Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optrode Array for samtidig optogenetisk modulasjon og elektrisk nevral opptak

Published: September 1, 2022 doi: 10.3791/63460
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 1, 1, 1,2, 3,4, 1,2,5
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi fabrikasjonsmetoden til et optrode-system med optiske fibre for lyslevering og en elektrodematrise for nevral opptak. In vivo eksperimenter med transgene mus som uttrykker channelrhodopsin-2 viser gjennomførbarheten av systemet for samtidig optogenetisk stimulering og elektrofysiologisk opptak.

Abstract

I løpet av det siste tiåret har optogenetikk blitt et viktig verktøy for undersøkelse av nevral signalering på grunn av sin unike evne til selektiv nevral modulasjon eller overvåking. Som spesifikke typer nevronceller kan genetisk modifiseres for å uttrykke opsinproteiner, muliggjør optogenetikk optisk stimulering eller hemming av de valgte nevronene. Det har vært flere teknologiske fremskritt i det optiske systemet for optogenetikk. Nylig ble det foreslått å kombinere den optiske bølgelederen for lyslevering med elektrofysiologisk opptak for samtidig å overvåke nevrale responser på optogenetisk stimulering eller hemming. I denne studien ble en implanterbar optrode array (2x2 optiske fibre) utviklet med innebygde flerkanalselektroder.

En lysdiode (LED) ble brukt som lyskilde, og et mikrofabrikkert mikrolens array ble integrert for å gi tilstrekkelig lyseffekt på spissen av de optiske fibrene. Optrode array-systemet består av engangsdelen og den gjenbrukbare delen. Engangsdelen har optiske fibre og elektroder, mens den gjenbrukbare delen har LED og elektroniske kretser for lyskontroll og nevral signalbehandling. Den nye utformingen av det implanterbare optrode array-systemet er introdusert i den medfølgende videoen i tillegg til prosedyren for optrodimplantasjonskirurgi, optogenetisk lysstimulering og elektrofysiologisk nevral registrering. Resultatene av in vivo-eksperimenter viste vellykket tidslåste nevrale pigger fremkalt av lysstimuliene fra hippocampale eksitatoriske nevroner av mus.

Introduction

Registrering og kontroll av nevral aktivitet er avgjørende for å forstå hvordan hjernen fungerer i et nevralt nettverk og på cellulære nivåer. Konvensjonelle elektrofysiologiske opptaksmetoder inkluderer patchklemmen 1,2,3,4 ved hjelp av en mikropipette og ekstracellulær opptak ved hjelp av mikroneurale elektroder 5,6,7,8. Som en nevromoduleringsmetode har elektrisk stimulering ofte blitt brukt til å stimulere en fokal hjerneregion direkte eller indirekte depolarisering av nevronceller direkte. Den elektriske metoden kan imidlertid ikke skille mellom nevronale celletyper for registrering eller stimulering fordi de elektriske strømmene sprer seg i alle retninger.

Som en ny teknologi har optogenetikk innledet en ny epoke for å forstå hvordan nervesystemet fungerer 9,10,11,12,13,14,15,16. Essensen av optogenetiske teknikker er å bruke lys for å kontrollere aktiviteten til lysfølsomme opsinproteiner uttrykt av genetisk modifiserte celler. Dermed muliggjør optogenetikk den sofistikerte moduleringen eller overvåkingen av genetisk utvalgte celler i kompliserte nevrale kretser14,17. Den bredere bruken av den optogenetiske tilnærmingen har nødvendiggjort samtidig nevral registrering for å direkte bekrefte optisk nevromodulering. Derfor vil en integrert enhet med lyskontroll og opptaksfunksjoner være ekstremt verdifull 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Det er begrensninger i konvensjonell, laserbasert optogenetisk stimulering, som krever et klumpete og dyrt lysleveringssystem 26,27,28,29,30. Derfor brukte noen forskningsgrupper μLED-baserte silisiumsonder for å minimere størrelsen på lysleveringssystemet 31,32,33,34. Det er imidlertid en risiko for termisk hjerneskade forårsaket av direkte kontakt med μLEDer på grunn av den lave energikonverteringseffektiviteten til lysdioder. Lysbølgeledere, som optiske fibre, SU-8 og silisiumoksynitrid (SiON), er påført for å unngå termisk skade 30,35,36,37,38,39. Denne strategien har imidlertid også en ulempe på grunn av den lave koblingseffektiviteten mellom lyskilder og bølgelederne.

Mikrolens-arrayet ble tidligere introdusert for å forbedre lyskoblingseffektiviteten mellom lysdioder og optiske fibre40. Et optrode-system ble utviklet basert på mikroelektromekaniske systemer (MEMS) teknologier for optisk stimulering og elektrisk opptak på en mikroskala40. Mikrolens-arrayet mellom en LED og optiske fibre økte lyseffektiviteten med 3,13 dB. Som vist i figur 1, er en 2x2 optisk fibermatrise justert på 4x4 mikrolens-arrayet, og LED-lampen er plassert under mikrolens-arrayet. De 2x2 optiske fibrene er montert i stedet for 4x4 for å redusere hjerneskade. En wolframelektrodematrise er plassert ved siden av optrode-matrisen ved hjelp av silisium via hull for elektrofysiologisk opptak (figur 1B).

Systemet består av en topp engangsdel og avtakbare bunndeler. Den øverste engangsdelen, som inkluderer den optiske fibermatrisen, mikrolens arrayet og wolframelektrode arrayet, er designet for å implanteres permanent i hjernen for in vivo-eksperimenter . Den nederste delen inkluderer en LED-lyskilde og en ekstern strømforsyningslinje, som er lett flyttbar og gjenbrukbar for et annet dyreforsøk. Et plastdeksel som kan festes, beskytter engangsdelen når den avtakbare delen fjernes.

Gjennomførbarheten av systemet er verifisert ved implantasjon i hjernen til transgene mus som uttrykker channelrhodopsin-2 (ChR2) i Ca2 +/calmodulin-avhengig protein kinase II-positive nevroner (CaMKIIα::ChR2 mus). Registrering av elektroder ble brukt til å registrere nevrale aktiviteter fra individuelle nevroner under optisk stimulering av nevronene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrepleie- og kirurgiske prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ewha Womans University (nr. 20-029).

1. Fremstilling av en optrode array (figur 1 og figur 2)

  1. Fest optiske fibre med mikrolens-arrayet.
    1. Fjern passivasjonsbelegget til den optiske fiberen og kutt den i 5 mm lange stykker ved hjelp av en presisjons optisk fiberklype.
    2. Dypp den optiske fiberen i den klare UV-harpiksen og plasser de optiske fibrene på mikrolens-arrayet.
    3. Herd harpiksen ved hjelp av en UV-lampe.
    4. Fest mikrolensmatrisen til det 3D-trykte huset ved hjelp av epoksy.
  2. Juster perfluoroalkoxy (PFA)-belagte wolframtråder.
    1. Lodde de 4 delene av 30 mm lange PFA wolfram ledninger og 1 sølv ledning til 5-pinners, 1,27 mm pitch kvinnelig kontakt. Bruk sølvtråd som referanseelektrode.
    2. Koble den kvinnelige kontakten på 1,27 mm til hodelyktforsterkeren.
    3. Sett wolframtrådene forsiktig gjennom silisiumet via hullene (figur 1B) for å hjelpe finjustering av wolframelektrodene.
    4. Klipp de justerte wolframledningene 1 mm kortere enn den optiske fiberlengden.
    5. Fest kontakten til det 3D-trykte huset ved hjelp av epoksy.
  3. LED-plassering
    1. Plasser LED-lampen i det 3D-trykte huset.
    2. Koble LED-lampen til kjørekretsen som genererer pulsbreddemodulering (PWM).
      MERK: PWM-pulsen genereres av mikrokontrolleren.
    3. Gitt støyen som er indusert av LED-kjørekretsen, må du sørge for at opptakselektrodene er 50 mm bortsett fra LED-kjørekretsen.
    4. Mål lysintensiteten på slutten av den optiske fiberspissen ved hjelp av en fotodiode.
  4. Senk wolframelektrodene og optiske fibrene ned i alkohol i 15 minutter. Senk deretter systemet ned i sterilt D.I-vann og steriliser med etylenoksidgass.

2. Implantasjonskirurgi (figur 3 og figur 4)

MERK: Steril teknikk må følges under operasjonen.

