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Neuroscience

Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63483
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

Summary

Nous présentons ici un protocole sur la façon de préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir de cortex de rat pour l’imagerie vidéo time-lapse de Ca2+ intracellulaire pour la recherche sur la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique dans le modèle de rat hSOD1G93A .

Abstract

Ce protocole montre comment préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir des cortex de rats Sprague Dawley et comment utiliser ces cellules dans le but d’étudier la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) dans le modèle hSOD1G93A du rat. Tout d’abord, le protocole montre comment isoler et cultiver les astrocytes et les microglies à partir de cortex postnatal de rat, puis comment caractériser et tester la pureté de ces cultures par immunocytochimie en utilisant le marqueur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) des astrocytes et le marqueur microglial de la molécule ionisée liant le calcium 1 (Iba1). Dans l’étape suivante, des méthodes sont décrites pour la charge de colorant (Fluo 4-AM sensible au calcium) des cellules en culture et les enregistrements des changements Ca2+ dans des expériences d’imagerie vidéo sur des cellules vivantes.

Les exemples d’enregistrements vidéo sont les suivants: (1) cas d’imagerie Ca2+ d’astrocytes en culture exposés de manière aiguë à l’immunoglobuline G (IgG) isolée chez des patients atteints de SLA, montrant une réponse caractéristique et spécifique par rapport à la réponse à l’ATP démontrée dans la même expérience. Les exemples montrent également une augmentation transitoire plus prononcée de la concentration intracellulaire de calcium évoquée par les IgG de la SLA dans les astrocyteshSOD1 G93A par rapport aux témoins non transgéniques; (2) imagerie Ca 2+ d’astrocytes en culture lors d’un épuisement des réserves de calcium par la thapsigargine (Thg), un inhibiteur non compétitif de l’ATPase du réticulum endoplasmiqueCa2+, suivie d’une entrée de calcium opérée en magasin provoquée par l’ajout de calcium dans la solution d’enregistrement, qui démontre la différence entre le fonctionnement du magasin Ca2+ dans hSOD1G93A et dans les astrocytes non transgéniques; (3) L’imagerie Ca 2+ de la microglie en culture montrant principalement un manque de réponse aux IgG SLA, tandis que l’application d’ATP a provoqué un changement Ca2+. Cet article met également l’accent sur les mises en garde et les mises en garde possibles concernant la densité cellulaire critique et la pureté des cultures, le choix de la concentration correcte du colorant Ca2+ et les techniques de chargement du colorant.

Introduction

Les techniques de culture cellulaire ont donné lieu à de nombreux progrès dans divers domaines de la neurophysiologie cellulaire dans la santé et la maladie. En particulier, les cultures de cellules primaires, fraîchement isolées du tissu neuronal d’un animal de laboratoire, permettent à l’expérimentateur d’étudier de près le comportement de diverses cellules dans différents milieux biochimiques et configurations physiologiques. L’utilisation de différents indicateurs physiologiques fluorescents tels que les colorants sensibles au Ca2+ en combinaison avec la microscopie vidéo time-lapse permet de mieux comprendre les processus biophysiques et biochimiques cellulaires en temps réel.

La SLA est une maladie neurodégénérative dévastatrice qui affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs1. La maladie présente une pathogenèse complexe de type familial mais surtout de forme sporadique (90% des cas)2. Il est bien connu que les mécanismes autonomes non cellulaires contribuent à la physiopathologie de la SLA, principalement en raison du rôle essentiel des cellules gliales3. La SLA est également bien caractérisée comme une maladie neuroinflammatoire avec implication de facteurs humoraux et cellulaires de l’inflammation.

L’immunoglobuline G est largement utilisée comme marqueur moléculaire de la SLA et d’autres maladies neurodégénératives. L’étude du taux sérique de ce marqueur peut indiquer la présence et le stade de la neuroinflammation dans la maladie 4,5,6, tandis que sa présence dans le liquide céphalorachidien peut indiquer une brèche de la barrière hémato-encéphalique7. Les IgG ont également été identifiées comme des dépôts dans les motoneurones de la moelle épinière de patients atteints de SLA7. Néanmoins, cette approche a montré quelques incohérences dans la corrélation du taux d’IgG avec le stade et les caractéristiques de la maladie6.

Les IgG isolées à partir des sérums de patients atteints de SLA (IgG SLA) peuvent induire une réponse calcique dans les astrocytesnaïfs 8 et la libération de glutamate dans les neurones, ce qui indique un effet excitotoxique - une caractéristique de la pathologie de la SLA9. Cependant, des études sur le modèle de rat hSOD1G93A ALS (contenant plusieurs copies de la mutation humaine SOD110) ont montré un certain nombre de marqueurs du stress oxydatif dans les cellules neurogliales en culture11, les tissus 12,13,14 ou les animaux vivants 13. Il est à noter que les astrocytes cultivés à partir du modèle de rat SLA étaient plus sujets au stress oxydatif induit par le peroxyde que les astroglies de compagnons de portée non transgéniques11.

Les cellules microgliales en culture sont affectées par les IgG de la SLA d’une manière moins apparente. À savoir, une lignée cellulaire microgliale BV-2 a montré une augmentation du signal provenant de marqueurs fluorescents du stress oxydatif en réponse à l’application de seulement 4/11 échantillons de patients atteints d’IgG SLA15. Il est bien connu que la microglie participe à de nombreuses pathologies neuroinflammatoires, ajoutant au stress oxydatif et à la phase de progression tardive dans le mécanisme autonome non cellulaire de la SLA16,17. Néanmoins, les données avec les IgG de la SLA ont indiqué que ces cellules peuvent ne pas être aussi réactives que les astrocytes à ces facteurs humoraux de l’inflammation de la SLA. Plusieurs études ont été menées avec des astrocytes primaires à partir de modèles murins de SLA, non seulement chez les petits mais aussi chez les animaux symptomatiques, soit sur le cerveau, soit sur la moelle épinière 18,19,20,21. Cela est également vrai pour les cultures primaires microgliales, bien que dans une moindre mesure que les astrocytes et principalement à partir de régions du cerveau au stade embryonnaire22,23,24.

Nous utilisons l’imagerie vidéo accélérée de Ca2+ sur des cellules en culture principalement comme moyen de suivre les transitoires intracellulaires de cet ion en tant que marqueur physiologique de l’excitotoxicité. Ainsi, par la caractérisation biophysique de ces transitoires (amplitude, aire sous transitoire, temps de montée, fréquence) le chercheur peut obtenir des paramètres diagnostiques expérimentaux à partir de divers modèles cellulaires de neurodégénérescence. Cette technique offre donc l’avantage d’une évaluation physiologique quantitative des IgG en tant que biomarqueurs de la maladie. Il existe une abondante littérature sur le rôle des IgG et du Ca2+ dans l’induction de la SLA. La plupart de ces études ont été réalisées en induisant la SLA en injectant des IgG à des patients 25,26,27,28,29, qui ont ensuite montré une élévation intracellulaire du Ca 2+ et des dépôts d’IgG. Une série d’études a exploré l’effet des IgG de la SLA sur la synapse motrice in vitro30,31,32. Dans le contexte ci-dessus, la technique présentée ici met l’accent sur les cellules gliales en tant qu’acteurs importants du mécanisme autonome non cellulaire de la SLA et quantifie leur réponse excitotoxique potentielle aux IgG en tant que facteurs humoraux de la neuroinflammation. Cette approche peut avoir une application plus large dans le test d’autres facteurs humoraux tels que les sérums entiers, le LCR ou les cytokines dans différents systèmes de culture cellulaire et dans des modèles cellulaires d’inflammation générale.

Cet article décrit comment préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir des cortex de rats Sprague Dawley et comment utiliser davantage ces cellules pour étudier la physiopathologie de la SLA avec des IgG dérivées de sérums de patients. Les protocoles sont détaillés pour le chargement de colorant des cellules en culture (Figure 1) et les enregistrements des changements de Ca2+ dans les expériences d’imagerie vidéo accélérée. Des exemples d’enregistrements vidéo montreront comment les cellules gliales réagissent aux IgG de la SLA par rapport à l’ATP, ce dernier activant les récepteurs de la membrane purinergique. Pour la première fois, on montre un exemple sur la façon dont les astrocytes isolés du cerveau de rat hSOD1G93A de la SLA réagissent avec une réponse Ca 2+ plus prononcée aux IgG de la SLA par rapport aux témoins non transgéniques et comment relier ce processus aux différences dans le fonctionnement du magasin Ca2+. On montre également un exemple d’imagerie calcique dans les cellules microgliales fortement défiées par les IgG SLA, avec seulement une réponse modeste du calcium intracellulaire.

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Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives de l’UE sur la protection des animaux à des fins scientifiques et avec l’autorisation de la Commission éthique de la Faculté de biologie de l’Université de Belgrade (numéro d’approbation EK-BF-2016/08). En ce qui concerne le matériel du patient (sérum pour les IgG), il a été recueilli pour un examen clinique de routine avec le consentement éclairé du patient conformément au Code de déontologie de l’Association médicale mondiale (Déclaration d’Helsinki) pour les expériences impliquant des humains. Le protocole a été approuvé par le comité d’éthique du Centre clinique de Serbie (n ° 850/6).

1. Préparation de la culture cellulaire primaire

  1. Isolement des tissus cérébraux
    REMARQUE : L’isolement doit être effectué sur de la glace, en utilisant des solutions glacées.
    1. Utilisez des nouveau-nés âgés de 1 à 3 jours pour la culture cellulaire néonatale primaire33.
      NOTE: Pour l’étude présentée ici, Sprague Dawley hSOD1G93A et des rats non transgéniques ont été utilisés. Pour le génotypage, les queues de rats ont été utilisées pour l’extraction ultérieure de l’ADN et la PCR.
    2. Saupoudrez la tête du chiot avec de l’éthanol à 70% et décapitez-le immédiatement rapidement à l’aide de ciseaux.
    3. Coupez la peau à l’aide de ciseaux à petit angle pour exposer le crâne. Ouvrez le crâne en faisant une coupe du foramen magnum vers les orbites. Ensuite, faites une coupe perpendiculaire de la ligne médiane. Retirez le cerveau du crâne et placez-le dans une boîte de Petri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      REMARQUE: Nettoyez les outils entre les petits pour éviter la contamination croisée entre les chiots transgéniques et non transgéniques. L’isolement des cortex du reste du cerveau doit être fait sous un stéréomicroscope.
    4. À l’aide de la pointe de la pince, déchirez les connexions entre les deux hémisphères. Ensuite, séparez les hémisphères avec des pinces incurvées en poussant doucement un hémisphère du centre vers le côté.
    5. Retirez les méninges en les déchirant soigneusement avec des pinces droites et incurvées.
    6. Retirez l’hippocampe en le pinçant avec une pince incurvée. Jetez l’hippocampe ou utilisez-le pour une autre préparation de culture cellulaire.
      REMARQUE: D’autres étapes doivent être effectuées sous la hotte à flux laminaire pour assurer des conditions stériles.
  2. Homogénéisation et dissociation tissulaires
    1. Transférer un cortex dans un tube de 15 mL rempli de 3 mL de PBS froid. Pipeter la suspension de haut en bas avec un embout de 1 mL, en effectuant 10-15 coups jusqu’à ce que la suspension devienne homogène.
      REMARQUE: Soyez très prudent de ne pas produire de bulles dans ce processus.
    2. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3 mL de PBS froid en la pipetant de haut en bas avec un embout de 1 mL. Répétez l’étape de centrifugation.
      NOTA: Toutes les solutions utilisées à partir de ce point doivent être préchauffées à 37 °C.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) complet de Dulbecco, complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine). Transférer l’homogénat dans un tube de 2 mL.
    4. Passer l’homogénat à travers des aiguilles de 21 G et 23 G (trois fois chacune) pour faire une suspension de cellules individuelles.
      REMARQUE: Soyez très prudent de ne pas produire de bulles dans ce processus.
  3. Verser la suspension cellulaire préparée à partir d’un cortex dans une boîte de Petri de 60 mm de diamètre ou une fiole T25 (avec la surface prétraitée avec un revêtement polypeptidique pour la croissance des cellules adhérentes) contenant 3 mL de DMEM complet. Secouez légèrement la boîte de Petri afin que la suspension soit uniformément répartie.
  4. Cultiver les cellules dans l’incubateur dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2/95% d’air à 37 °C.
  5. Changez le milieu 48 h après l’isolement et remplacez le milieu tous les 3 jours.
  6. Pour favoriser la croissance des astrocytes, lorsque les cellules atteignent 70% à 80% de confluence, lavez-les avec du PBS préchauffé pour éliminer les cellules gliales faiblement attachées et les traces de FBS dans le milieu.
    1. Trypsiniser la couche sous-jacente des astrocytes en ajoutant 1 mL de solution de trypsine préchauffée (0,25% trypsine, 0,02% EDTA dans PBS, filtrée stérile).
    2. Placer le plat dans l’incubateur à 37 °C pendant 2-5 min.
    3. Vérifiez les cellules au microscope. Lorsqu’ils commencent à se détacher, ajoutez 4 mL de DMEM complet.
    4. Prélever la suspension cellulaire et la transférer dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu complet. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    6. Replaquer les cellules à une densité de 104 cellules/cm2 dans 5 mL de DMEM complet frais.
  7. Changez le milieu tous les 3 jours. Pour minimiser la présence d’autres types de cellules gliales, après que les astrocytes atteignent 50% de confluence et avant chaque remplacement de milieu, laver les cellules avec DMEM complet.
    1. Aspirer le milieu surnageant avec une pipette de 1 mL et le distribuer doucement sur la couche de cellules plusieurs fois. Assurez-vous que toute la surface de la couche cellulaire est couverte pendant cette étape de lavage.
  8. Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence (généralement après 14 jours), répétez la trypsinisation et la collecte des astrocytes comme décrit à l’étape 1.6.
  9. Semence 5 × 103 d’astrocytes sur une lamelle circulaire de verre de 7 mm recouverte de poly-L-lysine (50 μg/mL). Utilisez-les dans des expériences après 48 h.
  10. Pour favoriser la microglie, après l’étape 1.7, permettre aux cellules gliales d’atteindre une couche confluente34. Lorsque des cellules microgliales apparaissent au-dessus de la couche astrocytaire (après 10-15 jours, reconnues par leurs corps plus petits et plus ovales et leurs processus plus courts), agitez la boîte de Petri sur un agitateur orbital pendant 2 h à 220 tr / min.
  11. Dispersion et ensemencement des cellules microgliales
    1. Lavez légèrement les cellules détachées et lâchement attachées en aspirant le milieu surnageant avec un embout de pipette de 1 ml et distribuez-le doucement sur la couche de cellules plusieurs fois. Assurez-vous de couvrir toute la surface de la couche cellulaire pendant cette étape de lavage, de recueillir le fluide avec les cellules détachées et de le transférer dans un tube de 15 mL.
    2. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu.
    3. Passez la suspension cellulaire à travers une aiguille de 21 G pour obtenir une suspension unicellulaire.
      NOTE: La plupart des méthodes publiées utilisent la trypsine ou la papaïne pour dissocier le tissu; Cependant, les aiguilles de 21 G ont l’avantage d’empêcher la surdigestion des cellules, permettant une dissociation plus douce.
    4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Semer 5 × 103 cellules microgliales sur une enveloppe circulaire en verre de 7 mm recouverte de poly-L-lysine (50 μg/mL). Utilisez-les dans des expériences après 48 h.
      NOTE: Il est difficile d’obtenir une culture microgliale pure par agitation, car les cellules précurseurs des oligodendrocytes et les astrocytes peuvent encore être présents en nombre variable selon l’expérience de l’expérimentateur. Le protocole immunocytochimique utilisé pour estimer la présence de différentes populations cellulaires dans les cultures gliales a été décrit ailleurs35.

2. Immunocytochimie

  1. Rincer les cellules plaquées sur des lamelles de couverture dans PBS, 2 x 1 min.
  2. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min à température ambiante (RT).
  3. Laver en PBS 3 x 5 min.
  4. Incuber dans une solution de blocage contenant 10 % de sérum d’âne normal (NDS)/1 % d’albumine sérique bovine (BSA)/0,1 % de Triton X-100 pendant 45 min à TA.
    1. Ajouter 50 μL d’une solution de blocage par lamelle de couverture de 10 mm de diamètre.
  5. Préparer les anticorps primaires dans 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 dans les dilutions suivantes : souris anti-GFAP 1:300, chèvre anti-Iba1 1:500. Incuber les cellules avec des anticorps primaires pendant une nuit à +4 °C.
  6. Rincer dans PBS, 3 x 10 min.
  7. Incuber avec les anticorps secondaires conjugués à un fluorophore : âne anti-souris (excitation 488 nm [1:200)) ou âne anti-chèvre (excité à 647 nm [1:200)). Incuber les cellules pendant 2 h à RT dans l’obscurité.
  8. Lavage au PBS, 7 x 5 min.
  9. Incuber les cellules avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1:4 000) pendant 10 min à TA.
  10. Laver en PBS 5 x 5 min.
  11. Monter les lames de couverture sur des lames de microscope à l’aide d’une solution de montage; Utilisez une goutte de celui-ci par feuillet de couverture.
    REMARQUE : Les dilutions d’anticorps peuvent varier selon le producteur. Les utilisateurs doivent déterminer les dilutions optimales pour leurs expériences.

3. Imagerie vidéo accélérée

REMARQUE: Les solutions contenant le colorant fluorescent doivent être protégées de la lumière directe. Avant de commencer l’expérience d’imagerie, assurez-vous que la lamelle de couverture en verre ne bouge pas lorsque vous allumez la perfusion.

  1. Préparation des solutions et des cellules
    1. Préparer la solution extracellulaire (SEC) pour l’imagerie : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose et 10 mM HEPES. Ajustez le pH à 7,4. S’assurer que l’osmolarité est de 280-300 mOsm/kg et préparer le SEC sans Ca2+ : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES, et 0,1 mM EGTA.
    2. Préparer les solutions d’essai : 100 μM d’ATP dissous dans ECS, 1 μM Thg dans ECS sans Ca2+ et 0,1 mg/mL d’ALS IgG dans ECS8.
    3. Transférer une housse dans un plat avec ECS pour laver le DMEM complet. Préparer la solution de chargement de colorant en diluant 1 mM de solution mère de Fluo-4 AM avec ECS à la concentration finale de 5 μM de Fluo-4 AM.
      1. Placer la lamelle de couverture avec les cellules dans la solution de chargement de colorant pendant 30 min à TA dans l’obscurité. Lavez les cellules dans ECS pendant 20 min.
    4. Si les cellules ne sont pas suffisamment chargées (c.-à-d. si le niveau de fluorescence de base est trop faible - <5 % de la plage dynamique de la caméra avec un temps d’exposition supérieur à 400 ms), augmenter le temps de chargement jusqu’à 45 min à 1 h à 37 °C. Vous pouvez également mélanger la solution mère de Fluo-4 AM avec un volume égal de détergent à 20% (p / v) (Pluronic) dans du DMSO avant de diluer dans l’ECS, ce qui rend la concentration finale de Pluronic ~ 0,02%.
      NOTE: Les exemples expérimentaux de cette étude ont été réalisés avec des IgG humaines isolées à partir de sérums sanguins de patients SLA comme décrit précédemment 4,5,11. Chaque expérience a été réalisée avec des échantillons d’IgG d’un seul patient.
  2. Imagerie vidéo
    REMARQUE: Dans ce protocole, le système d’imagerie vidéo a été combiné avec une lampe à arc court au xénon, un système de polychromateur et un microscope à épifluorescence inversée équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau, la glycérine et l’huile. L’imagerie timelapse a été réalisée à l’aide d’un système d’appareil photo numérique.
    1. Allumez les composants de la configuration d’imagerie 15 min avant l’expérience pour permettre au système d’atteindre la température de fonctionnement.
    2. Placez la lamelle de recouvrement dans la chambre d’enregistrement avec 1 mL de solution de travail (ECS ou ECS sans Ca2+).
    3. Pour choisir le protocole d’imagerie approprié, ouvrez le logiciel d’imagerie et, dans le panneau Acquisition, choisissez les paires de filtres pour Fluo4-AM avec une longueur d’onde d’excitation à 480 nm, un miroir dichroïque à 505 nm et une longueur d’onde d’émission à 535 nm.
    4. Choisissez le champ de vision en prenant soin d’avoir un nombre constant de cellules tout au long de l’expérience. Régler le temps d’exposition et le gain du détecteur de manière appropriée, de manière à ce que le signal ne soit pas saturé. Choisissez le mode pseudocolor pour l’acquisition. Pour des instructions plus détaillées, reportez-vous au manuel fourni par le fabricant.
    5. Ajustez la fréquence d’échantillonnage à 1 Hz (1 image par seconde).
    6. Commencez l’imagerie en acquérant le niveau de fluorescence de base pendant 3-5 minutes pour la détermination de la ligne de base (F0). Assurer un flux constant de la solution de travail.
    7. Arrêtez le flux de la solution de travail et passez à la solution d’essai pendant la durée souhaitée (voir également les barres de temps dans les exemples de la Figure 2 et de la Figure 3). Entre chaque solution d’essai, laver les cellules avec un débit constant de la solution de travail pendant 3-5 min.
    8. Maintenir le volume de la solution dans la chambre d’enregistrement à ~1 mL en organisant une aspiration constante à partir du haut de la solution (voir Figure 2E).
      REMARQUE : Pour appliquer le traitement directement aux cellules imagées, un système d’administration personnalisé constitué d’une pipette en verre (0,8 mm de diamètre intérieur) a été placé à ~350 μm de distance et ~1 mm au-dessus des cellules, à un angle de 45° combiné avec le système d’échange de solution contenant des vannes à pincement et un contrôleur électronique de vanne (voir Figure 2E).

4. Analyse des données

  1. Définissez une région d’intérêt (ROI) qui correspond à la cellule individuelle.
    1. Choisissez l’image avec l’intensité du signal la plus élevée (c’est-à-dire à partir de l’application de l’ATP) et encerclez une cellule à l’aide de l’outil polygonal d’application. Répétez l’opération pour toutes les cellules du champ acquis. Choisissez cinq ROI en arrière-plan à l’aide de l’outil Cercle.
    2. Pour mesurer l’intensité moyenne du signal d’une seule cellule et l’arrière-plan pour chaque période, sélectionnez tous les ROI et utilisez la commande Multi Measure dans ROI Manager dans ImageJ ou toute commande équivalente dans les logiciels commerciaux (voir le Tableau des matériaux).
  2. Exportez les valeurs d’intensité du signal moyen des ROI sous forme de feuille de calcul.
  3. Faites la moyenne de cinq ROI d’arrière-plan et soustrayez l’arrière-plan moyen de chaque image de l’intensité moyenne de ROI de l’image acquise en même temps.
  4. Pour normaliser les données obtenues par rapport au signal de base, utilisez l’équation (1) :
    ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
    où F est l’intensité du signal de chaque période après la soustraction de fond, et F0 est la fluorescence Fluo-4 de base.
    REMARQUE : Un code sur mesure a été utilisé dans cette étude.
  5. Pour analyser l’activité calcique, déterminer plusieurs paramètres4 : l’amplitude du pic calcique (ΔF/F 0), le changement intégré (intégrale temporelle, surface sous l’enregistrement de la réponse) du calcium transitoire (ΔF/F 0 × s), le temps jusqu’au pic-temps écoulé entre le début de la stimulation et le maximum de transitoire(s) calcique(s), le temps d’élévation écoulé depuis le début de la stimulation jusqu’à la valeur de ΔF/F0 qui atteint 50%-80% de l’amplitude maximale (s), demi-largeur-pleine largeur d’un transitoire à demi-amplitude maximale (s), fréquence des réponses si elles sont répétitives (Hz).

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Representative Results

Caractérisation de différents types de cellules gliales en culture
Il faut généralement 15 à 21 jours pour produire des astrocytes pour les expériences, tandis que les cellules microgliales prennent 10 à 15 jours pour se développer. Une immunocoloration a été effectuée pour évaluer la pureté cellulaire de la culture. La figure 1 montre l’expression du double marquage du marqueur astrocytaire GFAP et du marqueur microglial Iba1 dans les cultures respectives.

L’imagerie calcique est connue pour révéler les différences dans la physiologie cellulaire des astrocytes sains et malades. Précédemment dans les astrocytes de type sauvage, nous avons démontré que les IgG de la SLA affectent le Ca2+ cellulaire en mobilisant les pools intra- et extracellulaires dans le cytosol8. Le protocole suivant a déterminé s’il y avait des différences entre les transitoires calciques dans hSOD1G93A et les astrocytes cultivés non transgéniques exposés de manière aiguë à des échantillons d’IgG de la SLA provenant de patients. Les astrocytes chargés de Fluo4-AM ont été perfusés avec ECS pendant 3 minutes pour obtenir une ligne de base stable. Ensuite, 100 μg/mL d’IgG ALS ont été appliqués dans le bain pendant 5 min. Les astrocytes ont été lavés avec ECS, puis 100 μM d’ATP ont été appliqués à la fin de chaque enregistrement pour tester la santé de chaque cellule et observer la réponse calcique à un stimulus standard.

Des traces représentatives de la figure 2A,B montrent que les astrocytes hSOD1G93A répondent aux IgG de la SLA avec une plus grande amplitude du transitoire calcique, un changement intégré global plus important et un temps de pointe plus court que les astrocytes non transgéniques. Ici, cependant, il faut faire preuve de prudence dans l’interprétation des données quantitatives lorsque des sondes Ca2+ à longueur d’onde unique telles que Fluo4-AM sont utilisées (voir la section de discussion). De plus, la forme de la réponse aux IgG de la SLA se distingue de la réponse à l’ATP (notez un transitoire plus rapide avec une plus grande amplitude dans les traces et une synchronicité cellulaire dans les images pseudo-couleur en réponse à l’ATP, Figure 2A,B).

Dans le but d’étudier plus avant l’origine des différences dans la réponse calcique aux IgG et à l’ATP de la SLA entre hSOD1G93A et les astrocytes non transgéniques, nous avons utilisé une approche pharmacologique pour manipuler les réserves internes de Ca 2+ pendant l’imagerie calcique en utilisant 1 μM Thg. Thg est un inhibiteur non sélectif du réticulum endoplasmique Ca2+ ATPase (SERCA), l’épuisement des réserves intracellulaires de Ca2+ presque immédiatement, ce qui se reflète dans un transitoire calcique de plusieurs minutes. Pour exclure l’effet du Ca2+ externe dans les phénomènes observés, le SEC privé de Ca2+ a été utilisé au cours de l’expérience. Après avoir enregistré le niveau basal de la fluorescence pendant 3 min, 1 μM Thg a été appliqué dans le bain pendant 2 min. Après l’épuisement du calcium induit par le Thg, les astrocytes ont été perfusés avec du SEC contenant du Ca2+ pour induire et surveiller le remplissage des réserves. Des traces représentatives de l’expérience décrite sont montrées à la figure 2C,D. Comme prévu, les astrocytes hSOD1G93A avaient un niveau plus élevé de Ca2+ dans les réserves, comme révélé par l’épuisement des réserves, indiquant une surcharge de cet ion. Un mécanisme similaire a été démontré dans des astrocytes cultivés de souris transgéniques SOD1G93A 36.

Imagerie calcique des cellules microgliales en culture
L’imagerie timelapse de microglies marquées avec Fluo-4 AM a été réalisée de la même manière que celle décrite pour les astrocytes (Figure 3B). Des cellules microgliales ont été perfusées avec ECS avec 2 mM Ca2+ pendant 3 minutes pour obtenir une ligne de base stable, suivie d’une application en bain de 100 μg / mL ALS IgG pendant 5 min, d’un lavage avec ECS et d’une stimulation avec 100 μM ATP. Fait intéressant, alors que les astrocytes répondent facilement aux IgG de la SLA, une grande majorité des cellules microgliales n’ont pas répondu aux IgG de la SLA (comme l’illustre une seule cellule microgliale réagissant avec un transitoire de calcium; trace rouge dans l’exemple de la figure 3A). Cependant, ils ont toujours répondu à l’ATP et de la même manière que les astrocytes (Figure 3A). Notons également un cas de transitoire Ca2+ spontané dans la trace cellulaire 2 (Figure 3A) qui ne doit pas être confondu avec une réponse induite.

Figure 1
Figure 1 : Astrocytes et microglies dans une culture primaire. Images confocales représentatives d’astrocytes (à gauche) en culture marquées à l’aide du GFAP (rouge) et de la microglie (à droite) dans une culture colorée avec Iba1 (vert). Le double étiquetage (GFAP/Iba1) a été utilisé pour indiquer la pureté de la culture. DAPI a été utilisé pour marquer les noyaux (bleu). Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : GFAP = protéine acide fibrillaire gliale; LBA1 = molécule ionisée d’adaptateur liant le calcium 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Exemple d’application de l’imagerie calcique dans une étude de physiopathologie des astrocytes (A) Un exemple représentatif d’une expérience d’imagerie calcique où les astrocytes hSOD1G93A ont été imagés pendant 5 minutes pour recueillir la fluorescence de base (« ligne de base »), suivie d’une application aiguë d’IgG de la SLA (0,1 mg / mL) pendant 5 minutes (« réponse aux IgG SLA ») et d’un traitement avec 100 μM d’ATP (« réponse à l’ATP »). Le panneau supérieur montre des images pseudo-colorées (l’intensité de la fluorescence est codée par couleur, où le noir correspond à une très faible intensité, tandis que le blanc marque les pixels avec la plus haute intensité; la relation couleur-intensité est représentée dans une barre de couleur à droite dans le panneau supérieur de B qui correspond à l’intensité de fluorescence d’une cellule individuelle dans chacun des segments de l’expérience ('baseline', « réponse aux IgG de la SLA » et « réponse à l’ATP »). Les lignes pointillées grises pointent vers les images pseudocolorées de points temporels spécifiques pour la trace de calcium représentative (en orange). La boîte grise au milieu de la trace calcique marque l’application de 5 minutes d’ALS IgG. Une barre noire sous la trace de calcium marque l’application de l’ATP. (B) Identique à (A) sauf pour les astrocytes non transgéniques (trace en bleu). (C) Une trace de calcium représentative (orange) dans l’astrocyte hSOD1G93A défiée par 1 μg/mL de thapsigargine (barre noire sous la trace) dans le SEC sans calcium, suivie de l’ajout de 2 mM Ca 2+ ('2 mM Ca2+', barre noire sous la trace). (D) Identique à (C) sauf pour l’astrocyte non transgénique (trace en bleu). Échelle d’amplitude = 100% ΔF/F0. Échelle de temps = 200 s. Barres d’échelle = 50 μm. (E) Schéma de la configuration expérimentale décrivant le mode personnalisé d’échange de solution et l’emplacement de la pipette pour l’application d’agents biochimiques. Abréviations : SLA = sclérose latérale amyotrophique; IgG = immunoglobuline G; Thg = thapsigargin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemple d’imagerie calcique de microglies en culture. (A) À gauche : Image en fond clair de microglies en culture. Comme il est difficile d’obtenir une culture microgliale pure, des astrocytes sont également présents ici (cellules polygonales plates plus grandes, voir exemple indiqué par pointe de flèche). Les microglies ramifiées (petit soma, processus proéminents) et amiboïdes (indiquées par des cases vertes et jaunes, respectivement) sont présentes dans la culture. Au milieu : Boîtes jaunes et cyan agrandies à partir de la gauche. Les lignes rouges, bleues et violettes marquent les ROI à partir desquels l’intensité de fluorescence moyenne au fil du temps est extraite. À droite : Traces de calcium de trois cellules dans le panneau du milieu. La couleur de la trace correspond à la couleur des ROI dans le panneau du milieu. Après imagerie de la fluorescence calcique de base (« fluorescence de base ») pendant 200 s, les cellules ont été exposées à une application aiguë d’IgG de la SLA (0,1 mg / mL) pendant 5 minutes (« réponse aux IgG SLA »), suivie de 100 μM d’ATP (« réponse à l’ATP »). La boîte grise au milieu de la trace calcique marque l’application de 5 minutes d’ALS IgG. La barre noire sous la trace de calcium marque l’application de l’ATP. Notez que seule la cellule 1 (trace rouge) représentant une grande minorité de cellules, a répondu aux IgG SLA, alors que toutes les cellules ont répondu à l’ATP. (B) Les images pseudo-colorées représentent l’intensité de fluorescence dans chacun des segments des enregistrements (« ligne de base », « réponse aux IgG SLA » et « réponse à l’ATP ») où les lignes pointillées orange pointent vers les points temporels spécifiques dans les traces de calcium représentatives (A, panneau de droite). Les cases vertes et oranges marquent la microglie amiboïde (comme dans A). La relation couleur-intensité est représentée dans une barre de couleur à droite. Échelle d’amplitude = 100% ΔF/F0. Échelle de temps = 100 s. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : SLA = sclérose latérale amyotrophique; IgG = immunoglobuline G; ROI = région d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Cet article présente la méthode de culture cellulaire primaire comme un outil rapide et « sur le budget » pour étudier différents aspects de la (physionomie) cellulaire tels que la SLA dans le modèle hSOD1G93A du rat. La technique convient donc à des études au niveau unicellulaire qui peuvent être extrapolées et étudiées plus avant à un niveau d’organisation plus élevé (c.-à-d. dans des tranches de tissu ou chez un animal vivant). La culture cellulaire en tant que technique, cependant, a quelques mises en garde. Il est très important de faire l’isolement des tissus cérébraux et la dissociation des cellules sur la glace et d’effectuer ces étapes et les étapes ultérieures d’isolement et de préparation dans les plus brefs délais. La contamination est un obstacle omniprésent qui peut être surmonté en utilisant un équipement bien stérilisé et en prenant un soin particulier à effectuer la dissociation tissulaire dans la hotte laminaire37. Il est également essentiel d’ensemencer la densité correcte des cellules. Si le nombre de cellules ensemencées est inférieur au nombre souhaité, cela ne favorisera pas la croissance et la propagation des cellules dans la boîte. Cependant, si les cellules sont trop denses, il y aura une concurrence entre elles pour les nutriments dans le milieu de croissance, et, par conséquent, plus de mort cellulaire. C’est pourquoi il est conseillé de compter les cellules dissociées avant l’ensemencement, au moins avant d’acquérir une certaine expérience concernant la relation correcte entre le tissu de départ et le volume de dissociation.

GFAP est un marqueur astrocytaire largement utilisé et est souvent utilisé pour évaluer la pureté de la culture cellulaire38,39. Cependant, seul le GFAP n’est pas suffisant pour étudier la réactivité des astrocytes . Il est conseillé de le combiner avec un marqueur de prolifération tel que Ki67 ou d’autres marqueurs astrocytaires (glutamine synthétase, aldolase-C ou aldéhyde déshydrogénase-1)18,38. Bien que ces techniques aient tendance à produire des cultures de type cellulaire glial pur, il faut faire preuve de prudence dans l’évaluation de la pureté des cellules de culture. Ceci est particulièrement important pour les cultures de cellules microgliales qui contiennent généralement des précurseurs d’oligodendrocytes ou astrocytes34. Les marqueurs spécifiques des cellules microgliales suscitent beaucoup d’intérêt. Le marqueur le plus utilisé est Iba1, mais d’autres marqueurs souvent utilisés, tels que les récepteurs de différenciation (CD68, CD45) et le récepteur de fractacine (CX3CR1), peuvent également être détectés dans d’autres cellules (pour plus de détails, voir40). Actuellement, les marqueurs les plus spécifiques de la microglie sont TMEM119 et le récepteur purinergique P2Y1241, bien qu’un article récent ait soulevé des préoccupations concernant la spécificité TMEM11942.

L’introduction de l’imagerie de cellules vivantes timelapse offre l’avantage de surveiller les processus cellulaires, tels que la signalisation Ca2+, en temps réel. De plus, la modulation du comportement cellulaire par l’application de différents agents chimiques (par exemple, Thg ici) donne des informations supplémentaires pour la description des voies et des messagers de signal activés dans une cellule saine ou un modèle de maladie cellulaire (isolé et cultivé ici à partir du rat hSOD1G93A ALS). Lorsque vous travaillez avec des colorants fluorescents perméables à la membrane cellulaire tels que Fluo-4 AM, il est essentiel de trouver la concentration et le temps d’incubation corrects pour que le colorant remplisse l’intérieur de la cellule. Si cela prend trop de temps, l’absorption du colorant peut être augmentée en maintenant les cellules dans un incubateur à 37 ° C. Dans les cas plus graves, un détergent doux (p. ex. Pluronic F-127) peut être utilisé dans la solution de chargement. Il n’est pas non plus conseillé d’obtenir ce qui précède en augmentant la concentration du colorant au-dessus de 10 μM. En fait, à des concentrations plus élevées, le colorant peut agir comme un tampon Ca 2+ et amortir l’amplitude du signal Ca2+.

