Summary
Apresentamos aqui um protocolo sobre como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglias de córtices de ratos para imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ intracelular para pesquisa sobre fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica no modelo de rato hSOD1G93A .
Abstract
Este protocolo demonstra como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células com a finalidade de estudar a fisiopatologia da esclerose lateral amiotrófica (ELA) no modelo hSOD1G93A de ratos. Primeiro, o protocolo mostra como isolar e cultivar astrócitos e micróglias de córtices de ratos pós-natais e, em seguida, como caracterizar e testar a pureza dessas culturas por imunocitoquímica usando o marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrócitos e o marcador microglial da molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado 1 (Iba1). Na próxima etapa, são descritos métodos para o carregamento de corantes (Fluo 4-AM sensível ao cálcio) de células cultivadas e as gravações de alterações de Ca2+ em experimentos de imagem de vídeo em células vivas.
Os exemplos de gravações de vídeo consistem em: (1) casos de imagem de Ca2+ de astrócitos cultivados agudamente expostos à imunoglobulina G (IgG) isolados de pacientes com ELA, mostrando uma resposta característica e específica em comparação com a resposta ao ATP, conforme demonstrado no mesmo experimento. Exemplos também mostram um aumento transitório mais pronunciado na concentração intracelular de cálcio evocada pela ELA IgG em astrócitos hSOD1G93A em comparação com controles não transgênicos; (2) Imagem Ca 2+ de astrócitos cultivados durante uma depleção dos estoques de cálcio pela thapsigargina (Thg), um inibidor não competitivo do retículo endoplasmático Ca 2+ ATPase, seguido pela entrada de cálcio operada em armazém provocada pela adição de cálcio na solução de registro, o que demonstra a diferença entre a operação de armazenamento de Ca2+ em hSOD1G93A e em astrócitos não transgênicos; (3) Imagens de Ca 2+ da micróglia cultivada mostraram predominantemente uma falta de resposta à IgG da ELA, enquanto a aplicação de ATP provocou uma alteração de Ca2+. Este artigo também enfatiza possíveis ressalvas e advertências em relação à densidade celular crítica e pureza das culturas, escolhendo a concentração correta do corante Ca2+ e das técnicas de carregamento de corantes.
Introduction
As técnicas de cultura de células deram origem a inúmeros avanços em diversos campos da neurofisiologia celular na saúde e na doença. Particularmente, as culturas de células primárias, recém-isoladas do tecido neuronal de um animal de laboratório, permitem que o experimentador estude de perto o comportamento de diversas células em diferentes meios bioquímicos e configurações fisiológicas. O uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como os corantes sensíveis ao Ca2+, em combinação com a microscopia de vídeo de lapso de tempo, fornece uma melhor visão dos processos biofísicos e bioquímicos celulares em tempo real.
A ELA é uma doença neurodegenerativa devastadora que afeta os neurônios motores superiores e inferiores1. A doença tem uma patogênese complexa do tipo familiar, mas principalmente da forma esporádica (90% dos casos)2. Sabe-se que mecanismos autônomos não celulares contribuem para a fisiopatologia da ELA, principalmente devido ao papel essencial das células gliais3. A ELA também é bem caracterizada como uma doença neuroinflamatória com envolvimento de fatores humorais e celulares de inflamação.
A imunoglobulina G é amplamente utilizada como marcador molecular na ELA e em outras doenças neurodegenerativas. Estudar o nível sérico desse marcador pode indicar a presença e o estágio da neuroinflamação na doença 4,5,6, enquanto sua presença no líquido cefalorraquidiano pode indicar uma violação da barreira hematoencefálica 7. IgGs também foram identificadas como depósitos nos neurônios motores da medula espinhal de pacientes com ELA7. No entanto, essa abordagem tem mostrado algumas inconsistências na correlação do nível de IgGs com o estágio e as características da doença6.
A IgG isolada dos soros de pacientes com ELA (ALS IgG) pode induzir uma resposta de cálcio em astrócitos ingênuos8 e liberação de glutamato em neurônios, apontando para um efeito excitotóxico - uma característica da patologia da ELA9. No entanto, estudos sobre o modelo de camundongo HSA hSOD1G93A (contendo múltiplas cópias da mutação humanaSOD1 10) mostraram uma série de marcadores de estresse oxidativo em células neurogliais cultivadas 11, tecidos 12,13,14 ou animais vivos 13. Ressalta-se que os astrócitos cultivados a partir do modelo de ratos com ELA foram mais propensos ao estresse oxidativo induzido pelo peróxido do que a astroglia de companheiros de ninhada não transgênicos11.
