert acrylamid og en paraformaldehydblanding (protokoltrin 7), som ændrer aminogruppen på cellulære proteiner snarere end at tværbinde protein til protein eller protein til DNA.

Placeringen af histoner og genomassocierede proteiner bevares ved forbindelsen til polyacrylamidpolymeren. Nukleosomer denatureres omkring 71-74 °C21. Derfor er histoner i den genanvendelige enkeltcelle sandsynligvis denatureret og afslappet/dissocieret fra hinanden efter udglødningstrinnet i den 1. tilfældige primer (94 °C). Dette kan slappe af heterochromatinstrukturen og forbedre tilgængeligheden af antistoffer og andre molekyler til heterochromatinregioner. Denne konklusion understøttes af vores rapporterede resultater7 , der viser, at bias forbundet med kromatinstruktur reduceres i genanvendelige enkeltceller sammenlignet med CUT&Tag tilgange9.

Forbindelsen af histon H3 til polyacrylamid opretholdes efter mindst 3 runder varmedenaturering, da placeringen af histoner i den genanvendelige enkeltcelle bevares over gentagne forsøg7. Denne funktion tillader gentagelse af det samme eksperiment ved hjælp af den samme enkelte celle. Gentagne eksperimenter bidrager til at øge antallet af signaler fra en enkelt celle sammenlignet med CUT&Tag tilgange.

Verificerbarhed er et grundlæggende princip inden for videnskab. Det er imidlertid ikke muligt at verificere eksperimentelle resultater af en enkelt celle i CUT&Tag-tilgange, da gentagne eksperimenter med de samme celler ikke er mulige. Det genomiske DNA spaltes ved transposase og modtager DNA-stregkoden for et epigenetisk mærke. Det spaltede genomiske DNA frigives fra dets oprindelige placering. Derfor er CUT&Tag-tilgangen en ulempe for analysen af flere epigenetiske mærker i den samme enkeltcelle. Denne funktion ved CUT&Tag-metoder ligger til grund for afvejningen af nedsat signaltæthed med et øget antal epigenetiske mærker pr. Enkelt celle.

For at undgå dette problem kopierede vi genomisk DNA i stedet for at skære genomet og mærkede derefter det kopierede genomiske DNA med en antistof-DNA-sonde. REpi-seq tillader analyse af de samme enkeltceller og øger signaltætheden. Det giver også et middel til verificerbarhed af eksperimentelle resultater, multiplexing af epigenomisk analyse og løsning af afvejningsproblemet i CUT&Tag-tilgange. Selvom metoden overvinder begrænsningerne ved transposasebaseret epigenomisk analyse, er den endnu ikke i stand til at analysere et stort antal celler på enkeltcelleniveau. Der er behov for yderligere udvikling.

Afslutningsvis kopierer REpi-seq genomisk DNA i stedet for at skære genomet og mærker derefter det kopierede genomiske DNA med en antistof-DNA-sonde. REpi-seq er stadig i barndommen og har brug for at øge gennemstrømningen af celler. REpi-seq har imidlertid styrker, som overvinder begrænsningerne i nuværende enkeltcellede epigenommetoder: 1) øget signaltæthed ved at reducere udfald af signaler gennem gentagne eksperimenter i de samme enkeltceller; 2) reducere strukturel bias ved at reducere utilgængelige regioner baseret på kromatinstruktur; 3) tilvejebringelse af verificerbarhed af eksperimentelle resultater ved gentagne eksperimenter i samme enkelt celle, 4) signalidentifikation baseret på gendetekteringssandsynlighed for det samme signal i hver enkelt celle; 5) analysere flere epigenetiske mærker i samme enkeltcelle uden konkurrence mellem epigenetiske mærker. Disse fremskridt gør det muligt at analysere epigenetiske mekanismer i en enkelt celle, hvilket er en vigtig anvendelse og ikke gennemførlig med de andre enkeltcelle epigenomiske metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Ohnuki og Tosato er medopfindere på et patent med titlen "Metoder til fremstilling af en genanvendelig enkeltcelle og metoder til analyse af epigenomet, transkriptomet og genomet i en enkelt celle" (EP3619307 og US20200102604). Patentansøgningen blev delvist indgivet på baggrund af foreløbige resultater relateret til den teknologi, der er beskrevet i det aktuelle manuskript. Den eller de opfindelser, der er beskrevet og gjort krav på i denne patentansøgning, blev gjort, mens opfinderne var fuldtidsansatte i den amerikanske regering. Derfor er alle rettigheder, titel og interesse for denne patentansøgning i henhold til 45 Code of Federal Regulations Part 7 blevet eller bør ved lov tildeles den amerikanske regering. Den amerikanske regering overfører en del af de royalties, den modtager, til sine medarbejderopfindere i henhold til 15 U.S. Code § 3710c.

Acknowledgments

Vi takker Dr. David Sanchez-Martin og Christopher B. Buck for kommentarer i projektets konceptualiseringsfase. Vi takker også Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health for hjælp i indledende eksperimenter og Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH for rådgivning i beregningsanalyse. Vi takker Anna Word for at hjælpe med optimeringen af DNA-polymeraser, der anvendes i metoden. Dette arbejde udnyttede beregningsressourcerne i NIHHPC Biowulf-klyngen (http://hpc.nih.gov). Dette projekt støttes af det intramurale program fra Center for Kræftforskning, National Cancer Institute, National Institutes of Health, NCI Director's Innovation Award (# 397172) og føderale midler fra National Cancer Institute under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Vi takker Dr. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy og alle medlemmer af Laboratory of Cellular Oncology for produktive kommentarer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Tags

Tilbagetrækning udgave 180
Genanvendelig enkeltcelle til iterative epigenomiske analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov,… More

Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter