Summary
本プロトコルは、再利用可能な単一細胞を用いた反復エピゲノム解析のための単一細胞法を記載する。再利用可能なシングルセルにより、同じシングルセル内の複数のエピジェネティックマークの分析と結果の統計的検証が可能になります。
Abstract
現在のシングルセルエピゲノム解析は、シングルユース向けに設計されています。細胞は1回の使用で廃棄されるため、単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析が妨げられ、単一細胞内の実験的バックグラウンドノイズからシグナルを区別するために他の細胞からのデータが必要になります。この論文では、反復的なエピゲノム解析のために同じ単一細胞を再利用する方法について説明します。
この実験方法では、細胞タンパク質をタンパク質やDNAに架橋するのではなく、まずポリアクリルアミドポリマーに固定し、構造バイアスを軽減します。この重要なステップにより、同じ単一細胞で繰り返し実験を行うことができます。次に、近接ライゲーション用のスキャフォールド配列を有するランダムプライマーをゲノムDNAにアニーリングし、DNAポリメラーゼを用いて伸長によりゲノム配列をプライマーに付加する。続いて、それぞれ異なるDNAプローブで標識されたエピジェネティックマーカーおよびコントロールIgGに対する抗体を、同じ単一細胞内のそれぞれの標的に結合させる。
ランダムプライマーと抗体-DNAプローブの足場配列に相補配列を有するコネクターDNAを付加することにより、ランダムプライマーと抗体との間の近接ライゲーションが誘導される。このアプローチは、抗体情報と近くのゲノム配列を近接ライゲーションの単一のDNA産物に統合します。同じ単一細胞で実験を繰り返すことで、希少細胞からのデータ密度を高め、同一細胞のIgGと抗体データのみを用いた統計解析を可能にします。この方法で調製された再利用可能な単一細胞は、少なくとも数ヶ月間保存し、後で再利用してエピジェネティックな特性評価を広げ、データ密度を高めることができます。この方法は、研究者とそのプロジェクトに柔軟性を提供します。
Introduction
シングルセル技術は、個々のシングルセルオミクス技術を統合したシングルセルマルチオミクスの時代に突入しています1。最近、シングルセルトランスクリプトミクスは、クロマチンアクセシビリティ(scNMT-seq2 およびSHARE-seq 3)またはヒストン修飾(ペア-seq4 およびペアタグ5)を検出するための方法と組み合わせています。最近では、シングルセルトランスクリプトミクスとプロテオミクスがクロマチンアクセシビリティと統合されました(DOGMA-seq6)。これらの方法は、クロマチンアクセシビリティまたはヒストン修飾を検出するためにトランスポザーゼベースのタグ付けを使用します。
トランスポザーゼベースのアプローチは、ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNA断片の最後にDNAバーコードを追加します。切断された各ゲノム断片は、最大2つのDNAバーコード(=切断部位ごとに1つのエピジェネティックマーク)しか受け入れることができず、切断部位のゲノムDNAは失われます。したがって、切断ベースのアプローチは、テストされるエピジェネティックマークの数とシグナル密度の間にトレードオフがあります。これは、同じ単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析を妨げます。この問題を克服するために、ゲノムDNAを切断しない単一細胞エピゲノム法が開発されました7,8。
上記の切断由来の問題に加えて、トランスポザーゼベースのアプローチには他の制限があります。シングルセルエピゲノム解析では、ゲノム上のヒストンやDNA関連タンパク質の位置を知ることが重要です。現在のアプローチでは、これは未固定の単一細胞を使用し、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用を保持することによって達成されます。しかし、これは、ヒストン修飾の分析においても、アクセス可能なクロマチン領域に強いバイアスを発生させる9。ゲノム上のヒストンおよびゲノム関連タンパク質の位置は、ポリアクリルアミド足場を使用して、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質を架橋することなく保存することができる7,8。このアプローチは、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用に依存する現在のアプローチで観察される構造バイアスを低減します。
トランスポザーゼベースのアプローチは、単一の細胞から一度だけシグナルを取得できます。したがって、シグナルのドロップオフのために単一細胞の完全なエピゲノムを描写することは困難である。再利用可能な単一細胞は、同じ単一細胞内で反復的なエピゲノム解析を可能にすることにより、現在の制限を克服するために開発されました。
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Protocol
メモ: この方法の概略図を 図 1 に示します。
図1:プロトコルワークフローの概略図。ステップ7.2〜13は、概略図を使用して説明されています。各行は、プロトコルのステップを示します。緑色に着色された細胞タンパク質は、結晶構造に基づいて生成されたヒトヌクレオソームです(PDB:6M4G)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. 脱塩カラムの平衡化
注:脱塩スピンカラムは、次の手順で説明するように平衡化されます。平衡脱塩カラムは、ステップ2.1、3.4、および4.6で使用されます。
- 脱塩カラムの下部クロージャー(カットオフ7 kDa、樹脂ビーズ容量0.5 mL、 材料表を参照)を取り外し、脱塩カラム上部のキャップを緩めます。
- カラムを1.5 mLタンパク質低結合チューブ(収集チューブ、 材料表を参照)に入れ、室温で1分間1,500 × g で遠心分離して、カラム内の保存液を除去します。
注意: スイングローター遠心分離機を使用して、ビーズベッドの上部を平らにします。 - 1.5 mLチューブ内のフロースルーを除去し、樹脂床の上に300 μLの150 mM NaCl/100 mMリン酸バッファー、pH 8.0( 表1を参照)を加えます。
- 室温で1,500 × g で1分間遠心分離し、収集チューブ内のフロースルーを除去します。
- 手順1.3〜1.4をさらに3回繰り返します。
- 収集チューブからバッファーを廃棄し、カラムを新しい収集チューブに入れます。
- 平衡脱塩カラムは、ステップ2.1、3.4、および4.4で使用します。
2. 抗体のバッファー交換
注:抗H3K27ac 10、抗H3K27me3 10、抗Med111、および抗Pol II10からグリセロール、アルギニン、およびアジ化ナトリウムを除去します(表1に示すバッファー組成を参照)。以下の手順はすべて、DNase汚染を避けるために清潔なフードの下で実行されます。時間:1時間
- 抗体溶液(100 μL、 表2参照)を、ステップ1に続いて調製した平衡脱塩カラムに塗布します。
- 1,500 × g で4°Cで2分間遠心分離し、フロースルーを収集チューブから1.5 mLタンパク質低結合チューブに移します。
- 280nmの吸光度を用いてIgG濃度を測定する12 (マイクロボリューム分光光度計を使用)。
- 抗体溶液を限外ろ過カセット(分子量カットオフ100 kDa、0.5 mL、 材料表を参照)に移し、12,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 280 nmの吸光度を用いてIgG濃度を測定します。
- IgG濃度が1 mg / mLに達するまで、手順2.4〜2.5を繰り返します。
3. 抗体の活性化
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:2.5時間
