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Genetics

반복적인 후성유전체학 분석을 위한 재사용 가능한 단일 세포

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63456
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

Summary

본 프로토콜은 재사용 가능한 단일 세포를 사용하여 반복적인 후성유전체 분석을 위한 단일 세포 방법을 설명합니다. 재사용 가능한 단일 세포를 통해 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 마크를 분석하고 결과를 통계적으로 검증할 수 있습니다.

Abstract

현재의 단일 세포 에피게놈 분석은 일회용으로 설계되었습니다. 세포는 일회성 사용 후 폐기되어 단일 세포에서 여러 후성유전학적 표지를 분석할 수 없으며 단일 세포에서 실험 배경 잡음과 신호를 구별하기 위해 다른 세포의 데이터가 필요합니다. 이 논문은 반복적인 후성유전체학 분석을 위해 동일한 단일 세포를 재사용하는 방법을 설명합니다.

이 실험 방법에서 세포 단백질은 단백질과 DNA에 가교하는 대신 먼저 폴리아크릴아미드 폴리머에 고정되어 구조적 편향을 완화합니다. 이 중요한 단계를 통해 동일한 단일 세포로 반복적인 실험이 가능합니다. 다음으로, 근접 결찰을 위한 스캐폴드 서열을 가진 무작위 프라이머를 게놈 DNA에 어닐링하고, DNA 중합효소를 이용하여 연장하여 프라이머에 게놈 서열을 첨가한다. 이어서, 후성유전학적 마커 및 대조군 IgG에 대한 항체는 각각 상이한 DNA 프로브로 표지되어 동일한 단일 세포 내의 각각의 표적에 결합된다.

근접 라이게이션은 랜덤 프라이머와 항체-DNA 프로브의 스캐폴드 서열에 상보적인 서열을 가진 커넥터 DNA를 부가함으로써 랜덤 프라이머와 항체 사이에 유도된다. 이 접근법은 항체 정보와 주변 게놈 서열을 근접 결찰의 단일 DNA 산물에 통합합니다. 이 방법을 사용하면 동일한 단일 세포로 반복 실험을 수행할 수 있으므로 희귀 세포의 데이터 밀도를 높이고 동일한 세포의 IgG 및 항체 데이터만 사용하여 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법으로 제조된 재사용 가능한 단일 세포는 최소 몇 개월 동안 보관하고 나중에 재사용하여 후성유전학적 특성을 넓히고 데이터 밀도를 높일 수 있습니다. 이 방법은 연구자와 프로젝트에 유연성을 제공합니다.

Introduction

Single-cell 기술은 개별 single-cell omics 기술을 통합하는 single-cell multiomics의 시대로 진입하고 있습니다1. 최근 단일 세포 전사체학은 염색질 접근성(scNMT-seq2 및 SHARE-seq3) 또는 히스톤 변형(Paired-seq4 및 Paired-Tag5)을 검출하는 방법과 결합되었습니다. 보다 최근에는 단일 세포 전사체학 및 단백질체학이 염색질 접근성과 통합되었습니다(DOGMA-seq6). 이러한 방법은 염색질 접근성 또는 히스톤 변형을 감지하기 위해 전이효소 기반 태깅을 사용합니다.

전이효소 기반 접근 방식은 게놈 DNA를 절단하고 게놈 DNA 단편 끝에 DNA 바코드를 추가합니다. 절단된 각 게놈 단편은 최대 2개의 DNA 바코드(= 절단 부위당 하나의 후성유전학적 마크)만 수용할 수 있으며 절단 부위의 게놈 DNA는 손실됩니다. 따라서 분열 기반 접근법은 테스트된 후성유전학적 마크의 수와 신호 밀도 사이에 절충안이 있습니다. 이것은 동일한 단일 세포에서 여러 후성 유전 학적 표지의 분석을 방해합니다. 게놈 DNA를 절단하지 않는 단세포 후성유전체법이 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다 7,8.

위에서 언급한 절단 유래 문제 외에도 전이효소 기반 접근 방식에는 다른 제한 사항이 있습니다. 단일 세포 후성유전체 분석에서는 게놈에서 히스톤과 DNA 관련 단백질의 위치를 아는 것이 중요합니다. 현재의 접근법에서, 이것은 고정되지 않은 단일 세포와 단백질-DNA 및 단백질-단백질 상호작용의 유지를 사용함으로써 달성된다. 그러나 이것은 히스톤 변형 분석에서도 접근 가능한 염색질 영역에 강한 편향을 일으킨다9. 게놈 상의 히스톤 및 게놈 관련 단백질의 위치는 폴리아크릴아미드 스캐폴드 7,8을 사용하여 단백질-DNA 및 단백질-단백질을 가교하지 않고 보존할 수 있습니다. 이 접근법은 단백질-DNA 및 단백질-단백질 상호작용에 의존하는 현재 접근법에서 관찰되는 구조적 편향을 줄입니다.

전이효소 기반 접근법은 단일 세포에서 신호를 한 번만 획득할 수 있습니다. 따라서 신호의 감소로 인해 단일 세포의 완전한 후성유전체를 묘사하는 것은 어렵습니다. 재사용 가능한 단일 세포는 동일한 단일 세포에서 반복적인 후성유전체 분석을 허용함으로써 현재의 한계를 극복하기 위해 개발되었습니다.

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Protocol

참고: 이 방법의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

Figure 1
그림 1: 프로토콜 워크플로의 개략도. 7.2-13단계는 개략도를 통해 설명됩니다. 각 행은 프로토콜의 단계를 나타냅니다. 녹색으로 착색된 세포 단백질은 결정 구조(PDB: 6M4G)를 기반으로 생성된 인간 뉴클레오솜입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 탈염 컬럼의 평형

참고: 탈염 스핀 컬럼은 다음 단계에 설명된 대로 평형을 이룹니다. 평형 탈염 컬럼은 2.1, 3.4 및 4.6 단계에서 사용됩니다.

  1. 탈염 컬럼의 하단 폐쇄(7kDa 컷오프, 0.5mL 수지 비드 부피, 재료 표 참조)를 제거하고 탈염 컬럼 상단의 캡을 풉니다.
  2. 컬럼을 1.5 mL 단백질 저결합 튜브(수집 튜브, 표 재료 참조)에 넣고 실온에서 1분 동안 1,500 × g 에서 원심분리하여 컬럼 내의 저장 용액을 제거하였다.
    알림: 스윙 로터 원심분리기를 사용하여 비드 베드 상단을 평평하게 합니다.
  3. 1.5mL 튜브에서 플로우스루를 제거하고 수지 베드 위에 150mM NaCl/100mM 인산염 완충액(pH 8.0)( 표 1 참조) 300μL를 추가합니다.
  4. 실온에서 1분 동안 1,500× g 의 원심분리하고 수집 튜브에서 유동을 제거합니다.
  5. 1.3-1.4단계를 세 번 더 반복합니다.
  6. 수집 튜브에서 버퍼를 버리고 컬럼을 새 수집 튜브에 넣습니다.
  7. 2.1, 3.4 및 4.4단계에서 평형 탈염 컬럼을 사용합니다.

2. 항체의 완충액 교환

참고: 항-H3K27ac 10, 항-H3K27me3 10, 항-Med111 및 항-Pol II10에서 글리세롤, 아르기닌 및 아지드화나트륨을 제거합니다(표 1에 표시된 완충액 조성 참조). 다음의 모든 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 소요시간: 1시간

  1. 항체 용액(100 μL, 표 2 참조)을 단계 1 다음에 제조된 평형화된 탈염 컬럼에 적용한다.
  2. 4°C에서 2분 동안 1,500× g 의 원심분리하고 수집 튜브에서 1.5mL 단백질 저결합 튜브로 플로우스루를 옮깁니다.
  3. 280 nm에서 흡광도를 사용하여 IgG 농도를 측정한다12 (마이크로 볼륨 분광 광도계 사용).
  4. 항체 용액을 한외여과 카세트(분자량 컷오프 100 kDa, 0.5 mL, 물질 표 참조)로 옮기고, 4°C에서 5분 동안 12,000 × g 에서 원심분리한다.
  5. 280 nm에서 흡광도를 이용하여 IgG 농도를 측정한다.
  6. IgG 농도가 2.4 mg / mL에 도달 할 때까지 2.5-1 단계를 반복하십시오.