  1. Forbered de transgene dyrene, som er genetisk modifisert for å uttrykke lysfølsomme opsinproteiner i den spesifikke typen nevronceller.
    MERK: En mannlig, 2 måneder gammel, transgen mus som uttrykker channelrhodopsin-2 (ChR2) i Ca2+/calmodulin-avhengig protein kinase II-positive nevroner (CaMKIIα::ChR2 mus) ble brukt i denne studien41.
  2. Bedøv musen med en ketamin-xylazin cocktail-en blanding av ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg)-ved intraperitoneal administrering.
    1. Kontroller det bedøvede dyret hvert 30.
    2. Injiser ketamin-xylazincocktailen ved halvparten av den første dosen hvis ytterligere anestesi er nødvendig.
  3. Barber hodehuden og plasser den bedøvede musen i den stereotaktiske rammen.
    MERK: Utfør kirurgisk hudforberedelse og draper dyr. Hudpreparat innebærer hårfjerning etterfulgt av rengjøring av huden med antimikrobielle midler.
    1. Plasser hodet innenfor den stereotaktiske rammen og sett ørestengene inn i kjøttstykket.
    2. Sentrer musehodet i den stereotaktiske rammen ved å løsne og stramme ørestengene gjentatte ganger for nøyaktig posisjonering.
    3. Plasser snittstangen slik at de øvre snittene hekter over den fremre innerkanten.
    4. Juster snittstangen for å stille inn høyden på snittstangen, og stram neseklemmen mot snuten.
    5. Slå på den termiske varmeputen som er innebygd i den stereotaktiske rammen på forhånd for å opprettholde kroppstemperaturen ved 37 °C gjennom de kirurgiske prosedyrene.
    6. Sett den termiske sonden inn i musens endetarm for homeothermic regulering.
      MERK: Plasseringen av ørestangen må kontrolleres ved å gripe forsiktig og svinge snuten. Ørestangen må justeres på nytt hvis snuten kan flyttes mer enn ~4 mm sidelengs.
  4. Dekk øynene med petroleumjell (se materialtabellen) for å forhindre tørrhet.
  5. Injiser 1% lidokain i hodebunnen. Løft huden på hodet med tang, sikre et injeksjonsrom og injiser lidokainen under hodebunnen.
  6. Utfør et sagittal snitt ved hjelp av en skalpell og fin saks. Hold den innsnevrede huden med en mikroklamp for å utvide synligheten til det kirurgiske området.
    MERK: Snittlengden er <1 cm over bregma og kaudal kant av interparietalbenet.
  7. Fjern periosteumet ved hjelp av bomullspinne. Hvis det er blødning, cauterize skallen ved hjelp av en bovie for å forsegle blodårene.
  8. Rengjør skallen med saltvann og merk kraniotomiplassene ved hjelp av en manipulatorarm: hippocampus Anterior-Posterior (AP) −1,8 til −2,8 mm, Medial-Lateral (ML) 0,5-2,5 mm og Dorsal-Ventral (DV) −1 til −2 mm.
    MERK: Med tanke på tykkelsen på museskallen, sett inn optrode array -1,2 til -2,2 mm fra det eksponerte hjerneområdet. Gitt hippocampal banen, pyramideceller av CA3 sende sine axoner til CA1. Derfor er optiske fibre 1 mm lengre enn opptakselektroder, slik at de optiske fibrene plasseres i CA3 og opptakselektrodene i CA1.
  9. Bor et hull over cerebellum og sett inn en skrue for bakken. Sett jordskruen 0,5 mm dyp med en presisjonsskrue til den når toppen av cerebellum.
    MERK: Sørg for tett innsetting av skruen, som vil bli brukt som jordelektrode og en støttestruktur for å maksimere den langsiktige stabiliteten til implantasjon, da den øker den tredimensjonale overflaten for overholdelse av tannsementen.
  10. Bor det merkede området og fjern et stykke av skallen med tang.
  11. Bøy en 26 G nålespiss til med klokken 120°, og utsett hjerneområdet ved å sette inn den skrå siden av nålen vendt oppover. Vær forsiktig så du ikke skader hjernen og blodårene.
  12. Rengjør den eksponerte hjernen med saltvann for å vaske ut benstøv og fremmedlegemer.
  13. Fest optrode-arrayet i manipulatorarmen og beveg deg nær det eksponerte området.
    MERK: Når du plasserer enheten, kan omberegning av målområdet igjen fra bregma øke nøyaktigheten av plasseringen.
  14. Sett optrode-arrayet langsomt inn og koble jordskruen til sølvtråden som er festet til systemet42.
    MERK: I denne prosessen må matrisen festes tett til manipulatorarmen for å minimere slingring for å forhindre hjerneskade fra mikromotion under innsetting. Innsetting må utføres sakte, med hvile i 10 minutter for å ta hensyn til hevelse i hjernen som kan ha blitt presset etter innsetting. Innsettingshastighet under 1 μm/s i hjernevevet anbefales for høy kvalitet på signal-til-støy-forholdet og antall separerbare enkeltenheter42.
  15. Hvis det er blødning, bruk direkte trykk på blødninger med tørr bomullspinne eller bruk cautery. Ikke gå videre til de neste trinnene før blødningen er helt stoppet.
  16. Sett inn gelskum mellom den eksponerte hjernen og enheten for å beskytte kjemikalier mot direkte kontakt med hjernen.
    MERK: Gelskum hjelper også hemostase og holder hjernen fuktig.
  17. Tørk skallen med bomullspinne for å fjerne fuktighet så mye som mulig, og fortsett til neste fikseringstrinn.
  18. Påfør forsiktig tannsement på skallen for å fikse enheten og dekke gelskummet. Før tannsementen er helt herdet, separer hodebunnen hvis den er festet til tannsement. Trekk den innsnevret huden med tang for å dekke den herdede tannsementen og suturer hodebunnen. Slipp deretter enheten fra manipulatorarmen.
    MERK: Pass på at tannsementen ikke fester seg til huden og bare dekker skalleområdet. Når huden vokser, kan den skyve sementen bort, og til slutt vil enheten falle av. Dette vil føre til et kritisk problem for langsiktige in vivo-eksperimenter .