- 1 mgのスクシンイミジル6-ヒドラジノニコチン酸アセトンヒドラゾン(S-HyNic、材料 表を参照)を100 μLの無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF、 材料表を参照)に溶解します。
注意: DMFは可燃性の有機溶媒であり、皮膚から吸収される強力な肝毒素です。手袋、安全ゴーグル、白衣を着用してください。施設の安全ガイドラインに従ってください。使用済みのラボウェアは、機関のガイドラインに従って廃棄してください。 - 100 μLの抗体溶液(150 mM NaCl/100 mMリン酸ナトリウム溶液1 mg/mL、pH8.0)に0.6 μLのS-HyNic/DMFを加えます。使用した抗体および対照IgGについては 表2 を参照されたい。
- 室温で2時間インキュベートします(光から保護します)。
- 100 μLのS-HyNic反応抗体を平衡脱塩カラムの上部に塗布し(ステップ1を参照)、1,500 × g で4°Cで2分間遠心分離してサンプルを回収します。
- 使用後は脱塩カラムを廃棄してください。
注:タンパク質やその他の生体分子に対するHyNic基の安定性はさまざまです。HyNic修飾生体分子を直ちに結合させることが推奨されます。
4. DNAプローブの活性化
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:2.5時間
- 抗体またはコントロールIgG(抗体プローブ、 表3)用のアミン修飾DNAプローブのペレットを、20 μLの150 mM NaCl/100 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 8.0に溶解します。
注意: チューブの底にある薄くて透明なペレット/フィルムを探します。バッファーをペレットに直接塗布します。ペレットが見えない場合は、ペレットが剥離して壁や蓋に付着している可能性があります。この場合、チューブを遠心分離し、チューブの底にあるペレットを探します。 - 1 mgのスクシンイミジル4-ホルミルベンゾエート(S-4FB、 材料表を参照)を50 μLの無水DMFで溶解し、溶解した抗体プローブに10 μLのDMFを加えます。
- ステップ4.2で調製したS-4FB/DMFを4 μL加え、混合し、室温で2時間インキュベートします(光から保護します)。
- 34 μLのS-4FB反応抗体プローブを平衡脱塩カラムの上部に塗布します(ステップ1を参照)。
- サンプルが完全に吸収されたら、15 μLの150 mM NaCl/100 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 8.0)をゲルベッドの上部に塗布し、1,500 × g で4°Cで2分間遠心分離してS-4FB修飾抗体プローブを回収します。
- 後続の活用にフロースルーを使用します。260 nmでの吸光度を測定します。抗体プローブの回収率を計算します。
5. S-HyNic修飾抗体とS-4FB修飾抗体プローブの接合
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:2時間
- S-HyNic修飾抗体とS-4FB修飾抗体プローブを混合し、溶液を上下にピペットでピペットで混合します。
- 室温で2時間インキュベートします(光から保護します)。
- 反応をクエンチするには、478.8 μLのクエンチング&ストレージ溶液を加えます( 表1を参照)。
- 抗体プローブ結合抗体溶液を限外ろ過カセット(分子量カットオフ100 kDa)に移します。
- 12,000 × g、4°Cで5分間遠心分離します。
- ピペッティングでカセット内の溶液の量を確認します。
- 容量が100 μLに達するまで手順5.5〜5.6を繰り返し、-20°Cで保管します。
注:IgG濃度は、IgG標準を使用してサンドイッチELISA13、14、15 によって測定されます。
6. コア磁気ビーズの作製
注:この方法では、単一のセルが二層アクリルアミドビーズに埋め込まれます(図2を参照)。コアは磁性ポリアクリルアミドビーズです。外層はポリアクリルアミド単独である。コア磁気ビーズはこのセクションで生成されます。このセクションは実験に必須ではありません。時間:3時間
図2:REpi-seq実験での視認性と取り扱いの容易さのための二層ポリアクリルアミドビーズの構造 。 (a)遠心分離後の工程6.6からの磁性ナノ粒子。磁性ナノ粒子は、モノマーアクリルアミドで修飾され、 Bに示すポリアクリルアミド磁気ビーズに組み込まれる。(B)ポリアクリルアミド磁気ビーズを用いた再利用可能な単一セルの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 50 μLの1 M重炭酸ナトリウムバッファー、pH 8.5、および450 μLの40%アクリルアミド溶液を混合します。
注:アクリルアミドは神経毒です。手袋、アイプロテクター、白衣を着用してください。施設の安全ガイドラインに従ってください。使用済みのラボウェアは、機関のガイドラインに従って廃棄してください。 - 1 gのNHSエステル官能化30 nm酸化鉄粉末( 材料表を参照)をアクリルアミド/重炭酸ナトリウムバッファーに懸濁し、4°Cで一晩インキュベートします。
注意: アクリルアミドビーズは透明なため、ビーズの位置を確認および操作するのが難しい場合があります。酸化鉄製のコアビーズを組み込むことで、磁石でビーズの位置を制御できるため、視認性が向上し、操作が容易になります。ただし、ユーザーがREpi-seq実験に精通している場合は、コア磁性ポリアクリルアミドビーズの使用をスキップできます。 - ナノビーズ懸濁液を2本のチューブ(1.5 mL)に移し、21,300 × g で4°Cで1時間遠心分離(斜めローターを使用)し、上清を除去します。
- ボトムスラリーを1 mLの40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(19:1、 材料表を参照)で懸濁します。
注:ビスアクリルアミドは神経毒です。手袋と白衣を着用してください。施設の安全ガイドラインに従ってください。使用済みのラボウェアは、機関のガイドラインに従って廃棄してください。 - 21,300 × g で4°Cで1時間遠心分離(斜めローターを使用)。
- 5,000 × g で4°Cで30分間遠心分離(ブレーキなしのスイングローターを使用)。
- 低速吸引のP1000ピペットを使用して上清を除去します。
- 40%アクリルアミド/ビスアクリルアミドの容量を400μLに調整します(19:1、 材料の表を参照)。
- 25 μLの10%過硫酸アンモニウム溶液を追加します( 表1を参照)。
注:過硫酸アンモニウムは強力な酸化剤です。過硫酸アンモニウムを含む浮遊粉塵は、接触すると目、鼻、喉、肺、および皮膚を刺激する可能性があります。手袋、安全ゴーグル、白衣を着用してください。施設の安全ガイドラインに従ってください。使用済みのラボウェアは、機関のガイドラインに従って廃棄してください。 - コア磁性ポリアクリルアミドビーズを生成するには、0.5 μLのアクリルアミド修飾酸化鉄懸濁液をPCRチューブに移します。
- 4%N,N,N ',N'-テトラメチルエチレンジアミン/ミネラルオイル(TEMED、 表1参照)を50 μL加え、室温で一晩インキュベートします。
注意: TEMEDは可燃性の溶剤です。フードの下で作業します。吸い込まないでください。裸火、高温の表面、発火源から遠ざけてください。手袋、安全ゴーグル、白衣を着用してください。施設の安全ガイドラインに従ってください。使用済みのラボウェアは、機関のガイドラインに従って廃棄してください。
7.モノマーアクリルアミドによる細胞タンパク質のアミノ基の修飾
注:REpi-seqは、マウスおよびヒト細胞のエピゲノムを単一細胞レベルで分析するために設計されました。マウスまたはヒト以外の種の細胞でこの方法を使用する場合、各ステップを最適化する必要があります。
- 細胞を収穫する
注: 時間:30分- セルカウンターを使用して細胞濃度と生存率を測定します( 材料表を参照)。
注:このステップでの細胞の生存率は、データ分析における生細胞の数に影響します。 - ウシ胎児血清を10%含有する培地(*)で細胞濃度を1×105 細胞/mLに調整します。
注:*培地は、目的の細胞に最適な培地です。 - 1 mLの細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移します。
- 細胞懸濁液を240 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLを加え、穏やかなピペッティングで細胞を混合し、細胞懸濁液を240 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を取り除きます。
注意: 上記のすべての手順は、汚染を防ぐために層流のクリーンフードで実行する必要があります。
- セルカウンターを使用して細胞濃度と生存率を測定します( 材料表を参照)。
- 細胞タンパク質のアミノ基を単量体アクリルアミドで修飾
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:1.5時間- 1 mLのアミノ基修飾溶液( 表1を参照)を細胞ペレットに加え、穏やかなピペッティングによって細胞ペレットを懸濁します。
- チューブを氷上で1時間インキュベートし、細胞懸濁液を240 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、DNA用のインターカレーター色素を含む100 mLの4%アクリルアミド/1 mM EDTA/PBSで細胞を再懸濁します(表1、 1細胞/ μLを参照)。
8.再利用可能な単一細胞の調製
- 再利用可能な単一セルの調製(手動バージョン)
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:9 時間/96セル- 1 mLの細胞懸濁液(1細胞/μL)と、DNA用のインターカレーター色素を含む1 mM EDTA/PBS199 mLを混合します( 表1を参照)。
- 200μLの細胞懸濁液を平底96ウェルプレートの各ウェルに移す(合計10プレート、 材料表を参照)。
- カバーを96ウェルプレートに置き、走査型顕微鏡( 材料表を参照)を使用して10枚のプレートをスキャンし、単一細胞を含むウェルを特定します。
- 単一細胞を含むウェルの内容物をPCRチューブに移します。
- プレートを(オペレーターに向かって)傾け、単一セルがウェルの下端に沈むまで数分待ちます。
- ピペットチップを下隅に置き、シングルセルとバッファー(吸引液210 μL/ウェル= バッファー200 μL+空気10 μL)をPCRチューブに移します。
注意: 必ずP200低保持チップを使用してください。 - 蛍光顕微鏡を用いてウェルを確認し、転写を確認する。
- 単一細胞がまだウェル内にある場合は、DNA用のインターカレーター色素を含む1 mM EDTA/PBSを200 μL/ウェル追加します。
- その後、転送を繰り返します。
- ブレーキなしのスイングローターを使用して、PCRチューブを240 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
注意: ブレーキをかけると、チューブ内の水が渦巻くようになり、単細胞の沈殿が妨げられます。ブレーキなしでスイングローターで遠心分離する場合、単一セルは常にチューブの底に沈みます。ただし、角度付きローターを使用すると、単一細胞がPCRチューブの側壁に付着し、失われる可能性があります。 - 非常に遅いピペッティング速度で195 μLの上清を除去します。
- 195 μL/チューブのアクリルアミド/ビスアクリルアミド/APS溶液を加えます( 表1を参照)。
- ブレーキなしのスイングローターを使用して、PCRチューブを240 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 非常に遅いピペッティング速度で195 μLの上清を除去します。
- 底部3 μLを、4%TEMED/ミネラルオイルと磁性ポリアクリルアミドビーズ(ステップ6で生成)を含むPCRチューブに移します。
注意: 必ずP10低保持チップを使用してください。磁性ポリアクリルアミドビーズの近くにセルを分注します。鉱物油では、単セルを含む液体が表面張力により磁性ポリアクリルアミドビーズの表面に付着する。 - 室温で一晩インキュベートします。
注:このプロセスにより、二層アクリルアミドゲルビーズが生成されます。コアは磁性ゲルビーズです。外層は、単一細胞を含むポリアクリルアミドゲルである。単一細胞はゲルの外層に埋め込まれている。 安全な停止点:再利用可能な単一細胞を50%グリセロール/1 mM EDTA/0.05%トゥイーン20/0.5%BSA/TBSバッファーで洗浄した後、再利用可能な単一細胞を-20°Cで最大6ヶ月間保存できます。
- 再利用可能な単一細胞の調製(半自動版)
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:3 時間/ 96セル- 1 mLの細胞懸濁液(1細胞/μL)と、DNA用のインターカレーター色素を含む1 mM EDTA/PBS199 mLを混合します( 表1を参照)。
- 200 μLの細胞懸濁液を4 nLのナノウェルプレートの各ウェルに移し(図3および材料表を参照)、4 nLのナノウェルプレートを自動シングルセルピッキングロボット(材料表を参照)に置きます。
- 96ウェルPCRプレートをデスティネーションプレートとして、自動シングルセルピッキングロボットに配置します。各ウェルに200 μL/ウェルのアクリルアミド/ビスアクリルアミド/APS溶液が含まれていることを確認します( 表1を参照)。
- 単一細胞を4 nLのナノウェルから96ウェルPCRプレートのウェルに移します( 補足ビデオS1を参照)。
- 96ウェルPCRプレートの上にカバーを置き、ブレーキなしのスイングローターを使用して、96ウェルプレートを240 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 96ウェルPCRプレートを自動リキッドハンドリングロボットのデッキに置きます( 材料表、 図4、および 補足コード1を参照)。
- 補足コード1をリキッドハンドリングロボットのソフトウェアウィンドウ(材料表を参照)にドラッグアンドドロップします。
- 自動リキッドハンドリングロボットでプログラムを実行します(補足ビデオS2および補足ビデオS3を参照)。
- 非常に遅いピペッティング速度で195 μLの上清を除去します。
- 50 μLの4%TEMED/ミネラルオイルを加えます。
注意: 手順8.2.8.1〜8.2.8.2は、手動ピペッティングで実行できます。
- 室温で一晩インキュベートします(図5)。 安全な停止点:再利用可能な単一細胞を50%グリセロール/1 mM EDTA/0.05%トゥイーン20/0.5%BSA/TBSバッファーで洗浄した後、再利用可能な単一細胞を-20°Cで最大6か月間保存します。
