Summary
Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1G93A .
Abstract
Este protocolo demuestra cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar estas células con el fin de estudiar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el modelo hSOD1G93A de rata. Primero, el protocolo muestra cómo aislar y cultivar astrocitos y microglia de cortezas de ratas postnatales, y luego cómo caracterizar y probar la pureza de estos cultivos mediante inmunocitoquímica utilizando el marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de los astrocitos y el marcador microglial ionizado de la molécula adaptadora de unión al calcio 1 (Iba1). En la siguiente etapa, se describen métodos para la carga de colorantes (Fluo 4-AM sensible al calcio) de células cultivadas y las grabaciones de cambios de Ca2+ en experimentos de imágenes de video en células vivas.
Los ejemplos de grabaciones de vídeo consisten en: (1) casos de imágenes de Ca2+ de astrocitos cultivados expuestos agudamente a inmunoglobulina G (IgG) aislados de pacientes con ELA, mostrando una respuesta característica y específica en comparación con la respuesta al ATP como se demostró en el mismo experimento. Los ejemplos también muestran un aumento transitorio más pronunciado en la concentración de calcio intracelular evocado por ALS IgG en astrocitos hSOD1G93A en comparación con los controles no transgénicos; (2) imágenes de Ca 2+ de astrocitos cultivados durante una depleción de las reservas de calcio por thapsigargin (Thg), un inhibidor no competitivo de la ATPasa del retículo endoplásmico Ca 2+, seguida de una entrada de calcio operada por el almacén provocada por la adición de calcio en la solución de registro, lo que demuestra la diferencia entre la operación de almacenamiento de Ca2+ en hSOD1G93A y en astrocitos no transgénicos; (3) Las imágenes de Ca 2+ de la microglía cultivada muestran predominantemente una falta de respuesta a la IgG de ELA, mientras que la aplicación de ATP provocó un cambio de Ca2+. Este documento también enfatiza posibles advertencias y precauciones con respecto a la densidad celular crítica y la pureza de los cultivos, eligiendo la concentración correcta del colorante Ca2+ y las técnicas de carga de colorante.
Introduction
Las técnicas de cultivo celular han dado lugar a numerosos avances en diversos campos de la neurofisiología celular en la salud y la enfermedad. En particular, los cultivos celulares primarios, recién aislados del tejido neuronal de un animal de laboratorio, permiten al experimentador estudiar de cerca el comportamiento de diversas células en diferentes medios bioquímicos y configuraciones fisiológicas. El uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como los colorantes sensibles al Ca2+ en combinación con la microscopía de video de lapso de tiempo, proporciona una mejor comprensión de los procesos biofísicos y bioquímicos celulares en tiempo real.
La ELA es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores1. La enfermedad tiene una patogénesis compleja de tipo familiar, pero principalmente de forma esporádica (90% de los casos)2. Es bien sabido que los mecanismos autónomos no celulares contribuyen a la fisiopatología de la ELA, principalmente debido al papel esencial de las células gliales3. La ELA también se caracteriza bien como una enfermedad neuroinflamatoria con la participación de factores humorales y celulares de inflamación.
La inmunoglobulina G es ampliamente utilizada como marcador molecular en la ELA y otras enfermedades neurodegenerativas. El estudio del nivel sérico de este marcador puede indicar la presencia y el estadio de la neuroinflamación en la enfermedad 4,5,6, mientras que su presencia en el líquido cefalorraquídeo puede indicar una ruptura de la barrera hematoencefálica7. Las IgG también fueron identificadas como depósitos en las neuronas motoras de la médula espinal de pacientes con ELA7. Sin embargo, este abordaje ha mostrado algunas inconsistencias en la correlación del nivel de IgG con el estadio y las características de la enfermedad6.
La IgG aislada de sueros de pacientes con ELA (ALS IgG) puede inducir una respuesta al calcio enastrocitos 8 naïve y la liberación de glutamato en las neuronas, apuntando a un efecto excitotóxico, un sello distintivo de la patología de ELA9. Sin embargo, los estudios en el modelo de rata hSOD1G93A ALS (que contiene múltiples copias de la mutación SOD1 humana10) mostraron una serie de marcadores de estrés oxidativo en células neurogliales cultivadas 11, tejidos 12,13,14 o animales vivos 13. Cabe destacar que los astrocitos cultivados del modelo de rata ALS fueron más propensos al estrés oxidativo inducido por el peróxido que la astroglía de compañeros de camada no transgénicos11.
Las células microgliales en cultivo se ven afectadas por la ELA IgG de una manera menos aparente. A saber, una línea celular microglial BV-2 mostró un aumento en la señal de marcadores fluorescentes de estrés oxidativo en respuesta a la aplicación de solo 4/11 muestras de pacientes con ELAIgG 15. Es bien sabido que la microglía participa en muchas patologías neuroinflamatorias, añadiendo estrés oxidativo y fase de progresión tardía en el mecanismo autónomo no celular de ALS16,17. Sin embargo, los datos con ALS IgG indicaron que estas células pueden no ser tan reactivas como los astrocitos a estos factores humorales de la inflamación de la ELA. Se han realizado varios estudios con astrocitos primarios de modelos murinos de ELA, no solo en cachorros sino también en animales sintomáticos, ya sea en el cerebro o en la médula espinal 18,19,20,21. Esto también es cierto para los cultivos primarios microgliales, aunque en menor medida que los astrocitos y principalmente de regiones cerebrales en la etapa embrionaria22,23,24.
Utilizamos imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ en células en cultivo principalmente como un medio para seguir los transitorios intracelulares de este ion como un marcador fisiológico de excitotoxicidad. Así, mediante la caracterización biofísica de estos transitorios (amplitud, área bajo transitorio, tiempo de subida, frecuencia) el investigador puede obtener parámetros diagnósticos experimentales a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneración. Por lo tanto, esta técnica ofrece una ventaja de una evaluación fisiológica cuantitativa de IgG como biomarcadores de enfermedades. Existe una gran cantidad de literatura sobre el papel de las IgG y el Ca2+ en la inducción de la ELA. La mayoría de estos estudios se realizaron mediante la inducción de ELA mediante la inyección de IgG de pacientes en animales de experimentación 25,26,27,28,29, que luego mostraron elevación intracelular de Ca 2+ y depósitos de IgG. Una línea de estudios exploró el efecto de las IgG de ELA en la sinapsis motora in vitro30,31,32. En el contexto anterior, la técnica presentada aquí pone el foco en las células gliales como actores importantes en el mecanismo autónomo no celular de la ELA y cuantifica su potencial respuesta excitotóxica a las IgG como factores humorales de neuroinflamación. Este enfoque puede tener una aplicación más amplia en la prueba de otros factores humorales como sueros enteros, LCR o citoquinas en diferentes sistemas de cultivo celular y en modelos celulares de inflamación general.
Este documento describe cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar aún más estas células para estudiar la fisiopatología de la ELA con IgG derivada de sueros del paciente. Los protocolos se detallan para la carga de colorante de células cultivadas (Figura 1) y las grabaciones de cambios de Ca2+ en experimentos de imágenes de video de lapso de tiempo. Ejemplos de grabaciones de video mostrarán cómo reaccionan las células gliales a la IgG ALS en comparación con el ATP, este último activando los receptores de membrana purinérgica. Se muestra por primera vez un ejemplo de cómo los astrocitos aislados del cerebro de rata hSOD1G93A ALS reaccionan con una respuesta de Ca 2+ más pronunciada a la IgG de ELA en comparación con los controles no transgénicos y cómo relacionar este proceso con las diferencias en la operación de almacenamiento de Ca2+. También se muestra un ejemplo de imágenes de calcio en células microgliales con un desafío agudo con ELA IgG, con solo una respuesta modesta de calcio intracelular.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas de la UE sobre la protección de los animales con fines científicos y con el permiso de la Comisión de Ética de la Facultad de Biología de la Universidad de Belgrado (número de aprobación EK-BF-2016/08). En cuanto al material del paciente (sueros para IgGs), se recolectó para el examen clínico de rutina con el consentimiento informado del paciente de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) para experimentos con humanos. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Clínico de Serbia (No. 850/6).
1. Preparación del cultivo celular primario
- Aislamiento del tejido cerebral
NOTA: El aislamiento debe realizarse en hielo, utilizando soluciones heladas.- Utilizar cachorros recién nacidos de 1 a 3 días de edad para cultivo celular neonatal primario33.
NOTA: Para el estudio aquí presentado, se utilizó Sprague Dawley hSOD1G93A y ratas no transgénicas. Para el genotipado, se utilizaron colas de rata para la posterior extracción de ADN y PCR. - Espolvorea la cabeza del cachorro con etanol al 70% e inmediatamente decapitarla rápidamente usando tijeras.
- Abra la piel con tijeras de ángulo pequeño para exponer el cráneo. Abra el cráneo haciendo un corte desde el foramen magnum hacia las órbitas. A continuación, haga un corte perpendicular en la línea media. Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: Limpie las herramientas entre cachorros para evitar la contaminación cruzada entre cachorros transgénicos y no transgénicos. El aislamiento de las cortezas del resto del cerebro debe hacerse bajo un microscopio estereoscópico. - Usando la punta de los fórceps, rasgue las conexiones entre ambos hemisferios. Luego, separe los hemisferios con pinzas curvas empujando suavemente un hemisferio desde el centro hacia un lado.
- Retire las meninges rasgándolas cuidadosamente con fórceps rectas y curvas.
- Retire el hipocampo pellizcándolo con un fórceps curvo. Deseche el hipocampo o úselo para otra preparación de cultivo celular.
NOTA: Se deben realizar pasos adicionales debajo de la campana de flujo laminar para garantizar condiciones estériles.
- Utilizar cachorros recién nacidos de 1 a 3 días de edad para cultivo celular neonatal primario33.
- Homogeneización y disociación tisular
- Transfiera una corteza a un tubo de 15 ml lleno de 3 ml de PBS frío. Pipet la suspensión hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 mL, completando 10-15 golpes hasta que la suspensión se vuelva homogénea.
NOTA: Tenga mucho cuidado de no producir burbujas en este proceso. - Centrifugar a 500 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de PBS frío pipeteándolo hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 ml. Repita el paso de centrifugación.
NOTA: Todas las soluciones utilizadas a partir de este punto deben precalentarse a 37 °C. - Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de medio de águila modificado (DMEM) completo de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y antibióticos (penicilina y estreptomicina). Transfiera el homogeneizado a un tubo de 2 ml.
- Pase el homogeneizado a través de agujas de 21 G y 23 G (tres veces cada una) para hacer una suspensión de células individuales.
NOTA: Tenga mucho cuidado de no producir burbujas en este proceso.
- Transfiera una corteza a un tubo de 15 ml lleno de 3 ml de PBS frío. Pipet la suspensión hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 mL, completando 10-15 golpes hasta que la suspensión se vuelva homogénea.
- Verter la suspensión celular preparada a partir de una corteza en una placa de Petri de 60 mm de diámetro o en un matraz T25 (con la superficie pretratada con un recubrimiento polipeptídico para el crecimiento de células adherentes) que contenga 3 ml de DMEM completo. Agite ligeramente la placa de Petri para que la suspensión se distribuya uniformemente.
- Cultivar las células en la incubadora en una atmósfera humidificada de 5% de CO2/95% de aire a 37 °C.
- Cambie el medio 48 h después del aislamiento y reemplace el medio cada 3 días.
- Para promover el crecimiento de astrocitos, cuando las células alcanzan una confluencia del 70% -80%, lávelas con PBS precalentado para eliminar las células gliales sueltas y los rastros de FBS en el medio.
- Tripsinizar la capa subyacente de astrocitos añadiendo 1 ml de solución de tripsina precalentada (tripsina al 0,25%, EDTA al 0,02% en PBS, filtrada estéril).
- Colocar el plato en la incubadora a 37 °C durante 2-5 min.
- Revise las células bajo el microscopio. Cuando comiencen a desprenderse, agregue 4 ml de DMEM completo.
- Recoja la suspensión celular y transfiérala a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 500 × g durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio completo. Contar las células con un hemocitómetro.
- Replacar las células a una densidad de 104 células/cm2 en 5 ml de DMEM completo fresco.
- Cambiar el medio cada 3 días. Para minimizar la presencia de otros tipos de células gliales, después de que los astrocitos alcancen el 50% de confluencia y antes de cada reemplazo de medios, lave las células con DMEM completo.
- Aspirar el medio sobrenadante con una pipeta de 1 ml y dispensar suavemente sobre la capa de células varias veces. Asegúrese de que toda la superficie de la capa celular esté cubierta durante este paso de lavado.
- Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia (generalmente después de 14 días), repita la tripsinización y la recolección de astrocitos como se describe en el paso 1.6.
- Semilla 5 × 103 de astrocitos en un cubreobjetos de vidrio circular de 7 mm recubierto con poli-L-lisina (50 μg/ml). Úsalos en experimentos después de 48 h.
- Para promover la microglía, después del paso 1.7, permita que las células gliales alcancen una capa confluente34. Cuando las células microgliales aparezcan en la parte superior de la capa de astrocitos (después de 10-15 días, reconocidas por sus cuerpos más pequeños y ovalados y procesos más cortos), agite la placa de Petri en un agitador orbital durante 2 h a 220 rpm.
- Dispersión y siembra de células microgliales
- Lave ligeramente las células desprendidas y sueltas aspirando el medio sobrenadante con una punta de pipeta de 1 ml y dispense suavemente sobre la capa de células varias veces. Asegúrese de cubrir toda la superficie de la capa celular durante este paso de lavado, recoja el medio con las células desprendidas y transfiéralo a un tubo de 15 ml.
- Centrifugar a 500 × g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio.
- Pase la suspensión celular a través de una aguja de 21 G para obtener una suspensión de una sola celda.
NOTA: La mayoría de los métodos publicados utilizan tripsina o papaína para disociar el tejido; sin embargo, las agujas de 21 G tienen la ventaja de prevenir la sobredigestión de las células, lo que permite una disociación más suave. - Contar las células con un hemocitómetro. Semilla 5 × 103 células microgliales en un cubreobjetos de vidrio circular de 7 mm recubierto con poli-L-lisina (50 μg/ml). Úsalos en experimentos después de 48 h.
NOTA: Es difícil obtener un cultivo microglial puro por agitación, ya que las células precursoras de oligodendrocitos y los astrocitos todavía pueden estar presentes en un número variable dependiendo de la experiencia del experimentador. El protocolo inmunocitoquímico utilizado para estimar la presencia de diferentes poblaciones celulares en cultivos gliales ha sido descrito en otra parte35.
2. Inmunocitoquímica
- Enjuague las celdas chapadas en cubreobjetos en PBS, 2 x 1 min.
- Fijar las células en paraformaldehído al 4% durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
- Lavar en PBS 3 x 5 min.
- Incubar en una solución bloqueante que contenga 10% de suero de burro normal (NDS)/1% de albúmina sérica bovina (BSA)/0,1% de Triton X-100 durante 45 min a RT.
- Añadir 50 μL de solución de bloqueo por cubreobjetos de 10 mm de diámetro.
- Preparar anticuerpos primarios en 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 en las siguientes diluciones: ratón anti-GFAP 1:300, cabra anti-Iba1 1:500. Incubar las células con anticuerpos primarios durante la noche a +4 °C.
- Enjuagar en PBS, 3 x 10 min.
- Incubar con los anticuerpos secundarios conjugados con un fluoróforo: burro anti-ratón (excitación 488 nm [1:200)) o burro anti-cabra (excitado a 647 nm [1:200)). Incubar las células durante 2 h a RT en la oscuridad.
- Lavar en PBS, 7 x 5 min.
- Incubar las células con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:4.000) durante 10 min a RT.
- Lavar en PBS 5 x 5 min.
- Monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio utilizando una solución de montaje; Use una gota por cubreobjetos.
NOTA: Las diluciones de anticuerpos pueden variar dependiendo del productor. Los usuarios deben determinar diluciones óptimas para sus experimentos.
3. Imágenes de video de lapso de tiempo
NOTA: Las soluciones que contienen el tinte fluorescente deben protegerse de la luz directa. Antes de comenzar el experimento de imágenes, asegúrese de que el cubreobjetos de vidrio no se mueva al encender la perfusión.
- Preparación de soluciones y células
- Preparar la solución extracelular (ECS) para la obtención de imágenes: 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCal 2, 2 mM de MgCl2, 10 mM de D-glucosa y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4. Asegúrese de que la osmolaridad sea de 280-300 mOsm/kg y prepare ECS sin Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosa, 10 mM HEPES y 0.1 mM EGTA.
- Preparar las soluciones de prueba: 100 μM ATP disuelto en ECS, 1 μM Thg en ECS sin Ca2+ y 0,1 mg/mL ALS IgG en ECS8.
- Transfiera un cubreobjetos a un plato con ECS para lavar el DMEM completo. Preparar la solución de carga de colorante diluyendo 1 mM de solución madre de Fluo-4 AM con ECS hasta la concentración final de 5 μM de Fluo-4 AM.
- Coloque el cubreobjetos con células en la solución de carga de tinte durante 30 minutos a RT en la oscuridad. Lave las celdas en ECS durante 20 min.
- Si las células no están cargadas adecuadamente (es decir, si el nivel basal de fluorescencia es demasiado bajo, <5% del rango dinámico de la cámara con un tiempo de exposición superior a 400 ms), aumente el tiempo de carga hasta 45 min a 1 h a 37 °C. Alternativamente, mezcle la solución madre de Fluo-4 AM con un volumen igual de detergente al 20% (p/v) (Pluronic) en DMSO antes de diluir en ECS, haciendo que la concentración final de Pluronic sea ~0.02%.
NOTA: Los ejemplos experimentales de este estudio se realizaron con IgG humana aislada de sueros sanguíneos de pacientes con ELA como se describió anteriormente 4,5,11. Cada experimento se realizó con muestras de IgG de un solo paciente.
- Imágenes de vídeo
NOTA: En este protocolo, el sistema de imágenes de video se combinó con una lámpara de arco corto de xenón, un sistema policromador y un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con agua, glicerina y objetivo de inmersión en aceite. Las imágenes de lapso de tiempo se realizaron utilizando un sistema de cámara digital.- Encienda los componentes de la configuración de imágenes 15 minutos antes del experimento para permitir que el sistema alcance la temperatura de trabajo.
- Coloque el cubreobjetos en la cámara de grabación con 1 ml de solución de trabajo (ECS o ECS sin Ca2+).
- Para elegir el protocolo de imágenes correcto, abra el software de imágenes y, en el panel Adquisición, elija los pares de filtros para Fluo4-AM con una longitud de onda de excitación a 480 nm, un espejo dicroico a 505 nm y una longitud de onda de emisión a 535 nm.
- Elija el campo de visión teniendo cuidado de tener un número constante de células a lo largo del experimento. Ajuste el tiempo de exposición y la ganancia del detector adecuadamente, de tal manera que la señal no esté saturada. Elija el modo pseudocolor para la adquisición. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte el manual proporcionado por el fabricante.