3. Restitusjon og implantatpleie

  1. Ta musen ut av den stereotaktiske rammen.
  2. Administrer Carprofen-oppløsningen med en 26 G nål. Injiser en gang før operasjonen og 12 timer (neste morgen i tilfelle ettermiddagskirurgi) og 24 timer etter operasjonen for å redusere smerte.
    MERK: Legemiddelkonsentrasjonen i flasken er 50 mg/ml, og den lagres ved 4 °C. Carprofen er viskøs og må fortynnes i sterilt vann 1:10. Hvis steriliteten opprettholdes, kan løsningen lagres i opptil 4 uker. For å opprettholde den effektive varigheten av stoffet, injiser Carprofen-løsningen med 12 timers intervaller.
  3. Plasser musen på varmeputen og sjekk om den gjenoppretter godt fra anestesi.
    MERK: Dyret blir ikke stående uten tilsyn før det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet.
  4. Fjern suturtrådene 7 - 10 dager etter operasjonen.
  5. La dyret gjenopprette i 1 uke. Overvåk mat- og vanninntaket under restitusjonstiden. Administrer smertestillende og se etter tegn på ubehag eller smerte.
    MERK: Dyrene som har gjennomgått kirurgi kan ikke bli hos de andre dyrene før de er helt restituert.
    1. I løpet av gjenopprettingsperioden, vei musen hver dag for å se etter vektendringer. Ofre musen (se avsnitt 6) hvis det er 20% vekttap sammenlignet med alder og kjønn matchet kontroll dyr.