図3:ステップ8.2における自動シングルセルピッキングと96ウェルPCRプレートへの移入 。 (A)シングルセルピッキングシステムの概要。単一のセルピッキングロボットは、汚染を避けるために層流クリーンフードに入っています。(B)ウェル内に4nLのナノウェルを備えた24ウェルプレート。(C)24ウェルプレートからのウェル内の細胞分布。緑色の点は、各4 nLナノウェルで単一細胞として識別された細胞です。マゼンタドットは、ダブレットまたはセルのマルチプレットとして識別されるセルです。(D)24ウェルプレート内のウェルの明視野画像。緑色の四角形は、単一細胞を含む4 nLのナノウェルです。マゼンタの正方形は、複数の細胞を含む4nLのナノウェルです。(E)約4nLのナノウェルの拡大場。明るいドットは、4 nLナノウェル内の単一細胞です。シングルセルピッキングシステムは、DAPI染色で細胞の明視野および蛍光画像を取得することにより、単一細胞を含むナノウェルを識別します。同定された単一細胞は、4 nLナノウェルから96ウェルPCRプレートのウェルに移されます。スケールバー= 2ミリメートル(C、D)、100ミリメートル(E)。略称= DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:リキッドハンドリングロボットを使用した再利用可能な単一セルの生成 。 (A)リキッドハンドリングロボットのデッキ。デッキには、ピペットチップラック用の11個のスロット(P300チップ:スロット1〜3、P20チップ:スロット5〜6)、2 mLディープウェル96ウェルプレート(スロット4)、ウェルごとに1つのセルを含む2つの96ウェルPCRプレート(スロット7および10)、および液体廃棄物用の2つの平底96ウェルプレート(スロット8および11)があります。(B)実験器具を置いた後のデッキ。(C)ステップ8.8.1のロボットピペッティングの概略図。このプログラムは、96ウェルPCRプレートの底部から単一の細胞を吸引することなく上清を除去します。(D) 補足コード1を使用して生成された再利用可能な単一セル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
9.ランダムプライマーアニーリングと伸長
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。以下のステップにおけるアスタリスク(*)は、チューブ内の再利用可能な単一セルを含むポリアクリルアミドビーズの位置を制御するために磁気分離器を使用できることを示す。しかしながら、磁気分離器の使用は必須ではない。チューブの壁に沿ってピペットチップをゆっくりと下に移動することにより、ビーズは洗浄またはバッファー交換のために押し上げられます。時間:9時間
- ピペッティング(*)で鉱物油を除去し、200 μLの1x TP Mg(-)バッファーで5回洗浄(*)します(10x TP Mg(-)バッファーを超純水で1xバッファーに希釈、 表1を参照)。
- 上清(*)を除去し、15 μLのアニーリングバッファーを加えます( 表1を参照)。
- 氷上で1時間インキュベートします。
注:このインキュベーションの目的は、プラズマ膜と核膜を透過し、ランダムプライマーを細胞核に送達することです。 - PCRチューブをサーマルサイクラーに置き、94°Cで3分間加熱します。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の体積は、ポリアクリルアミドビーズの体積を含めて約20μLである。サーマルサイクラー蓋の温度は105°Cです。 - チューブを氷冷した金属ブロックに移し、2分間インキュベートします。
- 4 μLのMgSO4/NaCl/dNTPミックス( 表1を参照)を加え、ボルテックスミキサーで中速で混合します。
- 1 μLのBstポリメラーゼ、大きなフラグメント( 材料の表を参照)を加え、ボルテックスミキサーを使用して中速で混合します。
- シェーカー(4°Cで600 rpm)で4時間インキュベートします。
注:このインキュベーションの目的は、Bstポリメラーゼを細胞核に送達することです。 - PCRチューブをサーマルサイクラーに置き、次のいずれかのプログラムを実行します。
- 10°Cで30分間、20°Cで30分間、25°Cで180分間の4時間のプログラムを実行します。
- または、4°Cで4時間、10°Cで2時間、20°Cで2時間、25°Cで4時間、4°Cで保持する一晩プログラムを実行します。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の体積は、ポリアクリルアミドビーズの体積を含めて約25μLである。サーマルサイクラーの蓋の温度は105°Cです。 安全な停止 点:再利用可能な単一細胞を4°Cで保存することにより、ここで実験を最大1日間停止します。
10. 抗体結合
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:1.5時間
- 1.625 μLのNaCl/EDTA/BSA溶液( 表1を参照)を加え、低速でボルテックスして混合します。
注:このステップは、1)EDTAによるMg2+ のキレート化を促進し、2)300 mM NaClによって拡張された1番目の ランダムプライマーの結合を安定化させ、3)その後の反応でウシ血清アルブミン(BSA)を使用して抗体の非特異的結合をブロックすることを目的としています。 - 氷上で1時間インキュベートし、抗体プローブ(ステップ5で調製)を結合させた抗体およびコントロールIgGをそれぞれ0.1 μg/mL加えます。
- シェーカーで穏やかに振とうしながら氷上で一晩インキュベートします。
11.抗体プローブと近接伸長ランダムプライマーの近接ライゲーション
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。次の手順のアスタリスク(*)は、チューブ内の再利用可能な単一セルを含むポリアクリルアミドビーズの位置を制御するために磁気分離器を使用できる場所を示します。しかしながら、磁気分離器の使用は必須ではない。チューブの壁に沿ってピペットチップをゆっくりと下に移動することで、ビーズを押し上げて洗浄またはバッファー交換を行うことができます。時間:6時間
- 氷上で200 μLの1x TPM-Tバッファーで2回洗浄(*)します(各洗浄で20分間インキュベート)。TPM-T緩衝液(トリス塩酸/塩化カリウム/硫酸マグネシウム/トリトンX-100)10倍を超純水で10倍に希釈します。
- 上清を除去し(*)、1x T4 DNAリガーゼバッファーで1回洗浄(*)します( 材料の表を参照)。
- 上清(*)を除去し、ライゲーションアダプター溶液19 μLを加えます( 表1を参照)。
- 25°Cで1時間インキュベートします。
- 1 μL T4 DNAリガーゼ( 材料の表を参照)を加え、ボルテックスミキサー上でチューブを中速で混合します。
- チューブをサーマルサイクラーに置き、次のプログラムを実行します:近接ライゲーションプログラム、16°Cで4時間、25°Cで30分。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の体積は、ポリアクリルアミドビーズの体積を含めて約25μLである。サーマルサイクラー蓋の温度は室温である。 - 200 μLの1x Bst Mg(-)EDTA(+)バッファー( 表1を参照、10xストックバッファーから1xバッファーを調製)で2回短時間洗浄し、細胞を4°Cで一晩保存します。 安全な停止点:再利用可能な単一細胞を4°Cで保存することにより、ここで実験を最大1日間停止します。
12.第1ランダムプライマーの完全な伸展
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:4.5時間
- 200 μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) バッファー (表 1 を参照、10 x ストックバッファーから 1x バッファーを調製) で 2 回洗浄し、上清を除去し、20 μL の Bst/dNTP/MgSO4 混合物を加えます (表 1 を参照)。
- ボルテックスミキサーと中速で混合し、オービタルシェーカー(6°Cおよび500rpm)で4時間インキュベートします。
- チューブをサーマルサイクラーに置き、次のプログラムを実行します:フルエクステンションプログラム:10°Cで1時間、20°Cで1時間、30°Cで1時間、40°Cで1時間、50°Cで1時間、65°Cで1時間、94°Cで10分間、4°Cで保持します。
注: 安全な停止点:再利用可能な単一細胞を4°Cで保存することにより、実験をここで最大1日間停止できます。
13. 多重変位増幅