- Ajuste la frecuencia de muestreo a 1 Hz (1 fotograma por segundo).
- Comience la imagen adquiriendo el nivel basal de fluorescencia durante 3-5 minutos para la determinación de la línea de base (F0). Asegurar un flujo constante de la solución de trabajo.
- Detenga el flujo de la solución de trabajo y cambie a la solución de prueba durante el período de tiempo deseado (consulte también las barras de tiempo en los ejemplos de la Figura 2 y la Figura 3). Entre cada solución de prueba, lave las celdas con un flujo constante de la solución de trabajo durante 3-5 minutos.
- Mantenga el volumen de la solución en la cámara de grabación en ~1 ml organizando una succión constante desde la parte superior de la solución (ver Figura 2E).
NOTA: Para aplicar el tratamiento directamente a las células fotografiadas, se colocó un sistema de administración personalizado hecho de una pipeta de vidrio (0,8 mm de diámetro interior) a ~350 μm de distancia y ~1 mm por encima de las células, en un ángulo de 45° combinado con el sistema de intercambio de solución que contiene válvulas de pellizco y un controlador electrónico de válvulas (ver Figura 2E).
4. Análisis de datos
- Defina una región de interés (ROI) que corresponda a la celda individual.
- Elija la trama con la intensidad de señal más alta (es decir, de la aplicación de ATP) y rodee una celda utilizando la herramienta poligonal de aplicación. Repita para todas las células en el campo adquirido. Elija cinco ROI en segundo plano con la herramienta Círculo.
- Para medir la intensidad media de la señal de una sola celda y el fondo para cada período de tiempo, seleccione todos los ROI y utilice el comando Multimedida en ROI Manager en ImageJ o cualquier comando equivalente en software comercial (consulte la Tabla de materiales).
- Exporte los valores medios de intensidad de señal de los ROI como una hoja de cálculo.
- Promedia cinco ROI de fondo y resta el fondo promediado de cada fotograma de la intensidad media del ROI del fotograma adquirido al mismo tiempo.
- Para normalizar los datos obtenidos a la señal de referencia, use la ecuación (1):
ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
donde F es la intensidad de la señal de cada marco de tiempo después de la resta de fondo, y F0 es la fluorescencia Fluo-4 de referencia.
NOTA: En este estudio se utilizó un código personalizado. - Para analizar la actividad del calcio, determine varios parámetros4: la amplitud del pico de calcio (ΔF / F 0), el cambio integrado (tiempo integral, superficie bajo el registro de respuesta) del transitorio de calcio (ΔF / F 0 × s), el tiempo transcurrido hasta el pico transcurrido desde el inicio de la estimulación hasta el máximo de calcio transitorio (s), aumento del tiempo transcurrido desde el inicio de la estimulación hasta el valor de ΔF / F 0 que alcanza el 50%-80% de la(s) amplitud(es) máxima(s), anchura-anchura completa de un transitorio a amplitud (s) media-máxima(s), frecuencia de respuestas si son repetitivas (Hz).
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Representative Results
Caracterización de diferentes tipos de células gliales en cultivo
Por lo general, toma de 15 a 21 días producir astrocitos para experimentos, mientras que las células microgliales tardan de 10 a 15 días en crecer. Se realizó inmunotinción para evaluar la pureza celular del cultivo. La Figura 1 muestra la expresión del doble marcaje del marcador astrocítico GFAP y el marcador microglial Iba1 en cultivos respectivos.
Se sabe que las imágenes de calcio revelan las diferencias en la fisiología celular de los astrocitos sanos y enfermos. Previamente en astrocitos de tipo salvaje, demostramos que la ELA IgG afecta al Ca2+ celular mediante la movilización de piscinas intra y extracelulares en el citosol8. El siguiente protocolo determinó si había diferencias entre los transitorios de calcio en hSOD1G93A y los astrocitos cultivados no transgénicos expuestos de forma aguda a muestras de IgG ALS de pacientes. Los astrocitos cargados con Fluo4-AM se perfundieron con ECS durante 3 min para obtener una línea de base estable. A continuación, se aplicaron 100 μg/ml de ALS IgG en el baño durante 5 min. Los astrocitos se lavaron con ECS, y luego se aplicaron 100 μM de ATP al final de cada registro para probar la salud de cada célula y observar la respuesta del calcio a un estímulo estándar.
Las trazas representativas en la Figura 2A,B muestran que los astrocitos hSOD1G93A responden a la IgG ALS con una mayor amplitud del transitorio de calcio, un cambio integrado general más grande y un tiempo hasta el pico más corto que los astrocitos no transgénicos. Aquí, sin embargo, se debe tener cuidado al interpretar datos cuantitativos cuando se utilizan sondas de Ca2+ de longitud de onda única como Fluo4-AM (consulte la sección de discusión). Además, la forma de la respuesta a ALS IgG se distingue de la respuesta a ATP (nótese un transitorio más rápido con una mayor amplitud en las trazas y sincronicidad celular en imágenes pseudocolor en respuesta a ATP, Figura 2A,B).