As células microgliais em cultura são afetadas pela ELA IgG de forma menos aparente. Ou seja, uma linhagem celular microglial BV-2 apresentou um aumento no sinal de marcadores fluorescentes de estresse oxidativo em resposta à aplicação de apenas 4/11 amostras de pacientes com ELA IgG15. Sabe-se que a micróglia participa de muitas patologias neuroinflamatórias, aumentando o estresse oxidativo e a fase de progressão tardia no mecanismo autônomo não celular da ELA16,17. No entanto, os dados com IgGs da ELA indicaram que essas células podem não ser tão reativas quanto os astrócitos a esses fatores humorais da inflamação da ELA. Vários estudos têm sido realizados com astrócitos primários de modelos murinos de ELA, não apenas em filhotes, mas também em animais sintomáticos, seja no cérebro ou na medula espinhal 18,19,20,21. Isso também é verdade para culturas primárias microgliais, embora em menor grau do que os astrócitos e principalmente de regiões cerebrais no estágio embrionário22,23,24.
Usamos imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca2+ em células em cultura principalmente como um meio de seguir os transientes intracelulares deste íon como um marcador fisiológico de excitotoxicidade. Assim, pela caracterização biofísica desses transientes (amplitude, área sob transiente, tempo de subida, frequência) o pesquisador pode obter parâmetros diagnósticos experimentais a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneração. Esta técnica oferece, portanto, uma vantagem de uma avaliação fisiológica quantitativa de IgGs como biomarcadores da doença. Há um grande corpo de literatura sobre o papel das IgGs e Ca2+ na indução da ELA. A maioria desses estudos foi realizada induzindo ELA injetando IgGs de pacientes em animais experimentais 25,26,27,28,29, que então mostraram elevação intracelular de Ca 2+ e deposições de IgG. Uma linha de estudos explorou o efeito da ELA IgGs na sinapse motora in vitro30,31,32. No contexto acima, a técnica aqui apresentada coloca o foco nas células gliais como atores importantes no mecanismo autônomo não celular da ELA e quantifica sua potencial resposta excitotóxica às IgGs como fatores humorais da neuroinflamação. Essa abordagem pode ter uma aplicação mais ampla no teste de outros fatores humorais como soros inteiros, LCR ou citocinas em diferentes sistemas de cultura celular e em modelos celulares de inflamação geral.
Este artigo descreve como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células para estudar a fisiopatologia da ELA com IgG derivada de soros de pacientes. Os protocolos são detalhados para o carregamento de corante de células cultivadas (Figura 1) e as gravações de alterações de Ca2+ em experimentos de imagem de vídeo de lapso de tempo. Exemplos de gravações de vídeo mostrarão como as células gliais reagem à ALS IgG em comparação com o ATP, este último ativando os receptores de membrana purinérgicos. Mostrado pela primeira vez é um exemplo de como os astrócitos isolados do cérebro de ratos hSOD1G93A ALS reagem com uma resposta mais pronunciada de Ca 2+ à ALS IgG em comparação com controles não transgênicos e como relacionar esse processo com as diferenças na operação de armazenamento de Ca2+. Também é mostrado um exemplo de imagem de cálcio em células microgliais agudamente desafiadas com ALS IgG, com apenas uma resposta modesta de cálcio intracelular.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretivas da UE sobre a proteção de animais para fins científicos e com permissão da Comissão de Ética da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado (número de aprovação EK-BF-2016/08). Em relação ao material do paciente (soros para IgGs), este foi coletado para exame clínico de rotina com o consentimento informado do paciente, de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque) para experimentos envolvendo seres humanos. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Centro Clínico da Sérvia (No. 850/6).
1. Preparação da cultura celular primária
- Isolamento do tecido cerebral
NOTA: O isolamento deve ser realizado em gelo, utilizando soluções geladas.- Utilizar filhotes recém-nascidos de 1 a 3 dias de idade para cultura primária de células neonatais33.
NOTA: Para o estudo aqui apresentado, foram utilizados ratos Sprague Dawley hSOD1G93A e não transgênicos. Para genotipagem, caudas de ratos foram usadas para posterior extração de DNA e PCR. - Polvilhe a cabeça do filhote com etanol a 70% e imediatamente decapite-o rapidamente usando uma tesoura.
- Abra a pele usando uma tesoura de ângulo pequeno para expor o crânio. Abra o crânio fazendo um corte do forame magno em direção às órbitas. Em seguida, faça um corte perpendicular da linha média. Remova o cérebro do crânio e coloque-o em uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: Limpe as ferramentas entre filhotes para evitar a contaminação cruzada entre filhotes transgênicos e não transgênicos. O isolamento dos córtices do resto do cérebro deve ser feito sob um estereomicroscópio. - Usando a ponta do fórceps, rasgue as conexões entre os dois hemisférios. Em seguida, separe os hemisférios com pinças curvas empurrando suavemente um hemisfério do centro para o lado.
- Remova as meninges rasgando-as cuidadosamente com pinças retas e curvas.