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:2.5 時間(ステップ13.1-13.2)+ 15分(ステップ13.3-13.4)+ 1日(ステップ13.5-13.10)
- 0.4 μLの100 μM 2番目の ランダムプライマー( 表3を参照)を追加し、ボルテックスミキサーで中速で混合します。
- オービタルシェーカーで6°C、500rpmで2時間インキュベートし、チューブをサーマルサイクラーに置き、94°Cで3分間加熱します。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の体積は、ポリアクリルアミドビーズの体積を含めて約25.4μLである。サーマルサイクラー蓋の温度は105°Cです。 - チューブを氷冷した金属ブロックに入れ、Bst DNAポリメラーゼを1 μL/チューブに加えます。
- 低速でボルテックスし、チューブをサーマルサイクラーに置き、次のプログラムを実行します。
4°Cで4時間、10°Cで30分、20°Cで30分、30°Cで30分、40°Cで30分、50°Cで30分、65°Cで60分、94°Cで3分間、4°Cで保持します。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の体積は、ポリアクリルアミドビーズの体積を含めて約26.4μLである。サーマルサイクラーの蓋の温度は105°Cです。 安全な停止 点:再利用可能な単一細胞を4°Cで保存することにより、ここで実験を最大1日間停止します。 - 上清(約20μL)を採取し、PCRチューブに移します。
- 回収した上清を-80°Cで保存する。
- 再利用可能な単一細胞を含むPCRチューブに20 μL/チューブの0.05%Tween 20/0.1x TEバッファーを加え( 表1を参照)、再利用可能な単一細胞を4°Cで一晩インキュベートします。 安全な停止ポイント:インキュベーション時間を延長して、ここで数日間実験を停止します。
- 上清を収集し、上清をステップ13.5で収集したサンプルと組み合わせます。
- 手順13.7〜13.8をもう一度繰り返します。再利用可能な単一細胞を50%グリセロール/5 mM EDTA/0.5% BSA/0.05% Tween20/TBSバッファーに浸し、オービタルシェーカー(4°C、600 rpm)で30分間インキュベートします。再利用可能な単一細胞を次の実験まで-20°Cで保存してください。
- 40 μLのExo- マスターミックス( 表1を参照)を加え、チューブをサーマルサイクラーに置き、次のプログラムを実行します:i)95°Cで5分間、ii)95°Cで30秒間、iii)60°Cで30秒間、iv)72°Cで30秒間、v)ステップii〜ivを19回繰り返し、vi)72°Cで5分間、 vii)4°Cで保持する。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の体積は、ポリアクリルアミドビーズの体積を含めて約45μLである。サーマルサイクラー蓋の温度は105°Cです。 安全停止点:サンプルを-80°Cで保存することにより、実験をここで少なくとも数日間停止できます。
14.フェノール-クロロホルム精製とポリエチレングリコール沈殿
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:1.5時間
- 製品を0.5 mL DNA低結合チューブに移し、100 μLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加えます。
注:フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールは刺激を引き起こし、接触すると火傷する可能性があります。手袋、安全ゴーグル、白衣を着用してください。十分な換気でのみ使用するか、適切な呼吸用保護具を着用してください。施設の安全ガイドラインに従ってください。使用済みのラボウェアは、機関のガイドラインに従って廃棄してください。 - 手で30秒間振とうし、12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 水相(80 μL)を0.5 mL DNA低結合チューブに回収し、40.84 μL/チューブの直鎖アクリルアミド/MgCl2 混合物を加えます( 表1を参照)。
- 50%(w/v)PEG8000(RNaseフリー)の47.06 μL/チューブを加え、ピペッティングで混合します。
- 室温で20分間インキュベートし、室温で10分間240 × g で遠心分離します。
- 上清を除去し、80%エタノール(EtOH)を400μL/チューブに加えます。
- 80%EtOHで洗浄し、アスピレーターを使用して上清を除去し、ペレットを風乾します。
- ペレットを20 μLの1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl、pH 7.4バッファーで懸濁し、溶液を-80°Cで保存します。
注:二本鎖DNA特異的インターカレーター色素を使用してDNA濃度を測定します(材料表を参照)。安全な停止ポイント:実験はここで少なくとも1週間安全に停止できます。
15. インビトロ 転写
注意: 次の手順は、DNaseおよびRNaseの汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:5時間
- 単一細胞由来産物のDNAを解凍し(ステップ14から)、DNA産物の2 μL/細胞を混合して単一細胞由来産物の混合ライブラリーを作製します(総容量20 μL)。
- 26 μLの in vitro 転写マスターミックス( 材料表 および製造元のプロトコルを参照)を追加し、ピペッティングで混合します。
- PCRチューブをサーマルサイクラーに置き、37°Cで4時間インキュベートします。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の容量は46μLである。サーマルサイクラー蓋の温度は105°Cです。 - 5 μLの10x DNase Iバッファー(材料の表を参照)を追加し、4 μLのDNase I(RNaseフリー、4 U、材料の表を参照)を追加します。
- 混合して37°Cで15分間インキュベートし、サンプルを0.5 mLチューブに移します。
- チオシアン酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム( 材料表を参照)を300μL/チューブに加え、穏やかなボルテックスで混合します。
注意: チオシアン酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルムは、接触すると深刻な化学火傷を引き起こす可能性があります。手袋、安全ゴーグル、白衣を着用してください。十分な換気でのみ使用するか、適切な呼吸用保護具を着用してください。機関の安全ガイドラインに従ってください。使用済みのラボウェアは、機関のガイドラインに従って廃棄してください。 - R.T.でシェーカーで5分間インキュベートした後、サンプルを-80°Cで最大3日間保存します。
注意: 安全な停止ポイント:実験はここで最大3日間安全に停止できます。
16. RNA精製
注意: 次の手順は、DNaseおよびRNaseの汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:2時間
- ステップ15.7のサンプルに80 μL/チューブのクロロホルムを加え、チューブを手で15秒間激しく振ってください。
- 室温で2〜15分間インキュベートし、サンプルを12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
- サンプルの水相(~200 μL)を回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。