3. 항체 활성화

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 2.5시간

  1. 숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 아세톤 히드라존(S-HyNic, 재료 표 참조) 1mg을 무수 N,N-디메틸포름아미드(DMF, 재료 표 참조) 100μL와 함께 녹입니다.
    참고: DMF는 가연성 유기 용매이며 피부를 통해 흡수되는 강력한 간 독소입니다. 장갑, 보안경 및 실험복을 착용하십시오. 기관 안전 지침을 따르십시오. 사용한 실험기구는 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
  2. 항체 용액 100μL에 S-HyNic/DMF 0.6μL를 추가합니다(150mM NaCl/100mM 인산나트륨, pH8.0 중 1mg/mL). 사용된 항체 및 대조군 IgG에 대해서는 표 2 를 참조한다.
  3. 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오 (빛으로부터 보호).
  4. S-Hynic 반응 항체 100μL를 평형 탈염 컬럼 상단(1단계 참조)에 적용하고 1,500× g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리하여 샘플을 수집합니다.
  5. 사용 후에는 탈염 컬럼을 폐기하십시오.
    참고: 단백질 및 기타 생체 분자에 대한 HyNic 그룹의 안정성은 다양합니다. HyNic으로 변형된 생체 분자를 즉시 접합하는 것이 좋습니다.

4. DNA 프로브의 활성화

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 2.5시간

  1. 항체 또는 대조군 IgG(항체 프로브, 표 3)에 대한 아민 변형 DNA 프로브 펠릿을 150mM NaCl/100mM 인산나트륨 완충액, pH 8.0 20μL로 용해합니다.
    알림: 튜브 바닥에 얇고 투명한 펠릿/필름을 찾으십시오. 완충액을 펠릿에 직접 바르십시오. 펠릿이 보이지 않으면 펠릿이 분리되어 벽이나 뚜껑에 부착되었을 수 있습니다. 이 경우 튜브를 원심분리하고 튜브 바닥에서 펠릿을 찾습니다.
  2. 1mg의 숙신이미딜 4-포르밀벤조에이트(S-4FB, 재료 표 참조)를 50μL의 무수 DMF와 함께 용해하고 10μL의 DMF를 용해된 항체 프로브에 추가합니다.
  3. 4.2단계에서 준비한 S-4FB/DMF 4μL를 넣고 혼합한 후 실온에서 2시간 동안 배양합니다(빛으로부터 보호).
  4. 34μL의 S-4FB 반응 항체 프로브를 평형 탈염 컬럼 상단에 적용합니다(1단계 참조).
  5. 15μL의 150mM NaCl/100mM 인산나트륨 완충액(pH 8.0)을 겔 베드 상단에 도포한 후 s-4FB 변형 항체 프로브를 수집하기 위해 4°C에서 2분 동안 1,500× g 에서 원심분리합니다.
  6. 후속 접합을 위해 플로우 스루를 사용하십시오. 260 nm에서 흡광도를 측정하고; 항체 프로브의 회수율을 계산합니다.

5. S-Hynic 개질 항체와 S-4FB 개질 항체 프로브의 접합

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 소요시간: 2시간

  1. S-Hynic 변형 항체와 S-4FB 변형 항체 프로브를 혼합하고 용액을 위아래로 피펫하여 혼합합니다.
  2. 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오 (빛으로부터 보호).
  3. 반응을 켄칭하기 위해, 478.8 μL의 Quenching & Storage 용액을 첨가한다 ( 표 1 참조).
  4. 항체 프로브 접합 항체 용액을 한외여과 카세트(분자량 컷오프 100kDa)로 옮깁니다.
  5. 12,000 × g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리한다.
  6. 피펫팅으로 카세트 내부의 용액 부피를 확인하십시오.
  7. 부피가 100μL에 도달할 때까지 5.5-5.6단계를 반복하고 -20°C에서 보관합니다.
    참고 : IgG 농도는 IgG 표준을 사용하여 샌드위치 ELISA13,14,15로 측정됩니다.

6. 코어 마그네틱 비드의 제조

참고: 이 방법에서는 단일 셀이 이중층 아크릴아미드 비드에 삽입됩니다( 그림 2 참조). 코어는 자성 폴리아크릴아미드 비드입니다. 외부층은 폴리아크릴아미드 단독입니다. 코어 마그네틱 비드는 이 섹션에서 생성됩니다. 이 섹션은 실험에 필수적인 것은 아닙니다. 소요시간: 3시간

Figure 2
그림 2: REpi-seq 실험에서 가시성과 손쉬운 취급을 위한 이중층 폴리아크릴아미드 비드의 구조 . (a) 원심분리 후 단계 6.6의 자성 나노입자. 자성 나노 입자는 단량체 아크릴 아미드로 변형되어 B에 표시된 폴리 아크릴 아미드 자성 비드에 통합됩니다. (B) 폴리아크릴아미드 자성 비드가 있는 재사용 가능한 단일 셀의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 50μL의 1M 중탄산나트륨 완충액, pH 8.5 및 450μL의 40% 아크릴아미드 용액을 혼합합니다.
    참고: 아크릴아마이드는 신경독입니다. 장갑, 보안경 및 실험복을 착용하십시오. 기관 안전 지침을 따르십시오. 사용한 실험기구는 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
  2. NHS 에스테르 작용화 된 30 nm의 산화철 분말 ( 재료 표 참조) 1g을 아크릴 아미드 / 중탄산 나트륨 완충액에 현탁하고 4 °C에서 밤새 배양합니다.
    알림: 아크릴아마이드 비드는 투명하기 때문에 비드의 위치를 보고 조작하기 어려울 수 있습니다. 산화철로 만들어진 코어 비드를 포함하면 자석을 사용하여 비드의 위치를 제어할 수 있기 때문에 가시성이 향상되고 조작이 용이합니다. 그러나 사용자가 REpi-seq 실험에 익숙하다면 코어 자성 폴리아크릴아미드 비드의 사용을 건너뛸 수 있습니다.
  3. 나노비드 현탁액을 2개의 튜브(1.5mL)로 옮기고, 4°C에서 1시간 동안 21,300× g 에서 원심분리하고(각진 로터 사용), 상층액을 제거합니다.
  4. 바닥 슬러리를 40% 아크릴아마이드/비스-아크릴아미드 1mL(19:1, 재료 표 참조)로 현탁합니다.
    참고: 비스-아크릴아마이드는 신경독입니다. 장갑과 실험복을 착용하십시오. 기관 안전 지침을 따르십시오. 사용한 실험기구는 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
  5. 4°C에서 21,300× g 의 원심분리기에서 1시간 동안(각진 로터 사용).
  6. 4°C에서 5,000× g 에서 30분 동안 원심분리(브레이크 없이 스윙 로터 사용).
  7. 저속 흡인이 있는 P1000 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
  8. 부피를 400 μL의 40 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (19 : 1, 재료 표 참조)로 조정합니다.
  9. 25 μL의 10% 과황산암모늄 용액을 첨가한다( 표 1 참조).
    알림: 과황산암모늄은 강력한 산화제입니다. 과황산암모늄이 포함된 공기 중 먼지는 접촉 시 눈, 코, 목, 폐 및 피부를 자극할 수 있습니다. 장갑, 보안경 및 실험복을 착용하십시오. 기관 안전 지침을 따르십시오. 사용한 실험기구는 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
  10. 코어 자성 폴리아크릴아미드 비드를 생성하려면 아크릴아미드 변성 산화철 현탁액 0.5μL를 PCR 튜브로 옮깁니다.
  11. 4% N,N,N', N'-테트라메틸에틸렌디아민/미네랄 오일(TEMED, 표 1 참조) 50μL를 넣고 실온에서 밤새 배양합니다.
    알림: TEMED는 가연성 용매입니다. 후드 아래에서 작업하십시오. 흡입하지 마십시오. 화염, 뜨거운 표면 및 발화원에서 멀리하십시오. 장갑, 보안경 및 실험복을 착용하십시오. 기관 안전 지침을 따르십시오. 사용한 실험기구는 기관 지침에 따라 폐기하십시오.

7. 세포 단백질의 아미노기를 단량체 아크릴아미드로 변형

참고: REpi-seq는 단일 세포 수준에서 마우스와 인간 세포의 후성유전체를 분석하도록 설계되었습니다. 이 방법을 마우스 또는 인간 이외의 종의 세포에 사용할 때 각 단계를 최적화해야 합니다.

  1. 세포 수확
    참고: 소요시간: 30분
    1. 세포 계수기를 사용하여 세포 농도 및 생존율을 측정한다( 재료 표 참조).
      참고: 이 단계에서 세포의 생존력은 데이터 분석에서 살아있는 세포인 세포 수에 영향을 미칩니다.
    2. 10% 소 태아 혈청이 포함된 배양 배지(*)를 사용하여 세포 농도를 1 ×10 5 cells/mL로 조정합니다.
      참고: *배양 배지는 관심 세포에 최적의 배양 배지입니다.
    3. 세포 현탁액 1mL를 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
    4. 세포 현탁액을 240 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
    5. 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 부드러운 피펫팅으로 세포를 혼합하고, 세포 현탁액을 4°C에서 5분 동안 240× g 에서 원심분리합니다.
    6. 상청액을 제거합니다.
      알림: 위의 모든 단계는 오염을 방지하기 위해 층류 청소 후드에서 수행해야 합니다.
  2. 세포 단백질의 아미노기를 단량체 아크릴아미드로 변형
    알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 1.5시간
    1. 1mL의 아미노기 변형 용액( 표 1 참조)을 세포 펠릿에 넣고 부드러운 피펫팅으로 세포 펠릿을 현탁합니다.
    2. 튜브를 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세포 현탁액을 4°C에서 5분 동안 240 × g 에서 원심분리한다.
    3. 상층액을 제거하고 DNA용 삽입기 염료를 포함하는 4% 아크릴아미드/1mM EDTA/PBS 100mL로 세포를 재현탁합니다(표 1, 1 cell/μL 참조).

8. 재사용 가능한 단세포(single cell)의 제조

  1. 재사용 가능한 단일 셀의 준비(수동 버전)
    알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 9시간/96셀
    1. 1mL의 세포 현탁액(1 cell/μL)과 DNA용 삽입기 염료가 포함된 199mL의 1mM EDTA/PBS (표 1 참조)를 혼합합니다.
    2. 세포 현탁액 200 μL를 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다 (총 10 플레이트, 재료 표 참조).
    3. 덮개를 96웰 플레이트에 놓고 주사 현미경( 재료 표 참조)을 사용하여 10개의 플레이트를 스캔하여 단일 세포가 포함된 웰을 식별합니다.
    4. 단일 세포를 함유하는 웰의 내용물을 PCR 튜브로 옮긴다.
      1. 플레이트를 기울이고(작업자 쪽으로) 단일 셀이 웰의 아래쪽 가장자리로 가라앉을 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
      2. 피펫 팁을 하단 모서리에 놓고 단일 세포와 완충액(흡인 210μL/웰 = 완충액 200μL + 공기 10μL)을 PCR 튜브로 옮깁니다.
        알림: P200 저유지 팁을 사용해야 합니다.
      3. 형광현미경을 이용하여 웰을 확인하여 전사를 확인하였다.
      4. 단일 세포가 여전히 웰에 있는 경우 DNA용 삽입기 염료가 포함된 1mM EDTA/PBS의 200μL/웰을 추가합니다.
      5. 그런 다음 전송을 반복합니다.
    5. 브레이크 없이 스윙 로터를 사용하여 4°C에서 5분 동안 240× g 에서 PCR 튜브를 원심분리합니다.
      알림: 제동은 튜브에 소용돌이치는 물의 흐름을 일으켜 단일 셀의 침전을 방해합니다. 브레이크가 없는 스윙 로터로 원심분리할 때 단일 셀은 항상 튜브 바닥으로 가라앉습니다. 그러나 각진 로터를 사용하면 단일 셀이 PCR 튜브의 측벽에 부착되어 손실될 수 있습니다.
    6. 매우 느린 피펫팅 속도로 195 μL의 상층액을 제거합니다.
    7. 195μL/튜브의 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드/APS 용액을 추가합니다( 표 1 참조).
    8. 브레이크 없이 스윙 로터를 사용하여 4°C에서 5분 동안 240× g 에서 PCR 튜브를 원심분리합니다.
    9. 매우 느린 피펫팅 속도로 195μL의 상층액을 제거합니다.
    10. 바닥 3μL를 4% TEMED/미네랄 오일과 자성 폴리아크릴아미드 비드(6단계에서 생성)가 포함된 PCR 튜브로 옮깁니다.
      알림: P10 저유지 팁을 사용해야 합니다. 자성 폴리아크릴아미드 비드 근처에 셀을 분배합니다. 광유에서, 단일세포를 포함하는 액체는 표면장력에 의해 자성 폴리아크릴아미드 비드의 표면에 부착된다.
    11. 실온에서 밤새 배양하십시오.
      참고: 이 공정은 이중층 아크릴아미드 겔 비드를 생성합니다. 코어는 마그네틱 겔 비드입니다. 외부층은 단일 세포를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔이다. 단세포는 겔의 외층에 매립된다. 안전한 정지점: 재사용 가능한 단일 세포를 50% 글리세롤/1mM EDTA/0.05% 트윈 20/0.5% BSA/TBS 완충액으로 세척한 후 재사용 가능한 단일 세포를 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 재사용 가능한 단일 셀의 제조 (반자동 버전)
    알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 3시간/96셀
    1. 1mL의 세포 현탁액(1 cell/μL)과 DNA용 삽입기 염료가 포함된 199mL의 1mM EDTA/PBS (표 1 참조)를 혼합합니다.
    2. 200 μL의 세포 현탁액을 4 nL 나노웰 플레이트의 각 웰로 옮기고(도 3 및 재료 표 참조) 4 nL 나노웰 플레이트를 자동화된 단일 세포 선별 로봇에 위치시킨다 (재료 표 참조).
    3. 96웰 PCR 플레이트를 자동 단일 세포 선별 로봇의 대상 플레이트로 배치합니다. 각 웰에 200μL/웰 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드/APS 용액이 포함되어 있는지 확인합니다( 표 1 참조).
    4. 단일 세포를 4nL 나노웰에서 96웰 PCR 플레이트의 웰로 옮깁니다( 보충 비디오 S1 참조).
    5. 96-웰 PCR 플레이트 상부에 커버를 씌우고 브레이크가 없는 스윙 로터를 이용하여 4°C에서 5분 동안 240 × g 의 96-웰 플레이트를 원심분리하였다.
    6. 자동 액체 처리 로봇의 데크에 96웰 PCR 플레이트를 놓습니다( 재료 표, 그림 4 및 보충 코드 1 참조).
    7. 보충 코드 1을 액체 취급 로봇의 소프트웨어 창(재료 표 참조)으로 끌어다 놓습니다.
    8. 자동 액체 처리 로봇에서 프로그램을 실행합니다(보충 비디오 S2 및 보충 비디오 S3 참조).
      1. 매우 느린 피펫팅 속도로 195 μL의 상층액을 제거합니다.
      2. 4% TEMED/미네랄 오일 50 μL를 추가합니다.
        참고: 8.2.8.1-8.2.8.2 단계는 수동 피펫팅으로 수행할 수 있습니다.
    9. 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다(그림 5). 안전한 정지점: 재사용 가능한 단일 세포를 50% 글리세롤/1mM EDTA/0.05% 트윈 20/0.5% BSA/TBS 완충액으로 세척한 후 재사용 가능한 단일 세포를 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.

