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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Oprode Array para modulação optogenética simultânea e gravação neural elétrica

Published: September 1, 2022 doi: 10.3791/63460
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 1, 1, 1,2, 3,4, 1,2,5
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos o método de fabricação de um sistema optrode com fibras ópticas para entrega de luz e uma matriz de eletrodos para gravação neural. Experimentos in vivo com camundongos transgênicos expressando channelrhodopsin-2 mostram a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e gravação eletrofisiológica.

Abstract

Durante a última década, a optogenética tornou-se uma ferramenta essencial para a investigação da sinalização neural devido à sua capacidade única de modulação ou monitoramento neural seletivo. Como tipos específicos de células neuronais podem ser geneticamente modificados para expressar proteínas de opsina, a optogenética permite estimulação óptica ou inibição dos neurônios selecionados. Houve vários avanços tecnológicos no sistema óptico para optogenética. Recentemente, foi proposto combinar o guia óptico de ondas para entrega de luz com gravação eletrofisiológica para monitorar simultaneamente as respostas neurais à estimulação ou inibição optogenética. Neste estudo, foi desenvolvido um conjunto de optrode implantável (fibras ópticas 2x2) com eletrodos multicanais incorporados.

Um diodo emissor de luz (LED) foi empregado como fonte de luz, e uma matriz de microluvas microfrágico foi integrada para fornecer energia de luz suficiente na ponta das fibras ópticas. O sistema de matriz optrode compreende a parte descartável e a parte reutilizável. A peça descartável possui fibras ópticas e eletrodos, enquanto a parte reutilizável possui o LED e circuitos eletrônicos para controle de luz e processamento de sinal neural. O novo desenho do sistema de matriz optrode implantável é introduzido no vídeo que acompanha, além do procedimento da cirurgia de implantação de optrode, estimulação de luz optogenética e gravação neural eletrofisiológica. Os resultados de experimentos in vivo mostraram com sucesso picos neurais bloqueados pelo tempo evocados pelos estímulos de luz dos neurônios excitatórios hipocampais de camundongos.

Introduction

Gravar e controlar a atividade neural é essencial para entender como o cérebro funciona em uma rede neural e em níveis celulares. Os métodos convencionais de gravação eletrofisiológica incluem o grampode remendo 1,2,3,4 utilizando um micropipette e gravação extracelular usando eletrodos microneurais 5,6,7,8. Como método de neuromodulação, a estimulação elétrica tem sido frequentemente usada para estimular diretamente uma região cerebral focal através da despolarização direta ou indireta das células neuronais. No entanto, o método elétrico não pode distinguir tipos de células neuronais para gravação ou estimulação porque as correntes elétricas se espalham em todas as direções.

Como tecnologia emergente, a optogenética iniciou uma nova era na compreensão de como funciona o sistema nervoso 9,10,11,12,13,14,15,16. A essência das técnicas optogenéticas é usar a luz para controlar a atividade de proteínas de opsina sensíveis à luz expressas por células geneticamente modificadas. Assim, a optogenética permite a modulação ou monitoramento sofisticado de células geneticamente selecionadas em circuitos neurais complicados14,17. O uso mais amplo da abordagem optogenética exigiu registro neural simultâneo para confirmar diretamente a neuromodulação óptica. Portanto, um dispositivo integrado com funções de controle de luz e gravação seria extremamente valioso 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Há limitações da estimulação optogenética convencional baseada em laser, que requer um sistema de entrega de luz volumoso e caro 26,27,28,29,30. Portanto, alguns grupos de pesquisa utilizaram sondas de silício baseadas em μLED para minimizar o tamanho do sistema de entrega de luz 31,32,33,34. No entanto, há risco de danos cerebrais térmicos causados pelo contato direto com μLEDs devido à baixa eficiência de conversão de energia dos LEDs. Guias de ondas leves, como fibras ópticas, SU-8 e oxírio de silício (SiON), foram aplicados para evitar danos térmicos 30,35,36,37,38,39. No entanto, essa estratégia também tem uma desvantagem devido à sua baixa eficiência de acoplamento entre fontes de luz e os guias de onda.

O conjunto de microlens foi introduzido anteriormente para aumentar a eficiência de acoplamento de luz entre LEDs e fibras ópticas40. Um sistema optrode foi desenvolvido com base em tecnologias de sistemas microeletromecânicos (MEMS) para estimulação óptica e gravação elétrica em uma microescala40. O conjunto de microlens entre um LED e fibras ópticas aumentou a eficiência da luz em 3,13 dB. Como mostrado na Figura 1, uma matriz de fibra óptica 2x2 está alinhada na matriz de microlens 4x4, e o LED está posicionado abaixo da matriz de microlens. As fibras ópticas 2x2 são montadas em vez de 4x4 para reduzir os danos cerebrais. Uma matriz de eletrodo de tungstênio é posicionada adjacente à matriz optrode usando silício através de orifícios para gravação eletrofisiológica (Figura 1B).

O sistema consiste em uma peça descartável superior e partes inferiores destacáveis. A parte descartável superior, que inclui o conjunto de fibra óptica, a matriz de microlens e a matriz de eletrodo de tungstênio, foi projetada para ser permanentemente implantada no cérebro para experimentos in vivo . A parte inferior inclui uma fonte de luz LED e uma linha de alimentação externa, que é facilmente removível e reutilizável para outro experimento animal. Uma tampa de plástico anexável protege a parte descartável quando a parte destacável é removida.

A viabilidade do sistema é verificada pela implantação nos cérebros de camundongos transgênicos que expressam channelrhodopsin-2 (ChR2) em Neurônios kinase II-positivos de proteína dependente de Ca2+/calmodulin (CaMKIIα::ChR2 mouse). Os eletrodos de gravação foram utilizados para registrar as atividades neurais de neurônios individuais durante a estimulação óptica dos neurônios.

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Protocol

Os procedimentos cirúrgicos e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Mulher de Ewha (nº 20-029).

1. Preparação de uma matriz optrode (Figura 1 e Figura 2)

  1. Conecte fibras ópticas com a matriz de microlens.
    1. Remova o revestimento de passivação da fibra óptica e corte-a em pedaços de 5 mm de comprimento usando um cutelo de fibra óptica de precisão.
    2. Mergulhe a fibra óptica na resina UV clara e coloque as fibras ópticas na matriz de microlens.
    3. Cure a resina usando uma lâmpada UV.
    4. Conecte a matriz de microlens à carcaça impressa 3D usando epóxi.
  2. Alinhe os fios de tungstênio revestidos de perfluoroalkoxy (PFA).
    1. Soldar as 4 peças de fios de tungstênio PFA de 30 mm de comprimento e 1 fio de prata para o conector feminino de 5 pinos e 1,27 mm de arremesso. Use fio prateado como um eletrodo de referência.
    2. Conecte o conector feminino de 1,27 mm ao pré-amplificador do palco.
    3. Coloque cuidadosamente fios de tungstênio através do silício através dos orifícios (Figura 1B) para ajudar o alinhamento fino dos eletrodos de tungstênio.
    4. Corte os fios de tungstênio alinhados 1 mm mais curto que o comprimento da fibra óptica.
    5. Conecte o conector à carcaça impressa 3D usando epóxi.
  3. Colocação de LED
    1. Coloque o LED na carcaça impressa 3D.
    2. Conecte o LED ao circuito de condução que gera modulação da largura de pulso (PWM).
      NOTA: O pulso PWM é gerado pelo microcontrolador.
    3. Dado o ruído induzido pelo circuito de condução led, certifique-se de que os eletrodos de gravação estão a 50 mm de distância do circuito de condução led.
    4. Meça a intensidade da luz no final da ponta de fibra óptica usando um fotodiodo.
  4. Mergulhe os eletrodos de tungstênio e fibras ópticas em álcool por 15 minutos. Em seguida, mergulhe o sistema em água d.I estéril e esterilize com gás óxido de etileno.

2. Cirurgia de implantação (Figura 3 e Figura 4)

NOTA: A técnica estéril deve ser seguida durante a cirurgia.

  1. Prepare os animais transgênicos, que são geneticamente modificados para expressar proteínas de opsina sensíveis à luz no tipo específico de células neuronais.
    NOTA: Um camundongo macho, de 2 meses, que expressa canalrhodopsin-2 (ChR2) em Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-positive neurônios (CaMKIIα::ChR2 mouse) foi utilizado neste estudo41.
  2. Anestesiar o rato com um coquetel de cetamina-xylazine- uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg)-por administração intraperitoneal.
    1. Verifique o animal anestesiado a cada 30 minutos monitorando o movimento do bigode e a reação ao aperto da pata.
    2. Injete o coquetel de cetamina-xilazina em metade da dose inicial se for necessária anestesia adicional.
  3. Raspe a pele da cabeça e coloque o rato anestesiado na moldura estereotática.
    NOTA: Realize a preparação cirúrgica da pele e o animal de cortina. A preparação da pele envolve depilação seguida de limpeza da pele com agentes antimicrobianos.
    1. Posicione a cabeça dentro do quadro estereotático e insira barras de ouvido no meatus.
    2. Centralizar a cabeça do mouse no quadro estereotático afrouxando e apertando repetidamente as barras de ouvido para posicionamento exato.
    3. Coloque a barra incisivo para que os incisivos superiores engancharem sobre a borda interna dianteira.
    4. Ajuste a barra incisora para definir a altura da barra incisora e aperte o grampo do nariz contra o focinho.
    5. Ligue a almofada de aquecimento térmico embutida no quadro estereotático com antecedência para manter a temperatura corporal a 37 °C durante os procedimentos cirúrgicos.
    6. Coloque a sonda térmica no reto do mouse para regulação homeotérmica.
      NOTA: A colocação da barra de ouvido deve ser verificada agarrando suavemente e balançando o focinho. A barra de ouvido deve ser reajustada se o focinho puder ser movido mais de ~4 mm lateralmente.
  4. Cubra os olhos com geleia de petróleo (veja a Tabela de Materiais) para evitar o ressecamento.
  5. Injete 1% de lidocaína no couro cabeludo. Levante a pele da cabeça com fórceps, proteja um espaço de injeção e injete a lidocaína sob o couro cabeludo.
  6. Realize uma incisão sagital usando um bisturi e uma tesoura fina. Segure a pele incisada com um microclamp para ampliar a visibilidade da área cirúrgica.
    NOTA: O comprimento da incisão é de <1 cm acima da borda bregma e caudal do osso interparietal.
  7. Remova o periosteum usando cotonetes de algodão. Se houver sangramento, cauterize o crânio usando um bovie para selar os vasos sanguíneos.
  8. Limpe o crânio com soro fisiológico e marque os sítios de craniotomia usando um braço manipulador: hipocampo Anterior-Posterior (AP) −1,8 a −2,8 mm, Medial-Lateral (ML) 0,5-2,5 mm e Dorsal-Ventral (DV) −1 a −2 mm.
    NOTA: Considerando a espessura do crânio do rato, insira a matriz optrode -1,2 a -2,2 mm da área cerebral exposta. Dada a via hipocampal, células piramidas de CA3 enviam seus axônios para CA1. Portanto, as fibras ópticas são 1 mm mais longas que a gravação de eletrodos, de modo que as fibras ópticas são colocadas em CA3 e os eletrodos de gravação em CA1.
  9. Faça um furo acima do cerebelo e insira um parafuso para o chão. Coloque o parafuso moído 0,5 mm de profundidade com um parafuso de precisão até atingir a parte superior do cerebelo.
    NOTA: Certifique-se de uma inserção apertada do parafuso, que será usado como um eletrodo moído e uma estrutura de suporte para maximizar a estabilidade a longo prazo da implantação, pois aumenta a superfície tridimensional para a adesão do cimento dental.
  10. Perfurar a área marcada e remover um pedaço do crânio com fórceps.
  11. Dobre uma ponta de agulha de 26 G no sentido horário 120°, e exponha a área cerebral inserindo o lado bevel da agulha virada para cima. Tenha cuidado para não danificar o cérebro e os vasos sanguíneos.
  12. Limpe o cérebro exposto com soro fisiológico para lavar o pó ósseo e matéria íntenua.
  13. Fixar a matriz optrode no braço manipulador e mover-se perto da área exposta.
    NOTA: Ao colocar o dispositivo, recalcular novamente a área alvo do bregma pode aumentar a precisão da colocação.
  14. Insira lentamente a matriz optrode e conecte o parafuso moído ao fio de prata ligado ao sistema42.
    NOTA: Neste processo, a matriz deve ser firmemente fixada ao braço manipulador para minimizar a oscilação para evitar danos cerebrais de microsoção durante a inserção. A inserção deve ser realizada lentamente, com descanso de 10 minutos para explicar o inchaço do cérebro que pode ter sido pressionado após a inserção. A velocidade de inserção abaixo de 1 μm/s no tecido cerebral é recomendada para a alta qualidade da relação sinal-ruído e o número de unidades únicas separáveis42.
  15. Se houver sangramento, aplique pressão direta aos sangradores com um cotonete seco ou use cautery. Não passe para os próximos passos até que o sangramento esteja completamente parado.
  16. Insira espuma de gel entre o cérebro exposto e o dispositivo para proteger os produtos químicos do contato direto com o cérebro.
    NOTA: A espuma de gel também ajuda a hemostasia e mantém o cérebro úmido.
  17. Limpe o crânio com cotonetes para remover a umidade o máximo possível, e prossiga para a próxima etapa de fixação.
  18. Aplique cuidadosamente cimento dentário no crânio para fixar o dispositivo e cobrir a espuma de gel. Antes que o cimento dentário seja completamente endurecido, separe o couro cabeludo se estiver preso ao cimento dental. Puxe a pele incisada com fórceps para cobrir o cimento dentário endurecido e suturar o couro cabeludo. Em seguida, solte o dispositivo do braço manipulador.
    NOTA: Certifique-se de que o cimento dental não gruda na pele e cobre apenas a região do crânio. Quando a pele cresce, pode afastar o cimento e, eventualmente, o dispositivo cairá. Isso causará um problema crítico para experimentos in vivo de longo prazo.

3. Cuidados com recuperação e implante

  1. Tire o mouse do quadro estereotático.
  2. Administre a solução Carprofen usando uma agulha de 26 G. Injete uma vez antes da cirurgia e 12h (na manhã seguinte em caso de cirurgia à tarde) e 24h após a cirurgia para reduzir a dor.
    NOTA: A concentração da droga na garrafa é de 50 mg/mL, e é armazenada a 4 °C. Carprofeno é viscoso e precisa ser diluído em água estéril 1:10. Se a esterilidade for mantida, a solução pode ser armazenada por até 4 semanas. Para manter a duração efetiva da droga, injete a solução Carprofen em intervalos de 12h.
  3. Coloque o mouse na almofada de aquecimento e verifique se ele se recupera bem da anestesia.
    NOTA: O animal não fica sozinho até recuperar a consciência suficiente.
  4. Remova os fios de sutura 7 a 10 dias após a cirurgia.
  5. Deixe o animal se recuperar por 1 semana. Monitore a ingestão de alimentos e água durante o tempo de recuperação. Administre o analgésico e verifique os sinais de desconforto ou dor.
    NOTA: Os animais submetidos à cirurgia não podem ficar com os outros animais até que se recuperem totalmente.
    1. Durante o período de recuperação, pese o mouse todos os dias para verificar se há mudanças de peso. Sacrifique o camundongo (ver seção 6) se houver perda de peso de 20% em comparação com animais de controle de idade e sexo.

4. Estimulação optogenética e gravação eletrofisiológica

  1. Anestesiar o mouse e colocar o mouse anestesiado na moldura estereotática.
  2. Configure os parâmetros de estimulação.
    1. Coloque a receita de pulso de luz em 4% de ciclo de imposto e frequência de 10 Hz43. Configure a estimulação da luz para 2 s (20 pulsos) durante a gravação neural.
    2. Use uma corrente de 50 mA para conduzir 3 mW/mm2 intensidade de luz na ponta da fibra óptica. Meça a energia da luz usando um fotodiodo e um medidor de energia e divida a energia da luz pela área de faceta de fibra óptica.
  3. Tire a tampa plástica e conecte a parte superior contendo o sistema de entrega de luz com o LED reutilizável e circuitos.
  4. Conecte o preamplificador do palco ao conector de 5 pinos implantado.
  5. Abra o software para gravar sinais neurais.
  6. Configure os filtros de software. Use um filtro bandpass a 0,1-20 kHz e um filtro de entalhe a 60 Hz. Defina a taxa de amostragem do amplificador para 20 kHz.
  7. Antes da gravação, verifique se os sinais de espigão neural são detectados.
    NOTA: O cancelamento de ruído é importante porque os sinais neurais são muito pequenos. Se o nível de ruído for muito alto, sinais neurais podem ser obscurecidos pelo ruído e se tornar invisíveis. Use aterramento adequado e blindagem de ondas eletromagnéticas para reduzir o ruído.
  8. Após a verificação do sinal, grave sinais neurais sem estimulação de luz para gravação da linha de base.
  9. Fornecer luz LED e registrar simultaneamente respostas neuronais (Figura 5 e Figura 6).
    NOTA: Uma vez estimulado, o próximo experimento de estimulação deve ser realizado após um intervalo de pelo menos 5 minutos para que a atividade neuronal evocada pela estimulação anterior não afete o próximo experimento.

5. Análise de dados

  1. Carregue os dados adquiridos usando o programa MATLAB.
  2. Obtenha atividades neurais únicas usando um algoritmo de classificação de picos "Wave-Clus"44,45. Detecte os picos em cada canal por um limiar de amplitude como em Eq (1)45.
    Limiar = 5 × mediana Equation 1 (1)
    Onde x está o sinal filtrado do bandpass.
    1. Para instalar "Wave-Clus", consulte o link de download na Tabela de Materiais.
    2. Para abrir a interface gráfica do usuário (GUI), digite wave_clus no prompt de comando do MATLAB.
    3. Digite Get_spikes ('filename.ext') função para extensão de arquivo preparada para detecção de pico. Em seguida, execute Do_clustering ('filename_spikes.mat') para a classificação de picos.
  3. Conte os picos classificados antes, durante e depois da estimulação da luz com caixas de tempo específicas. Use caixas de tempo de 0,2 s e 2 s para análise.
  4. Plote o número de picos de cada canal de gravação.
    NOTA: Média com erro padrão dos meios (SEM) dos dados dos resultados de 8 experimentos repetidos foi calculada e plotada.

6. Eutanásia

  1. Depois de todos os experimentos, sacrifique o rato por inalação de dióxido de carbono (CO2).
  2. Sem precarregar a câmara, coloque o mouse na câmara transparente de eutanásia, sem fornecimento de CO2 e/ou vazamentos.
  3. Ligue o gás CO2 e desloque o ar a uma taxa de 30 a 50% do volume de ar da câmara de eutanásia por minuto.
    NOTA: Um medidor de fluxo deve ser conectado ao cilindro de gás CO2 para garantir que a taxa de deslocamento do ar seja de 30-50% do volume da câmara de eutanásia por minuto.
  4. Monitore o rato sacrificado por falta de respiração e mude a cor dos olhos.
    NOTA: O tempo esperado para eutanásia é geralmente de 10 a 15 minutos.
  5. Depois de observar os sinais de morte, remova o rato da câmara de eutanásia.
  6. Para completar o procedimento de eutanásia, verifique a morte confirmando parada respiratória e cardíaca.

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Representative Results

O sistema optrode é fabricado com sucesso para fornecer energia de luz suficiente para ativar os neurônios alvo. O fino alinhamento dos eletrodos de tungstênio é alcançado através do silício microfrágico através dos orifícios. A intensidade da luz medida é de 3,6 mW/mm2 na ponta da fibra óptica quando a corrente de 50 mA é aplicada. Os microlens aumentaram a eficiência da luz em 3,13 dB. Devido à matriz de microlens, que melhora o acoplamento de luz, a corrente aplicada é aproximadamente metade da corrente necessária para atingir a mesma intensidade de luz sem o sistema de matriz de microlens. Como o LED gera mais calor com mais corrente, é obviamente vantajoso empregar o conjunto de microlens para diminuir o calor do dispositivo. A impedância média de 4 eletrodos foi de 71,39 kΩ na frequência de 1 kHz, o que é baixo o suficiente para a detecção dos potenciais de ação. Além disso, a matriz optrode compreende as peças descartáveis e reutilizáveis para reduzir o custo e minimizar o peso total da implantação. O peso da peça descartável é ~0,58 g.