- チオシアン酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルムを600 μL/チューブに加え、サンプルを1.5 mLチューブに移します。
- 180 μL/チューブのクロロホルムを加え、チューブを手で15秒間激しく振ってください。
- サンプルを12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
- サンプルの水相(~450 μL)を採取し、1.5 mLチューブに移します。
- 60 μL/チューブのリニアアクリルアミド(5 μg/μL)を加え、400 μL/チューブの100%イソプロパノールを水相に加えます。
- チューブを室温で10分間インキュベートし、12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を慎重に取り除きます。
- RNAペレットを200 μLの75%エタノール(EtOH / RNaseフリー水)で3回洗浄し、上清を除去して、RNAペレットを風乾します。
注:ペレットは溶解性を失う可能性があるため、RNAを完全に乾燥させないでください。 - RNAse阻害剤(1 μL/20 μL)を含む20 μLのRNaseフリー水にRNAペレットを再懸濁し、ピペッティングでペレットを溶解します。
- 260 nmでの吸光度を測定します。
17.逆転写
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:1時間
- 7 μL/チューブの逆転写プライマー+ dNTPミックス(表 1 および 表3を参照)を追加し、チューブをサーマルサイクラーに置きます。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の容量は27μLである。サーマルサイクラー蓋の温度は105°Cです。 - 65°Cで5分間加熱し、チューブを氷の上に少なくとも1分間置きます。
- 14 μL/チューブの逆転写酵素マスターミックス( 表1を参照)を加え、ピペッティングで混合します。
- チューブをサーマルサイクラーに置き、55°Cで10分間インキュベートした後、80°Cで10分間インキュベートします。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の容量は60μLである。サーマルサイクラー蓋の温度は105°Cです。
18. 第二鎖合成
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:2.5時間
- 40 μL/チューブの超純水を加え、100 μLの溶液を2本の0.2 mL PCRチューブ(50 μL/チューブ)に分割します。
- 60 μL/チューブのセカンドストランド合成ミックス( 表1を参照)を加え、チューブをサーマルサイクラーに置き、次のプログラムを実行します:i)95°Cで5分間、ii)95°Cで30秒間、iii)60°Cで30秒間、iv)72°Cで30秒間、v)手順ii〜ivを20回繰り返し、vi)4°Cで保持します。
注:チューブサイズは0.2mLです。溶液の容量は110μLである。サーマルサイクラー蓋の温度は105°Cです。 - 0.5 M EDTA(最終20 mM)の4.4 μL/チューブを加え、-80°Cで一晩保存します。
注意: 安全な停止ポイント:実験はここで最大数日間安全に停止できます。 - フェノール・クロロホルム精製およびポリエチレングリコール沈殿によってDNAを精製する(ステップ14に記載)。
注意: 安全な停止ポイント:実験はここで少なくとも1週間安全に停止できます。
19. 制限酵素消化とサイズ選択
注意: 次の手順は、DNase汚染を避けるために、清潔なフードの下で実行されます。時間:3 時間(ステップ19.1-19.7)
- 260nmにおける吸光度を測定することにより、精製されたDNAのDNA濃度を測定する(ステップ18.4から)。
- 6 μgのDNAをPCRチューブに移し、30 μLの10x消化バッファーを加え、超純水で容量を294 μLに調整します。
- 6 μLのBciVI制限酵素を添加し、37°Cで1時間インキュベートします。
- 直鎖状ポリアクリルアミドでEtOH沈殿を行います。
- 3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)を60 μL/チューブ添加し、次に直鎖アクリルアミド(5 mg/mL、 材料表を参照)を40 μL/チューブ加えます。
- 400 μL/チューブのEtOHを加え、-20°Cで一晩インキュベートします。
注: 安全な停止ポイント:実験はここで1日安全に停止できます。 - 12,000 × g を4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去します。
- ペレットを80%EtOHで2回洗浄し、ペレットを乾燥させます。
- ペレットを20 μLの1xTEバッファーで溶解し、4 μL/チューブの新鮮な6xゲルローディングバッファーを追加します。
- サンプルを5%アガロースゲル/0.5x TAEバッファーにロードし、電気泳動(50 Vで40分間)を行います。
- ゲルを50 bp以上で切断して回収し( 図6を参照)、ゲル抽出キットを使用してDNAを抽出します。
注意: 安全な停止ポイント:実験はここで少なくとも1週間安全に停止できます。 - DNAライブラリ調製キットを使用してシーケンシングライブラリを構築します(材料の表を参照)16,17。
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Representative Results
K562単一細胞は、ステップ8に記載されるプロトコルを用いて生成された( 図5参照)。単一細胞は、ポリアクリルアミドビーズの外層に包埋した。細胞DNAを染色し、DNA染色用のインターカレーター色素を用いて可視化した。
図5:生成された再利用可能な単一セル。 細胞をDNA用のインターカレーター色素(緑色蛍光)で染色する。白い矢印は、ポリアクリルアミドビーズの外層に埋め込まれた単一細胞を示す。再利用可能な単一セルは、96ウェルの平底プレートに入れられます。画像は走査型顕微鏡BZ-X710で撮影しました。スケールバー= 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6に示す結果は、所望のDNA産物の生成を支持した。ステップ19.7からのDNA産物は、BciVI制限酵素によって19〜20 bp、31〜32 bp、49 bp、および>49 bpの断片に切断されました。これらの結果は、ほとんどの製品に抗体プローブ由来配列と2番目のランダムプライマー由来配列が含まれているという結論を支持しました。続いて、DNA産物をTruSeq Nanoキットを用いてイルミナアダプターとライゲーションし、イルミナNovaSeq6000シーケンサーを用いてシーケンシングした。
図6:BciVI制限酵素消化前後のDNA産物 。 (A)BciVI消化により、予想される19〜20 bpフラグメント、31〜32 bpフラグメント、および抗体バーコード、ライゲーション配列、ゲノムDNA、および細胞バーコードを含む目的製品(>49 bp)が生成されました。(B)ステップ19.7の終了時の最終製品のサイズ分布。構築したDNAライブラリーをキャピラリー電気泳動により解析した。薄いピンク色の線は、シーケンシングアダプター、抗体バーコード、および細胞バーコードを含む目的の製品を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