- Remova o hipocampo apertando-o com uma pinça curva. Descarte o hipocampo ou use-o para outra preparação de cultura de células.
NOTA: Outras etapas devem ser executadas sob o exaustor de fluxo laminar para garantir condições estéreis.
- Utilizar filhotes recém-nascidos de 1 a 3 dias de idade para cultura primária de células neonatais33.
- Homogeneização e dissociação tecidual
- Transfira um córtex para um tubo de 15 mL preenchido com 3 mL de PBS frio. Pipete a suspensão para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL, completando 10-15 cursos até que a suspensão se torne homogênea.
NOTA: Seja muito cauteloso para não produzir bolhas neste processo. - Centrífuga a 500 × g durante 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL de PBS frio, pipetando-o para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL. Repita a etapa de centrifugação.
NOTA: Todas as soluções utilizadas a partir deste ponto devem ser pré-aquecidas a 37 °C. - Descarte o sobrenadante e ressuscite o pellet em 2 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completo suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 10% e antibióticos (penicilina e estreptomicina). Transfira o homogeneizado para um tubo de 2 mL.
- Passe o homogeneizado através de agulhas de 21 G e 23 G (três vezes cada) para fazer uma suspensão de células únicas.
NOTA: Seja muito cauteloso para não produzir bolhas neste processo.
- Transfira um córtex para um tubo de 15 mL preenchido com 3 mL de PBS frio. Pipete a suspensão para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL, completando 10-15 cursos até que a suspensão se torne homogênea.
- Despeje a suspensão celular preparada a partir de um córtex em uma placa de Petri de 60 mm de diâmetro ou em um frasco T25 (com a superfície pré-tratada com um revestimento polipeptídico para o crescimento de células aderentes) contendo 3 mL de DMEM completo. Agite levemente a placa de Petri para que a suspensão seja uniformemente distribuída.
- Cultivar as células na incubadora em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2/95% de ar a 37 °C.
- Troque o meio 48 h após o isolamento e substitua o meio a cada 3 dias.
- Para promover o crescimento de astrócitos, quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, lave-as com PBS pré-aquecido para remover as células gliais frouxamente ligadas e os vestígios de FBS no meio.
- Tripsinize a camada subjacente de astrócitos adicionando 1 mL de solução de tripsina pré-aquecida (tripsina a 0,25%, EDTA a 0,02% em PBS, filtrada estéril).
- Coloque o prato na incubadora a 37 °C durante 2-5 min.
- Verifique as células sob o microscópio. Quando começarem a se desprender, adicione 4 mL de DMEM completo.
- Recolher a suspensão celular e transferi-la para um tubo de 15 ml. Centrífuga a 500 × g durante 5 min.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio completo. Conte as células usando um hemocitômetro.
- Replacar as células a uma densidade de 104 células/cm2 em 5 mL de DMEM completo fresco.
- Mude o meio a cada 3 dias. Para minimizar a presença de outros tipos de células gliais, após os astrócitos atingirem 50% de confluência e antes de cada meio de substituição, lavar as células com DMEM completo.
- Aspirar o meio sobrenadante com uma pipeta de 1 ml e dispensá-lo suavemente sobre a camada de células várias vezes. Certifique-se de que toda a superfície da camada celular esteja coberta durante esta etapa de lavagem.
- Quando as células atingirem 80% de confluência (geralmente após 14 dias), repita a tripsinização e a coleta de astrócitos, conforme descrito na etapa 1.6.
- A semente 5 × 103 de astrócitos em uma tampa de vidro circular de 7 mm revestida com poli-L-lisina (50 μg/mL). Use-os em experimentos após 48 h.
- Para promover a micróglia, após o passo 1.7, permita que as células gliais atinjam uma camada confluente34. Quando as células microgliais aparecerem no topo da camada de astrócitos (após 10-15 dias, reconhecidos por seus corpos menores, mais ovais e processos mais curtos), agite a placa de Petri em um agitador orbital por 2 h a 220 rpm.
- Dispersão e semeadura de células microgliais
- Lave levemente as células separadas e frouxamente presas aspirando o meio sobrenadante com uma ponta de pipeta de 1 mL e distribua-o suavemente na camada de células várias vezes. Certifique-se de cobrir toda a superfície da camada celular durante esta etapa de lavagem, coletar o meio com as células separadas e transferi-lo para um tubo de 15 mL.
- Centrífuga a 500 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio.
- Passe a suspensão celular através de uma agulha 21 G para obter uma suspensão de célula única.
NOTA: A maioria dos métodos publicados usa tripsina ou papaína para dissociar o tecido; no entanto, as agulhas 21 G têm a vantagem de prevenir a superdigestão das células, permitindo uma dissociação mais suave. - Conte as células usando um hemocitômetro. A semente 5 × 103 células microgliais em uma tampa de vidro circular de 7 mm revestida com poli-L-lisina (50 μg/mL). Use-os em experimentos após 48 h.
