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Neuroscience

Optrode Array per la modulazione optogenetica simultanea e la registrazione neurale elettrica

Published: September 1, 2022 doi: 10.3791/63460
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 1, 1, 1,2, 3,4, 1,2,5
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo il metodo di fabbricazione di un sistema optrode con fibre ottiche per l'erogazione della luce e un array di elettrodi per la registrazione neurale. Esperimenti in vivo con topi transgenici che esprimono channelrhodopsin-2 mostrano la fattibilità del sistema per la stimolazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrofisiologica.

Abstract

Durante l'ultimo decennio, l'optogenetica è diventata uno strumento essenziale per lo studio della segnalazione neurale grazie alla sua capacità unica di modulazione o monitoraggio neurale selettivo. Poiché tipi specifici di cellule neuronali possono essere geneticamente modificati per esprimere proteine opsina, l'optogenetica consente la stimolazione ottica o l'inibizione dei neuroni selezionati. Ci sono stati diversi progressi tecnologici nel sistema ottico per l'optogenetica. Recentemente, è stato proposto di combinare la guida d'onda ottica per l'erogazione della luce con la registrazione elettrofisiologica per monitorare contemporaneamente le risposte neurali alla stimolazione o all'inibizione optogenetica. In questo studio, è stato sviluppato un array optrode impiantabile (fibre ottiche 2x2) con elettrodi multicanale incorporati.

Un diodo a emissione luminosa (LED) è stato impiegato come sorgente luminosa e un array di microlenti microfabbricati è stato integrato per fornire una potenza luminosa sufficiente sulla punta delle fibre ottiche. Il sistema optrode array comprende la parte monouso e la parte riutilizzabile. La parte monouso ha fibre ottiche ed elettrodi, mentre la parte riutilizzabile ha il LED e i circuiti elettronici per il controllo della luce e l'elaborazione del segnale neurale. Il nuovo design del sistema di array optrode impiantabile viene introdotto nel video di accompagnamento oltre alla procedura della chirurgia di impianto optrodo, alla stimolazione della luce optogenetica e alla registrazione neurale elettrofisiologica. I risultati degli esperimenti in vivo hanno mostrato con successo picchi neurali bloccati nel tempo evocati dagli stimoli luminosi dei neuroni eccitatori dell'ippocampo dei topi.

Introduction

La registrazione e il controllo dell'attività neurale è essenziale per capire come funziona il cervello in una rete neurale e a livello cellulare. I metodi di registrazione elettrofisiologica convenzionali includono il patch clamp 1,2,3,4 utilizzando una micropipetta e la registrazione extracellulare utilizzando elettrodi microneurali 5,6,7,8. Come metodo di neuromodulazione, la stimolazione elettrica è stata spesso utilizzata per stimolare direttamente una regione focale del cervello attraverso la depolarizzazione diretta o indiretta delle cellule neuronali. Tuttavia, il metodo elettrico non può distinguere i tipi di cellule neuronali per la registrazione o la stimolazione perché le correnti elettriche si diffondono in tutte le direzioni.

Come tecnologia emergente, l'optogenetica ha inaugurato una nuova era nella comprensione di come funziona il sistema nervoso 9,10,11,12,13,14,15,16. L'essenza delle tecniche optogenetiche è quella di utilizzare la luce per controllare l'attività delle proteine opsina sensibili alla luce espresse da cellule geneticamente modificate. Pertanto, l'optogenetica consente la sofisticata modulazione o monitoraggio di cellule geneticamente selezionate in circuiti neurali complicati14,17. L'uso più ampio dell'approccio optogenetico ha richiesto la registrazione neurale simultanea per confermare direttamente la neuromodulazione ottica. Pertanto, un dispositivo integrato con funzioni di controllo e registrazione della luce sarebbe estremamente prezioso 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Ci sono limiti della stimolazione optogenetica convenzionale basata su laser, che richiede un sistema di erogazione della luce ingombrante e costoso 26,27,28,29,30. Pertanto, alcuni gruppi di ricerca hanno impiegato sonde al silicio basate su μLED per ridurre al minimo le dimensioni del sistema di erogazione della luce 31,32,33,34. Tuttavia, esiste il rischio di danni cerebrali termici causati dal contatto diretto con i μLED a causa della bassa efficienza di conversione energetica dei LED. Le guide d'onda luminose, come fibre ottiche, SU-8 e ossitruro di silicio (SiON), sono state applicate per evitare danni termici 30,35,36,37,38,39. Tuttavia, questa strategia presenta anche uno svantaggio a causa della sua bassa efficienza di accoppiamento tra le sorgenti luminose e le guide d'onda.

L'array di microlenti è stato precedentemente introdotto per migliorare l'efficienza di accoppiamento della luce tra LED e fibre ottiche40. È stato sviluppato un sistema optrode basato su tecnologie di sistemi microelettromeccanici (MEMS) per la stimolazione ottica e la registrazione elettrica su microscala40. L'array di microlenti tra un LED e fibre ottiche ha aumentato l'efficienza luminosa di 3,13 dB. Come mostrato nella Figura 1, un array di fibre ottiche 2x2 è allineato sull'array di microlenti 4x4 e il LED è posizionato sotto l'array di microlenti. Le fibre ottiche 2x2 sono montate invece di 4x4 per ridurre i danni cerebrali. Un array di elettrodi di tungsteno è posizionato adiacente all'array di optrodi utilizzando il silicio tramite fori per la registrazione elettrofisiologica (Figura 1B).

Il sistema è costituito da una parte superiore monouso e da parti inferiori staccabili. La parte superiore monouso, che comprende l'array di fibre ottiche, l'array di microlenti e l'array di elettrodi di tungsteno, è progettata per essere impiantata in modo permanente nel cervello per esperimenti in vivo . La parte inferiore comprende una sorgente luminosa a LED e una linea di alimentazione esterna, facilmente rimovibile e riutilizzabile per un altro esperimento animale. Una copertura in plastica collegabile protegge la parte monouso quando la parte rimovibile viene rimossa.

La fattibilità del sistema è verificata mediante l'impianto nel cervello di topi transgenici che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) in neuroni Ca2+/calmodulina-dipendenti proteina chinasi II-positivi (caMKIIα::ChR2 mouse). Gli elettrodi di registrazione sono stati utilizzati per registrare le attività neurali dei singoli neuroni durante la stimolazione ottica dei neuroni.

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Protocol

Le procedure chirurgiche e di cura degli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Ewha Womans University (n. 20-029).

1. Preparazione di un array optrode (Figura 1 e Figura 2)

  1. Collegare le fibre ottiche con l'array di microlenti.
    1. Rimuovere il rivestimento di passivazione della fibra ottica e tagliarlo in pezzi lunghi 5 mm utilizzando una mannaia in fibra ottica di precisione.
    2. Immergere la fibra ottica nella resina UV trasparente e posizionare le fibre ottiche sull'array di microlenti.
    3. Polimerizzare la resina con una lampada UV.
    4. Collega l'array di microlenti all'alloggiamento stampato in 3D usando la resina epossidica.
  2. Allineare i fili di tungsteno rivestiti con perfluoroaltolsossi (PFA).
    1. Saldare i 4 pezzi di fili di tungsteno PFA lunghi 30 mm e 1 filo d'argento al connettore femmina a 5 pin e passo 1,27 mm. Utilizzare il filo d'argento come elettrodo di riferimento.
    2. Collegare il connettore femmina con passo di 1,27 mm al preamplificatore headstage.
    3. Posizionare con cura i fili di tungsteno attraverso il silicio attraverso i fori (Figura 1B) per aiutare l'allineamento fine degli elettrodi di tungsteno.
    4. Tagliare i fili di tungsteno allineati 1 mm più corti della lunghezza della fibra ottica.
    5. Collegare il connettore all'alloggiamento stampato in 3D utilizzando resina epossidica.
  3. Posizionamento LED
    1. Posizionare il LED nell'alloggiamento stampato in 3D.
    2. Collegare il LED al circuito di guida che genera la modulazione della larghezza di impulso (PWM).
      NOTA: l'impulso PWM viene generato dal microcontrollore.
    3. Dato il rumore indotto dal circuito di guida a LED, assicurarsi che gli elettrodi di registrazione siano distanti 50 mm dal circuito di guida a LED.
    4. Misurare l'intensità della luce all'estremità della punta della fibra ottica utilizzando un fotodiodo.
  4. Immergere gli elettrodi di tungsteno e le fibre ottiche in alcool per 15 min. Quindi immergere il sistema in acqua D.I sterile e sterilizzare con gas di ossido di etilene.

2. Chirurgia dell'impianto (Figura 3 e Figura 4)

NOTA: La tecnica sterile deve essere seguita durante l'intervento chirurgico.

  1. Preparare gli animali transgenici, che sono geneticamente modificati per esprimere proteine opsina sensibili alla luce nel tipo specifico di cellule neuronali.
    NOTA: In questo studio41 è stato utilizzato un topo transgenico di sesso maschile di 2 mesi che esprime channelrhodopsin-2 (ChR2) in ca2+/calmodulina-dipendente proteina chinasi II-positiva (caMKIIα::ChR2 mouse).
  2. Anestetizzare il topo con un cocktail ketamina-xilazina- una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) - per somministrazione intraperitoneale.
    1. Controlla l'animale anestetizzato ogni 30 minuti monitorando il movimento dei baffi e la reazione al pizzico della zampa.
    2. Iniettare il cocktail ketamina-xilazina a metà della dose iniziale se è necessaria un'anestesia aggiuntiva.
  3. Rasare la pelle della testa e posizionare il mouse anestetizzato nella cornice stereotassica.
    NOTA: Eseguire la preparazione chirurgica della pelle e drappeggiare l'animale. La preparazione della pelle comporta la depilazione seguita dalla pulizia della pelle con agenti antimicrobici.
    1. Posizionare la testa all'interno della cornice stereotassica e inserire le barre auricolari nel meato.
    2. Centrare la testa del mouse nella cornice stereotassica allentando e stringendo ripetutamente le barre auricolari per un posizionamento esatto.
    3. Posizionare la barra incisiva in modo che gli incisivi superiori si aggancino sul bordo interno anteriore.
    4. Regolare la barra incisiva per impostare l'altezza della barra incisiva e stringere il morsetto del naso contro il muso.
    5. Accendere in anticipo la piastra riscaldante termica incorporata nel telaio stereotassico per mantenere la temperatura corporea a 37 °C durante le procedure chirurgiche.
    6. Mettere la sonda termica nel retto del topo per la regolazione omeotermica.
      NOTA: il posizionamento della barra auricolare deve essere controllato afferrando e facendo oscillare delicatamente il muso. La barra auricolare deve essere regolata se il muso può essere spostato lateralmente di oltre ~ 4 mm.
  4. Coprire gli occhi con vaselina (vedi la Tabella dei materiali) per evitare secchezza.
  5. Iniettare l'1% di lidocaina nel cuoio capelluto. Sollevare la pelle della testa con una pinza, fissare uno spazio di iniezione e iniettare la lidocaina sotto il cuoio capelluto.
  6. Eseguire un'incisione sagittale utilizzando un bisturi e forbici fini. Tenere la pelle incisa con un microclamp per ampliare la visibilità dell'area chirurgica.
    NOTA: La lunghezza dell'incisione è <1 cm sopra il bregma e il bordo caudale dell'osso interparietale.
  7. Rimuovere il periostio con tamponi di cotone. Se c'è sanguinamento, cauterizzare il cranio usando un bovie per sigillare i vasi sanguigni.
  8. Pulire il cranio con soluzione salina e contrassegnare i siti craniotomici usando un braccio manipolatore: ippocampo anteriore-posteriore (AP) da -1,8 a -2,8 mm, mediale-laterale (ML) 0,5-2,5 mm e dorsale-ventrale (DV) da -1 a -2 mm.
    NOTA: Considerando lo spessore del cranio del topo, inserire l'array optrode da -1,2 a -2,2 mm dall'area del cervello esposta. Data la via ippocampale, le cellule piramidali di CA3 inviano i loro assoni a CA1. Pertanto, le fibre ottiche sono 1 mm più lunghe degli elettrodi di registrazione, in modo che le fibre ottiche siano posizionate in CA3 e gli elettrodi di registrazione in CA1.
  9. Praticare un foro sopra il cervelletto e inserire una vite per terra. Mettere la vite di terra profonda 0,5 mm con una vite di precisione fino a raggiungere la parte superiore del cervelletto.
    NOTA: Garantire l'inserimento stretto della vite, che verrà utilizzata come elettrodo di terra e struttura di supporto per massimizzare la stabilità a lungo termine dell'impianto, in quanto aumenta la superficie tridimensionale per l'aderenza del cemento dentale.
  10. Forare l'area contrassegnata e rimuovere un pezzo del cranio con una pinza.
  11. Piegare la punta dell'ago da 26 G in senso orario di 120° ed esporre l'area del cervello inserendo il lato smussato dell'ago rivolto verso l'alto. Fare attenzione a non danneggiare il cervello e i vasi sanguigni.
  12. Pulire il cervello esposto con soluzione salina per lavare via la polvere ossea e la materia estranea.
  13. Fissare l'array optrode nel braccio del manipolatore e avvicinarsi all'area esposta.
    NOTA: quando si posiziona il dispositivo, ricalcolare nuovamente l'area di destinazione dal bregma può aumentare la precisione del posizionamento.
  14. Inserire lentamente l'array optrode e collegare la vite di terra al filo d'argento collegato al sistema42.
    NOTA: in questo processo, l'array deve essere fissato saldamente al braccio del manipolatore per ridurre al minimo l'oscillazione e prevenire danni cerebrali da micromotion durante l'inserimento. L'inserimento deve essere eseguito lentamente, con riposo per 10 minuti per tenere conto del gonfiore del cervello che potrebbe essere stato premuto dopo l'inserimento. La velocità di inserimento inferiore a 1 μm/s nel tessuto cerebrale è raccomandata per l'alta qualità del rapporto segnale-rumore e il numero di singole unità separabili42.
  15. Se c'è sanguinamento, applicare una pressione diretta ai sanguinamenti con un batuffolo di cotone asciutto o usare la cauterizzazione. Non passare ai passaggi successivi fino a quando il sanguinamento non viene completamente interrotto.
  16. Inserire schiuma di gel tra il cervello esposto e il dispositivo per proteggere le sostanze chimiche dal contatto diretto con il cervello.
    NOTA: La schiuma gel aiuta anche l'emostasi e mantiene il cervello umido.
  17. Pulire il cranio con tamponi di cotone per rimuovere il più possibile l'umidità e procedere alla fase di fissazione successiva.
  18. Applicare con attenzione il cemento dentale sul cranio per fissare il dispositivo e coprire la schiuma gel. Prima che il cemento dentale sia completamente indurito, separare il cuoio capelluto se attaccato al cemento dentale. Tirare la pelle incisa con una pinza per coprire il cemento dentale indurito e suturare il cuoio capelluto. Quindi, rilasciare il dispositivo dal braccio del manipolatore.
    NOTA: Assicurarsi che il cemento dentale non si attacchi alla pelle e copra solo la regione del cranio. Quando la pelle cresce, può spingere via il cemento e, alla fine, il dispositivo cadrà. Ciò causerà un problema critico per gli esperimenti in vivo a lungo termine.