シーケンシングの結果、ステップ7〜19に従って生成された製品には、抗体プローブ、ライゲーション配列、ゲノム配列、および細胞バーコードが含まれていることが示されました。抗H3K27acおよび抗H3K27me3からのユニークなマッピングリードは、コントロールIgGからのリードよりも有意に多かった( 図7Aを参照)。これは、抗H3K27acと抗H3K27me3の特異的結合が所望の生成物の数を増加させることを示している。シングルセルエピゲノム解析のための最先端の技術であるPaired-Tagは、核あたり約2,000のH3K27acの一意のリードとH3K27me3の1,500の一意のリードを取得します。私たちの結果は、はるかに多くのユニークリード(平均699,398 H3K27acシグナル/セルおよび505,433 H3K27me3シグナル/セル)を示しました。結果はまた、同じ再利用可能な単一セルを使用して実験を繰り返すと、信号損失が減少し、信号密度が増加するという結論を支持しました。
図7Aに示すREpi-seqシグナルを、REpi-seqデータをバルクChIP-seqデータと比較することによって評価した。図7Bでは、平均して、REpi-seqからのH3K27acシグナルの91%±3.24%が、バルクChIP-seqのH3K27acピークと重複していました。この解析は、単一細胞エピゲノム解析における「精度」のレベルを測定します18。活性ヒストンマークH3K4me3に対する現在のシングルセルエピゲノム法の精度は53%(Drop-ChIP;H3K4me3)18, 50% (scChIC-seq;H3K4me3)19、および60%(ACT-seq;H3K4me3)20.さらに、不活性ヒストンマークH3K27me3のREpi-seqの精度は平均52.09%±3.71%でしたが(図7C)、H3K27me3の精度はシングルセルChIC-seq 19では47%でした。結論として、REpi-seqはH3K27acおよびH3K27me3の検出において高い精度を示します。
また、REpi-seqの「感度」18 も解析し、REpi-seqの再現リードによって検出されたバルクChIP-seqのピーク数を測定しました(図7D、E)。REpi-seqの感度は、H3K27acで55.30%、H3K27me3で50.94%でした。他のシングルセルエピゲノム法では、感度はDrop-ChIP(H3K4me3)18で5%、ACT-seq(H3K4me3)20で5%、scChIC-seq(H3K27me3)で9.5%です19。これらの結果は、REpi-seqがエピジェネティックなシグナルの検出に敏感であることを示しています。
図7:REpi-seqでの信号番号、精度、および感度。同じ再利用可能な単一セル(K562セル)を用いて同様の実験を3回繰り返した。(A)同じ8つの単一細胞からシグナルを取得。各ドットは、再利用可能な単一セルを表します。同じ単一細胞内のコントロールIgG(黒)、抗H3K27me3(青)、および抗H3K27ac(赤)からの固有のシグナルをカウントしました。抗H3K27me3および抗H3K27acシグナルは対照IgGよりも有意に高く、抗体の特異的結合が対照IgGよりも効率的にシグナルを生成することを示しています。バー:平均、エラーバー:標準偏差。(B, C)REpi-seq H3K27ac (B) および H3K27me3 (C) 固有のリードの精度。REpi-seqから得られた一意のリードの精度は、K562バルクセル分析からの既知のChIP-seqピークとの重複に基づいていました(H3K27ac:SRR3144862;H3K27me3: SRR069083)。ChIP-seqピークによって確認されたREpi-seq H3K27acおよびH3K27me3リードの割合を、各単一細胞において計算した。結果は、8つの単一細胞の平均パーセントとして表されます。(D、E)H3K27ac(D)およびH3K27me3(E)の既知のピークを検出する際のREpi-seqの感度。REpi-seqの一意の読み取りが使用されました。ECODEプロジェクトにおけるK562バルクセルのChIP-seqによって同定されたH3K27acおよびH3K27me3ピーク(H3K27ac:ENCFF038DDS;H3K27me3: ENCFF031FSF) は、REpi-seq 固有のリードによって認識されました。結果は、REpi-seqユニークリードによって認識されるChIP-seqピークの平均パーセントとして表されます。パネルB-EはOhnuki et al.7から再現した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: このプロトコルで使用されるバッファー。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:このプロトコルで使用した抗体およびIgGコントロール。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:このプロトコルで使用したオリゴヌクレオチドDNA。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS1:自動シングルセルピッキングと96ウェルPCRプレートへの転写(ステップ8.2.4)。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS2:リキッドハンドリングロボットを使用した単一セルを含むウェルからの上清除去(ステップ8.2.8.1)。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS3:液体処理ロボットを使用して、単一セルを含む井戸に4%TEMED/鉱油を追加します(ステップ8.2.8.2)。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コード1:ステップ8.2.8.1-8.2.8.2からのリキッドハンドリングロボットの自動プログラム。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、再利用可能な単一細胞7を使用した最近報告された単一細胞マルチエピゲノム解析の段階的なプロトコルについて説明します。後続の段落では、プロトコルの潜在的な制限を強調して、重要なポイントについて説明します。
プロトコル全体(ステップ7.2〜13から)の重要なポイントの1つは、DNase汚染を回避することです。1つの細胞にはゲノムDNAのコピーが2つしかありません。したがって、ゲノムDNAに損傷を与えると、シグナル数が著しく減少します。DNaseによる汚染を回避することは、ゲノムDNAの完全性を保護するために不可欠です。
細胞膜/細胞壁を横切る試薬の透過性も、プロトコル全体を通して重要です。REpi-seqは、マウスおよびヒト細胞のエピゲノムを単一細胞レベルで解析するために設計されました。この実験方法の最適条件は、各試薬に対する細胞種や核膜の透過性によって異なることが予想される。したがって、本手法を植物細胞、酵母、細菌など、マウスおよびヒト細胞以外の細胞に適用する場合、各ステップの条件を最適化する必要があります。
ステップ9.5(最初のランダムプライマーのアニーリング)に特有の臨界点は、ゲノムDNAを変性させた後の冷却の急速な速度であると考えています。変性後のゆっくりとした段階的な冷却は、ゲノムDNAに結合するランダムプライマーのアニーリング効率を低下させる可能性がある。また、工程11(近接結紮)において、臨界点は緩衝液組成物である。ポリエチレングリコール(PEG)を含むバッファーは、分子生物学アプリケーションにおけるより高速なライゲーション法に広く使用されています。低濃度のPEG(例えば、<7.5%)は、DNA沈殿なしで二本鎖DNAの迅速な形成を促進する。しかし、PEGを含むライゲーションバッファーは、単一細胞を含む単一細胞ゲルビーズ(再利用可能な単一細胞)の収縮を誘発することを観察し、ポリアクリルアミド足場のメッシュサイズが縮小していることを示唆しています。この収縮によりT4 DNAリガーゼのアクセシビリティが低下する可能性があるため、REpi-seqにはより高速なライゲーションプロトコルを使用しないことにしました。
REpi-seqでは、結果は、同じ単一細胞内のシグナルの再検出頻度によって評価することができる。再検出頻度は、抗体プローブおよび第1ランダムプライマーとの近接ライゲーションを含む反応をモニターするのに有用である。我々は以前に報告した7 1回の実験でのH3K27acリードの62.03%が2回の反復実験で確認され、個々の実験における近接結紮の効率が反復実験における全体的な再検出率よりも高いことを示唆している。