NOTA: É difícil obter uma cultura microglial pura por agitação, uma vez que as células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos ainda podem estar presentes em um número variável, dependendo da experiência do experimentador. O protocolo imunocitoquímico utilizado para estimar a presença de diferentes populações celulares em culturas gliais foi descrito em outros artigos35.
2. Imunocitoquímica
- Enxaguar as células revestidas em folhas de cobertura em PBS, 2 x 1 min.
- Fixar as células em paraformaldeído a 4% durante 20 min à temperatura ambiente (RT).
- Lave em PBS 3 x 5 min.
- Incubar em solução bloqueadora contendo 10% de soro de burro normal (NDS)/1% de albumina sérica bovina (BSA)/Triton X-100 a 0,1% por 45 min no RT.
- Adicionar 50 μL de uma solução de bloqueio por deslizamento de cobertura de 10 mm de diâmetro.
- Preparar anticorpos primários em 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 nas seguintes diluições: camundongo anti-GFAP 1:300, cabra anti-Iba1 1:500. Incubar as células com anticorpos primários durante a noite a +4 °C.
- Enxaguar em PBS, 3 x 10 min.
- Incubar com os anticorpos secundários conjugados com um fluoróforo: burro anti-rato (excitação 488 nm [1:200)) ou burro anti-cabra (excitado a 647 nm [1:200)). Incubar as células por 2 h no RT no escuro.
- Lave em PBS, 7 x 5 min.
- Incubar as células com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:4.000) por 10 min no RT.
- Lave em PBS 5 x 5 min.
- Monte as tampas em lâminas de microscópio usando uma solução de montagem; use uma gota dele por tampa.
NOTA: As diluições de anticorpos podem variar dependendo do produtor. Os usuários devem determinar diluições ideais para seus experimentos.
3. Imagem de vídeo de lapso de tempo
NOTA: As soluções que contêm o corante fluorescente devem ser protegidas da luz direta. Antes de iniciar o experimento de imagem, certifique-se de que a tampa de vidro não se mova ao ligar a perfusão.
- Preparação de soluções e células
- Prepare solução extracelular (ECS) para imagens: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glicose e 10 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,4. Certifique-se de que a osmolaridade seja de 280-300 mOsm/kg e prepare ECS sem Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glicose, 10 mM HEPES e 0,1 mM EGTA.
- Preparar as soluções de teste: 100 μM de ATP dissolvido em ECS, 1 μM de Thg em ECS sem Ca2+ e 0,1 mg/mL de ALS IgG em ECS8.
- Transfira uma tampa para um prato com ECS para lavar o DMEM completo. Preparar a solução de carga de corante diluindo a solução-mãe de 1 mM de Fluo-4 AM com ECS até à concentração final de 5 μM de Fluo-4 AM.
- Coloque a tampa com células na solução de carregamento do corante por 30 minutos a RT no escuro. Lave as células em ECS por 20 min.
- Se as células não estiverem adequadamente carregadas (ou seja, se o nível basal de fluorescência for muito baixo <5% da faixa dinâmica da câmera com tempo de exposição superior a 400 ms), aumente o tempo de carregamento para até 45 min a 1 h a 37 °C. Alternativamente, misture a solução-mãe de Fluo-4 AM com um volume igual de 20% (p/v) de detergente (Pluronic) em DMSO antes de diluir em ECS, tornando a concentração Plurônica final ~0,02%.
NOTA: Os exemplos experimentais deste estudo foram realizados com IgG humana isolada dos soros sanguíneos de pacientes com ELA, conforme descrito anteriormente 4,5,11. Cada experimento foi realizado com amostras de IgG de um único paciente.
- Imagem de vídeo
NOTA: Neste protocolo, o Video Imaging System foi combinado com uma lâmpada de arco curto de xenônio, um sistema policromador e um microscópio de epifluorescência invertida equipado com metaiscina de imersão em água, glicerina e óleo. A imagem de timelapse foi realizada por meio de um Sistema de Câmera Digital.- Ligue os componentes da configuração de imagem 15 minutos antes do experimento para permitir que o sistema atinja a temperatura de trabalho.
- Coloque a folha de cobertura na câmara de registo com 1 ml de solução de trabalho (ECS ou ECS sem Ca2+).
- Para escolher o protocolo de imagem correto, abra o software de imagem e, no painel Aquisição , escolha os pares de filtros para Fluo4-AM com um comprimento de onda de excitação a 480 nm, um espelho dicroico a 505 nm e um comprimento de onda de emissão a 535 nm.