Il convient également de mentionner qu’en plus du Fluo-4 et des colorants similaires à longueur d’onde unique, il existe des colorants ratiométriques sensibles au Ca 2+ (par exemple, Fura-2) qui émettent à une longueur d’onde de référence insensible à une mesure et à une longueur d’onde de référence Ca2+. De telles mesures sont donc insensibles au biais causé par la distribution inégale du colorant dans la cellule et aux modifications du trajet optique. Néanmoins, l’utilisation de colorants à une seule longueur d’onde, en particulier avec des indicateurs de haute affinité tels que Fluo-4, est recommandée dans les cas où des mesures relatives sont effectuées au sein du même échantillon, ou lorsque l’on suit principalement la dynamique du processus et non les changements réels de concentration en Ca2+ 43. Néanmoins, ces mesures ne peuvent pas être utilisées pour des données quantitatives en termes de concentration de Ca2+, et la prudence est nécessaire lors de l’interprétation des amplitudes à partir des données présentées à la figure 2.

Nous avons démontré ici comment l’utilisation de cette installation d’imagerie sur des cellules vivantes - astrocytes en culture - peut révéler des mécanismes intracellulaires subtils de physiopathologie tels que la reconstitution des réserves de Ca 2+ et l’entrée Ca2+ exploitée en magasin, qui sont perturbés dans le modèle ALS, conformément aux résultats précédents sur les cellules murines36. Cela pourrait alors expliquer une sensibilité plus élevée des astrocytes hSOD1G93A aux IgG de la SLA comme suggéré ici, ce qui pourrait potentialiser la progression de la pathologie. Pour comparer les mesures dans de telles expériences, il est conseillé d’avoir une densité cellulaire similaire dans le champ de vision et que les mêmes compartiments cellulaires soient pris pour les ROI (par exemple, soma vs processus).

Un exemple a été montré ici que les cellules microgliales ne répondaient pas aux IgG de la SLA avec la même vigueur que les astrocytes. Ceci est conforme à la découverte de la faible génération de peroxyde dans la lignée cellulaire microgliale lors du traitement par IgG de la SLA15. Dans l’ensemble, cette approche indique une réponse spécifique de la cellule aux IgG liée à la SLA, également un fait important réalisé grâce à l’utilisation de cultures cellulaires pures de microglie par rapport à l’astroglie. L’utilisation des cellules gliales issues de modèles de neurophysiopathologie ou dérivées de cellules souches pluripotentes inductibles de patients a l’avenir du biomarquage physiologique dans les maladies neuronales sévères telles que la SLA. Il serait donc essentiel de comprendre la signalisation fine Ca2+ comme l’empreinte digitale de l’état particulier de la maladie ou de distinguer différentes maladies excitotoxiques. À ces fins, une procédure d’apprentissage automatique doit être développée et les enregistrements de données catégorisés. De plus, ces cellules peuvent être cultivées en culture et ensemencées dans un dispositif microfluidique pour être utilisées pour le diagnostic ou la stratification de maladies neurodégénératives chez les patients en évoquant une réponse à divers facteurs humoraux de neuroinflammation (par exemple, sérums, IgG, LCR).

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le contrat n ° 451-03-9/2021-14 / 200178 du ministère de l’Éducation, des Sciences et du Développement technologique de la République de Serbie, le projet FENS - NENS Education and Training Cluster « Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation » et la subvention EC H2020 MSCA RISE #778405. Nous remercions Marija Adžić et Mina Perić pour avoir fourni les images immunohistochimiques et Danijela Bataveljić pour leur aide dans la rédaction de documents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube Sarstedt, Germany 62 554 502
2 mL tube Sarstedt, Germany 72.691
21 G needle Nipro, Japan HN-2138-ET
23 G needle Nipro, Japan HN-2338-ET
5 mL syringe Nipro, Japan SY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslip Menzel Glasser, Germany 630-2113
60 mm Petri dish ThermoFisher Sientific, USA 130181
ATP Sigma-Aldrich, Germany A9062
AxioObserver A1 Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumine Sigma-Aldrich, Germany B6917
Calcium chloride Sigma-Aldrich, Germany 2110
Centrifuge Eppendorf, Germany
DAPI Sigma-Aldrich, Germany 10236276001
D-glucose Sigma-Aldrich, Germany 158968
DMEM Sigma-Aldrich, Germany D5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody Invitrogen, USA A-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody Invitrogen, USA A-21202
EDTA Sigma-Aldrich, Germany EDS-100G
EGTA Sigma-Aldrich, Germany E4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera System Photometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 10500064
Fiji ImageJ Software Open source under the GNU General Public Licence
FITC filter set Chroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AM Molecular Probes, USA F14201
Goat anti-Iba1 Fujifilm Wako Chemicals, USA 011-27991
HEPES Biowest, France P5455
HighSpeed Solution Exchange System ALA Scientific Instruments, USA
Incubator Memmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chloride Sigma-Aldrich, Germany M2393
Matlab software Math Works, USA
Mouse anti-GFAP Merck Millipore, USA MAB360
Mowiol 40-88 Sigma-Aldrich, Germany 324590
Normal donkey serum Sigma-Aldrich, Germany D9663
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich, Germany 158127
Penicilin and Streptomycin ThermoFisher Sientific, USA 15140122
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich, Germany P5899
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Germany P5405
Potassium dihydrogen phosphate Carlo Erba Reagents, Spain 471686
Shaker DELFIA PlateShake PerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Germany S3817
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Germany S5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Carl ROTH GmbH X987.2
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich, Germany P5280
Thapsigargine Tocris Bioscience, UK 1138
Triton X - 100 Sigma-Aldrich, Germany T8787
Trypsin Sigma-Aldrich, Germany T4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging System Visitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator System Visitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setup Visitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lamp Ushio, Japan

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References

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Neurosciences numéro 184
Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique
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Milićević, K., Korenić, A., Milošević, M., Andjus, P. R. Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (184), e63483, doi:10.3791/63483 (2022).

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