Con el objetivo de estudiar más a fondo el origen de las diferencias en la respuesta del calcio a ALS IgG y ATP entre hSOD1G93A y astrocitos no transgénicos, utilizamos un enfoque farmacológico para manipular las reservas internas de Ca 2+ durante las imágenes de calcio mediante el uso de 1 μM Thg. Thg es un inhibidor no selectivo del retículo endoplásmico Ca2+ ATPasa (SERCA), agotar las reservas intracelulares de Ca2+ casi de inmediato, lo que se refleja en un transitorio de calcio que dura varios minutos. Para excluir el efecto del Ca 2+ externo en los fenómenos observados, se utilizó ECS privado de Ca2+ durante el experimento. Después de registrar el nivel basal de la fluorescencia durante 3 min, se aplicó 1 μM Thg en el baño durante 2 min. Después del agotamiento de calcio inducido por Thg, los astrocitos se perfundieron con ECS que contenía Ca2+ para inducir y monitorear el rellenado de las tiendas. Las trazas representativas del experimento descrito se muestran en la Figura 2C, D. Como era de esperar, los astrocitos hSOD1G93A tenían un nivel más alto de Ca2+ en las tiendas, como lo revela el agotamiento de la tienda, lo que indica una sobrecarga de este ion. Un mecanismo similar ha sido demostrado en astrocitos cultivados de ratones transgénicos SOD1G93A 36.
Imágenes de calcio de células microgliales en cultivo
Las imágenes de lapso de tiempo de la microglía marcada con Fluo-4 AM se realizaron de la misma manera que se describió para los astrocitos (Figura 3B). Las células microgliales se perfundieron con ECS con 2 mMCa 2+ durante 3 min para obtener una línea de base estable, seguido de la aplicación en baño de 100 μg / ml ALS IgG durante 5 min, lavado con ECS y estimulación con 100 μM ATP. Curiosamente, mientras que los astrocitos responden fácilmente a la ELA IgG, una gran mayoría de las células microgliales no respondieron a la ELA IgG (como se ilustra con una sola célula microglial que reacciona con un transitorio de calcio; rastro rojo en el ejemplo de la Figura 3A). Sin embargo, siempre respondieron al ATP y de manera similar a los astrocitos (Figura 3A). Nótese también un caso de un transitorio espontáneo de Ca2+ en la traza celular 2 (Figura 3A) que no debe confundirse con una respuesta inducida.
Figura 1: Astrocitos y microglía en un cultivo primario. Imágenes confocales representativas de astrocitos (izquierda) en cultivo etiquetadas con GFAP (rojo) y microglía (derecha) en un cultivo teñido con Iba1 (verde). Se utilizó doble etiquetado (GFAP/Iba1) para indicar la pureza del cultivo. DAPI se utilizó para etiquetar los núcleos (azul). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: GFAP = proteína ácida fibrilar glial; LBa1 = molécula 1 adaptadora ionizada de unión al calcio; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un ejemplo de aplicación de imágenes de calcio en un estudio de fisiopatología de astrocitos. (A) Un ejemplo representativo de un experimento de imágenes de calcio en el que se tomaron imágenes de astrocitos hSOD1G93A durante 5 minutos para recoger la fluorescencia basal («línea de base»), seguida de una aplicación aguda de IgG de ELA (0,1 mg/ml) durante 5 min («respuesta a la IgG de ELA») y un tratamiento con ATP de 100 μM («respuesta al ATP»). El panel superior muestra imágenes pseudocolor (la intensidad de la fluorescencia está codificada por colores, donde el negro corresponde a una intensidad muy baja, mientras que el blanco marca los píxeles con mayor intensidad; la relación color-intensidad se representa en una barra de color a la derecha en el panel superior de B que corresponde a la intensidad de fluorescencia de una celda individual en cada uno de los segmentos del experimento ('línea de base', «respuesta a la IgG de ELA» y «respuesta a la ATP»). Las líneas discontinuas grises apuntan a las imágenes pseudocolor de puntos de tiempo específicos para la traza de calcio representativa (en naranja). El cuadro gris en el centro de la traza de calcio marca la aplicación de 5 minutos de ALS IgG. La barra negra debajo de la traza de calcio marca la aplicación de ATP. (B) Igual que en (A) excepto para los astrocitos no transgénicos (traza en azul). (C) Una traza representativa de calcio (naranja) en el astrocito hSOD1G93A desafiado con 1 μg/ml de thapsigargin (barra negra debajo de la traza) en ECS sin calcio, seguido de la adición de 2 mM Ca 2+ ('2 mM Ca2+', barra negra debajo de la traza). (D) Igual que en (C) excepto para el astrocito no transgénico (traza está en azul). Escala de amplitud = 100% ΔF/F0. Escala de tiempo = 200 s. Barras de escala = 50 μm. (E) Esquema de la configuración experimental que representa el modo personalizado de intercambio de solución y la colocación de la pipeta para la aplicación de agentes bioquímicos. Abreviaturas: ELA = esclerosis lateral amiotrófica; IgG = inmunoglobulina G; Thg = thapsigargin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un ejemplo de imágenes de calcio de microglia cultivada. (A) Izquierda: Imagen de campo claro de microglia cultivada. Dado que es difícil obtener un cultivo microglial puro, los astrocitos también están presentes aquí (células poligonales planas más grandes, ver ejemplo indicado por punta de flecha). Tanto la microglía ramificada (soma pequeño, procesos prominentes) como la microglía ameboide (indicada con cajas verdes y amarillas, respectivamente) están presentes en el cultivo. Medio: Cajas amarillas y cian ampliadas desde la izquierda. Las líneas rojas, azules y violetas marcan los ROI de los que se extrae la intensidad media de fluorescencia a lo largo del tiempo. Derecha: Trazas de calcio de tres celdas en el panel central. El color de la traza corresponde al color de los ROI en el panel central. Después de obtener imágenes de la fluorescencia de calcio basal ("fluorescencia basal") durante 200 s, las células se expusieron a una aplicación aguda de IgG ALS (0,1 mg / ml) durante 5 min ("respuesta a la IgG de ELA"), seguida de ATP de 100 μM («respuesta a ATP»). El cuadro gris en el centro de la traza de calcio marca la aplicación de 5 minutos de ALS IgG. La barra negra debajo de la traza de calcio marca la aplicación de ATP. Tenga en cuenta que solo la célula 1 (rastro rojo) que representa una gran minoría de células, respondió a la ELA IgG, mientras que todas las células respondieron al ATP. (B) Las imágenes pseudocolor representan la intensidad de fluorescencia en cada uno de los segmentos de las grabaciones ('línea de base', 'respuesta a ALS IgG' y 'respuesta a ATP') donde las líneas discontinuas naranjas apuntan a los puntos de tiempo específicos en las trazas de calcio representativas (A, panel derecho). Las cajas verdes y naranjas marcan la microglía ameboide (igual que en A). La relación color-intensidad se representa en una barra de color a la derecha. Escala de amplitud = 100% ΔF/F0. Escala de tiempo = 100 s. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: ELA = esclerosis lateral amiotrófica; IgG = inmunoglobulina G; ROI = región de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo presenta el método de cultivo de células primarias como una herramienta rápida y "dentro del presupuesto" para estudiar diferentes aspectos de la (fisio)fisiología celular, como la ELA en el modelo hSOD1G93A de rata. Por lo tanto, la técnica es adecuada para estudios a nivel unicelular que pueden extrapolarse e investigarse más a fondo a un nivel superior de organización (es decir, en rodajas de tejido o en un animal vivo). El cultivo celular como técnica, sin embargo, tiene algunas advertencias. Es más crítico hacer el aislamiento del tejido cerebral y la disociación de las células en hielo y realizar estas y las etapas posteriores de aislamiento y preparación en el menor tiempo posible. La contaminación es un obstáculo siempre presente que puede superarse utilizando equipos bien esterilizados y teniendo especial cuidado en la disociación de tejidos en la campana laminar37. También es fundamental sembrar la densidad correcta de las células. Si el número de células sembradas es menor que el número deseado, esto no apoyará el crecimiento celular y la propagación en el plato. Sin embargo, si las células son demasiado densas, habrá competencia entre ellas por los nutrientes en el medio de crecimiento y, por lo tanto, más muerte celular. Es por eso que es aconsejable contar las células disociadas antes de la siembra, al menos antes de que se adquiera algo de experiencia con respecto a la relación correcta del tejido de partida y el volumen de disociación.
GFAP es un marcador de astrocitos ampliamente utilizado y se utiliza a menudo para evaluar la pureza del cultivo celular38,39. Sin embargo, solo GFAP no es suficiente cuando se estudia la reactividad de los astrocitos. Se aconseja combinarlo con un marcador de proliferación como Ki67 u otros marcadores de astrocitos (glutamina sintetasa, aldolasa-C o aldehído deshidrogenasa-1)18,38. Aunque estas técnicas tienden a producir cultivos puros de tipo de células gliales, se debe tener cuidado al evaluar la pureza de las células de cultivo. Esto es de particular importancia para los cultivos de células microgliales que generalmente contienen algunos precursores de oligodendrocitos o astrocitos34. Los marcadores específicos para las células microgliales atraen mucho interés. El marcador más utilizado es Iba1, pero otros marcadores de uso frecuente, como los receptores de diferenciación (CD68, CD45) y el receptor de fractalcinas (CX3CR1), también se pueden detectar en otras células (para más detalles, ver40). Actualmente, los marcadores más específicos para la microglía son TMEM119 y el receptor purinérgico P2Y1241, aunque un artículo reciente ha planteado preocupación con respecto a la especificidad de TMEM11942.
