Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Summary

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca²⁺ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1^G93A .

Abstract

Este protocolo demuestra cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar estas células con el fin de estudiar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el modelo hSOD1^G93A de rata. Primero, el protocolo muestra cómo aislar y cultivar astrocitos y microglia de cortezas de ratas postnatales, y luego cómo caracterizar y probar la pureza de estos cultivos mediante inmunocitoquímica utilizando el marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de los astrocitos y el marcador microglial ionizado de la molécula adaptadora de unión al calcio 1 (Iba1). En la siguiente etapa, se describen métodos para la carga de colorantes (Fluo 4-AM sensible al calcio) de células cultivadas y las grabaciones de cambios de Ca²⁺ en experimentos de imágenes de video en células vivas.

Los ejemplos de grabaciones de vídeo consisten en: (1) casos de imágenes de Ca²⁺ de astrocitos cultivados expuestos agudamente a inmunoglobulina G (IgG) aislados de pacientes con ELA, mostrando una respuesta característica y específica en comparación con la respuesta al ATP como se demostró en el mismo experimento. Los ejemplos también muestran un aumento transitorio más pronunciado en la concentración de calcio intracelular evocado por ALS IgG en astrocitos hSOD1^G93A en comparación con los controles no transgénicos; (2) imágenes de Ca 2+ de astrocitos cultivados durante una depleción de las reservas de calcio por thapsigargin (Thg), un inhibidor no competitivo de la ATPasa del retículo endoplásmico Ca 2+, seguida de una entrada de calcio operada por el almacén provocada por la adición de calcio en la solución de registro, lo que demuestra la diferencia entre la operación de almacenamiento de Ca²⁺ en hSOD1^G93A y en astrocitos no transgénicos; (3) Las imágenes de Ca 2+ de la microglía cultivada muestran predominantemente una falta de respuesta a la IgG de ELA, mientras que la aplicación de ATP provocó un cambio de Ca²⁺. Este documento también enfatiza posibles advertencias y precauciones con respecto a la densidad celular crítica y la pureza de los cultivos, eligiendo la concentración correcta del colorante Ca²⁺ y las técnicas de carga de colorante.

Introduction

Las técnicas de cultivo celular han dado lugar a numerosos avances en diversos campos de la neurofisiología celular en la salud y la enfermedad. En particular, los cultivos celulares primarios, recién aislados del tejido neuronal de un animal de laboratorio, permiten al experimentador estudiar de cerca el comportamiento de diversas células en diferentes medios bioquímicos y configuraciones fisiológicas. El uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como los colorantes sensibles al Ca²⁺ en combinación con la microscopía de video de lapso de tiempo, proporciona una mejor comprensión de los procesos biofísicos y bioquímicos celulares en tiempo r....

Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas de la UE sobre la protección de los animales con fines científicos y con el permiso de la Comisión de Ética de la Facultad de Biología de la Universidad de Belgrado (número de aprobación EK-BF-2016/08). En cuanto al material del paciente (sueros para IgGs), se recolectó para el examen clínico de rutina con el consentimiento informado del paciente de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) para experimentos con humanos. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Clínico de Serbia (No. 850/6).

1. Preparaci....

Results

Caracterización de diferentes tipos de células gliales en cultivo
Por lo general, toma de 15 a 21 días producir astrocitos para experimentos, mientras que las células microgliales tardan de 10 a 15 días en crecer. Se realizó inmunotinción para evaluar la pureza celular del cultivo. La Figura 1 muestra la expresión del doble marcaje del marcador astrocítico GFAP y el marcador microglial Iba1 en cultivos respectivos.

Se sabe que las imágenes de c.......

Discussion

Este artículo presenta el método de cultivo de células primarias como una herramienta rápida y "dentro del presupuesto" para estudiar diferentes aspectos de la (fisio)fisiología celular, como la ELA en el modelo hSOD1^G93A de rata. Por lo tanto, la técnica es adecuada para estudios a nivel unicelular que pueden extrapolarse e investigarse más a fondo a un nivel superior de organización (es decir, en rodajas de tejido o en un animal vivo). El cultivo celular como técnica, sin embargo, tiene algunas advertencias........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de 15 mL	Sarstedt, Alemania	62 554 502
Tubo de 2 mL	Sarstedt, Alemania	72.691
Aguja de 21	Nipro, Japón	HN-2138-ET
Aguja de 23 G	Nipro, Japón	HN-2338-ET
	Nipro, Japón	SY3-5SC-EC
Cubreobjetos de vidrio circular de 6 mm	Menzel Glasser, Alemania	630-2113
Placa de Petri de 60 mm	ThermoFisher Sientific, Estados Unidos	130181
ATP	Sigma-Aldrich, Alemania	A9062
AxioObserver A1	Carl Zeiss, Alemania
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich, Alemania	B6917
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich, Alemania	2110
Centrífuga	Eppendorf, Alemania
DAPI	Sigma-Aldrich, Alemania	10236276001
D-glucosa	Sigma-Aldrich, Alemania	158968
DMEM	Sigma-Aldrich, Alemania	D5648
Anti burro-cabra AlexaFluor 647 IgG anticuerpo	Invitrogen, Estados Unidos	A-21447
Burro-anti ratón AlexaFluor 488 Anticuerpo IgG	Invitrogen, EE. UU.	A-21202
EDTA	Sigma-Aldrich, Alemania	EDS-100G
EGTA	Sigma-Aldrich, Alemania	E4378
" Sistema de cámara digital evolve"-EM 512	Photometrics, EE. UU.
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific, EE. UU.	10500064
Fiji ImageJ Software	Código abierto bajo la Licencia
filtros FITC	Chroma Technology Inc., EE. UU.
Sondas moleculares Fluo-4 AM	, EE. UU	F14201
Cabra anti-Iba1	Fujifilm Wako Chemicals, EE. UU.	011-27991
HEPES	Biowest, Francia	P5455
Sistema de intercambio de soluciones de alta velocidad	ALA Scientific Instruments, EE. UU
Incubadora	Memmert GmbH + Co. KG, Alemania
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich, Alemania	M2393
Software Matlab	Math Works, EE.UU.
Ratón anti-GFAP	Merck Millipore, EE.UU.	MAB360
Mowiol 40-88	Sigma-Aldrich, Alemania	324590
Suero de burro normal	Sigma-Aldrich, Alemania	D9663
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich, Alemania	158127
Penicilina y Estreptomicina	ThermoFisher Sientific, EE. UU.	15140122
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich, Alemania	P5899
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich, Alemania	P5405
Dihidrógeno fosfato de potasio	Reactivos Carlo Erba, España	Agitador de 471686
DELFIA PlateShake	PerkinElmer Life Sciencies, Estados Unidos
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich, Alemania	S3817
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich, Alemania	S5886
Fosfato de sodio dibásico heptahidratado	Carl ROTH GmbH	X987.2
Piruvato de sodio	Sigma-Aldrich, Alemania	P5280
Thapsigargine	Tocris Bioscience, Reino Unido	1138
Triton X - 100	Sigma-Aldrich, Alemania	T8787
Tripsina	Sigma-Aldrich, Alemania	T4799
Vapro Osmómetro de Presión de Vapor 5520	Wescor, ELITechGroup Inc., EE. UU.
Sistema de imágenes ViiFluor	Visitron System Gmbh, Alemania
Sistema de policromador VisiChrome	Visitron System Gmbh, Alemania
Configuración de alto rendimiento VisiView	Visitron System Gmbh, Alemania
Lámpara de arco corto de xenón	Ushio, Japón