3. Recupero e cura dell'impianto

  1. Estrarre il mouse dalla cornice stereotassica.
  2. Somministrare la soluzione di Carprofene utilizzando un ago da 26 G. Iniettare una volta prima dell'intervento chirurgico e 12 ore (la mattina successiva in caso di intervento chirurgico pomeridiano) e 24 ore dopo l'intervento chirurgico per ridurre il dolore.
    NOTA: La concentrazione del farmaco nel flacone è di 50 mg/ml e viene conservata a 4 °C. Il carprofene è viscoso e deve essere diluito in acqua sterile 1:10. Se la sterilità viene mantenuta, la soluzione può essere conservata per un massimo di 4 settimane. Per mantenere la durata effettiva del farmaco, iniettare la soluzione di Carprofen a intervalli di 12 ore.
  3. Posizionare il mouse sulla piastra riscaldante e verificare se si riprende bene dall'anestesia.
    NOTA: L'animale non viene lasciato incustodito fino a quando non riacquista sufficiente consapevolezza.
  4. Rimuovere i fili di sutura 7 - 10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  5. Lascia che l'animale si riprenda per 1 settimana. Monitorare l'assunzione di cibo e acqua durante il tempo di recupero. Somministrare l'analgesico e verificare la presenza di segni di disagio o dolore.
    NOTA: Gli animali che hanno subito un intervento chirurgico non possono rimanere con gli altri animali fino a quando non si riprendono completamente.
    1. Durante il periodo di recupero, pesare il mouse ogni giorno per verificare i cambiamenti di peso. Sacrificare il topo (vedere paragrafo 6) se c'è una perdita di peso del 20% rispetto agli animali di controllo abbinati all'età e al sesso.

4. Stimolazione optogenetica e registrazione elettrofisiologica

  1. Anestetizzare il mouse e posizionare il mouse anestetizzato nel frame stereotassico.
  2. Impostare i parametri di stimolazione.
    1. Impostare la ricetta dell'impulso luminoso su 4% duty cycle e 10 Hz di frequenza43. Impostare la stimolazione luminosa per 2 s (20 impulsi) durante la registrazione neurale.
    2. Utilizzare una corrente di 50 mA per pilotare un'intensità luminosadi 3 mW/mm 2 sulla punta della fibra ottica. Misurare la potenza luminosa utilizzando un fotodiodo e un misuratore di potenza e dividere la potenza luminosa per l'area della sfaccettatura della fibra ottica.
  3. Togliere il coperchio in plastica e fissare la parte superiore contenente il sistema di erogazione della luce con il LED e i circuiti riutilizzabili.
  4. Collegare il preamplificatore headstage al connettore a 5 pin impiantato.
  5. Aprire il software per registrare i segnali neurali.
  6. Impostare i filtri software. Utilizzare un filtro passa-banda a 0,1-20 kHz e un filtro notch a 60 Hz. Impostare la frequenza di campionamento dell'amplificatore su 20 kHz.
  7. Prima della registrazione, verificare se vengono rilevati i segnali di picco neurale.
    NOTA: la cancellazione del rumore è importante perché i segnali neurali sono troppo piccoli. Se il livello di rumore è troppo alto, i segnali neurali possono essere oscurati dal rumore e diventare invisibili. Utilizzare una messa a terra appropriata e una schermatura delle onde elettromagnetiche per ridurre il rumore.
  8. Dopo il controllo del segnale, registrare i segnali neurali senza stimolazione della luce per la registrazione al basale.
  9. Fornire luce LED e registrare contemporaneamente le risposte neuronali (Figura 5 e Figura 6).
    NOTA: Una volta stimolato, il prossimo esperimento di stimolazione deve essere eseguito dopo un intervallo di almeno 5 minuti in modo che l'attività neuronale evocata dalla stimolazione precedente non influisca sull'esperimento successivo.

5. Analisi dei dati

  1. Carica i dati acquisiti utilizzando il programma MATLAB.
  2. Ottenere singole attività neurali utilizzando un algoritmo di ordinamento spike "Wave-Clus"44,45. Rileva i picchi in ciascun canale di una soglia di ampiezza come in Eq (1)45.
    Soglia = 5 × mediana Equation 1 (1)
    Dove x è il segnale filtrato passa-banda.
    1. Per installare "Wave-Clus", fare riferimento al link per il download nella Tabella dei materiali.
    2. Per aprire l'interfaccia utente grafica (GUI), digitare wave_clus nel prompt dei comandi di MATLAB.
    3. Digitare Get_spikes funzione ('nomefile.ext') per l'estensione del file preparata per il rilevamento di picchi. Quindi, esegui Do_clustering ("filename_spikes.mat") per l'ordinamento dei picchi.
  3. Conta i picchi ordinati prima, durante e dopo la stimolazione luminosa con contenitori temporali specifici. Utilizzare i contenitori temporali da 0,2 s e 2 s per l'analisi.
  4. Traccia il numero di picchi da ciascun canale di registrazione.
    NOTA: Media con errore standard dei mezzi (SEM) dei dati dai risultati di 8 esperimenti ripetuti è stata calcolata e tracciata.

6. Eutanasia

  1. Dopo tutti gli esperimenti, sacrifica il topo per inalazione di anidride carbonica (CO2).
  2. Senza precaricare la camera, posizionare il mouse nella camera trasparente di eutanasia, senza alimentazione di CO2 e/o perdite.
  3. Accendere il gas CO2 e spostare l'aria ad una velocità del 30 - 50% del volume di aria della camera di eutanasia al minuto.
    NOTA: Un misuratore di portata deve essere collegato alla bombola del gas CO2 per garantire che la velocità di spostamento dell'aria sia del 30-50% del volume della camera di eutanasia al minuto.
  4. Monitora il mouse sacrificato per mancanza di respirazione e cambia il colore degli occhi.
    NOTA: Il tempo previsto per l'eutanasia è di solito entro 10-15 minuti.
  5. Dopo aver osservato i segni di morte, rimuovere il topo dalla camera di eutanasia.
  6. Per completare la procedura di eutanasia, verificare la morte confermando l'arresto respiratorio e cardiaco.

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Representative Results

Il sistema optrode è fabbricato con successo per fornire una potenza luminosa sufficiente per attivare i neuroni bersaglio. L'allineamento fine degli elettrodi di tungsteno si ottiene attraverso il silicio microfabbricato attraverso i fori. L'intensità luminosa misurata è di 3,6 mW/mm2 sulla punta della fibra ottica quando viene applicata una corrente di 50 mA. I microlenti hanno aumentato l'efficienza luminosa di 3,13 dB. A causa dell'array di microlenti, che migliora l'accoppiamento della luce, la corrente applicata è circa la metà della corrente necessaria per ottenere la stessa intensità luminosa senza il sistema di array di microlenti. Poiché il LED genera più calore con più corrente, è ovviamente vantaggioso utilizzare l'array di microlenti per abbassare il calore del dispositivo. L'impedenza media di 4 elettrodi era di 71,39 kΩ alla frequenza di 1 kHz, che è abbastanza bassa per il rilevamento dei potenziali d'azione. Inoltre, l'array optrode comprende le parti monouso e riutilizzabili per ridurre i costi e minimizzare il peso totale dell'impianto. Il peso della parte usa e getta è ~ 0,58 g.

Un topo CaMKIIα::ChR2 è stato utilizzato per stimolare direttamente i neuroni che esprimono ChR2 e i picchi neurali evocati sono stati registrati con successo, come mostrato nella Figura 6. Abbiamo mostrato l'intera forma d'onda registrata con condizioni esatte, incluso il periodo di accensione della luce di 2 s nel mezzo (Figura 6A). L'ordinamento spike dal segnale dati grezzo è stato condotto utilizzando un codice sorgente MATLAB personalizzato. L'attività neurale totale è stata analizzata dopo aver selezionato due diverse unità. Il numero di singoli picchi neurali evocati dopo ogni impulso di stimolazione luminosa è aumentato significativamente rispetto al basale (Figura 6A, B), con diversi contenitori temporali di 2 s e 0,2 s. Di conseguenza, abbiamo potuto identificare il chiaro effetto della stimolazione optogenetica sui neuroni.

Figure 1
Figura 1: Diagramma schematico di array optrode e array di microlenti. (A) Vista schematica 3D e vista trasversale; (B) Immagine SEM di array di microlenti 4X4 e vie di silicio. Barra della scala = 1 mm (B). Abbreviazione: LED = diodo emettitore di luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Prototipo del dispositivo del sistema optrode. (A) Vista completa del sistema. (B) Vista ingrandita dell'array optrode. Barre di scala = 5 mm (A), 2 mm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Chirurgia dell'impianto. (A) Il cranio viene esposto e pulito rimuovendo il periostio. (B) L'area del cervello bersaglio è stata esposta e la vite di terra è stata inserita sopra il cervelletto. (C) L'array Optrode è stato inserito nel cervello per raggiungere la profondità. La terra era collegata elettricamente. (D) Il cemento dentale viene applicato per fissare il dispositivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Diagramma schematico della sequenza temporale dell'amministrazione, del funzionamento e dell'esperimento in vivo . Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Configurazione sperimentale del sistema di registrazione elettrofisiologica. (A) Luce LED spenta, (B) Luce LED accesa. Abbreviazione: LED = diodo emettitore di luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Risultati della registrazione elettrofisiologica. (A) Forme d'onda rappresentative della registrazione neurale e forma d'onda ingrandita in rettangolo tratteggiato rosso che indica due stimoli luminosi (barre blu) e picchi ordinati (punte di freccia rosse e nere). (B) Istogramma spike per ogni canale prima, durante e dopo la stimolazione luminosa. La figura inserita indica la posizione dell'array optrode impiantato. (C) Istogramma Spike con contenitore temporale di 100 ms. La barra blu indica il periodo di accensione della luce LED. Abbreviazione: LED = diodo emettitore di luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

È stata verificata la fattibilità del sistema per la stimolazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrofisiologica (Figura 6). I grandi picchi durante la stimolazione della luce sono artefatti fotoelettrici che si verificano contemporaneamente alla stimolazione della luce (Figura 6A). Questo è chiaro nella vista ingrandita della forma d'onda nel rettangolo tratteggiato rosso (Figura 6A). Come mostrato nella Figura 6A, gli artefatti fotoelettrici potrebbero essere chiaramente risolti dalle forme d'onda registrate e le risposte neuronali indotte dalla stimolazione optogenetica della via del segnale ippocampale sono state chiaramente identificate. La figura 6B,C indica il numero di picchi, mostrando chiaramente l'effetto di stimolazione. La Figura 6A è una delle forme d'onda utilizzate per ottenere gli istogrammi in Figura 6B,C, perché i risultati della registrazione sono ottenuti da 8 sessioni di registrazione ripetute.

La Figura 6A mostra l'aumento dell'attività neurale indotto dalla luce. Abbiamo condotto lo stesso esperimento con topi di controllo senza espressione di ChR2. In quel caso, la stimolazione optogenetica non ha aumentato l'attività neurale. Poiché gli artefatti fotoelettrici sono facilmente esclusi dai dati di registrazione, il risultato dell'animale di controllo non è incluso nel manoscritto. Inoltre, le differenze nei risultati di registrazione tra i 4 canali, come mostrato nella Figura 6, possono essere giustificate considerando che la distanza tra gli elettrodi di registrazione del tungsteno è di 300 μm (da centro a centro). È probabile che le attività di picco in diversi canali provengano da neuroni diversi. Tuttavia, poiché le cellule neuronali sono collegate, specialmente nella regione locale del cervello, i modelli generali di spiking neuronale erano simili ma non esattamente gli stessi.

Per garantire il successo di questi esperimenti sugli animali, diversi passaggi critici richiedono un'elevata precisione e un'attenzione aggiuntiva durante l'intervento chirurgico di impianto. In primo luogo, il sanguinamento dai vasi sanguigni cerebrali deve essere gestito con cura. Non continuare con i passaggi successivi fino a quando l'emorragia non si è completamente fermata. Ciò consentirà il fermo fissaggio del dispositivo impiantato sul cervello e una chiara visibilità durante la procedura chirurgica. Cauterizzare le macchie sanguinanti con un bovie, sterilizzare con soluzione salina e inserire schiuma gel può essere utile per fermare l'emorragia.

In secondo luogo, il cervello del topo deve essere protetto dalla secchezza durante l'impianto di optrode. La schiuma salina e gel viene utilizzata per mantenere l'umidità. Se la membrana dura viene rimossa e il cervello è completamente esposto, le altre fasi chirurgiche devono essere eseguite il più rapidamente possibile. In terzo luogo, anche la bassa velocità di inserimento dell'optrode è cruciale. L'inserimento più lento riduce il danno tissutale e migliora la precisione dell'impianto nella posizione target46. Poiché la deformazione del tessuto cerebrale è inevitabile durante l'inserimento dell'optrode, l'inserimento lento è molto utile per il tessuto deformato per ripristinare la sua forma e il suo volume originali.

In quarto luogo, il processo di fissazione determina la stabilità a lungo termine. È utile rendere asciutta la superficie del cranio prima di solidificare il cemento dentale per un migliore attaccamento a lungo termine. Inoltre, bisogna fare attenzione per evitare di applicare troppo cemento dentale o lasciare che il cemento si attacchi direttamente alla pelle. Man mano che la pelle incisa si rigenera nel tempo, può gradualmente spingere e staccare il cemento dal cranio man mano che la pelle cresce. Inoltre, il contatto diretto del cemento dentale con il tessuto cerebrale deve essere evitato perché il cemento dentale è dannoso per il tessuto cerebrale. Questo può essere efficacemente prevenuto con l'inserimento di schiuma gel tra il cervello esposto e il dispositivo.

Oltre alle procedure chirurgiche, il sistema optrode deve essere attentamente controllato prima di iniziare gli esperimenti. In primo luogo, la parte impiantabile dell'array di fibre ottiche e gli elettrodi devono essere esaminati al microscopio prima dell'inserimento. È necessario verificare se c'è qualche rottura nella fibra ottica perché anche una piccola fessura può causare una perdita di luce critica. Inoltre, l'allineamento tra le fibre ottiche e gli elettrodi di registrazione deve essere controllato per un inserimento preciso. Le pinze sottili possono piegare minuziosamente gli elettrodi di tungsteno per correggere il loro disallineamento.

In secondo luogo, l'intensità della luce deve essere controllata prima dell'intervento chirurgico di impianto per determinare se la potenza luminosa è superiore alla soglia e abbastanza alta da attivare le opsine. In pratica, è noto che la soglia di eccitazione per ChR2 è di circa 1 mW/mm247. Tuttavia, il riscaldamento dei tessuti generato dalla luce deve essere ridotto al minimo fornendo un'intensità luminosa sufficiente per eccitare le cellule neuronali. Un'energia luminosa troppo forte può danneggiare i tessuti cerebrali a causa di un aumento della temperatura. Un aumento della temperatura di 6-8 °C nel cervello può causare danni tissutali immediati e irreversibili12,48. Uno studio precedente ha dimostrato che l'aumento di temperatura sulla punta della fibra ottica è inferiore a 0,5 ° C49. Un basso ciclo di lavoro di stimolazione ottica con una breve durata può essere utile. Rispetto a studi precedenti che riportavano problemi di temperatura con la stimolazione optogenetica, la nostra potenza di uscita (2 mW / mm2) e il protocollo con stimolazione luminosa con 4 ms a 20 Hz per 2 secondi è appropriato e all'interno dell'intervallo di sicurezza.

Una delle principali sfide per la registrazione neurale è quella di rimuovere gli artefatti indotti dalla stimolazione ottica. Gli artefatti sincroni con la stimolazione ottica devono essere considerati in diversi aspetti perché sia i meccanismi elettrici che quelli ottici possono generare questi artefatti. In primo luogo, gli artefatti elettrici possono essere causati dal circuito elettrico che aziona il LED. Quando una corrente elettrica scorre in un circuito per guidare la stimolazione della luce, possono essere generati artefatti elettrici. Questo problema può essere superato riducendo al minimo il numero di fili per le connessioni LED e massimizzando la distanza tra il circuito di stimolazione luminosa e i fili collegati con gli elettrodi di registrazione del tungsteno. In secondo luogo, gli artefatti fotoelettrici possono essere generati dall'effetto fotoelettrochimico durante la stimolazione optogenetica. Questi artefatti possono essere ridotti al minimo evitando l'esposizione diretta dell'elettrodo di registrazione alla luce di stimolazione e aumentando la spaziatura tra le fibre ottiche e gli elettrodi. Tuttavia, è difficile eliminare gli artefatti indotti dalla luce a causa della diffusione della luce nel tessuto cerebrale.

Ci sono ancora limitazioni nell'array optrode proposto, che possono essere migliorate in studi futuri. Sebbene la punta della fibra ottica sia stata tagliata piatta in questo studio, la smussatura o la riduzione graduale delle punte delle fibre ridurrà al minimo il danno tissutale durante l'inserimento e aumenterà l'angolo di diffusione della luce dalle punte50. Un'altra limitazione è la bassa intensità luminosa. Nonostante i risultati della registrazione elettrofisiologica, il sistema proposto ha una potenza di uscita relativamente inferiore rispetto a un sistema basato su laser. Pertanto, il sistema basato su LED proposto può eccitare optogeneticamente una regione cerebrale più piccola rispetto al sistema basato su laser. Ciò è dovuto principalmente al fatto che la maggior parte dei LED ha una potenza molto inferiore rispetto ai laser in generale. Tuttavia, poiché l'efficienza e l'intensità massima dei LED sono state notevolmente migliorate di recente, i LED con una potenza di uscita più elevata possono essere sviluppati con nuove tecnologie a semiconduttore. L'altra limitazione è che non è stato eseguito uno studio di registrazione longitudinale. Tuttavia, è stato confermato che il dispositivo è stato ben collegato ai mouse per un mese. Questo risultato mostra la possibilità che il dispositivo sia adatto per esperimenti a lungo termine. Pertanto, saranno condotti test in vivo a lungo termine per verificare la stabilità del dispositivo.

Il metodo più tipico per l'optogenetica nei laboratori è quello di utilizzare un sistema laser come fonte di luce. Sebbene un laser possa fornire una potenza di uscita superiore rispetto ai LED per l'attivazione delle opsine, il sistema basato su laser non può essere facilmente miniaturizzato e richiede un'implementazione ad alto costo. Al contrario, il sistema optogenetico basato su LED presenta diversi vantaggi, come la bassa complessità del sistema, l'economicità e il basso consumo energetico, che sono vantaggiosi per lo sviluppo del sistema wireless. Pertanto, in questo studio, il LED viene utilizzato come fonte di luce e l'array di microlenti viene adottato per aumentare l'intensità luminosa del LED.

Inoltre, la sorgente luminosa e i circuiti di guida attuali comprendono le parti staccabili e riutilizzabili del sistema. Nuovi LED con diverse lunghezze d'onda possono essere facilmente utilizzati nel dispositivo con una semplice sostituzione e il costo del sistema può essere significativamente ridotto grazie al riutilizzo in più esperimenti. L'intero sistema può essere ulteriormente implementato come un sistema wireless, che stimola e registra optogeneticamente i segnali neuronali senza linee legate adottando un sistema wireless a bassa potenza nel dispositivo integrato miniaturizzato.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata supportata dal Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza e delle TIC (NRF-2019M3C1B8090805) e supportato da una sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (n. 2019R1A2C1088909). Ringraziamo il laboratorio di Seung-Hee Lee presso il Dipartimento di Scienze Biologiche, KAIST, Daejeon, Corea, per aver gentilmente fornito i topi transgenici.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus

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Neuroscienze Numero 187
Optrode Array per la modulazione optogenetica simultanea e la registrazione neurale elettrica
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Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., … More

Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C. H., Kim, Y. K., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).

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