また、再利用可能な単一細胞におけるDNAに結合するRNAポリメラーゼII(Pol II)の検出に成功したことを 7報告しています。Pol II結合は、この結合の時間的で不安定な性質のために、現在の単一細胞エピゲノム法では捕捉が困難です。
シングルセルエピゲノム解析のための現在のトランスポザーゼベースのCUT&Tagアプローチでは、ヌクレオソームとDNAの相互作用を保存する必要があります。特異的抗体はヒストン修飾に結合する。次に、抗体に結合したトランスポゼがゲノムDNAを切断し、DNA切断部位にDNAバーコードを挿入します。この反応はヌクレオソーム(ヒストン)-DNA相互作用に依存する。したがって、ヌクレオソームとDNAの相互作用、および細胞タンパク質とクロマチンの構造が損なわれないことが不可欠です。したがって、CUT&Tagアプローチは、ヒストン修飾の分析において、必然的にクロマチン構造のアクセス可能な領域に偏っています。
アクセス可能なクロマチン領域への避けられないバイアスは、単一細胞エピゲノム解析におけるエピジェネティックシグナルの数の増加を妨げます。クロマチン構造は、ヌクレオソーム関連タンパク質を介したDNA-ヌクレオソームおよびヌクレオソーム-ヌクレオソーム相互作用を含む複数の種類の分子相互作用によって形成されます。したがって、細胞タンパク質の位置を維持しながら、再利用可能な単一細胞内のDNA-タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互作用を保存しないことを選択しました。この特徴は、単量体アクリルアミドとパラホルムアルデヒド混合物(プロトコルステップ7)の使用によって達成され、タンパク質をタンパク質に、またはタンパク質をDNAに架橋するのではなく、細胞タンパク質上のアミノ基を修飾します。
ヒストンおよびゲノム関連タンパク質の位置は、ポリアクリルアミドポリマーへの接続によって保持される。ヌクレオソームは71-74°C21付近で変性する。したがって、再利用可能な単一細胞では、ヒストンは変性し、1番目のランダムプライマーのアニーリングステップ(94°C)後に互いに緩和/解離する可能性があります。これにより、ヘテロクロマチン構造が緩和され、ヘテロクロマチン領域への抗体および他の分子のアクセス性が向上する可能性があります。この結論は、CUT&Tagアプローチ9と比較して、再利用可能な単一細胞でクロマチン構造に関連するバイアスが減少することを示す報告された結果7によって裏付けられています。
ヒストンH3とポリアクリルアミドの結合は、再利用可能な単一セル内のヒストンの位置が繰り返し実験7にわたって保存されるため、少なくとも3ラウンドの熱変性後に維持されます。この機能により、同じ単一セルを使用して同じ実験を繰り返すことができます。繰り返しの実験は、CUT&Tagアプローチと比較して、単一細胞からのシグナル数の増加に寄与する。
検証可能性は科学の基本原則です。しかし、CUT&Tagアプローチでは、同じ細胞で実験を繰り返すことができないため、単一細胞の実験結果を検証することはできません。ゲノムDNAはトランスポザーゼによって切断され、1つのエピジェネティックマークのDNAバーコードを受け取ります。切断されたゲノムDNAは元の場所から放出されます。したがって、CUT&Tagアプローチは、同じ単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析に不利です。CUT&Tag法のこの特徴は、単一細胞あたりのエピジェネティックマーク数の増加に伴うシグナル密度の低下というトレードオフの根底にあります。
この問題を回避するために、ゲノムを切断するのではなくゲノムDNAをコピーし、コピーしたゲノムDNAに抗体DNAプローブでタグを付けました。REpi-seqは、同じ単一細胞の解析を可能にし、シグナル密度を高めます。また、実験結果の検証可能性、エピゲノム解析の多重化、およびCUT&Tagアプローチのトレードオフ問題の解決のための手段も提供します。トランスポザーゼを用いたエピゲノム解析の限界は克服できるものの、多数の細胞を単一細胞レベルで解析するには至っていません。さらなる開発が必要です。
結論として、REpi-seqはゲノムを切断するのではなくゲノムDNAをコピーし、コピーされたゲノムDNAに抗体DNAプローブでタグを付けます。REpi-seqはまだ初期段階にあり、細胞のスループットを向上させる必要があります。しかし、REpi-seqには、現在のシングルセルエピゲノム法の限界を克服する強みがあります:1)同じシングルセルでの繰り返し実験を通じてシグナルのドロップアウトを減らすことによってシグナル密度を高めます。2)クロマチン構造に基づいてアクセスできない領域を減らすことによって構造バイアスを減らす。3)同じ単一細胞での繰り返し実験による実験結果の検証可能性の提供、4)すべての単一細胞での同じシグナルの再検出確率に基づくシグナル同定、5)エピジェネティックマーク間の競合なしに、同じ単一細胞内の複数のエピジェネティックマークを解析します。これらの進歩により、単一細胞におけるエピジェネティックなメカニズムを解析することが可能になり、これは重要なアプリケーションであり、他の単一細胞エピゲノム法では実現不可能です。
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Disclosures
大貫博士と土里博士は、「再利用可能な単一細胞の調製方法および単一細胞のエピゲノム、トランスクリプトームおよびゲノムの解析方法」(EP3619307およびUS20200102604)の共同発明者です。特許出願は、現在の原稿に記載されている技術に関連する予備的な結果に一部基づいて提出されました。この特許出願に記載および請求された発明は、発明者が米国政府のフルタイムの従業員であった間に行われました。したがって、45連邦規則集パート7の下では、この特許出願に対するすべての権利、権原、および利益は、法律によって米国政府に譲渡されているか、譲渡されるべきです。米国政府は、受け取ったロイヤルティの一部を、15 U.S. Code § 3710cに基づいて従業員の発明者に伝えます。
Acknowledgments
プロジェクトの概念化段階でコメントをくださったDavid Sanchez-Martin博士とChristopher B. Buck博士に感謝します。また、予備実験の支援を提供してくれたGenomics Core、Center for Cancer Research、National Cancer Institute、National Institutes of Health、および計算分析のアドバイスを提供してくれたCollaborative Bioinformatics Resource、CCR、NCI、NIHにも感謝します。この方法で使用されるDNAポリメラーゼの最適化を支援してくれたAnna Word氏に感謝します。この研究では、NIHHPCバイオウルフクラスター(http://hpc.nih.gov)の計算リソースを利用しました。このプロジェクトは、がん研究センター、国立がん研究所、国立衛生研究所、NCIディレクターズイノベーションアワード(#397172)、および契約番号HHSN261200800001Eに基づく国立がん研究所からの連邦資金によってサポートされています。Tom Misteli Drs、Carol Thiele、Douglas R. Lowy、および細胞腫瘍学研究所のすべてのメンバーに、生産的なコメントをいただき、感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo- DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
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