4. Optogenetisk stimulering og elektrofysiologisk opptak

  1. Bedøv musen og plasser den bedøvede musen i den stereotaktiske rammen.
  2. Definer stimuleringsparameterne.
    1. Sett lyspulsoppskriften til 4 % driftssyklus og 10 Hz-frekvens43. Sett opp lysstimulering for 2 s (20 pulser) under nevral opptak.
    2. Bruk en 50 mA strøm til å kjøre 3 mW/mm2 lysintensitet på den optiske fiberspissen. Mål lyseffekten ved hjelp av en fotodiode og kraftmåler og del lyseffekten med det optiske fibersisettområdet.
  3. Ta av plastdekselet og fest den øvre delen som inneholder lystilførselssystemet med den gjenbrukbare LED-en og kretsene.
  4. Koble headstage-forløperen til den implanterte 5-pinners kontakten.
  5. Åpne programvaren for å registrere nevrale signaler.
  6. Sett opp programvarefiltrene. Bruk et båndpassfilter på 0,1-20 kHz og et hakkfilter på 60 Hz. Sett forsterkerprøvefrekvensen til 20 kHz.
  7. Før opptaket, sjekk om nevrale piggsignaler oppdages.
    MERK: Støydemping er viktig fordi nevrale signaler er for små. Hvis støynivået er for høyt, kan nevrale signaler skjules av støy og bli usynlige. Bruk passende jording og elektromagnetisk bølgeskjerming for å redusere støy.
  8. Etter signalkontrollen registrerer du nevrale signaler uten lysstimulering for baselineopptak.
  9. Lever LED-lys og registrer samtidig nevronresponser (figur 5 og figur 6).
    MERK: Når det er stimulert, må neste stimuleringseksperiment utføres etter et intervall på minst 5 minutter, slik at nevronaktiviteten fremkalt av forrige stimulering ikke påvirker neste eksperiment.

5. Dataanalyse

  1. Last inn de innsamvede dataene ved hjelp av MATLAB-programmet.
  2. Oppnå enkle nevrale aktiviteter ved hjelp av en spike sorteringsalgoritme "Wave-Clus"44,45. Oppdag piggene i hver kanal med en amplitudeterskel som i Eq (1)45.
    Terskelverdi = 5 × median Equation 1 (1)
    Der x er det bandpassfiltrerte signalet.
    1. Hvis du vil installere "Wave-Clus", kan du se nedlastingskoblingen i innholdsfortegnelsen.
    2. Hvis du vil åpne det grafiske brukergrensesnittet, skriver du inn wave_clus i ledeteksten for MATLAB.
    3. Skriv inn Get_spikes('filename.ext')- funksjonen for filtype som er klargjort for å øke søket. Kjør deretter Do_clustering('filename_spikes.mat') for piggsortering.
  3. Tell de sorterte piggene før, under og etter lysstimulering med bestemte tidshyller. Bruk 0,2 s og 2 s tidshyller for analyse.
  4. Tegn inn antall topper fra hver innspillingskanal.
    MERK: Gjennomsnitt med standardfeil på gjennomsnittet (SEM) av dataene fra resultatene av 8 gjentatte eksperimenter ble beregnet og plottet.

6. Eutanasi

  1. Etter alle forsøkene, ofre musen ved karbondioksid (CO2) innånding.
  2. Uten å lade kammeret, plasser musen i det gjennomsiktige eutanasikammeret, uten CO2-forsyning og / eller lekkasjer.
  3. Slå på CO2-gassen , og fortreng luften med en hastighet på 30 - 50% av volumet av eutanasikammerluft per min.
    MERK: Et strømningsmåler må kobles til CO 2-gassflasken for å sikre at luftforskyvningshastigheten er 30-50% av volumet av eutanasikammeret per min.
  4. Overvåk den ofres musen for mangel på åndedrett og endret øyenfarge.
    MERK: Forventet tid for eutanasi er vanligvis innen 10 til 15 minutter.
  5. Etter å ha observert dødstegnene, fjern musen fra eutanasikammeret.
  6. For å fullføre eutanasiprosedyren, bekreft døden ved å bekrefte åndedretts- og hjertestans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optrode-systemet er vellykket fremstilt for å gi tilstrekkelig lyskraft til å aktivere målnevronene. Den fine justeringen av wolframelektrodene oppnås gjennom mikrofabrikkert silisium via hullene. Den målte lysintensiteten er 3,6 mW/mm2 ved den optiske fiberspissen når 50 mA strøm påføres. Mikrolenene økte lyseffektiviteten med 3,13 dB. På grunn av mikrolens-arrayet, som forbedrer lyskoblingen, er den påførte strømmen omtrent halvparten av strømmen som kreves for å oppnå samme lysintensitet uten mikrolens array-systemet. Ettersom LED-lampen genererer mer varme med mer strøm, er det åpenbart fordelaktig å bruke mikrolens-arrayet for å senke varmen på enheten. Gjennomsnittlig impedans på 4 elektroder var 71,39 kΩ ved 1 kHz frekvens, noe som er lavt nok til å oppdage handlingspotensialene. Videre består optrode-rekken av engangs- og gjenbrukbare deler for å redusere kostnadene og minimere den totale vekten av implantasjon. Vekten av engangsdelen er ~ 0,58 g.