La introducción de imágenes de células vivas timelapse ofrece la ventaja de monitorear procesos celulares, como la señalización de Ca2+, en tiempo real. Además, la modulación del comportamiento celular mediante la aplicación de diferentes agentes químicos (por ejemplo, Thg aquí) proporciona más información para la descripción de las vías y mensajeros de señal activados en una célula sana o un modelo de enfermedad celular (aislado y cultivado aquí de la rata hSOD1G93A ALS). Cuando se trabaja con colorantes fluorescentes permeables a la membrana celular como Fluo-4 AM, es fundamental encontrar la concentración correcta y el tiempo de incubación para que el tinte llene el interior de la célula. Si se tarda demasiado, la absorción de colorante se puede aumentar manteniendo las células en una incubadora a 37 °C. En casos más severos, se puede usar un detergente suave (por ejemplo, Pluronic F-127) en la solución de carga. Tampoco se recomienda lograr lo anterior elevando la concentración del colorante por encima de 10 μM. De hecho, a concentraciones más altas, el colorante puede actuar como un amortiguador de Ca 2+ y amortiguar la amplitud de la señal de Ca2+.
También vale la pena mencionar que, además de Fluo-4 y colorantes similares de longitud de onda única, existen colorantes ratiométricos sensibles a Ca 2+ (por ejemplo, Fura-2) que emiten a una medición y a una longitud de onda de referencia insensible a Ca2+. Por lo tanto, tales mediciones son insensibles al sesgo causado por la distribución desigual del tinte en la célula y a los cambios en la trayectoria óptica. Sin embargo, el uso de colorantes de longitud de onda única, especialmente con indicadores de alta afinidad como Fluo-4, es aconsejable en los casos en que las mediciones relativas se realizan dentro de la misma muestra, o cuando se sigue principalmente la dinámica del proceso y no los cambios reales de concentración de Ca2+ 43. Sin embargo, estas mediciones no pueden utilizarse para datos cuantitativos en términos de concentración de Ca2+, y es necesario tener precaución al interpretar las amplitudes de los datos presentados en la Figura 2.
Hemos demostrado aquí cómo el uso de esta instalación de imagen en células vivas -astrocitos en cultivo- puede revelar mecanismos intracelulares sutiles de fisiopatología, como la reposición de las reservas de Ca 2+ y la entrada de Ca2+ operada por la tienda, que se alteran en el modelo de ELA, de acuerdo con los resultados previos en células murinas36. Esto podría explicar una mayor sensibilidad de los astrocitos hSOD1G93A a la IgG ALS como se sugiere aquí, que puede potenciar la progresión de la patología. Para comparar las mediciones en tales experimentos, es aconsejable tener una densidad celular similar en el campo de visión y que se tomen los mismos compartimentos celulares para los ROI (por ejemplo, soma vs procesos).
Aquí se mostró un ejemplo de que las células microgliales no respondieron a la ELA IgG con el mismo vigor que los astrocitos. Esto está en línea con el hallazgo de la escasa generación de peróxido en la línea celular microglial en el tratamiento con ELAIgG 15. En conjunto, este enfoque apunta a una respuesta celular específica a la IgG relacionada con la ELA, también un hecho importante realizado mediante el uso de cultivos celulares puros de microglia versus astroglia. El uso de las células gliales de los modelos de neurofisiopatología o derivadas de las células madre pluripotentes inducibles de los pacientes tiene el futuro del biomarcado fisiológico en enfermedades neuronales graves como la ELA. Por lo tanto, sería esencial entender la señalización fina de Ca2+ como la huella digital del estado particular de la enfermedad o distinguir entre diferentes enfermedades excitotóxicas. Para estos fines, se debe desarrollar un procedimiento de aprendizaje automático y categorizar los registros de datos. Además, estas células pueden cultivarse en cultivo y sembrarse en un dispositivo microfluídico para ser utilizadas para el diagnóstico o para la estratificación del paciente de enfermedades neurodegenerativas mediante la estimulación de una respuesta a diversos factores humorales de neuroinflamación (por ejemplo, sueros, IgG, LCR).
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Desarrollo Tecnológico República de Serbia Contrato No. 451-03-9/2021-14 / 200178, el proyecto FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation", y la subvención EC H2020 MSCA RISE # 778405. Agradecemos a Marija Adžić y Mina Perić por proporcionar las imágenes de inmunohistoquímica y a Danijela Bataveljić por su ayuda con la redacción en papel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
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