Figure 3
그림 3: 8.2단계에서 자동 단일 세포 선별 및 96웰 PCR 플레이트로의 이식 . (A) 단일 세포 선별 시스템의 개요. 단일 세포 선별 로봇은 오염을 방지하기 위해 층류 청정 후드에 있습니다. (B) 웰 내부에 4nL 나노웰이 있는 24웰 플레이트. (c) 24-웰 플레이트로부터 웰 내에서의 세포 분포. 녹색 점은 각 4nL 나노웰에서 단일 세포로 식별되는 세포입니다. 마젠타 도트는 세포의 이중항 또는 다중선으로 식별되는 셀입니다. (D) 24-웰 플레이트 내 웰의 명시야 이미지. 녹색 사각형은 단일 세포를 포함하는 4nL 나노웰입니다. 마젠타 정사각형은 여러 세포를 포함하는 4nL 나노웰입니다. (E) 약 4nL 나노웰의 확대된 필드. 밝은 점은 4nL 나노웰의 단일 세포입니다. 단일 세포 선별 시스템은 DAPI 염색을 통해 세포의 명시야 및 형광 이미지를 획득하여 단일 세포를 포함하는 나노웰을 식별합니다. 확인된 단일 세포는 4 nL 나노웰로부터 96-웰 PCR 플레이트의 웰로 옮겨진다. 스케일 바 = 2 mm (C, D), 100 μm (E). 약어 = DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 액체 처리 로봇을 사용하여 재사용 가능한 단일 셀 생성. (A) 액체 처리 로봇의 갑판. 데크에는 피펫 팁 랙용 슬롯 11개(P300 팁: 슬롯 1-3, P20 팁: 슬롯 5-6), 2mL 딥웰 96웰 플레이트(슬롯 4), 웰당 단일 셀이 포함된 96웰 PCR 플레이트 2개(슬롯 7 및 10), 액체 폐기물용 평평한 바닥 96웰 플레이트 2개(슬롯 8 및 11)가 있습니다. (B) 실험기구를 놓은 후의 데크. (C) 8.8.1 단계에서 로봇 피펫팅의 개략도. 이 프로그램은 96웰 PCR 플레이트의 바닥에서 단일 세포를 흡인하지 않고 상층액을 제거합니다. (D) 보충 코드 1을 사용하여 생성된 재사용 가능한 단일 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

9. 무작위 프라이머 어닐링 및 확장

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 다음 단계에서 별표(*)는 자기 분리기를 사용하여 튜브에서 재사용 가능한 단일 세포를 포함하는 폴리아크릴아미드 비드의 위치를 제어할 수 있음을 나타냅니다. 그러나, 자기 분리기의 사용이 필수적인 것은 아니다. 튜브의 벽을 따라 피펫 팁을 천천히 아래로 이동시킴으로써, 세척 또는 완충액 교환을 위해 비드가 위로 밀려납니다. 소요시간: 9시간

  1. 피펫팅(*)으로 미네랄 오일을 제거하고 200μL의 1x TP Mg(-) 완충액으로 5회 세척(*)합니다(10x TP Mg(-) 완충액을 초순수로 1x 완충액으로 희석, 표 1 참조).
  2. 상층액(*)을 제거하고 15μL의 어닐링 완충액을 추가합니다( 표 1 참조).
  3. 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 이 배양의 목적은 원형질과 핵막을 투과시키고 무작위 프라이머를 세포핵에 전달하는 것입니다.
  4. PCR 튜브를 열 순환기에 놓고 94°C에서 3분 동안 가열합니다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 폴리아크릴아미드 비드의 부피를 포함하여 대략 20 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다.
  5. 튜브를 얼음 냉각 금속 블록으로 옮기고 2분 동안 배양합니다.
  6. 4μL의 MgSO4/NaCl/dNTP 혼합물( 표 1 참조)을 추가하고 중간 속도로 볼텍스 믹서와 혼합합니다.
  7. 1 μL의 Bst 중합효소, 큰 단편( 재료 표 참조)을 추가하고 중간 속도로 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합합니다.
  8. 셰이커에서 4시간 동안 배양합니다(4°C에서 600rpm).
    참고: 이 배양의 목적은 Bst 중합효소를 세포핵에 전달하는 것입니다.
  9. PCR 튜브를 열 순환기에 놓고 다음 프로그램 중 하나를 실행합니다.
    1. 4시간 프로그램 실행: 10°C에서 30분, 20°C에서 30분, 25°C에서 180분.
    2. 또는 4시간 동안 4°C, 2시간 동안 10°C, 2시간 동안 20°C, 4시간 동안 25°C, 4°C에서 유지와 같은 야간 프로그램을 실행합니다.
      참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 폴리아크릴아미드 비드의 부피를 포함하여 대략 25 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다. 안전한 정지 지점: 재사용 가능한 단일 세포를 4°C에서 보관하여 최대 1일 동안 여기에서 실험을 중지합니다.

10. 항체 결합

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 1.5시간

  1. 1.625μL의 NaCl/EDTA/BSA 용액( 표 1 참조)을 추가하고 저속으로 볼텍싱하여 혼합합니다.
    참고: 이 단계는 1) EDTA에 의한 Mg2+ 의 킬레이트화를 촉진하고, 2) 300mM NaCl에 의한 확장된 1차 무작위 프라이머의 결합을 안정화하고, 3) 후속 반응에서 소혈청알부민(BSA)을 사용하여 항체의 비특이적 결합을 차단하는 것을 목표로 합니다.
  2. 얼음에서 1 시간 동안 배양하고 항체 프로브 (5 단계에서 제조)와 접합 된 항체 및 대조군 IgG의 각각 0.1 μg / mL를 첨가하십시오.
  3. 얼음 위에서 하룻밤 동안 셰이커를 부드럽게 흔들어 배양합니다.

11. 항체 프로브 및 근위 확장 무작위 프라이머의 근접 결찰

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 다음 단계의 별표(*)는 튜브에서 재사용 가능한 단일 셀을 포함하는 폴리아크릴아미드 비드의 위치를 제어하기 위해 자기 분리기를 사용할 수 있는 위치를 나타냅니다. 그러나, 자기 분리기의 사용이 필수적인 것은 아니다. 튜브 벽을 따라 피펫 팁을 천천히 아래로 이동시킴으로써 세척 또는 완충액 교환을 위해 비드를 밀어 올릴 수 있습니다. 소요시간: 6시간

  1. 얼음에서 200μL의 1x TPM-T 버퍼(각 세척에서 20분 배양)로 두 번 세척(*)합니다. 10x TPM-T 완충액(Tris-HCl/염화칼륨/황산마그네슘/Triton X-100)을 초순수로 1x로 희석합니다.
  2. 상층액을 제거(*)하고 1x T4 DNA 리가아제 완충액으로 한 번 세척(*)합니다( 재료 표 참조).
  3. 상층액을 제거(*)하고 19μL의 결찰 어댑터 용액을 추가합니다( 표 1 참조).
  4. 25°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  5. 1 μL T4 DNA 리가아제( 재료 표 참조)를 추가하고 튜브를 중간 속도로 볼텍스 믹서에서 혼합합니다.
  6. 튜브를 열 순환기에 놓고 근접 결찰 프로그램, 16°C에서 4시간, 25°C에서 30분 프로그램을 실행합니다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 폴리아크릴아미드 비드의 부피를 포함하여 대략 25 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 실온입니다.
  7. 200μL의 1x Bst Mg(-) EDTA(+) 완충액으로 2회 세척(*)하고( 표 1 참조, 10x 스톡 완충액에서 1x 완충액 준비) 세포를 4°C에서 밤새 보관합니다. 안전한 정지점: 재사용 가능한 단세포를 4°C에서 보관하여 여기에서 최대 1일 동안 실험을 중지합니다.

12. 1차 무작위 프라이머의 전체 확장

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 4.5시간

  1. 200μL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) 완충액으로 2회 세척하고(표 1 참조, 10x 스톡 완충액에서 1x 완충액 준비), 상층액을 제거하고 Bst/dNTPs/MgSO4 혼합물 20μL를 추가합니다(표 1 참조).
  2. 중간 속도의 볼텍스 믹서와 혼합하고 오비탈 셰이커에서 4시간 동안 배양합니다(6°C 및 500rpm에서).
  3. 튜브를 열 순환기에 놓고 다음 프로그램을 실행하십시오: 완전 확장 프로그램: 10 °C 1 시간, 20 °C 1 시간, 30 °C 1 시간, 40 °C 1 시간, 50 °C 1 시간, 65 °C 1 시간, 94 °C 10 분, 4 °C에서 유지.
    참고: 안전한 정지 지점: 재사용 가능한 단일 세포를 4°C에서 보관하여 여기에서 최대 1일 동안 실험을 중지할 수 있습니다.

13. 다중 변위 증폭

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 2.5시간(13.1-13.2단계) + 15분(13.3-13.4단계) + 1일(13.5-13.10단계)

  1. 0.4μL의 100μM 2차 무작위 프라이머( 표 3 참조)를 추가하고 중간 속도로 볼텍스 믹서와 혼합합니다.
  2. 오비탈 셰이커 상에서 6°C 및 500rpm에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 튜브를 열 사이클러에 놓고 94°C에서 3분 동안 가열한다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 폴리아크릴아미드 비드의 부피를 포함하여 대략 25.4 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다.
  3. 튜브를 얼음 냉각 금속 블록에 넣고 1μL/튜브의 Bst DNA 중합효소를 추가합니다.
  4. 저속으로 소용돌이를 일으키고 튜브를 열 순환기에 놓고 다음 프로그램을 실행합니다.
    4 °C에서 4 시간, 10 °C에서 30 분, 20 °C에서 30 분, 30 °C에서 30 분, 40 °C에서 30 분, 50 °C에서 30 분, 65 °C에서 60 분, 94 °C에서 3 분, 4 °C에서 유지합니다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 폴리아크릴아미드 비드의 부피를 포함하여 대략 26.4 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다. 안전한 정지 지점: 재사용 가능한 단일 세포를 4°C에서 보관하여 최대 1일 동안 여기에서 실험을 중지합니다.
  5. 상층액(약 20μL)을 수집하여 PCR 튜브로 옮깁니다.
  6. 수집된 상등액을 -80°C에서 보관한다.
  7. 재사용 가능한 단일 세포( 표 1 참조)가 포함된 PCR 튜브에 0.05% Tween 20/0.1x TE 버퍼 20μL/튜브를 추가하고 재사용 가능한 단일 세포를 4°C에서 밤새 배양합니다. 안전한 정지 지점: 배양 시간을 연장하여 며칠 동안 실험을 중단합니다.
  8. 상청액을 수집하고 상청액을 13.5단계에서 수집된 샘플과 결합합니다.
  9. 13.7-13.8단계를 한 번 더 반복합니다. 재사용 가능한 단일 세포를 50% 글리세롤/5mM EDTA/0.5% BSA/0.05% Tween20/TBS 완충액에 담그고 오비탈 셰이커(4°C, 600rpm)에서 30분 동안 배양합니다. 재사용 가능한 단세포를 다음 실험까지 -20°C에서 보관한다.
  10. 40 μL의 Exo-마스터 믹스 (표 1 참조)를 추가하고 튜브를 열 순환기에 놓고 다음 프로그램을 실행하십시오 : i) 95 °C에서 5 분, ii) 95 °C에서 30 초, iii) 60 °C 30 초, iv) 72 °C에서 30 초, v) 단계 ii-iv를 19 회 반복, vi) 72 °C에서 5 분, vii) 4°C에서 유지한다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 폴리아크릴아미드 비드의 부피를 포함하여 대략 45 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다. 안전한 정지 지점: 샘플을 -80°C에서 보관하여 여기에서 최소 며칠 동안 실험을 중지할 수 있습니다.

14. 페놀-클로로포름 정제 및 폴리에틸렌글리콜 침전

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 1.5시간

  1. 생성물을 0.5mL DNA 저결합 튜브에 옮기고 100μL의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올을 추가합니다.
    참고: 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올은 자극을 유발하고 접촉에 의해 화상을 입을 수 있습니다. 장갑, 보안경 및 실험복을 착용하십시오. 환기가 잘 되는 곳에서만 사용하거나 적절한 호흡보호구를 착용하십시오. 기관 안전 지침을 따르십시오. 사용한 실험기구는 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
  2. 손으로 30초 동안 흔들고 12,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  3. 수성상(80μL)을 0.5mL DNA 저결합 튜브에 수집하고 40.84μL/튜브의 선형 아크릴아미드/MgCl2 혼합물을 추가합니다( 표 1 참조).
  4. 50%(w/v) PEG8000(RNase-free)의 47.06μL/tube를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
  5. 실온에서 20분 동안 배양하고 실온에서 240× g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
  6. 상청액을 제거하고 80% 에탄올(EtOH)의 튜브당 400μL를 추가합니다.
  7. 80% EtOH로 세척하고, 흡인기로 상층액을 제거하고, 펠릿을 자연 건조시킨다.
  8. 펠릿을 20μL의 1mM EDTA/10mM Tris-HCl, pH 7.4 완충액으로 현탁하고 용액을 -80°C에서 보관합니다.
    참고: 이중 가닥 DNA 특이적 삽입기 염료를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다( 재료 표 참조). 안전한 정지 지점: 최소 일주일 동안 실험을 안전하게 중단할 수 있습니다.

15. 시험관 전사

알림: 다음 절차는 DNase 및 RNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 소요시간: 5시간

  1. 단일 세포 유래 산물의 DNA를 해동하고(단계 14에서) DNA 산물의 세포 2μL/셀(총 부피 20μL)을 혼합하여 단일 세포 유래 산물의 혼합 라이브러리를 준비합니다.
  2. 26 μL의 In vitro transcription 마스터 믹스( 재료 표 및 제조업체의 프로토콜 참조)를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
  3. PCR 튜브를 열 순환기에 놓고 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 46 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다.
  4. 5 μL의 10x DNase I 완충액을 추가하고(재료 표 참조) 4 μL의 DNase I(RNase-free, 4 U, 재료 표 참조)을 추가합니다.
  5. 37°C에서 15분 동안 혼합 및 인큐베이션하고 샘플을 0.5mL 튜브로 옮깁니다.
  6. Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform의 300 μL / tube ( 재료 표 참조)를 넣고 부드럽게 와동 처리하여 혼합합니다.
    알림: 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름은 접촉에 의해 심각한 화학적 화상을 유발할 수 있습니다. 장갑, 보안경 및 실험복을 착용하십시오. 환기가 잘 되는 곳에서만 사용하거나 적절한 호흡보호구를 착용하십시오. 기관 안전 지침을 따르십시오. 사용한 실험기구는 기관 지침에 따라 폐기하십시오.
  7. R.T.에서 5분 동안 배양한 후 -80°C에서 최대 3일 동안 샘플을 보관합니다.
    참고: 안전한 정지 지점: 실험은 여기에서 최대 3일 동안 안전하게 중지할 수 있습니다.