Um rato CaMKIIα::ChR2 foi usado para estimular diretamente os neurônios expressos de ChR2, e os picos neurais evocados foram registrados com sucesso, como mostrado na Figura 6. Mostramos toda a forma de onda registrada com condições exatas, incluindo 2 s período de luz no meio (Figura 6A). A classificação do pico do sinal de dados brutos foi conduzida usando um código fonte MATLAB personalizado. A atividade neural total foi analisada após a triagem de duas unidades diferentes. O número de picos neurais individuais evocados após cada pulso de estimulação de luz aumentou significativamente em comparação com a linha de base (Figura 6A,B), com diferentes caixas de tempo de 2 s e 0,2 s. Como resultado, poderíamos identificar o efeito claro da estimulação optogenética nos neurônios.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático da matriz optrode e da matriz de microlens. (A) visão esquemática 3D e visão transversal; (B) Imagem SEM da matriz de microlens 4X4 e vias de silício. Barra de escala = 1 mm (B). Abreviação: LED = diodo emissor de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Protótipo do dispositivo do sistema optrode. (A) Visão completa do sistema. (B) Visão ampliada da matriz optrode. Barras de escala = 5 mm (A), 2 mm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Cirurgia de implantação. (A) Crânio é exposto e limpo removendo periosteum. (B) A área cerebral alvo foi exposta, e o parafuso moído foi inserido acima do cerebelo. (C) A matriz Optrode foi inserida no cérebro para atingir a profundidade. O solo estava conectado eletricamente. (D) O cimento dental é aplicado para fixar o dispositivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Diagrama esquemático da linha do tempo de experiência de administração, operação e in vivo . Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Configuração experimental do sistema de gravação eletrofisiológica. (A) luz LED acesa, (B) luz LED acesa. Abreviação: LED = diodo emissor de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados de gravação eletrofisiológica. (A) Formas de onda representativas da gravação neural e forma de onda ampliada em retângulo tracejado vermelho indicando dois estímulos de luz (barras azuis) e espinhos classificados (pontas de flecha vermelha e preta). (B) Espetar histograma para cada canal antes, durante e depois da estimulação da luz. A figura de inset indica a localização da matriz optrode implantada. (C) Spike histograma com 100 ms time bin. A barra azul indica o período de luz LED acesa. Abreviação: LED = diodo emissor de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Verificou-se a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e registro eletrofisiológico (Figura 6). Os grandes picos durante a estimulação da luz são artefatos fotoelétricos que ocorrem ao mesmo tempo que a estimulação da luz (Figura 6A). Isso é claro na visão ampliada da forma de onda no retângulo tracejado vermelho (Figura 6A). Como mostrado na Figura 6A, os artefatos fotoelétricos poderiam ser claramente classificados a partir das formas de onda registradas, e as respostas neuronais induzidas pela estimulação optogenética da via do sinal hipocampal foram claramente identificadas. Figura 6B,C indicam o número de picos, mostrando o efeito de estimulação claramente. A Figura 6A é uma das formas de onda utilizadas para obter os histogramas na Figura 6B,C, pois os resultados de gravação são obtidos a partir de 8 sessões de gravação repetidas.

A Figura 6A mostra o aumento induzido pela luz na atividade neural. Realizamos o mesmo experimento com ratos de controle sem expressão ChR2. Nesse caso, a estimulação optogenética não aumentou a atividade neural. Como os artefatos fotoelétricos são facilmente excluídos dos dados de gravação, o resultado do animal de controle não está incluído no manuscrito. Além disso, as diferenças nos resultados de gravação entre os 4 canais, como mostrado na Figura 6, podem ser justificadas considerando que a distância entre os eletrodos de gravação de tungstênio é de 300 μm (centro-a-centro). É provável que as atividades de pico em diferentes canais sejam de diferentes neurônios. No entanto, como as células neuronais estão conectadas, especialmente na região cerebral local, os padrões globais de espigagem neuronal eram semelhantes, mas não exatamente os mesmos.

Para garantir o sucesso desses experimentos em animais, várias etapas críticas requerem alta precisão e atenção adicional durante a cirurgia de implantação. Primeiro, o sangramento dos vasos sanguíneos cerebrais deve ser cuidadosamente manuseado. Não continue para os próximos passos até que o sangramento tenha parado completamente. Isso permitirá a fixação firme do dispositivo implantado no cérebro e visibilidade clara durante o procedimento cirúrgico. Cauterizar os pontos sanguíneos com um bovie, esterilizar com soro fisiológico, e inserir espuma de gel pode ser útil para parar o sangramento.

Em segundo lugar, o cérebro do camundongo deve ser protegido do ressecamento durante a implantação da optrode. A espuma salina e gel são usadas para manter a úmida. Se a membrana dura for removida e o cérebro estiver totalmente exposto, as outras etapas cirúrgicas devem ser realizadas o mais rápido possível. Em terceiro lugar, a velocidade de inserção lenta do optrode também é crucial. A inserção mais lenta reduz os danos teciduais e melhora a precisão da implantação no localalvo 46. Como a deformação do tecido cerebral é inevitável durante a inserção optrode, a inserção lenta é muito útil para o tecido deformado restaurar sua forma e volume originais.

Em quarto lugar, o processo de fixação determina a estabilidade a longo prazo. É útil para fazer a superfície do crânio secar antes de solidificar o cimento dental para uma fixação melhorada e de longo prazo. Além disso, deve-se tomar cuidado para evitar aplicar muito cimento dental ou deixar o cimento grudar diretamente na pele. À medida que a pele incisada se regenera com o tempo, ela pode gradualmente empurrar e separar o cimento do crânio à medida que a pele cresce. Além disso, o contato direto do cimento dental com o tecido cerebral deve ser evitado porque o cimento dental é prejudicial ao tecido cerebral. Isso pode ser efetivamente evitado pela inserção de espuma de gel entre o cérebro exposto e o dispositivo.

Além dos procedimentos cirúrgicos, o sistema optrode deve ser cuidadosamente verificado antes de iniciar os experimentos. Primeiro, a parte implantável da matriz de fibra óptica e os eletrodos devem ser examinados sob um microscópio antes da inserção. É necessário verificar se há alguma quebra na fibra óptica porque mesmo uma pequena rachadura pode causar perda crítica de luz. Além disso, o alinhamento entre as fibras ópticas e os eletrodos de gravação deve ser verificado para uma inserção precisa. Fórceps finos podem dobrar minuciosamente os eletrodos de tungstênio para corrigir seu desalinhamento.

Em segundo lugar, a intensidade da luz deve ser verificada antes da cirurgia de implantação para determinar se a energia da luz está acima do limiar e alta o suficiente para ativar as opsinas. Na prática, sabe-se que o limiar de excitação para ChR2 é de aproximadamente 1 mW/mm247. No entanto, o aquecimento do tecido gerado pela luz deve ser minimizado, fornecendo intensidade de luz suficiente para excitar as células neuronais. Energia de luz muito forte pode danificar os tecidos cerebrais devido ao aumento da temperatura. Um aumento de temperatura de 6-8 °C no cérebro pode causar danos imediatos e irreversíveis ao tecido 12,48. Um estudo anterior mostrou que o aumento da temperatura na ponta da fibra óptica é inferior a 0,5 °C49. Um ciclo de baixa função de estimulação óptica com curta duração pode ser útil. Em comparação com estudos anteriores relatando problemas de temperatura com estimulação optogenética, nossa potência de saída (2 mW/mm2) e o protocolo com estimulação de luz com 4 ms a 20 Hz por 2 segundos é apropriado e dentro da faixa segura.

Um grande desafio para a gravação neural é remover os artefatos induzidos pela estimulação óptica. Artefatos síncronas com estimulação óptica devem ser considerados em vários aspectos diferentes porque tanto mecanismos elétricos quanto ópticos podem gerar esses artefatos. Primeiro, artefatos elétricos podem ser causados pelo circuito elétrico que conduz o LED. Quando uma corrente elétrica flui em um circuito para estimular a estimulação da luz, artefatos elétricos podem ser gerados. Esse problema pode ser superado minimizando o número de fios para as conexões led e maximizando a distância entre o circuito de estimulação da luz e os fios conectados com os eletrodos de gravação de tungstênio. Em segundo lugar, artefatos fotoelétricos podem ser gerados pelo efeito fotoelémico durante a estimulação optogenética. Esses artefatos podem ser minimizados evitando a exposição direta do eletrodo de gravação à luz de estimulação e aumentando o espaçamento entre as fibras ópticas e os eletrodos. No entanto, é difícil eliminar artefatos induzidos pela luz devido à dispersão de luz no tecido cerebral.

Ainda há limitações na matriz optrode proposta, que pode ser melhorada em estudos futuros. Embora a ponta de fibra óptica tenha sido cortada plana neste estudo, o chanfrado ou o afunilamento das pontas das fibras minimizarão os danos teciduais durante a inserção e aumentarão o ângulo de propagação da luz a partir das pontas50. Outra limitação é a baixa intensidade de luz. Apesar dos resultados do registro eletrofisiológico, o sistema proposto tem uma potência de saída relativamente menor do que um sistema baseado em laser. Portanto, o sistema baseado em LED proposto pode excitar optogeneticamente uma região cerebral menor do que o sistema baseado em laser. Isso ocorre principalmente porque a maioria dos LEDs tem potência muito menor do que os lasers em geral. No entanto, como a eficiência e a intensidade máxima dos LEDs foram dramaticamente melhoradas recentemente, leds com maior potência de saída podem ser desenvolvidos com novas tecnologias de semicondutores. A outra limitação é que não foi realizado um estudo de gravação longitudinal. No entanto, foi confirmado que o dispositivo estava bem conectado aos ratos por um mês. Este resultado mostra a possibilidade de que o dispositivo seja adequado para experimentos de longo prazo. Portanto, serão realizados testes in vivo de longo prazo para verificar a estabilidade do dispositivo.

O método mais típico para optogenética em laboratórios é usar um sistema laser como fonte de luz. Embora um laser possa fornecer uma potência de saída maior do que os LEDs para ativar opsinas, o sistema baseado em laser não pode ser facilmente miniaturizado e requer implementação de alto custo. Em contraste, o sistema optogenético baseado em LED tem várias vantagens, como baixa complexidade do sistema, custo-efetividade e baixo consumo de energia, que são vantajosos para o desenvolvimento do sistema sem fio. Portanto, neste estudo, o LED é empregado como fonte de luz, e o conjunto de microlens é adotado para aumentar a intensidade de luz do LED.

Além disso, a fonte de luz e os circuitos de condução atuais compreendem as partes destacáveis e reutilizáveis do sistema. Novos LEDs com diferentes comprimentos de onda podem ser facilmente usados no dispositivo por substituição simples, e o custo do sistema pode ser significativamente reduzido devido à reutilização em vários experimentos. Todo o sistema pode ser implementado ainda mais como um sistema sem fio, que estimula e registra sinais neuronais sem linhas amarradas, adotando um sistema sem fio de baixa potência no dispositivo integrado miniaturizado.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo Convergent Technology P&D Program for Human Augmentation através da National Research Foundation of Korea (NRF), financiada pelo Ministério da Ciência e TIC (NRF-2019M3C1B8090805), e apoiada por uma bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (nº 2019R1A2C10888909). Agradecemos ao laboratório de Seung-Hee Lee no Departamento de Ciências Biológicas, KAIST, Daejeon, Coreia, por fornecer gentilmente os ratos transgênicos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus

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Neurociência Edição 187
Oprode Array para modulação optogenética simultânea e gravação neural elétrica
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Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., … More

Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C. H., Kim, Y. K., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).

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