En CaMKIIα::ChR2-mus ble brukt til å stimulere ChR2-uttrykkende nevroner direkte, og de fremkalte nevrale piggene ble vellykket registrert, som vist i figur 6. Vi viste hele de registrerte bølgeformene med eksakte forhold, inkludert 2 s lys-på-periode i midten (figur 6A). Spike sortering fra rådatasignalet ble utført ved hjelp av en skreddersydd MATLAB kildekode. Den totale nevrale aktiviteten ble analysert etter å ha sortert ut to forskjellige enheter. Antallet fremkalte individuelle nevrale pigger etter hver lysstimuleringspuls økte betydelig sammenlignet med baseline (figur 6A,B), med forskjellige tidsbeholdere på 2 s og 0,2 s. Som et resultat kunne vi identifisere den klare effekten av optogenetisk stimulering på nevronene.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram over optrode array og microlens array. (A) 3D-skjematisk visning og tverrsnittsvisning; (B) SEM-bilde av 4X4 mikrolens array og silisium via. Skalastang = 1 mm (B). Forkortelse: LED = lysdiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Enhetsprototyp av optrode-system. (A) Hele visningen av systemet. (B) Forstørret visning av optrode-matrisen. Skalastenger = 5 mm (A), 2 mm (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Implantasjonskirurgi. (A) Skallen eksponeres og rengjøres ved å fjerne periosteum. (B) Målhjerneområdet ble eksponert, og jordskruen ble satt inn over cerebellum. (C) Optrode-matrisen ble satt inn i hjernen for å målrette dybden. Bakken var elektrisk tilkoblet. (D) Dental sement påføres for å fikse enheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk diagram over administrasjon, drift og in vivo eksperiment tidslinje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksperimentelt oppsett av elektrofysiologisk opptakssystem. (A) LED-lys av, (B) LED-lys på. Forkortelse: LED = lysdiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Elektrofysiologiske opptaksresultater. (A) Representative bølgeformer av nevral registrering og forstørret bølgeform i rødt stiplet rektangel som indikerer to lysstimuli (blå stolper) og sorterte pigger (røde og svarte pilspisser). (B) Spike histogram for hver kanal før, under og etter lysstimulering. Innsett figur indikerer plasseringen av den implanterte optrode array. (C) Spike histogram med 100 ms tid bin. Blå stolpe indikerer perioden med LED-lys på. Forkortelse: LED = lysdiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gjennomførbarheten av systemet for samtidig optogenetisk stimulering og elektrofysiologisk opptak ble verifisert (figur 6). De store piggene under lysstimulering er fotoelektriske artefakter som forekommer samtidig med lysstimuleringen (figur 6A). Dette er tydelig i den zoomede visningen av bølgeformen i det røde stiplede rektangelet (figur 6A). Som vist i figur 6A, kunne de fotoelektriske artefaktene tydelig sorteres ut fra de registrerte bølgeformene, og de nevronale responsene som ble indusert av optogenetikkstimuleringen av hippocampal signalbanen ble tydelig identifisert. Figur 6B,C angir antall pigger, og viser stimuleringseffekten tydelig. Figur 6A er en av bølgeformene som brukes til å hente histogrammer i figur 6B,C, fordi opptaksresultatene er hentet fra 8 gjentatte opptaksøkter.

Figur 6A viser den lysinduserte økningen i nevral aktivitet. Vi har utført det samme eksperimentet med kontrollmus uten ChR2-uttrykk. I så fall økte den optogenetiske stimuleringen ikke nevral aktivitet. Siden de fotoelektriske artefaktene lett utelukkes fra opptaksdataene, er resultatet fra kontrolldyret ikke inkludert i manuskriptet. Videre kan forskjellene i opptaksresultatene blant de 4 kanalene, som vist i figur 6, rettferdiggjøres ved å vurdere at avstanden mellom wolframopptakselektrodene er 300 μm (senter-til-senter). Det er sannsynlig at piggaktivitetene i forskjellige kanaler er fra forskjellige nevroner. Men fordi nevroncellene er forbundet, spesielt i den lokale hjerneregionen, var de generelle mønstrene for nevronal spiking like, men ikke akkurat de samme.