- Escolha o campo de visão tomando cuidado para ter um número consistente de células ao longo do experimento. Ajuste o tempo de exposição e o ganho do detector adequadamente, de modo que o sinal não esteja saturado. Escolha o modo de pseudocor para aquisição. Para obter instruções mais detalhadas, consulte o manual fornecido pelo fabricante.
- Ajuste a taxa de amostragem para 1 Hz (1 quadro por segundo).
- Inicie a imagem adquirindo o nível basal de fluorescência por 3-5 min para a determinação basal (F0). Garantir um fluxo constante da solução de trabalho.
- Pare o fluxo da solução de trabalho e alterne para a solução de teste pelo período de tempo desejado (consulte também as barras de tempo nos exemplos da Figura 2 e da Figura 3). Entre cada solução de teste, lave as células com um fluxo constante da solução de trabalho por 3-5 min.
- Manter o volume da solução na câmara de registo a ~1 ml, organizando uma sucção constante a partir da parte superior da solução (ver Figura 2E).
NOTA: Para aplicar o tratamento diretamente nas células fotografadas, um sistema de entrega personalizado feito de uma pipeta de vidro (0,8 mm de diâmetro interno) foi posicionado a ~350 μm de distância e ~1 mm acima das células, em um ângulo de 45° combinado com o sistema de troca de solução contendo válvulas de pinça e um controlador eletrônico de válvulas (ver Figura 2E).
4. Análise dos dados
- Defina uma região de interesse (ROI) que corresponda à célula individual.
- Escolha o quadro com a maior intensidade de sinal (ou seja, a partir da aplicação de ATP) e cerque uma célula usando a ferramenta poligonal do aplicativo. Repita para todas as células no campo adquirido. Escolha cinco ROIs em segundo plano usando a Ferramenta Círculo.
- Para medir a intensidade média do sinal de uma única célula e o plano de fundo para cada período de tempo, selecione todos os ROIs e use o comando Multi Measure no ROI Manager no ImageJ ou qualquer comando equivalente em software comercial (consulte a Tabela de Materiais).
- Exporte os valores médios de intensidade de sinal dos ROIs como uma planilha.
- Média de cinco ROIs de fundo e subtraia o fundo médio de cada quadro da intensidade média do ROI do quadro adquirido ao mesmo tempo.
- Para normalizar os dados obtidos para o sinal de linha de base, use a equação (1):
ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
onde F é a intensidade do sinal de cada período de tempo após a subtração de fundo, e F0 é a fluorescência Fluo-4 basal.
NOTA: Um código personalizado foi utilizado neste estudo. - Para analisar a atividade do cálcio, determine vários parâmetros4: a amplitude do pico de cálcio (ΔF/F 0), a mudança integrada (integral de tempo, superfície sob o registro da resposta) do transiente de cálcio (ΔF/F 0 × s), o tempo decorrido do início do pico desde o início da estimulação até o máximo do(s) transiente(s) de cálcio, o tempo-tempo de elevação decorrido desde o início da estimulação até o valor de ΔF/F 0 que atinge 50%-80% da(s) amplitude(s) máxima(s), meia-largura-largura total de um transitório a meia-amplitude máxima(s), frequência de respostas se forem repetitivas (Hz).
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Representative Results
Caracterização de diferentes tipos de células gliais em cultura
Geralmente leva de 15 a 21 dias para produzir astrócitos para experimentos, enquanto as células microgliais levam de 10 a 15 dias para crescer. A imunocoloração foi realizada para avaliar a pureza celular da cultura. A Figura 1 mostra a expressão da dupla marcação do marcador astrocítico GFAP e do marcador microglial Iba1 nas respectivas culturas.
Sabe-se que a imagem de cálcio revela as diferenças na fisiologia celular de astrócitos saudáveis e doentes. Anteriormente, em astrócitos do tipo selvagem, demonstramos que a ELA IgG afeta o Ca2+ celular, mobilizando pools intra e extracelulares no citosol8. O protocolo a seguir determinou se havia diferenças entre os transientes de cálcio na hSOD1G93A e astrócitos cultivados não transgênicos agudamente expostos a amostras de IgG de ELA de pacientes. Astrócitos carregados com Fluo4-AM foram perfundidos com ECS por 3 min para obter uma linha de base estável. Em seguida, 100 μg/mL de ALS IgG foi aplicado no banho por 5 min. Os astrócitos foram lavados com ECS e, em seguida, 100 μM de ATP foram aplicados no final de cada registro para testar a saúde de cada célula e observar a resposta de cálcio a um estímulo padrão.
Traços representativos na Figura 2A,B mostram que os astrócitos hSOD1G93A respondem à IgG da ELA com uma maior amplitude do transiente de cálcio, uma maior mudança global integrada e um menor tempo até o pico do que os astrócitos não transgênicos. Aqui, no entanto, deve-se ter cautela na interpretação de dados quantitativos quando sondas Ca2+ de comprimento de onda único, como a Fluo4-AM, são usadas (veja a seção de discussão). Além disso, a forma da resposta à ELA IgG é distinguível da resposta ao ATP (note um transiente mais rápido com maior amplitude nos traços e sincronicidade celular em imagens pseudocoloridas em resposta ao ATP, Figura 2A,B).