16. RNA 정제

알림: 다음 절차는 DNase 및 RNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 소요시간: 2시간

  1. 15.7단계의 샘플에 80μL/튜브의 클로로포름을 추가하고 15초 동안 손으로 튜브를 세게 흔듭니다.
  2. 실온에서 2-15분 동안 배양하고 샘플을 4°C에서 15 분 동안 12,000×g에서 원심분리합니다.
  3. 샘플의 수상(~200μL)을 수집하여 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  4. Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform의 600 μL / tube를 추가하고 샘플을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
  5. 클로로포름 180μL/튜브를 넣고 튜브를 손으로 15초 동안 세게 흔듭니다.
  6. 시료를 12,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  7. 샘플의 수상(~450μL)을 수집하여 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  8. 선형 아크릴아미드 60μL/튜브(5μg/μL)를 추가하고 100% 이소프로판올 400μL/튜브를 수상에 추가합니다.
  9. 튜브를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 4°C에서 10분 동안 12,000× g 에서 원심분리합니다.
  10. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
  11. RNA 펠릿을 200μL의 75% 에탄올(EtOH/RNase가 없는 물)로 3회 세척하고 상층액을 제거하고 RNA 펠릿을 자연 건조합니다.
    알림: 펠릿이 용해도를 잃을 수 있으므로 RNA가 완전히 건조되지 않도록 하십시오.
  12. RNAse 억제제(1μL/20μL)가 포함된 RNase가 없는 물 20μL에 RNA 펠릿을 재현탁하고 피펫팅으로 펠릿을 용해합니다.
  13. 260nm에서 흡광도를 측정합니다.

17. 역전사

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 소요시간: 1시간

  1. 7μL/튜브의 역전사 프라이머 + dNTP 혼합물(표 1 및 표 3 참조)을 추가하고 튜브를 열 순환기에 놓습니다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 27 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다.
  2. 65°C에서 5분 동안 가열하고 튜브를 얼음 위에 최소 1분 동안 두십시오.
  3. 14 μL/tube의 역전사효소 마스터 믹스( 표 1 참조)를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
  4. 튜브를 열 순환기에 놓고 55°C에서 10분 동안 배양한 다음 80°C에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 60 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다.

18. 두 번째 가닥 합성

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 2.5시간

  1. 튜브당 초순수 40μL를 넣고 100μL 용액을 두 개의 0.2mL PCR 튜브(50μL/튜브)로 나눕니다.
  2. 60μL/튜브의 두 번째 가닥 합성 혼합물( 표 1 참조)을 추가하고 튜브를 열 순환기에 놓고 다음 프로그램을 실행합니다: i) 95분 동안 5°C, ii) 95초 동안 30°C, iii) 60초 동안 30°C, iv) 72초 동안 30°C, v) ii-iv 단계를 20회 반복하고 vi) 4°C에서 유지합니다.
    참고: 튜브 크기는 0.2mL입니다. 용액의 부피는 110 μL이다. 열 순환기 뚜껑의 온도는 105°C입니다.
  3. 0.5M EDTA(최종 20mM)의 튜브당 4.4μL를 추가하고 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
    참고: 안전한 정지 지점: 실험은 여기에서 최대 며칠 동안 안전하게 중지할 수 있습니다.
  4. 페놀-클로로포름 정제 및 폴리에틸렌 글리콜 침전(단계 14에 기술됨)에 의해 DNA를 정제합니다.
    참고: 안전한 정지 지점: 최소 1주일 동안 여기에서 실험을 안전하게 중지할 수 있습니다.

19. 제한효소 소화 및 크기 선택

알림: 다음 절차는 DNase 오염을 방지하기 위해 깨끗한 후드 아래에서 수행됩니다. 시간: 3시간(19.1-19.7단계)

  1. 260 nm에서 흡광도를 측정하여 정제된 DNA의 DNA 농도를 측정합니다(단계 18.4로부터).
  2. 6μg의 DNA를 PCR 튜브에 옮기고 30μL의 10x 소화 완충액을 넣고 초순수로 부피를 294μL로 조정합니다.
  3. 6 μL의 BciVI 제한 효소를 첨가하고 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
  4. 선형 폴리아크릴아미드로 EtOH 침전을 수행합니다.
    1. 60 μL/튜브의 3 M 아세트산나트륨(pH 5.2)을 추가한 다음 40 μL/튜브의 선형 아크릴아미드(5 mg/mL, 재료 표 참조)를 추가합니다.
    2. 튜브당 400μL의 EtOH를 넣고 -20°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: 안전한 정지 지점: 실험은 여기에서 하루 동안 안전하게 중지할 수 있습니다.
    3. 12,000 × g 을 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
    4. 펠릿을 80% EtOH로 두 번 세척하고 펠릿을 건조시킵니다.
    5. 펠릿을 20μL의 1xTE 완충액으로 녹이고 4μL/튜브의 신선한 6x 젤 로딩 완충액을 추가합니다.
  5. 샘플을 5% 아가로스 겔/0.5x TAE 버퍼에 넣고 전기영동을 수행합니다(50V 40분).
  6. 50bp 이상의 겔을 절단 및 수집하고( 그림 6 참조) 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다.
    참고: 안전한 정지 지점: 최소 1주일 동안 여기에서 실험을 안전하게 중지할 수 있습니다.
  7. DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 구성합니다(재료 표 참조)16,17.

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Representative Results

K562 단일 세포는 단계 8에 기술된 프로토콜을 사용하여 생성되었다( 도 5 참조). 단일세포는 폴리아크릴아미드 비드의 외층에 포매되었다. 세포 DNA를 염색하고 DNA 염색을 위해 인터칼레이터 염료를 사용하여 시각화했습니다.

Figure 5
그림 5: 생성된 재사용 가능한 단일 셀. 세포는 DNA (녹색 형광)에 대한 intercalator 염료로 염색됩니다. 흰색 화살표는 폴리아크릴아미드 비드의 바깥층에 매립된 단일 세포를 나타냅니다. 재사용 가능한 단일 셀은 96웰 평평한 바닥 플레이트에 배치됩니다. 이미지는 주사현미경 BZ-X710으로 촬영하였다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6에 나타낸 결과는 목적하는 DNA 생성물의 생성을 지지하였다. 단계 19.7의 DNA 생성물을 BciVI 제한 효소에 의해 19-20 bp, 31-32 bp, 49 bp 및 >49 bp 단편으로 절단하였다. 이러한 결과는 대부분의 제품이 항체 프로브 유래 서열과 2차 무작위 프라이머 유래 서열을 포함한다는 결론을 뒷받침했습니다. DNA 산물은 TruSeq Nano 키트를 사용하여 Illumina 어댑터로 라이게이션되고 Illumina NovaSeq6000 시퀀서를 사용하여 시퀀싱되었습니다.

Figure 6
그림 6: BciVI 제한 효소 소화 전후의 DNA 산물. (A) BciVI 분해는 항체 바코드, 결찰 서열, 게놈 DNA 및 세포 바코드를 포함하는 예상 19-20 bp 단편, 31-32 bp 단편 및 목적 생성물(>49 bp)을 생성했습니다. (B) 단계 19.7의 끝에서 최종 제품의 크기 분포. 구축된 DNA 라이브러리는 모세관 전기영동으로 분석하였다. 밝은 분홍색 선은 시퀀싱 어댑터, 항체 바코드 및 세포 바코드가 포함된 원하는 제품을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

염기서열 분석 결과 7-19단계에 따라 생성된 제품에는 항체 프로브, 결찰 서열, 게놈 서열 및 세포 바코드가 포함되어 있는 것으로 나타났습니다. 항-H3K27ac 및 항-H3K27me3로부터의 고유한 맵핑 판독은 대조군 IgG에서보다 훨씬 더 많았다( 도 7A 참조). 이는 항-H3K27ac 및 항-H3K27me3의 특이적 결합이 원하는 생성물의 수를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 단일 세포 후성유전체 분석을 위한 가장 진보된 기술인 Paired-Tag는 핵당 약 2,000개의 H3K27ac 고유 판독과 1,500개의 H3K27me3 고유 판독을 획득합니다. 우리의 결과는 훨씬 더 많은 수의 고유 판독을 보여주었습니다(평균 699,398개의 H3K27ac 신호/셀 및 505,433개의 H3K27me3 신호/셀). 결과는 또한 동일한 재사용 가능한 단일 셀을 사용하여 반복되는 실험이 신호 손실을 줄이고 신호 밀도를 증가시킨다는 결론을 뒷받침했습니다.

그림 7A에 표시된 REpi-seq 신호는 REpi-seq 데이터와 벌크 ChIP-seq 데이터를 비교하여 평가되었습니다. 그림 7B에서 평균적으로 REpi-seq의 H3K27ac 신호의 91% ± 3.24%가 벌크 ChIP-seq에서 H3K27ac 피크와 겹쳤습니다. 이 분석은 단세포 후성유전체 분석에서 "정밀도" 수준을 측정한다18. 활성 히스톤 마크 H3K4me3에 대한 현재 단세포 후성유전체학 방법의 정밀도는 53%(Drop-ChIP; H3K4me3)18, 50%(scChIC-seq; H3K4me3)19 및 60%(ACT-seq; H3K4me3)20입니다. 또한, 비활성 히스톤 마크 H3K27me3에 대한 REpi-seq의 정밀도는 평균 52.09% ± 3.71%인 반면(그림 7C), H3K27me3에 대한 정밀도는 단일 셀 ChIC-seq19에서 47%였습니다. 결론적으로 REpi-seq는 H3K27ac 및 H3K27me3 검출에 높은 정밀도를 나타냅니다.

또한 REpi-seq의 "민감도"18를 분석했는데, 이는 REpi-seq의 재현 판독에 의해 얼마나 많은 벌크 ChIP-seq의 피크가 검출되었는지를 측정합니다(그림 7D,E). REpi-seq의 민감도는 H3K27ac에서 55.30%, H3K27me3에서 50.94%였습니다. 다른 단일 세포 후성유전체 방법에서 민감도는 Drop-ChIP(H3K4me3)18에서 5%, ACT-seq(H3K4me3)20에서 5%, scChIC-seq(H3K27me3)19에서 9.5%입니다. 이러한 결과는 REpi-seq가 후성유전학적 신호를 감지하는 데 민감하다는 것을 나타냅니다.

Figure 7
그림 7: REpi-seq의 신호 수, 정밀도 및 감도. 동일한 재사용 가능한 단일 세포(K562 세포)로 동일한 실험을 3회 반복하였다. (A) 동일한 8개의 단일 셀에서 신호를 획득했습니다. 각 점은 재사용 가능한 단일 셀을 나타냅니다. 동일한 단일 세포에서 대조군 IgG(검은색), 항-H3K27me3(파란색) 및 항-H3K27ac(빨간색)의 고유한 신호를 계수했습니다. 항-H3K27me3 및 항-H3K27ac 신호는 대조군 IgG보다 유의하게 높았으며, 이는 항체의 특이적 결합이 대조군 IgG보다 더 효율적으로 신호를 생성함을 나타낸다. 막대: 평균, 오차 막대: 표준 편차. (비, 씨) REpi-seq H3K27ac (B) 및 H3K27me3 (C) 고유 판독값의 정밀도. REpi-seq에서 파생된 고유 판독의 정밀도는 K562 벌크 세포 분석(H3K27ac: SRR3144862; H3K27me3: SRR069083)입니다. ChIP-seq 피크에 의해 확인된 REpi-seq H3K27ac 및 H3K27me3 판독의 백분율을 각 단일 셀에서 계산했습니다. 결과는 8개 단일세포의 평균 백분율로 표현된다. (디, 이) H3K27ac(D) 및 H3K27me3(E) 알려진 피크 검출 시 REpi-seq의 민감도. REpi-seq의 고유한 판독이 사용되었습니다. ECODE 프로젝트에서 K562 벌크 셀의 ChIP-seq에 의해 확인된 H3K27ac 및 H3K27me3 피크(H3K27ac: ENCFF038DDS; H3K27me3:ENCFF031FSF)는 REpi-seq 고유 판독에 의해 인식되었다. 결과는 REpi-seq 고유 판독에 의해 인식된 평균 ChIP-seq 피크 백분율로 표현됩니다. 패널 B-E는 Ohnuki et al.7로부터 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 이 프로토콜에 사용되는 버퍼. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 이 프로토콜에 사용된 항체 및 IgG 대조군. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 이 프로토콜에 사용된 올리고뉴클레오티드 DNA. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 S1: 자동화된 단일 세포 선별 및 96웰 PCR 플레이트로의 이식(단계 8.2.4). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 S2: 액체 처리 로봇을 사용하여 단일 세포를 함유하는 웰로부터 상청액 제거(단계 8.2.8.1). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 S3 : 액체 처리 로봇을 사용하여 단일 셀이 들어있는 우물에 4 % TEMED / 미네랄 오일을 추가합니다 (단계 8.2.8.2). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코드 1: 8.2.8.1-8.2.8.2 단계에서 액체 처리 로봇의 자동화된 프로그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 글은 재사용 가능한 단일세포를 이용한 최근 보고된 single-cell multiepigenomic 분석에 대한 단계별 프로토콜을 설명한다7. 다음 단락에서는 프로토콜의 잠재적 한계를 강조하면서 중요한 사항에 대해 논의합니다.

프로토콜 전반에 걸쳐 중요한 점 중 하나 (7.2-13 단계에서)는 DNase 오염을 피하는 것입니다. 단일 세포에는 게놈 DNA 사본이 두 개뿐입니다. 따라서 게놈 DNA를 손상시키면 신호 수가 크게 감소합니다. DNase로 인한 오염을 피하는 것은 게놈 DNA의 무결성을 보호하는 데 필수적입니다.

세포막/세포벽을 가로지르는 시약의 투과성도 프로토콜 전반에 걸쳐 중요합니다. REpi-seq는 단일 세포 수준에서 마우스와 인간 세포의 후성유전체를 분석하도록 설계되었습니다. 이러한 실험방법의 최적 조건은 각 시약에 대한 세포 유형 및 핵막의 투과성에 따라 달라질 것으로 예상된다. 따라서 이 방법을 식물 세포, 효모 및 박테리아와 같은 마우스 및 인간 세포 이외의 세포에 적용할 경우 각 단계의 조건을 최적화해야 합니다.

우리는 9.5단계(첫 번째 무작위 프라이머 어닐링)에 특정한 임계점은 게놈 DNA를 변성시킨 후 빠른 냉각 속도라고 믿습니다. 변성 후 느리고 점진적인 냉각은 게놈 DNA에 결합하는 무작위 프라이머의 어닐링 효율을 감소시킬 수 있습니다. 또한, 단계 11(근접 라이게이션)에서, 임계점은 완충액 조성이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 함유한 완충액은 분자 생물학 응용 분야에서 더 빠른 결찰 방법에 널리 사용됩니다. 낮은 농도의 PEG(예: <7.5%)는 DNA 침전 없이 이중 가닥 DNA의 빠른 형성을 촉진합니다. 그러나, 우리는 PEG를 함유하는 결찰 완충액이 단일 세포(재사용 가능한 단일 세포)를 함유하는 단일 세포 겔 비드의 수축을 유도하는 것을 관찰했으며, 이는 폴리아크릴아미드 스캐폴드의 메쉬 크기가 축소되었음을 시사한다. 이러한 수축으로 인해 T4 DNA 리가아제의 접근성이 감소할 수 있으므로 REpi-seq에 더 빠른 결찰 프로토콜을 사용하지 않기로 결정했습니다.

REpi-seq에서는 동일한 단일 셀에서 신호의 재검출 빈도로 결과를 평가할 수 있습니다. 재검출 빈도는 항체 프로브 및 첫 번째 무작위 프라이머를 사용한 근접 결찰을 포함한 반응을 모니터링하는 데 유용합니다. 우리는 이전에 한 실험에서 H3K27ac 판독의 62.03%가 두 번의 반복 실험에서 확인되었다고7 번 보고했으며, 이는 개별 실험에서 근접 결찰의 효율성이 반복 실험에서 전체 재검출 비율보다 높다는 것을 시사합니다.

우리는 또한 이전에 재사용 가능한 단일 세포에서DNA에 결합 하는 RNA 중합효소 II(Pol II)의 성공적인 검출을 7 보고했습니다. Pol II 결합은 이 결합의 시간적 및 불안정한 특성 때문에 현재의 단세포 에피게놈 방법으로 포획하기 어렵습니다.

단일 세포 후성유전체 분석을 위한 현재의 전이효소 기반 CUT&Tag 접근법은 뉴클레오솜-DNA 상호작용의 보존을 필요로 합니다. 특정 항체는 히스톤 변형에 결합합니다. 그런 다음 항체에 부착된 전이효소가 게놈 DNA를 절단하고 DNA 절단 부위에 DNA 바코드를 삽입합니다. 이 반응은 뉴클레오솜(히스톤)-DNA 상호작용에 의존합니다. 따라서 뉴클레오솜-DNA 상호작용과 세포 단백질 및 염색질의 구조가 손상되지 않은 상태로 유지되는 것이 중요합니다. 따라서 CUT&Tag 접근법은 히스톤 변형 분석에서 염색질 구조의 접근 가능한 영역에 필연적으로 편향됩니다.

접근 가능한 염색질 영역에 대한 불가피한 편향은 단일 세포 후성유전체 분석에서 후성유전학적 신호의 수의 증가를 방해합니다. 염색질 구조는 뉴클레오솜 관련 단백질을 통한 DNA-뉴클레오솜 및 뉴클레오솜-뉴클레오솜 상호작용을 포함한 여러 유형의 분자 상호작용에 의해 형성됩니다. 따라서 우리는 세포 단백질의 위치를 보존하면서 재사용 가능한 단일 세포에서 DNA-단백질 및 단백질-단백질 상호 작용을 보존하지 않기로 결정했습니다. 이 기능은 단량체 아크릴아미드와 파라포름알데히드 혼합물(프로토콜 단계 7)을 사용하여 달성되며, 이는 단백질을 단백질로 또는 단백질을 DNA로 가교결합하는 대신 세포 단백질의 아미노기를 변형합니다.

히스톤 및 게놈 관련 단백질의 위치는 폴리아크릴아미드 폴리머와의 연결에 의해 유지됩니다. 뉴클레오솜은 71-74°C 부근에서 변성된다21. 따라서 재사용 가능한 단일 세포에서 히스톤은 1차 무작위 프라이머(94°C)의 어닐링 단계 후에 변성 및 이완/해리될 가능성이 있습니다. 이것은 이질염색질 구조를 이완시키고 이질염색질 영역에 대한 항체 및 기타 분자의 접근성을 향상시킬 수 있습니다. 이 결론은 CUT&Tag 접근법9에 비해 재사용 가능한 단일 세포에서 염색질 구조와 관련된 편향이 감소한다는 것을 보여주는 보고된 결과7에 의해 뒷받침됩니다.

히스톤 H3와 폴리아크릴아미드의 연결은 재사용 가능한 단일 세포에서 히스톤의 위치가 반복적인 실험7을 통해 보존되기 때문에 최소 3라운드의 열 변성 후에도 유지됩니다. 이 기능을 사용하면 동일한 단일 셀을 사용하여 동일한 실험을 반복할 수 있습니다. 반복적인 실험은 CUT&Tag 접근법에 비해 단일 셀의 신호 수를 증가시키는 데 기여합니다.

검증 가능성은 과학의 기본 원칙입니다. 그러나 동일한 세포에 대한 반복 실험이 불가능하기 때문에 CUT&Tag 접근 방식에서는 단일 세포의 실험 결과를 검증하는 것이 불가능합니다. 게놈 DNA는 전치효소에 의해 절단되고 하나의 후성유전학적 마크에 대한 DNA 바코드를 받습니다. 절단된 게놈 DNA는 원래 위치에서 방출됩니다. 따라서 CUT&Tag 접근법은 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 마크를 분석하는 데 불리합니다. CUT&Tag 분석법의 이러한 특징은 신호 밀도 감소와 단일 세포당 후성유전학적 표지 수 증가의 절충안을 뒷받침합니다.

이 문제를 피하기 위해 게놈을 절단하는 대신 게놈 DNA를 복사한 다음 복사된 게놈 DNA에 항체 DNA 프로브로 태그를 지정했습니다. REpi-seq를 사용하면 동일한 단일 세포를 분석할 수 있으며 신호 밀도를 높일 수 있습니다. 또한 실험 결과의 검증 가능성, 후성유전체 분석 다중화 및 CUT&Tag 접근 방식의 트레이드오프 문제 해결을 위한 수단을 제공합니다. 이 방법은 전이효소 기반 후성유전체 분석의 한계를 극복하지만 아직 단일 세포 수준에서 많은 수의 세포를 분석할 수 없습니다. 추가 개발이 필요합니다.

결론적으로 REpi-seq는 게놈을 절단하지 않고 게놈 DNA를 복사한 다음 복사된 게놈 DNA에 항체 DNA 프로브를 태그합니다. REpi-seq는 아직 초기 단계이며 세포의 처리량을 늘려야 합니다. 그러나 REpi-seq는 현재 단일 세포 에피게놈 방법의 한계를 극복하는 강점을 가지고 있습니다: 1) 동일한 단일 세포에서 반복적인 실험을 통해 신호의 탈락을 줄임으로써 신호 밀도를 증가시킵니다. 2) 염색질 구조에 기초하여 접근하기 어려운 영역을 줄임으로써 구조적 편향을 감소시킨다; 3) 동일한 단일 셀에서 반복 실험을 통해 실험 결과의 검증 가능성을 제공하고, 4) 모든 단일 셀에서 동일한 신호의 재검출 확률에 기반한 신호 식별; 5) 후성유전학적 표지 간의 경쟁 없이 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 표지를 분석합니다. 이러한 발전을 통해 단일 세포에서 후성유전학적 메커니즘을 분석할 수 있으며, 이는 중요한 응용 분야이며 다른 단일 세포 후성유전체학 방법으로는 실현 가능하지 않습니다.

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Disclosures

오누키 박사와 토사토 박사는 "재사용 가능한 단일 세포를 제조하는 방법 및 단일 세포의 후성유전체, 전사체 및 게놈을 분석하는 방법"(EP3619307 및 US20200102604)이라는 제목의 특허에 대한 공동 발명자입니다. 특허 출원은 부분적으로 현재 원고에 설명 된 기술과 관련된 예비 결과를 기반으로 제출되었습니다. 이 특허 출원에 기술되고 청구된 발명 또는 발명은 발명가가 미국 정부의 정규직 직원이었을 때 만들어졌습니다. 따라서 45 Code of Federal Regulations Part 7에 따라 이 특허 출원에 대한 모든 권리, 소유권 및 이익은 법률에 따라 미국 정부에 양도되었거나 양도되어야 합니다. 미국 정부는 15 U.S. Code § 3710c에 따라 받는 로열티의 일부를 직원 발명가에게 전달합니다.

Acknowledgments

프로젝트의 개념화 단계에서 의견을 주신 David Sanchez-Martin 박사와 Christopher B. Buck 박사에게 감사드립니다. 또한 예비 실험에 도움을 주신 Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 그리고 전산 분석에 대한 조언을 해주신 Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH에 감사드립니다. 이 방법에 사용되는 DNA 중합효소의 최적화를 도와준 Ms. Anna Word에게 감사드립니다. 이 작업은 NIHHPC Biowulf 클러스터(http://hpc.nih.gov)의 계산 리소스를 활용했습니다. 이 프로젝트는 암 연구 센터, 국립 암 연구소, 국립 보건원의 교내 프로그램, NCI 이사 혁신상(#397172) 및 계약 번호 HHSN261200800001E에 따라 국립 암 연구소의 연방 기금의 지원을 받습니다. 생산적인 의견을 주신 Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy 및 Laboratory of Cellular Oncology의 모든 구성원에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo- DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

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References

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철회 문제 180
반복적인 후성유전체학 분석을 위한 재사용 가능한 단일 세포
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Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

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