For å sikre suksessen til disse dyreforsøkene krever flere kritiske trinn høy nøyaktighet og ekstra oppmerksomhet under implantasjonsoperasjonen. For det første må blødning fra hjernens blodårer håndteres nøye. Ikke fortsett til de neste trinnene før blødningen har stoppet helt. Dette vil tillate fast festing av den implanterte enheten på hjernen og klar synlighet under kirurgisk prosedyre. Cauterizing blødning flekker med en bovie, sterilisering med saltvann, og innsetting av gel skum kan være nyttig for å stoppe blødningen.

For det andre må musehjernen beskyttes mot tørrhet under optrodimplantatasjonen. Saltvann og gelskum brukes til å holde fuktig. Hvis duramembranen fjernes og hjernen er helt utsatt, må de andre kirurgiske trinnene utføres så raskt som mulig. For det tredje er den langsomme innsettingshastigheten til optroden også avgjørende. Langsommere innsetting reduserer vevsskade og forbedrer nøyaktigheten av implantasjonen til det målrettede stedet46. Ettersom deformasjonen av hjernevevet er uunngåelig under optrode-innsettingen, er langsom innsetting svært nyttig for det deformerte vevet for å gjenopprette sin opprinnelige form og volum.

For det fjerde bestemmer fikseringsprosessen langsiktig stabilitet. Det er nyttig å gjøre skalleoverflaten tørr før du størkner tannsementen for forbedret, langsiktig vedlegg. I tillegg må det tas hensyn til å unngå å bruke for mye tannsement eller la sementen holde seg direkte til huden. Når den innsnevrede huden regenererer over tid, kan den gradvis skyve og løsne sementen fra skallen etter hvert som huden vokser. Videre må direkte kontakt av tannsementen med hjernevevet unngås fordi tannsement er skadelig for hjernevev. Dette kan effektivt forhindres ved gelskuminnsetting mellom den eksponerte hjernen og enheten.

I tillegg til de kirurgiske prosedyrene, må optrode-systemet kontrolleres nøye før du starter forsøkene. Først må den implanterbare delen av den optiske fibermatrisen og elektrodene undersøkes under et mikroskop før innsetting. Det er nødvendig å sjekke om det er brudd i den optiske fiberen fordi selv en liten sprekk kan forårsake kritisk lystap. Videre må justeringen mellom optiske fibre og opptakselektrodene kontrolleres for presis innsetting. Fine tang kan minuttvis bøye wolframelektrodene for å rette opp feiljusteringen.

For det andre må lysintensiteten kontrolleres før implantasjonskirurgi for å avgjøre om lyseffekten er over terskelen og høy nok til å aktivere opsinene. I praksis er det kjent at eksitasjonsterskelen for ChR2 er ca. 1 mW/mm247. Imidlertid må lysgenerert vevsoppvarming minimeres samtidig som det gir nok lysintensitet til å begeistre nevroncellene. For sterk lysenergi kan skade hjernevevet på grunn av temperaturøkning. En temperaturøkning på 6-8 °C i hjernen kan forårsake umiddelbar og irreversibel vevsskade12,48. En tidligere studie viste at temperaturøkningen ved den optiske fiberspissen er mindre enn 0,5 °C49. En lav driftssyklus med optisk stimulering med kort varighet kan være nyttig. Sammenlignet med tidligere studier som rapporterte temperaturproblemer med optogenetisk stimulering, er utgangseffekten vår (2 mW / mm2) og protokollen med lysstimulering med 4 ms ved 20 Hz i 2 sekunder passende og innenfor det sikre området.

En stor utfordring for nevral registrering er å fjerne artefaktene forårsaket av optisk stimulering. Artefakter synkron med optisk stimulering må vurderes i flere forskjellige aspekter fordi både elektriske og optiske mekanismer kan generere disse artefaktene. For det første kan elektriske gjenstander skyldes den elektriske kretsen som driver LED-lampen. Når en elektrisk strøm strømmer i en krets for å drive lysstimulering, kan elektriske gjenstander genereres. Dette problemet kan løses ved å minimere antall ledninger for LED-tilkoblingene og maksimere avstanden mellom lysstimuleringskretsen og ledningene som er koblet til wolframopptakselektrodene. For det andre kan fotoelektriske artefakter genereres av den fotoelektriske effekten under optogenetisk stimulering. Disse artefaktene kan minimeres ved å unngå direkte eksponering av registreringselektroden til stimuleringslyset og øke avstanden mellom de optiske fibrene og elektrodene. Det er imidlertid vanskelig å eliminere lysinduserte gjenstander på grunn av lysspredning i hjernevevet.

