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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Optroden-Array zur simultanen optogenetischen Modulation und elektrischen neuronalen Aufzeichnung

Published: September 1, 2022 doi: 10.3791/63460
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 1, 1, 1,2, 3,4, 1,2,5
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University
* These authors contributed equally

Summary

Hier stellen wir das Herstellungsverfahren eines Optrode-Systems mit optischen Fasern für die Lichtabgabe und einem Elektrodenarray für die neuronale Aufzeichnung vor. In-vivo-Experimente mit transgenen Mäusen, die Kanalrhodopsin-2 exprimieren, zeigen die Machbarkeit des Systems für die gleichzeitige optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung.

Abstract

In den letzten zehn Jahren ist die Optogenetik aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit zur selektiven neuronalen Modulation oder Überwachung zu einem wesentlichen Werkzeug für die Untersuchung neuronaler Signale geworden. Da bestimmte Arten von neuronalen Zellen genetisch verändert werden können, um Opsin-Proteine zu exprimieren, ermöglicht die Optogenetik die optische Stimulation oder Hemmung der ausgewählten Neuronen. Es gab mehrere technologische Fortschritte im optischen System für die Optogenetik. Vor kurzem wurde vorgeschlagen, den Lichtwellenleiter für die Lichtabgabe mit elektrophysiologischer Aufzeichnung zu kombinieren, um gleichzeitig die neuronalen Reaktionen auf optogenetische Stimulation oder Hemmung zu überwachen. In dieser Studie wurde ein implantierbares Optrode-Array (2x2 optische Fasern) mit eingebetteten Mehrkanalelektroden entwickelt.

Eine Leuchtdiode (LED) wurde als Lichtquelle verwendet, und ein mikrofabriziertes Mikrolinsenarray wurde integriert, um eine ausreichende Lichtleistung an der Spitze der optischen Fasern bereitzustellen. Das optrode Array-System besteht aus dem Einwegteil und dem Mehrwegteil. Der Einwegteil verfügt über optische Fasern und Elektroden, während der wiederverwendbare Teil über die LED und die elektronische Schaltung für die Lichtsteuerung und die neuronale Signalverarbeitung verfügt. Das neuartige Design des implantierbaren Optrode-Array-Systems wird im begleitenden Video zusätzlich zum Ablauf der Optrode-Implantationschirurgie, der optogenetischen Lichtstimulation und der elektrophysiologischen neuronalen Aufzeichnung vorgestellt. Die Ergebnisse von In-vivo-Experimenten zeigten erfolgreich zeitgebundene neuronale Spikes, die durch die Lichtreize von Hippocampus-erregenden Neuronen von Mäusen hervorgerufen wurden.

Introduction

Die Aufzeichnung und Kontrolle der neuronalen Aktivität ist unerlässlich, um zu verstehen, wie das Gehirn in einem neuronalen Netzwerk und auf zellulärer Ebene funktioniert. Herkömmliche elektrophysiologische Aufzeichnungsmethoden umfassen die Patch-Klemme 1,2,3,4 mit einer Mikropipette und die extrazelluläre Aufzeichnung mit mikroneuralen Elektroden 5,6,7,8. Als Neuromodulationsmethode wurde die elektrische Stimulation häufig verwendet, um eine fokale Hirnregion durch direkte oder indirekte Depolarisation neuronaler Zellen direkt zu stimulieren. Das elektrische Verfahren kann jedoch keine neuronalen Zelltypen zur Aufzeichnung oder Stimulation unterscheiden, da sich die elektrischen Ströme in alle Richtungen ausbreiten.

Als aufstrebende Technologie hat die Optogenetik eine neue Ära eingeleitet, um zu verstehen, wie das Nervensystem funktioniert 9,10,11,12,13,14,15,16. Das Wesen der optogenetischen Techniken besteht darin, Licht zu verwenden, um die Aktivität von lichtempfindlichen Opsinproteinen zu kontrollieren, die von genetisch veränderten Zellen exprimiert werden. So ermöglicht die Optogenetik die ausgeklügelte Modulation oder Überwachung genetisch selektierter Zellen in komplizierten neuronalen Schaltkreisen14,17. Die breitere Anwendung des optogenetischen Ansatzes erforderte eine gleichzeitige neuronale Aufzeichnung, um die optische Neuromodulation direkt zu bestätigen. Daher wäre ein integriertes Gerät mit Lichtsteuerungs- und Aufzeichnungsfunktionen äußerst wertvoll 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Es gibt Einschränkungen der herkömmlichen, laserbasierten optogenetischen Stimulation, die ein sperriges und teures Lichtabgabesystem26,27,28,29,30 erfordert. Daher verwendeten einige Forschungsgruppen μLED-basierte Siliziumsonden, um die Größe des Lichtabgabesystems31,32,33,34 zu minimieren. Es besteht jedoch die Gefahr von thermischen Hirnschäden, die durch direkten Kontakt mit μLEDs aufgrund der geringen Energieumwandlungseffizienz von LEDs verursacht werden. Lichtwellenleiter wie optische Fasern, SU-8 und Siliziumoxynitrid (SiON) wurden angewendet, um thermische Schäden zu vermeiden 30,35,36,37,38,39. Diese Strategie hat jedoch auch einen Nachteil aufgrund ihrer geringen Kopplungseffizienz zwischen Lichtquellen und den Wellenleitern.

Das Mikrolinsen-Array wurde zuvor eingeführt, um die Lichtkopplungseffizienz zwischen LEDs und optischen Fasernzu verbessern 40. Es wurde ein optrode-System entwickelt, das auf mikroelektromechanischen Systemen (MEMS) Technologien zur optischen Stimulation und elektrischen Aufzeichnung im Mikromaßstab40 basiert. Das Mikrolinsenarray zwischen einer LED und optischen Fasern erhöhte die Lichtausbeute um 3,13 dB. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wird ein 2x2-Glasfaser-Array auf dem 4x4-Mikrolinsen-Array ausgerichtet, und die LED wird unter dem Mikrolinsen-Array positioniert. Die 2x2 optischen Fasern werden anstelle von 4x4 montiert, um Hirnschäden zu reduzieren. Ein Wolfram-Elektroden-Array wird neben dem Optrode-Array positioniert, wobei Silizium über Löcher für die elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet wird (Abbildung 1B).

Das System besteht aus einem oberen Einwegteil und abnehmbaren unteren Teilen. Der Top-Einwegteil, der das optische Faserarray, das Mikrolinsen-Array und das Wolfram-Elektroden-Array umfasst, ist so konzipiert, dass es für In-vivo-Experimente dauerhaft in das Gehirn implantiert werden kann. Der untere Teil enthält eine LED-Lichtquelle und eine externe Stromversorgungsleitung, die leicht abnehmbar und für einen anderen Tierversuch wiederverwendbar ist. Eine aufsteckbare Kunststoffabdeckung schützt das Einwegteil, wenn das abnehmbare Teil entfernt wird.

Die Machbarkeit des Systems wird durch Implantation in das Gehirn transgener Mäuse bestätigt, die Channelrhodopsin-2 (ChR2) in Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II-positiven Neuronen exprimieren (CaMKIIα::ChR2-Maus). Aufzeichnungselektroden wurden verwendet, um die neuronalen Aktivitäten einzelner Neuronen während der optischen Stimulation der Neuronen aufzuzeichnen.

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Protocol

Die Tierpflege und chirurgischen Eingriffe wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Ewha Womans University (Nr. 20-029) genehmigt.

1. Vorbereitung eines optrode Arrays (Abbildung 1 und Abbildung 2)

  1. Befestigen Sie optische Fasern mit dem Mikrolinsenarray.
    1. Entfernen Sie die Passivierungsbeschichtung der optischen Faser und schneiden Sie sie mit einem Präzisions-Glasfaserspalt in 5 mm lange Stücke.
    2. Tauchen Sie die optische Faser in das klare UV-Harz und legen Sie die optischen Fasern auf das Mikrolinsenarray.
    3. Aushärten Sie das Harz mit einer UV-Lampe.
    4. Befestigen Sie das Mikrolinsen-Array mit Epoxidharz am 3D-gedruckten Gehäuse.
  2. Ausrichtung von perfluoralkoxy (PFA)-beschichteten Wolframdrähten.
    1. Löten Sie die 4 Stück 30 mm langen PFA-Wolframdrähte und 1 Silberdraht an den 5-poligen Buchsenstecker mit 1,27 mm Raster. Verwenden Sie Silberdraht als Referenzelektrode.
    2. Schließen Sie die Buchse mit einem Rastermaß von 1,27 mm an den Kopfstufenvorverstärker an.
    3. Setzen Sie Wolframdrähte vorsichtig über die Löcher durch das Silizium (Abbildung 1B), um die feine Ausrichtung der Wolframelektroden zu unterstützen.
    4. Schneiden Sie die ausgerichteten Wolframdrähte 1 mm kürzer als die optische Faserlänge.
    5. Befestigen Sie den Stecker mit Epoxidharz am 3D-gedruckten Gehäuse.
  3. LED-Platzierung
    1. Platzieren Sie die LED im 3D-gedruckten Gehäuse.
    2. Schließen Sie die LED an die Antriebsschaltung an, die eine Pulsweitenmodulation (PWM) erzeugt.
      HINWEIS: Der PWM-Impuls wird vom Mikrocontroller erzeugt.
    3. Stellen Sie angesichts des durch die LED-Antriebsschaltung induzierten Rauschens sicher, dass die Aufzeichnungselektroden 50 mm von der LED-Treiberschaltung entfernt sind.
    4. Messen Sie die Lichtintensität am Ende der Glasfaserspitze mit einer Fotodiode.
  4. Tauchen Sie die Wolframelektroden und optischen Fasern für 15 min in Alkohol. Tauchen Sie dann das System in steriles D.I-Wasser und sterilisieren Sie es mit Ethylenoxidgas.

2. Implantationschirurgie (Abbildung 3 und Abbildung 4)

HINWEIS: Während der Operation muss eine sterile Technik befolgt werden.

  1. Bereiten Sie die transgenen Tiere vor, die genetisch verändert sind, um lichtempfindliche Opsinproteine in der spezifischen Art von neuronalen Zellen zu exprimieren.
    HINWEIS: Eine männliche, 2 Monate alte, transgene Maus, die Kanalrhodopsin-2 (ChR2) in Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II-positiven Neuronen (CaMKIIα::ChR2-Maus) exprimierte, wurde in dieser Studieverwendet 41.
  2. Betäuben Sie die Maus mit einem Ketamin-Xylazin-Cocktail - einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) - durch intraperitoneale Verabreichung.
    1. Überprüfen Sie das betäubte Tier alle 30 Minuten, indem Sie die Bewegung des Schnurrbartes und die Reaktion auf Pfotendruck überwachen.
    2. Injizieren Sie den Ketamin-Xylazin-Cocktail in der Hälfte der Anfangsdosis, wenn eine zusätzliche Anästhesie erforderlich ist.
  3. Rasieren Sie die Kopfhaut und legen Sie die betäubte Maus in den stereotaktischen Rahmen.
    HINWEIS: Führen Sie eine chirurgische Hautvorbereitung durch und drapieren Sie das Tier. Die Hautvorbereitung beinhaltet die Haarentfernung, gefolgt von der Reinigung der Haut mit antimikrobiellen Mitteln.
    1. Positionieren Sie den Kopf innerhalb des stereotaktischen Rahmens und führen Sie Ohrstangen in den Meatus ein.
    2. Zentrieren Sie den Mauskopf im stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrstangen wiederholt lösen und anziehen, um eine genaue Positionierung zu erzielen.
    3. Platzieren Sie die Schneidezähne so, dass die oberen Schneidezähne über der vorderen Innenkante eingehängt werden.
    4. Stellen Sie die Schneidezahnstange ein, um die Höhe der Schneidezahnstange einzustellen, und ziehen Sie die Nasenklemme gegen die Schnauze fest.
    5. Schalten Sie das im stereotaktischen Rahmen eingebettete Wärmekissen im Voraus ein, um die Körpertemperatur während der gesamten chirurgischen Eingriffe bei 37 ° C zu halten.
    6. Setzen Sie die Wärmesonde zur homöothermischen Regulation in das Rektum der Maus ein.
      HINWEIS: Die Platzierung der Ohrstange muss durch sanftes Greifen und Schwanken der Schnauze überprüft werden. Die Ohrstange muss nachjustiert werden, wenn die Schnauze seitlich um mehr als ~4 mm bewegt werden kann.
  4. Bedecken Sie die Augen mit Vaseline (siehe Materialtabelle), um Trockenheit zu vermeiden.
  5. Injizieren Sie 1% Lidocain in die Kopfhaut. Heben Sie die Haut des Kopfes mit einer Pinzette an, sichern Sie einen Injektionsraum und injizieren Sie das Lidocain unter die Kopfhaut.
  6. Führen Sie einen sagittalen Schnitt mit einem Skalpell und einer feinen Schere durch. Halten Sie die eingeschnittene Haut mit einer Mikroklemme, um die Sichtbarkeit des Operationsbereichs zu erweitern.
    HINWEIS: Die Schnittlänge beträgt <1 cm über der Bregma und dem Schwanzrand des Interparietalknochens.
  7. Entfernen Sie das Periost mit Wattestäbchen. Wenn es Blutungen gibt, kauterisieren Sie den Schädel mit einem Bovie, um die Blutgefäße zu versiegeln.
  8. Reinigen Sie den Schädel mit Kochsalzlösung und markieren Sie die Kraniotomiestellen mit einem Manipulatorarm: Hippocampus Anterior-Posterior (AP) −1,8 bis −2,8 mm, Medial-Lateral (ML) 0,5-2,5 mm und Dorsal-Ventral (DV) −1 bis −2 mm.
    HINWEIS: Fügen Sie unter Berücksichtigung der Dicke des Mausschädels das Optrode-Array -1,2 bis -2,2 mm aus dem exponierten Gehirnbereich ein. Angesichts des Hippocampus-Weges senden Pyramidenzellen von CA3 ihre Axone zu CA1. Daher sind optische Fasern 1 mm länger als Aufnahmeelektroden, so dass die optischen Fasern in CA3 und die Aufnahmeelektroden in CA1 platziert werden.
  9. Bohren Sie ein Loch über dem Kleinhirn und setzen Sie eine Schraube für den Boden ein. Setzen Sie die geschliffene Schraube 0,5 mm tief mit einer Präzisionsschraube ein, bis sie die Oberseite des Kleinhirns erreicht.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schraube, die als geschliffene Elektrode und Stützstruktur verwendet wird, fest eingesetzt wird, um die Langzeitstabilität der Implantation zu maximieren, da sie die dreidimensionale Oberfläche für die Haftung des Zahnzements erhöht.
  10. Bohren Sie den markierten Bereich und entfernen Sie ein Stück des Schädels mit einer Pinzette.
  11. Biegen Sie eine Nadelspitze von 26 G im Uhrzeigersinn um 120° und legen Sie den Gehirnbereich frei, indem Sie die abgeschrägte Seite der Nadel nach oben einführen. Achten Sie darauf, das Gehirn und die Blutgefäße nicht zu beschädigen.
  12. Reinigen Sie das exponierte Gehirn mit Kochsalzlösung, um Knochenstaub und Fremdkörper auszuwaschen.
  13. Fixieren Sie das Optrode-Array im Manipulatorarm und bewegen Sie sich in die Nähe des exponierten Bereichs.
    HINWEIS: Wenn Sie das Gerät platzieren, kann die Neuberechnung des Zielbereichs aus dem Bregma die Genauigkeit der Platzierung erhöhen.
  14. Setzen Sie das Optrode-Array langsam ein und verbinden Sie die Erdungsschraube mit dem Silberdraht, der am System42 befestigt ist.
    HINWEIS: Bei diesem Prozess muss das Array fest am Manipulatorarm befestigt werden, um das Wackeln zu minimieren und Hirnschäden durch Mikrobewegungen während des Einführens zu verhindern. Die Insertion muss langsam durchgeführt werden, mit einer Pause von 10 Minuten, um eine Schwellung des Gehirns zu berücksichtigen, die nach dem Einsetzen möglicherweise gedrückt wurde. Eine Einfügegeschwindigkeit unter 1 μm/s in das Hirngewebe wird für die hohe Qualität des Signal-Rausch-Verhältnisses und die Anzahl der trennbaren Einzeleinheiten42 empfohlen.
  15. Wenn es Blutungen gibt, üben Sie direkten Druck auf die Entlüftungen mit einem trockenen Wattestäbchen aus oder verwenden Sie Kauterisation. Fahren Sie nicht mit den nächsten Schritten fort, bis die Blutung vollständig gestoppt ist.
  16. Legen Sie Gelschaum zwischen das exponierte Gehirn und das Gerät ein, um Chemikalien vor direktem Kontakt mit dem Gehirn zu schützen.
    HINWEIS: Gelschaum hilft auch bei der Hämostase und hält das Gehirn feucht.
  17. Wischen Sie den Schädel mit Wattestäbchen ab, um die Feuchtigkeit so weit wie möglich zu entfernen, und fahren Sie mit dem nächsten Fixierungsschritt fort.
  18. Tragen Sie vorsichtig Zahnzement auf den Schädel auf, um das Gerät zu fixieren und den Gelschaum abzudecken. Bevor der Zahnzement vollständig ausgehärtet ist, trennen Sie die Kopfhaut, wenn sie an Zahnzement befestigt ist. Ziehen Sie die eingeschnittene Haut mit einer Pinzette ab, um den ausgehärteten Zahnzement zu bedecken, und nähen Sie die Kopfhaut. Lassen Sie dann das Gerät vom Manipulatorarm los.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Zahnzement nicht auf der Haut haftet und nur die Schädelregion bedeckt. Wenn die Haut wächst, kann sie den Zement wegdrücken und schließlich fällt das Gerät ab. Dies wird ein kritisches Problem für langfristige In-vivo-Experimente verursachen.

3. Genesung und Implantatpflege

  1. Nehmen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.
  2. Verabreichen Sie Carprofen-Lösung mit einer 26-G-Nadel. Einmal vor der Operation und 12 h (am nächsten Morgen im Falle einer Nachmittagsoperation) und 24 h nach der Operation injizieren, um Schmerzen zu lindern.
    HINWEIS: Die Arzneimittelkonzentration in der Flasche beträgt 50 mg / ml und wird bei 4 ° C gelagert. Carprofen ist viskos und muss in sterilem Wasser 1:10 verdünnt werden. Wenn die Sterilität erhalten bleibt, kann die Lösung bis zu 4 Wochen gelagert werden. Um die effektive Dauer des Arzneimittels aufrechtzuerhalten, injizieren Sie die Carprofen-Lösung in Abständen von 12 h.
  3. Legen Sie die Maus auf das Heizkissen und prüfen Sie, ob sie sich gut von der Anästhesie erholt.
    HINWEIS: Das Tier wird nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat.
  4. Entfernen Sie die Nahtfäden 7 - 10 Tage nach der Operation.
  5. Lassen Sie das Tier sich für 1 Woche erholen. Überwachen Sie die Nahrungs- und Wasseraufnahme während der Erholungszeit. Verabreichen Sie das Analgetikum und überprüfen Sie auf die Anzeichen von Beschwerden oder Schmerzen.
    HINWEIS: Die Tiere, die operiert wurden, können nicht bei den anderen Tieren bleiben, bis sie sich vollständig erholt haben.
    1. Wiegen Sie die Maus während der Erholungsphase jeden Tag, um nach Gewichtsveränderungen zu suchen. Opfern Sie die Maus (siehe Abschnitt 6), wenn im Vergleich zu alters- und geschlechtsangepassten Kontrolltieren ein Gewichtsverlust von 20% auftritt.

4. Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung

  1. Betäuben Sie die Maus und legen Sie die betäubte Maus in den stereotaktischen Rahmen.
  2. Richten Sie die Stimulationsparameter ein.
    1. Stellen Sie das Lichtimpulsrezept auf 4% Tastverhältnis und 10 Hz Frequenz43 ein. Richten Sie die Lichtstimulation für 2 s (20 Impulse) während der neuronalen Aufzeichnung ein.
    2. Verwenden Sie einen Strom von 50 mA, um eine Lichtintensität von 3 mW/mm2 an der Lichtwellenleiterspitze zu erzeugen. Messen Sie die Lichtleistung mit einer Fotodiode und einem Leistungsmesser und teilen Sie die Lichtleistung durch die optische Faserfacettenfläche.
  3. Entfernen Sie die Kunststoffabdeckung und befestigen Sie den oberen Teil, der das Lichtabgabesystem enthält, mit der wiederverwendbaren LED und den Schaltkreisen.
  4. Schließen Sie den Headstage-Vorverstärker an den implantierten 5-poligen Stecker an.
  5. Öffnen Sie die Software, um neuronale Signale aufzuzeichnen.
  6. Richten Sie die Softwarefilter ein. Verwenden Sie einen Bandpassfilter bei 0,1-20 kHz und einen Notch-Filter bei 60 Hz. Stellen Sie die Abtastrate des Verstärkers auf 20 kHz ein.
  7. Überprüfen Sie vor der Aufzeichnung, ob die neuronalen Spike-Signale erkannt werden.
    HINWEIS: Die Rauschunterdrückung ist wichtig, da neuronale Signale zu klein sind. Wenn der Rauschpegel zu hoch ist, können neuronale Signale durch Rauschen verdeckt werden und unsichtbar werden. Verwenden Sie eine geeignete Erdung und elektromagnetische Wellenabschirmung, um Geräusche zu reduzieren.
  8. Nach der Signalprüfung zeichnen Sie neuronale Signale ohne Lichtstimulation für die Baseline-Aufzeichnung auf.
  9. Liefern Sie LED-Licht und zeichnen Sie gleichzeitig neuronale Reaktionen auf (Abbildung 5 und Abbildung 6).
    HINWEIS: Nach der Stimulation muss das nächste Stimulationsexperiment nach einem Intervall von mindestens 5 Minuten durchgeführt werden, damit die durch die vorherige Stimulation hervorgerufene neuronale Aktivität das nächste Experiment nicht beeinflusst.

5. Datenanalyse

  1. Laden Sie die erfassten Daten mit dem MATLAB-Programm.
  2. Erhalten Sie einzelne neuronale Aktivitäten mit einem Spike-Sortieralgorithmus "Wave-Clus"44,45. Erkennen Sie die Spitzen in jedem Kanal anhand einer Amplitudenschwelle wie in Eq (1)45.
    Schwellenwert = 5 × Median Equation 1 (1)
    Dabei ist x das bandpassgefilterte Signal.
    1. Um "Wave-Clus" zu installieren, klicken Sie auf den Download-Link in der Tabelle der Materialien.
    2. Um die grafische Benutzeroberfläche (GUI) zu öffnen, geben Sie wave_clus in die Eingabeaufforderung von MATLAB ein.
    3. Geben Sie Get_spikes('Dateiname.ext')- Funktion für die Dateierweiterung ein, die für die Spike-Erkennung vorbereitet ist. Führen Sie dann Do_clustering('filename_spikes.mat') für die Spike-Sortierung aus.
  3. Zählen Sie die sortierten Spikes vor, während und nach der Lichtstimulation mit bestimmten Zeitbehältern. Verwenden Sie 0,2 s und 2 s Zeitfächer für die Analyse.
  4. Zeichnen Sie die Anzahl der Spitzen aus jedem Aufnahmekanal auf.
    HINWEIS: Der Mittelwert mit Standardfehler der Mittelwerte (REM) der Daten aus den Ergebnissen von 8 wiederholten Experimenten wurde berechnet und aufgetragen.

6. Euthanasie

  1. Nach all den Experimenten, opfern Sie die Maus durch Kohlendioxid (CO2) Inhalation.
  2. Ohne die Kammer vorzuladen, legen Sie die Maus in die transparente Euthanasiekammer, ohne CO2 -Zufuhr und / oder Leckagen.
  3. Schalten Sie das CO2 -Gas ein und verdrängen Sie die Luft mit einer Rate von 30 - 50% des Volumens der Euthanasiekammerluft pro Minute.
    HINWEIS: Ein Durchflussmesser muss an die CO2 -Gasflasche angeschlossen werden, um sicherzustellen, dass die Luftverdrängungsrate 30-50% des Volumens der Euthanasiekammer pro Minute beträgt.
  4. Überwachen Sie die geopferte Maus auf mangelnde Atmung und veränderte Augenfarbe.
    HINWEIS: Die erwartete Zeit für Euthanasie liegt in der Regel innerhalb von 10 bis 15 Minuten.
  5. Nachdem Sie die Todeszeichen beobachtet haben, entfernen Sie die Maus aus der Euthanasiekammer.
  6. Um das Euthanasieverfahren abzuschließen, überprüfen Sie den Tod, indem Sie den Atem- und Herzstillstand bestätigen.

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Representative Results

Das optrode-System wurde erfolgreich hergestellt, um eine ausreichende Lichtleistung zur Aktivierung der Zielneuronen bereitzustellen. Die feine Ausrichtung der Wolframelektroden wird durch das mikrofabrizierte Silizium über die Löcher erreicht. Die gemessene Lichtintensität beträgt 3,6 mW/mm2 an der Lichtwellenleiterspitze, wenn 50 mA Strom angelegt wird. Die Mikrolinse erhöhte die Lichtausbeute um 3,13 dB. Aufgrund des Mikrolinsenarrays, das die Lichtkopplung verbessert, beträgt der angelegte Strom etwa die Hälfte des Stroms, der erforderlich ist, um die gleiche Lichtintensität ohne das Mikrolinsen-Array-System zu erreichen. Da die LED mit mehr Strom mehr Wärme erzeugt, ist es natürlich von Vorteil, das Mikrolinsen-Array zu verwenden, um die Wärme des Geräts zu senken. Die durchschnittliche Impedanz von 4 Elektroden betrug 71,39 kΩ bei einer Frequenz von 1 kHz, was für die Detektion der Aktionspotentiale niedrig genug ist. Darüber hinaus umfasst das optrode Array die Einweg- und Mehrwegteile, um die Kosten zu senken und das Gesamtgewicht der Implantation zu minimieren. Das Gewicht des Einwegteils beträgt ~0,58 g.

Eine CaMKIIα::ChR2-Maus wurde verwendet, um die ChR2-exprimierenden Neuronen direkt zu stimulieren, und die evozierten neuronalen Spikes wurden erfolgreich aufgezeichnet, wie in Abbildung 6 gezeigt. Wir zeigten die gesamten aufgezeichneten Wellenformen mit genauen Bedingungen, einschließlich 2 s Einschaltperiode in der Mitte (Abbildung 6A). Die Spike-Sortierung aus dem Rohdatensignal wurde mit einem maßgeschneiderten MATLAB-Quellcode durchgeführt. Die gesamte neuronale Aktivität wurde analysiert, nachdem zwei verschiedene Einheiten aussortiert wurden. Die Anzahl der evozierten individuellen neuronalen Spikes nach jedem Lichtstimulationsimpuls nahm im Vergleich zum Ausgangswert signifikant zu (Abbildung 6A,B), mit unterschiedlichen Zeitfächern von 2 s und 0,2 s. Als Ergebnis konnten wir die klare Wirkung der optogenetischen Stimulation auf die Neuronen identifizieren.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Optrode-Arrays und des Mikrolinsen-Arrays. (A) 3D-Schaltplanansicht und Querschnittsansicht; (B) REM-Bild von 4X4 Mikrolinsen-Array und Silizium-vias. Maßstabsleiste = 1 mm (B). Abkürzung: LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Geräteprototyp des optrode-Systems . (A) Gesamtansicht des Systems. (B) Vergrößerte Ansicht des Optrode-Arrays. Maßstabsstäbe = 5 mm (A), 2 mm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Implantationschirurgie . (A) Der Schädel wird freigelegt und gereinigt, indem das Periost entfernt wird. (B) Das Zielhirngebiet wurde freigelegt und die Erdschraube wurde über dem Kleinhirn eingeführt. (C) Das Optroden-Array wurde in das Gehirn eingefügt, um die Zieltiefe anzuvisieren. Die Masse war elektrisch angeschlossen. (D) Zur Befestigung des Geräts wird Zahnzement aufgetragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Zeitleiste für Verwaltung, Betrieb und In-vivo-Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Versuchsaufbau eines elektrophysiologischen Aufzeichnungssystems. (A) LED-Licht aus, (B) LED-Licht an. Abkürzung: LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Ergebnisse der elektrophysiologischen Aufzeichnung. (A) Repräsentative Wellenformen der neuronalen Aufzeichnung und vergrößerte Wellenform in rot gestricheltem Rechteck, das zwei Lichtreize (blaue Balken) und sortierte Spitzen (rote und schwarze Pfeilspitzen) anzeigt. (B) Spike-Histogramm für jeden Kanal vor, während und nach der Lichtstimulation. Die Inset-Abbildung gibt die Position des implantierten Optrode-Arrays an. (C) Spike-Histogramm mit 100 ms Zeitraum. Blauer Balken zeigt die Periode des LED-Lichts an. Abkürzung: LED = Leuchtdiode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die Machbarkeit des Systems zur gleichzeitigen optogenetischen Stimulation und elektrophysiologischen Aufzeichnung wurde nachgewiesen (Abbildung 6). Die großen Spikes während der Lichtstimulation sind photoelektrische Artefakte, die gleichzeitig mit der Lichtstimulation auftreten (Abbildung 6A). Dies wird in der gezoomten Ansicht der Wellenform im rot gestrichelten Rechteck deutlich (Abbildung 6A). Wie in Abbildung 6A gezeigt, konnten die photoelektrischen Artefakte eindeutig aus den aufgezeichneten Wellenformen aussortiert werden, und die neuronalen Reaktionen, die durch die optogenetische Stimulation des Hippocampus-Signalweges induziert wurden, wurden eindeutig identifiziert. Abbildung 6B,C zeigt die Anzahl der Spikes und zeigt den Stimulationseffekt deutlich. Abbildung 6A ist eine der Wellenformen, die zum Abrufen der Histogramme in Abbildung 6B,C verwendet werden, da die Aufzeichnungsergebnisse aus 8 wiederholten Aufzeichnungssitzungen stammen.

Abbildung 6A zeigt den lichtinduzierten Anstieg der neuronalen Aktivität. Wir haben das gleiche Experiment mit Kontrollmäusen ohne ChR2-Expression durchgeführt. In diesem Fall erhöhte die optogenetische Stimulation die neuronale Aktivität nicht. Da die photoelektrischen Artefakte leicht aus den Aufnahmedaten ausgeschlossen werden können, ist das Ergebnis des Kontrolltieres nicht im Manuskript enthalten. Darüber hinaus können die Unterschiede in den Aufzeichnungsergebnissen zwischen den 4 Kanälen, wie in Abbildung 6 gezeigt, mit der Annahme begründet werden, dass der Abstand zwischen den Wolfram-Aufzeichnungselektroden 300 μm (Mitte-zu-Mitte) beträgt. Es ist wahrscheinlich, dass die Spike-Aktivitäten in verschiedenen Kanälen von verschiedenen Neuronen stammen. Da die neuronalen Zellen jedoch vor allem in der lokalen Hirnregion miteinander verbunden sind, waren die Gesamtmuster des neuronalen Spikings ähnlich, aber nicht genau gleich.

Um den Erfolg dieser Tierversuche sicherzustellen, erfordern mehrere kritische Schritte eine hohe Genauigkeit und zusätzliche Aufmerksamkeit während der Implantationsoperation. Zuerst müssen Blutungen aus den Blutgefäßen des Gehirns sorgfältig behandelt werden. Fahren Sie nicht mit den nächsten Schritten fort, bis die Blutung vollständig aufgehört hat. Dies ermöglicht die feste Befestigung des implantierten Geräts am Gehirn und eine klare Sicht während des chirurgischen Eingriffs. Das Kauterisieren der Blutungsstellen mit einem Bovie, das Sterilisieren mit Kochsalzlösung und das Einsetzen von Gelschaum kann hilfreich sein, um die Blutung zu stoppen.

Zweitens muss das Gehirn der Maus während der Optrode-Implantation vor Trockenheit geschützt werden. Kochsalzlösung und Gelschaum werden verwendet, um feucht zu bleiben. Wenn die Dura-Membran entfernt wird und das Gehirn vollständig exponiert ist, müssen die anderen chirurgischen Schritte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Drittens ist auch die langsame Einfügegeschwindigkeit der Optrode entscheidend. Eine langsamere Insertion reduziert Gewebeschäden und verbessert die Genauigkeit der Implantation in die Zielstelle46. Da die Verformung des Hirngewebes während der Optrodeninsertion unvermeidlich ist, ist eine langsame Insertion sehr hilfreich für das deformierte Gewebe, um seine ursprüngliche Form und sein ursprüngliches Volumen wiederherzustellen.

Viertens bestimmt der Fixationsprozess die Langzeitstabilität. Es ist hilfreich, die Schädeloberfläche trocknen zu lassen, bevor der Zahnzement für eine verbesserte, langfristige Befestigung verfestigt wird. Darüber hinaus muss darauf geachtet werden, dass nicht zu viel Zahnzement aufgetragen wird oder der Zement direkt auf der Haut klebt. Wenn sich die eingeschnittene Haut im Laufe der Zeit regeneriert, kann sie den Zement allmählich vom Schädel drücken und lösen, wenn die Haut wächst. Darüber hinaus muss ein direkter Kontakt des Zahnzements mit dem Hirngewebe vermieden werden, da Zahnzement für das Hirngewebe schädlich ist. Dies kann durch das Einsetzen von Gelschaum zwischen dem exponierten Gehirn und dem Gerät wirksam verhindert werden.

Neben den chirurgischen Eingriffen muss das optrode System vor Beginn der Experimente sorgfältig geprüft werden. Zunächst müssen der implantierbare Teil des optischen Faserarrays und die Elektroden vor dem Einsetzen unter einem Mikroskop untersucht werden. Es ist notwendig zu überprüfen, ob es einen Bruch in der Glasfaser gibt, da selbst ein kleiner Riss einen kritischen Lichtverlust verursachen kann. Weiterhin muss die Ausrichtung zwischen den optischen Fasern und den Aufnahmeelektroden auf ein genaues Einsetzen überprüft werden. Feine Pinzetten können die Wolframelektroden minutiös biegen, um ihre Fehlausrichtung zu korrigieren.

Zweitens muss die Lichtintensität vor der Implantationsoperation überprüft werden, um festzustellen, ob die Lichtleistung über dem Schwellenwert liegt und hoch genug ist, um die Opsine zu aktivieren. In der Praxis ist bekannt, dass die Anregungsschwelle für ChR2 bei etwa 1 mW/mm247 liegt. Die lichterzeugte Gewebeerwärmung muss jedoch minimiert werden, während genügend Lichtintensität bereitgestellt wird, um die neuronalen Zellen anzuregen. Zu starke Lichtenergie kann das Hirngewebe aufgrund eines Temperaturanstiegs schädigen. Ein Temperaturanstieg von 6-8 °C im Gehirn kann sofortige und irreversible Gewebeschäden verursachen12,48. Eine frühere Studie zeigte, dass der Temperaturanstieg an der Glasfaserspitze weniger als 0,5 °C49 beträgt. Ein geringes Tastverhältnis der optischen Stimulation mit kurzer Dauer kann hilfreich sein. Im Vergleich zu früheren Studien, die Temperaturprobleme mit der optogenetischen Stimulation berichteten, ist unsere Ausgangsleistung (2 mW/mm 2) und das Protokoll mit Lichtstimulation mit 4 ms bei 20 Hz für2 Sekunden angemessen und im sicheren Bereich.

Eine große Herausforderung für die neuronale Aufzeichnung besteht darin, die durch optische Stimulation induzierten Artefakte zu entfernen. Artefakte, die synchron mit der optischen Stimulation sind, müssen in verschiedenen Aspekten betrachtet werden, da sowohl elektrische als auch optische Mechanismen diese Artefakte erzeugen können. Erstens können elektrische Artefakte durch den Stromkreis verursacht werden, der die LED antreibt. Wenn ein elektrischer Strom in einem Stromkreis fließt, um die Lichtstimulation anzutreiben, können elektrische Artefakte erzeugt werden. Dieses Problem kann überwunden werden, indem die Anzahl der Drähte für die LED-Verbindungen minimiert und der Abstand zwischen der Lichtstimulationsschaltung und den Drähten, die mit den Wolfram-Aufzeichnungselektroden verbunden sind, maximiert wird. Zweitens können photoelektrische Artefakte durch den photoelektrochemischen Effekt während der optogenetischen Stimulation erzeugt werden. Diese Artefakte können minimiert werden, indem eine direkte Exposition der Aufzeichnungselektrode gegenüber dem Stimulationslicht vermieden und der Abstand zwischen den optischen Fasern und den Elektroden vergrößert wird. Es ist jedoch schwierig, lichtinduzierte Artefakte aufgrund der Lichtstreuung im Hirngewebe zu eliminieren.

Es gibt immer noch Einschränkungen im vorgeschlagenen Optrode-Array, die in zukünftigen Studien verbessert werden können. Obwohl die optische Faserspitze in dieser Studie flach geschnitten wurde, minimiert das Abschrägen oder Verjüngen von Faserspitzen Gewebeschäden während des Einführens und erhöht den Lichtausbreitungswinkel von den Spitzen50. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Lichtintensität. Trotz der Ergebnisse der elektrophysiologischen Aufzeichnung hat das vorgeschlagene System eine relativ geringere Ausgangsleistung als ein laserbasiertes System. Daher kann das vorgeschlagene LED-basierte System eine kleinere Hirnregion optogenetisch anregen als das laserbasierte System. Dies liegt vor allem daran, dass die meisten LEDs im Allgemeinen eine viel geringere Leistung haben als Laser. Da der Wirkungsgrad und die maximale Intensität von LEDs in letzter Zeit jedoch drastisch verbessert wurden, können LEDs mit einer höheren Ausgangsleistung mit neuen Halbleitertechnologien entwickelt werden. Die andere Einschränkung besteht darin, dass keine Längsschnittaufzeichnungsstudie durchgeführt wurde. Es wurde jedoch bestätigt, dass das Gerät einen Monat lang gut an den Mäusen befestigt war. Dieses Ergebnis zeigt die Möglichkeit, dass das Gerät für Langzeitexperimente geeignet ist. Daher werden langfristige In-vivo-Tests durchgeführt, um die Stabilität des Geräts zu überprüfen.

Die typischste Methode für die Optogenetik im Labor ist die Verwendung eines Lasersystems als Lichtquelle. Obwohl ein Laser eine höhere Ausgangsleistung als LEDs zur Aktivierung von Opsins bereitstellen kann, kann das laserbasierte System nicht einfach miniaturisiert werden und erfordert eine kostspielige Implementierung. Im Gegensatz dazu hat das LED-basierte optogenetische System mehrere Vorteile, wie geringe Systemkomplexität, Wirtschaftlichkeit und geringer Stromverbrauch, die für die Entwicklung des drahtlosen Systems von Vorteil sind. Daher wird in dieser Studie die LED als Lichtquelle verwendet, und das Mikrolinsenarray wird verwendet, um die Lichtintensität der LED zu erhöhen.

Darüber hinaus umfassen die Lichtquelle und die aktuellen Fahrkreise die abnehmbaren und wiederverwendbaren Teile des Systems. Neue LEDs mit unterschiedlichen Wellenlängen können durch einfachen Austausch problemlos im Gerät verwendet werden, und die Systemkosten können durch die Wiederverwendung in mehreren Experimenten erheblich gesenkt werden. Das gesamte System kann weiter als drahtloses System implementiert werden, das neuronale Signale ohne gebundene Leitungen optogenetisch stimuliert und aufzeichnet, indem es ein Low-Power-Funksystem in das miniaturisierte integrierte Gerät integriert.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch das Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (NRF-2019M3C1B8090805) finanziert und durch einen von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierten Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) (Nr. 2019R1A2C1088909) unterstützt wurde. Wir danken Seung-Hee Lees Labor am Department of Biological Sciences, KAIST, Daejeon, Korea, für die freundliche Bereitstellung der transgenen Mäuse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus

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Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C. H., Kim, Y. K., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).

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