Com o objetivo de aprofundar o estudo da origem das diferenças na resposta do cálcio à ELA IgG e ATP entre hSOD1G93A e astrócitos não transgênicos, utilizamos uma abordagem farmacológica para manipular os estoques internos de Ca2+ durante a imagem de cálcio usando 1 μM Thg. Thg é um inibidor não seletivo do retículo endoplasmático Ca2+ ATPase (SERCA), esgotando as reservas intracelulares de Ca2+ quase imediatamente, o que se reflete em um transiente de cálcio com duração de vários minutos. Para excluir o efeito do Ca 2+ externo nos fenômenos observados, utilizou-se ECS privado de Ca2+ durante o experimento. Após o registro do nível basal da fluorescência por 3 min, 1 μM Thg foi aplicado no banho por 2 min. Após a depleção de cálcio induzida por Thg, os astrócitos foram perfundidos com ECS contendo Ca2+ para induzir e monitorar o reabastecimento das lojas. Traços representativos do experimento descrito são mostrados na Figura 2C,D. Como esperado, os astrócitos hSOD1G93A apresentaram um nível mais elevado de Ca2+ nas lojas, como revelado pelo esgotamento da loja, indicando uma sobrecarga deste íon. Um mecanismo semelhante foi demonstrado em astrócitos cultivados de camundongos transgênicos SOD1G93A 36.
Imagem de cálcio de células microgliais em cultura
A imagem de timelapse da micróglia marcada com Fluo-4 AM foi realizada da mesma forma descrita para astrócitos (Figura 3B). As células microgliais foram perfundidas com ECS com 2 mM Ca2+ por 3 min para obter uma linha de base estável, seguida de aplicação em banho de 100 μg/mL de ALS IgG por 5 min, lavagem com ECS e estimulação com 100 μM de ATP. Curiosamente, enquanto os astrócitos respondem prontamente à IgG da ELA, a grande maioria das células microgliais não respondeu à IgG da ELA (como ilustrado por apenas uma célula microglial reagindo com um transiente de cálcio; traço vermelho no exemplo da Figura 3A). No entanto, eles sempre responderam ao ATP e de maneira semelhante aos astrócitos (Figura 3A). Observe também um caso de um transiente espontâneo de Ca2+ no traço celular 2 (Figura 3A) que não deve ser confundido com uma resposta induzida.
Figura 1: Astrócitos e micróglias em uma cultura primária. Imagens confocais representativas de astrócitos (esquerda) em cultura marcada usando GFAP (vermelho) e micróglia (direita) em uma cultura corada com Iba1 (verde). A dupla marcação (GFAP/Iba1) foi utilizada para indicar a pureza da cultura. DAPI foi usado para rotular núcleos (azul). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: GFAP = proteína glial fibrilar ácida; lba1 = molécula adaptadora ionizada de ligação ao cálcio 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um exemplo de aplicação de imagem de cálcio em um estudo de fisiopatologia de astrócitos. (A) Um exemplo representativo de um experimento de imagem de cálcio em que astrócitos hSOD1G93A foram fotografados por 5 minutos para coletar fluorescência basal ("linha de base"), seguido por uma aplicação aguda de ALS IgG (0,1 mg / mL) por 5 min ("resposta à ALS IgG") e um tratamento com 100 μM ATP ("resposta a ATP"). O painel superior mostra imagens pseudocoloridas (a intensidade da fluorescência é codificada por cores, onde o preto corresponde a uma intensidade muito baixa, enquanto o branco marca pixels com maior intensidade; a relação cor-intensidade é representada em uma barra de cores à direita no painel superior de B que corresponde à intensidade de fluorescência de uma célula individual em cada um dos segmentos do experimento ('linha de base', 'resposta à ELA IgG' e 'resposta à ATP'). As linhas tracejadas cinza apontam para as imagens pseudocoloridas de pontos de tempo específicos para o traço de cálcio representativo (em laranja). A caixa cinza no meio do traço de cálcio marca a aplicação de 5 minutos de ALS IgG. A barra preta sob o traço de cálcio marca a aplicação de ATP. (B) O mesmo que em (A), exceto para astrócitos não transgênicos (traço em azul). (C) Um traço de cálcio representativo (laranja) no astrócito hSOD1G93A desafiado com 1 μg/mL de thapsigargina (barra preta sob o traço) em ECS sem cálcio, seguido pela adição de 2 mM Ca 2+ ('2 mM Ca2+', barra preta sob o traço). (D) O mesmo que em (C), exceto para o astrócito não transgênico (o traço está em azul). Escala de amplitude = 100% ΔF/F0. Escala de tempo = 200 s. Barras de escala = 50 μm. (E) Esquema da configuração experimental que descreve o modo personalizado de troca de soluções e a colocação da pipeta para aplicação de agentes bioquímicos. Abreviaturas: ELA = esclerose lateral amiotrófica; IgG = imunoglobulina G; Thg = thapsigargin. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Um exemplo de imagem de cálcio de micróglia cultivada. (A) Esquerda: Imagem de campo brilhante de micróglia cultivada. Como é difícil obter uma cultura microglial pura, os astrócitos também estão presentes aqui (células poligonais planas maiores, ver exemplo indicado pela ponta da seta). Tanto a micróglia ramificada (pequeno soma, processos proeminentes) quanto a ameboide (indicadas com caixas verde e amarela, respectivamente) estão presentes na cultura. Meio: Caixas amarelas e ciano ampliadas a partir da esquerda. Linhas vermelhas, azuis e violetas marcam os ROIs dos quais a intensidade média de fluorescência ao longo do tempo é extraída. Direita: Traços de cálcio de três células no painel do meio. A cor do traço corresponde à cor dos ROIs no painel do meio. Após a obtenção de imagens da fluorescência basal do cálcio («fluorescência basal») durante 200 s, as células foram expostas a uma aplicação aguda de ALS IgG (0,1 mg/ml) durante 5 minutos («resposta à ALS IgG»), seguida de 100 μM de ATP («resposta a ATP»). A caixa cinza no meio do traço de cálcio marca a aplicação de 5 minutos de ALS IgG. A barra preta sob o traço de cálcio marca a aplicação de ATP. Note que apenas a célula 1 (traço vermelho), representando uma grande minoria de células, respondeu à ALS IgG, enquanto todas as células responderam ao ATP. (B) As imagens pseudocoloridas representam a intensidade de fluorescência em cada um dos segmentos dos registos («linha de base», «resposta à ALS IgG» e «resposta à ATP»), em que as linhas tracejadas a laranja apontam para os pontos de tempo específicos nos traços de cálcio representativos (A, painel direito). Caixas verdes e laranjas marcam a micróglia ameboide (o mesmo que em A). A relação cor-intensidade é representada em uma barra de cores à direita. Escala de amplitude = 100% ΔF/F0. Escala de tempo = 100 s. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: ELA = esclerose lateral amiotrófica; IgG = imunoglobulina G; ROI = região de interesse. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho apresenta o método de cultura celular primária como uma ferramenta rápida e "dentro do orçamento" para o estudo de diferentes aspectos da fisiologia celular (pato), como a ELA, no modelo hSOD1G93A de ratos. A técnica é, portanto, adequada para estudos no nível de célula única que podem ser extrapolados e investigados em um nível mais alto de organização (ou seja, em fatias de tecido ou em um animal vivo). A cultura celular como técnica, no entanto, tem algumas ressalvas. É mais importante fazer o isolamento do tecido cerebral e a dissociação das células no gelo e realizar esses e os estágios subsequentes de isolamento e preparação no menor tempo possível. A contaminação é um obstáculo sempre presente que pode ser superado com o uso de equipamentos bem esterilizados e com especial cuidado na realização da dissociação tecidual no exaustor laminar37. Também é fundamental semear a densidade correta das células. Se o número de células semeadas for menor do que o número desejado, isso não suportará o crescimento e a propagação celular no prato. No entanto, se as células forem muito densas, haverá competição entre elas pelos nutrientes no meio de crescimento e, portanto, mais morte celular. É por isso que é aconselhável contar as células dissociadas antes da semeadura, pelo menos antes de se adquirir alguma experiência em relação à relação correta do tecido inicial e do volume de dissociação.
A GFAP é um marcador de astrócitos amplamente utilizado e é frequentemente utilizada para avaliar a pureza da cultura celular38,39. No entanto, apenas a GFAP não é suficiente quando se estuda a reatividade dos astrócitos. Recomenda-se combiná-lo com um marcador de proliferação como o Ki67 ou outros marcadores de astrócitos (glutamina sintetase, aldolase-C ou aldeído desidrogenase-1)18,38. Embora essas técnicas tendam a produzir culturas puras do tipo glial, é preciso ter cuidado na avaliação da pureza das células de cultura. Isso é de particular importância para culturas de células microgliais que geralmente contêm alguns precursores de oligodendrócitos ou astrócitos34. Marcadores específicos para células microgliais atraem muito interesse. O marcador mais utilizado é o Iba1, mas outros marcadores frequentemente utilizados, como os recetores de diferenciação (CD68, CD45) e o recetor de fractalkine (CX3CR1), também podem ser detetados noutras células (para mais pormenores, ver40). Atualmente, os marcadores mais específicos para a micróglia são o TMEM119 e o receptor purinérgico P2Y1241, embora um artigo recente tenha levantado preocupação com a especificidade do TMEM11942.
A introdução da imagem de células vivas em timelapse oferece a vantagem de monitorar processos celulares, como a sinalização Ca2+, em tempo real. Além disso, a modulação do comportamento celular através da aplicação de diferentes agentes químicos (por exemplo, Thg aqui) fornece mais informações para a descrição das vias e mensageiros de sinal ativados em uma célula saudável ou em um modelo de doença celular (isolado e cultivado aqui a partir do rato hSOD1G93A ALS). Ao trabalhar com corantes fluorescentes permeáveis à membrana celular, como o Fluo-4 AM, é fundamental encontrar a concentração correta e o tempo de incubação para que o corante preencha o interior da célula. Se demorar muito tempo, a absorção do corante pode ser aumentada mantendo as células em uma incubadora a 37 °C. Em casos mais graves, um detergente neutro (por exemplo, Pluronic F-127) pode ser usado na solução de carregamento. Também não é aconselhável alcançar o acima exposto elevando a concentração do corante acima de 10 μM. De fato, em concentrações mais altas, o corante pode atuar como um tampão Ca 2+ e amortecer a amplitudedo sinal Ca2+.
Também vale a pena mencionar que, além do Fluo-4 e corantes similares de comprimento de onda único, existem corantes ratiométricos sensíveis ao Ca 2+ (por exemplo, Fura-2) que emitem em uma medição e em um comprimento de onda de referência Ca2+ -insensível. Tais medições são, portanto, insensíveis ao viés causado pela distribuição desigual do corante na célula e às mudanças no caminho óptico. No entanto, o uso de corantes de comprimento de onda único, especialmente com indicadores de alta afinidade, como o Fluo-4, é aconselhável nos casos em que as medições relativas são feitas dentro da mesma amostra, ou onde se segue principalmente a dinâmica do processo e não as mudanças reais de concentração de Ca2+ 43. No entanto, essas medidas não podem ser usadas para dados quantitativos em termos de concentração de Ca2+, e é necessário cautela ao interpretar as amplitudes dos dados, conforme apresentado na Figura 2.
Demonstramos aqui como o uso dessa instalação de imagem em células vivas - astrócitos em cultura - pode revelar mecanismos intracelulares sutis de fisiopatologia, como o reabastecimento de depósitos de Ca 2+ e entrada de Ca2+ operados em loja, que são perturbados no modelo de ELA, de acordo com resultados anteriores em células murinas36. Isso poderia então explicar uma maior sensibilidade dos astrócitos hSOD1G93A à ELA IgG, como sugerido aqui, que pode potencializar a progressão da patologia. Para comparar as medições em tais experimentos, é aconselhável ter uma densidade celular semelhante no campo de visão e que os mesmos compartimentos celulares sejam tomados para ROIs (por exemplo, soma vs processos).
Um exemplo foi mostrado aqui que as células microgliais não responderam à ALS IgG com o mesmo vigor que os astrócitos. Isso está de acordo com o achado da escassa geração de peróxido na linhagem celular microglial no tratamento com ELA IgG15. No seu conjunto, esta abordagem aponta para uma resposta celular específica à IgG relacionada com a ELA, também um facto importante realizado através do uso de culturas celulares puras de microglia versus astroglia. O uso das células gliais dos modelos de neurofisiopatologia ou derivadas das células-tronco pluripotentes induzíveis dos pacientes tem o futuro da biomarcação fisiológica em doenças neurais graves, como a ELA. Seria, portanto, essencial entender a sinalização fina de Ca2+ como a impressão digital do estado particular da doença ou distinguir entre diferentes doenças excitotóxicas. Para esses fins, um procedimento de aprendizado de máquina precisa ser desenvolvido e as gravações de dados categorizadas. Além disso, essas células podem ser cultivadas em cultura e semeadas em um dispositivo microfluídico para ser usado para diagnóstico ou estratificação de doença neurodegenerativa do paciente por meio da evocação de uma resposta a diversos fatores humorais de neuroinflamação (por exemplo, soros, IgG, LCR).
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Contrato de Ciência e Desenvolvimento Tecnológico da República da Sérvia nº 451-03-9/2021-14 / 200178, o projeto FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" e o EC H2020 MSCA RISE grant #778405. Agradecemos a Marija Adžić e Mina Perić por fornecerem as imagens imuno-histoquímicas e a Danijela Bataveljić por ajudarem com a escrita em papel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
- Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
- Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
- Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
- Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
- Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
- Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
- Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
- Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
- Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
- Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
- Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
- Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
- Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
- Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
- Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
- Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
- Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
- Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
- Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
- Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
- Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
- Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
- Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
- Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
- Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
- Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
- Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
- Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
- Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
- Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