Det er fortsatt begrensninger i det foreslåtte optrode arrayet, som kan forbedres i fremtidige studier. Selv om den optiske fiberspissen ble kuttet flatt i denne studien, vil skråkant eller avsmalnende fiberspisser minimere vevsskader under innsetting og øke lysvinkelen som sprer seg fratipsene 50. En annen begrensning er lav lysintensitet. Til tross for resultatene av det elektrofysiologiske opptaket har det foreslåtte systemet en relativt lavere utgangseffekt enn et laserbasert system. Derfor kan det foreslåtte LED-baserte systemet optogenetisk begeistre en mindre hjerneregion enn det laserbaserte systemet. Dette skyldes hovedsakelig at de fleste lysdioder har mye lavere effekt enn lasere generelt. Men etter hvert som effektiviteten og den maksimale intensiteten til lysdioder har blitt dramatisk forbedret i det siste, kan lysdioder med høyere utgangseffekt utvikles med nye halvlederteknologier. Den andre begrensningen er at en langsgående opptaksstudie ikke ble utført. Det ble imidlertid bekreftet at enheten var godt festet til musene i en måned. Dette resultatet viser muligheten for at enheten er egnet for langsiktige eksperimenter. Derfor vil langsiktige in vivo-tester bli utført for å verifisere stabiliteten til enheten.

Den mest typiske metoden for optogenetikk i laboratorier er å bruke et lasersystem som lyskilde. Selv om en laser kan gi høyere utgangseffekt enn lysdioder for aktivering av opsiner, kan ikke det laserbaserte systemet enkelt miniatyriseres og krever høykostnads implementering. I motsetning har det LED-baserte optogenetiske systemet flere fordeler, for eksempel lav systemkompleksitet, kostnadseffektivitet og lavt strømforbruk, som er fordelaktig for utviklingen av det trådløse systemet. Derfor, i denne studien, er LED-lampen ansatt som lyskilde, og mikrolens-arrayet er vedtatt for å øke lysintensiteten til LED-lampen.

I tillegg utgjør lyskilden og de nåværende kjørekretsene de avtakbare og gjenbrukbare delene av systemet. Nye lysdioder med forskjellige bølgelengder kan enkelt brukes i enheten ved enkel utskifting, og systemkostnadene kan reduseres betydelig på grunn av gjenbruk i flere eksperimenter. Hele systemet kan implementeres videre som et trådløst system, som optogenetisk stimulerer og registrerer nevronsignaler uten tethered linjer ved å ta i bruk et trådløst system med lav effekt i den miniatyriserte integrerte enheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av Ministry of Science and ICT (NRF-2019M3C1B8090805), og støttet av et National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea-regjeringen (MSIT) (nr. 2019R1A2C1088909). Vi takker Seung-Hee Lees laboratorium ved Institutt for biovitenskap, KAIST, Daejeon, Korea, for vennlig å gi de transgene musene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86 (2016).
  2. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54024 (2016).
  3. Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
  4. Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23 (2015).
  5. Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
  6. Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
  7. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  8. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  9. Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
  10. Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
  13. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  14. Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
  15. Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
  16. Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
  17. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  18. Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001 (2012).
  19. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007 (2009).
  21. Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
  22. Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  24. Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
  25. Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027 (2020).
  26. Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024 (2020).
  27. Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777 (2019).
  28. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10 (2018).
  29. Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004 (2017).
  30. Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466 (2015).
  31. Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503 (2020).
  32. Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063 (2020).
  33. Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
  34. Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381 (2016).
  35. Oh, K., Sonsi, Y. -A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
  36. McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010 (2019).
  37. Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69 (2015).
  38. Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , Stevenage. (2015).
  39. Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
  40. Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), Basel. 725 (2021).
  41. Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
  42. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111 (2019).
  43. Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  44. Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
  45. Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
  46. Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919 (2014).
  47. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
  48. Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007 (2016).
  49. Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343 (2019).
  50. Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294 (2019).

Tags

Nevrovitenskap utgave 187
Optrode Array for samtidig optogenetisk modulasjon og elektrisk nevral opptak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., … More

Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C. H., Kim, Y. K., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter