Summary
Vi presenterar här ett protokoll om hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från råttkortiker för time-lapse-videoavbildning av intracellulär Ca2+ för forskning om patofysiologi av amyotrofisk lateralskleros i hSOD1G93A-råttmodellen .
Abstract
Detta protokoll visar hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från kortikerna hos Sprague Dawley-råttor och hur man använder dessa celler för att studera patofysiologin för amyotrofisk lateralskleros (ALS) i råtta hSOD1G93A-modellen . Först visar protokollet hur man isolerar och odlar astrocyter och mikroglia från postnatala råttkortiker, och sedan hur man karakteriserar och testar dessa kulturer för renhet genom immunocytokemi med hjälp av glialfibrillärt surt protein (GFAP) markör för astrocyter och den joniserade kalciumbindande adaptermolekylen 1 (Iba1) mikroglial markör. I nästa steg beskrivs metoder för färgämnesbelastning (kalciumkänslig Fluo 4-AM) av odlade celler och inspelningar av Ca2+ förändringar i videoavbildningsexperiment på levande celler.
Exemplen på videoinspelningar består av: (1) fall av Ca2+ avbildning av odlade astrocyter akut exponerade för immunglobulin G (IgG) isolerade från ALS-patienter, vilket visar ett karakteristiskt och specifikt svar jämfört med svaret på ATP som visats i samma experiment. Exempel visar också en mer uttalad övergående ökning av intracellulär kalciumkoncentration som framkallas av ALS IgG i hSOD1G93A-astrocyter jämfört med icke-transgena kontroller; (2) Ca 2+ avbildning av odlade astrocyter under en utarmning av kalciumförråd av thapsigargin (Thg), en icke-konkurrenskraftig hämmare av endoplasmatisk retikulum Ca 2+ ATPas, följt av butiksdriven kalciumpost som framkallas genom tillsats av kalcium i registreringslösningen, vilket visar skillnaden mellan Ca2+ butiksdrift i hSOD1G93A och i icke-transgena astrocyter; (3) Ca 2+ avbildning av den odlade mikroglia som huvudsakligen visar brist på svar på ALS IgG, medan ATP-applikationen framkallade en Ca2+ förändring. Detta papper betonar också möjliga försiktighetsåtgärder och försiktighetsåtgärder angående kritisk celldensitet och renhet hos kulturer, genom att välja rätt koncentration av Ca2+ färgämne och färgladdningstekniker.
Introduction
Cellodlingstekniker har gett upphov till många framsteg inom olika områden av cellulär neurofysiologi inom hälsa och sjukdom. Särskilt primära cellkulturer, nyligen isolerade från neuronvävnaden hos ett laboratoriedjur, tillåter experimentören att noggrant studera beteendet hos olika celler i olika biokemiska medier och fysiologiska inställningar. Att använda olika fluorescerande fysiologiska indikatorer som Ca2+-känsliga färgämnen i kombination med time-lapse-videomikroskopi ger bättre inblick i de cellulära biofysiska och biokemiska processerna i realtid.
ALS är en förödande neurodegenerativ sjukdom som drabbar övre och nedre motorneuroner1. Sjukdomen har en komplex patogenes av familjär typ men mestadels av sporadisk form (90% av fallen)2. Det är välkänt att icke-cellautonoma mekanismer bidrar till ALS-patofysiologi, främst på grund av glialcellernas väsentliga roll3. ALS karakteriseras också väl som en neuroinflammatorisk sjukdom med involvering av humorala och cellulära faktorer av inflammation.
Immunoglobulin G används ofta som en molekylär markör vid ALS och andra neurodegenerativa sjukdomar. Att studera serumnivån för denna markör kan indikera närvaron och stadiet av neuroinflammation i sjukdomen 4,5,6, medan dess närvaro i cerebrospinalvätskan kan indikera ett brott mot blodhjärnbarriären7. IgG identifierades också som avlagringar i ryggmärgsmotorneuronerna hos ALS-patienter7. Ändå har detta tillvägagångssätt visat vissa inkonsekvenser i korrelationen mellan nivån av IgG och sjukdomsstadiet och egenskaperna hos sjukdomen6.
IgG isolerad från serum hos ALS-patienter (ALS IgG) kan inducera ett kalciumsvar i naiva astrocyter8 och glutamatfrisättning i nervceller, vilket pekar på en excitotoxisk effekt - ett kännetecken för ALS-patologi9. Studier på hSOD1G93A ALS-råttmodellen (innehållande flera kopior av den humana SOD1-mutationen10) visade dock ett antal markörer för oxidativ stress i odlade neurogliaceller11, vävnader 12,13,14 eller levande djur 13. Det är anmärkningsvärt att astrocyterna som odlades från ALS-råttmodellen var mer benägna att oxidativ stress inducerad av peroxid än astroglia från icke-transgena kullkamrater11.
Mikrogliaceller i odling påverkas av ALS IgG på ett mindre uppenbart sätt. En BV-2 mikroglial cellinje visade nämligen en ökning av signalen från fluorescerande markörer för oxidativ stress som svar på appliceringen av endast 4/11 ALS IgG-patientprover15. Det är välkänt att mikroglia deltar i många neuroinflammatoriska patologier, vilket bidrar till oxidativ stress och sen progressionsfas i den icke-cellautonoma mekanismen för ALS16,17. Ändå indikerade data med ALS IgGs att dessa celler kanske inte är lika reaktiva som astrocyter mot dessa humorala faktorer av ALS-inflammation. Flera studier har utförts med primära astrocyter från ALS murinmodeller, inte bara hos ungar utan också hos symtomatiska djur, antingen på hjärnan eller på ryggmärgen 18,19,20,21. Detta gäller även för mikrogliala primära kulturer, men i mindre utsträckning än astrocyter och mestadels från hjärnregioner i embryonalstadiet22,23,24.
Vi använder time-lapse videoavbildning av Ca2+ på celler i odling främst som ett sätt att följa intracellulära transienter av denna jon som en fysiologisk markör för excitotoxicitet. Genom biofysisk karakterisering av dessa transienter (amplitud, område under övergående, stigtid, frekvens) kan forskaren således erhålla experimentella diagnostiska parametrar från olika cellulära modeller av neurodegeneration. Denna teknik erbjuder således en fördel av en kvantitativ fysiologisk bedömning av IgG som sjukdomsbiomarkörer. Det finns en stor mängd litteratur om IgGs och Ca2+ roll i induktionen av ALS. De flesta av dessa studier utfördes genom att inducera ALS genom att injicera patientens IgG i försöksdjur 25,26,27,28,29, som sedan visade intracellulär Ca 2+ förhöjning och IgG-deposition. En rad studier undersökte effekten av ALS IgG på motorsynapsen in vitro30,31,32. I ovanstående sammanhang sätter tekniken som presenteras här fokus på gliacellerna som viktiga aktörer i den icke-cellautonoma mekanismen för ALS och kvantifierar deras potentiella excitotoxiska svar på IgG som humorala faktorer för neuroinflammation. Detta tillvägagångssätt kan ha en bredare tillämpning vid testning av andra humorala faktorer som hela sera, CSF eller cytokiner i olika cellodlingssystem och i cellulära modeller av allmän inflammation.
Detta dokument beskriver hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från kortikerna hos Sprague Dawley-råttor och hur man ytterligare använder dessa celler för att studera ALS-patofysiologi med patientens sera-härledda IgG. Protokollen är detaljerade för färgämnesbelastning av odlade celler (figur 1) och inspelningar av Ca2+ förändringar i time-lapse videoavbildningsexperiment. Exempel på videoinspelningar visar hur gliaceller reagerar på ALS IgG jämfört med ATP, det senare aktiverar purinerga membranreceptorer. För första gången visas ett exempel på hur astrocyter isolerade från hSOD1G93A ALS-råtthjärnan reagerar med ett mer uttalat Ca 2+ svar på ALS IgG jämfört med icke-transgena kontroller och hur man relaterar denna process till skillnaderna i Ca2+ butiksdrift. Dessutom visas ett exempel på kalciumavbildning i mikrogliaceller som akut utmanas med ALS IgG, med endast ett blygsamt svar av intracellulärt kalcium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med EU-direktiven om skydd av djur för vetenskapliga ändamål och med tillstånd från den etiska kommissionen vid biologiska fakulteten, Belgrads universitet (godkännandenummer EK-BF-2016/08). När det gäller patientmaterial (serum för IgG) samlades det in för rutinmässig klinisk undersökning med informerad patients samtycke i enlighet med World Medical Association (Helsingforsdeklarationen) för experiment på människor. Protokollet godkändes av etikkommittén för Serbiens kliniska centrum (nr 850/6).
1. Primär cellodlingsberedning
- Isolering av hjärnvävnad
OBS: Isolering bör utföras på is med iskalla lösningar.- Använd nyfödda valpar 1-3 dagar gamla för primär neonatal cellodling33.
OBS: För studien som presenteras här användes Sprague Dawley hSOD1G93A och icke-transgena råttor. För genotypning användes råttsvansar för senare DNA-extraktion och PCR. - Strö valpens huvud med 70% etanol och halshugg det omedelbart snabbt med sax.
- Skär upp huden med en liten vinklad sax för att exponera skallen. Öppna skallen genom att göra ett snitt från foramen magnum mot banorna. Gör sedan ett vinkelrätt mittlinjesnitt. Ta bort hjärnan från skallen och placera den i en petriskål som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: Rengör verktygen mellan valparna för att förhindra korskontaminering mellan transgena och icke-transgena valpar. Isolering av kortikerna från resten av hjärnan bör ske under ett stereomikroskop. - Använd spetsen på pincetten och riv anslutningarna mellan båda halvklotet. Separera sedan halvklotet med böjda pincett genom att försiktigt trycka på en halvklot från mitten till sidan.
- Ta bort hjärnhinnorna genom att försiktigt riva dem med raka och böjda pincett.
- Ta bort hippocampus genom att klämma fast den med en krökt tång. Kassera hippocampus eller använd den för ett annat cellodlingspreparat.
OBS: Ytterligare steg bör utföras under den laminära flödeshuven för att säkerställa sterila förhållanden.
- Använd nyfödda valpar 1-3 dagar gamla för primär neonatal cellodling33.
- Vävnadshomogenisering och dissociation
- Överför en cortex till ett 15 ml rör fyllt med 3 ml kall PBS. Pipa upphängningen upp och ner med en 1 ml spets och slutför 10-15 slag tills suspensionen blir homogen.
OBS: Var mycket försiktig så att du inte producerar bubblor i denna process. - Centrifugera vid 500 × g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml kall PBS genom att pipettera den upp och ner med en 1 ml spets. Upprepa centrifugeringssteget.
OBS: Alla lösningar som används från denna punkt bör förvärmas till 37 °C. - Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 ml komplett Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och antibiotika (penicillin och streptomycin). Överför homogenatet till ett 2 ml rör.
- För homogenatet genom 21 G och 23 G nålar (tre gånger vardera) för att göra en suspension av enstaka celler.
OBS: Var mycket försiktig så att du inte producerar bubblor i denna process.
- Överför en cortex till ett 15 ml rör fyllt med 3 ml kall PBS. Pipa upphängningen upp och ner med en 1 ml spets och slutför 10-15 slag tills suspensionen blir homogen.
- Häll cellsuspensionen framställd från en cortex i en petriskål med en diameter på 60 mm eller en T25-kolv (med ytan förbehandlad med en polypeptidbeläggning för tillväxt av vidhäftande celler) innehållande 3 ml fullständig DMEM. Skaka petriskålen lätt så att suspensionen fördelas jämnt.
- Odla cellerna i inkubatorn i en fuktad atmosfär med 5% CO2/95% luft vid 37 °C.
- Byt medium 48 h efter isolering och byt ut mediet var 3: e dag.
- För att främja astrocyttillväxt, när cellerna når 70% -80% sammanflöde, tvätta dem med förvärmd PBS för att ta bort de löst fästa gliacellerna och spåren av FBS i mediet.
- Trypsinisera det underliggande skiktet av astrocyter genom att tillsätta 1 ml förvärmd trypsinlösning (0,25% trypsin, 0,02% EDTA i PBS, sterilfiltrerat).
- Placera skålen i inkubatorn vid 37 °C i 2-5 min.
- Kontrollera cellerna under mikroskopet. När de börjar lossna lägger du till 4 ml komplett DMEM.
- Samla cellsuspensionen och överför den till ett 15 ml rör. Centrifugera vid 500 × g i 5 min.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml komplett medium. Räkna cellerna med en hemocytometer.
- Replate cellerna med en densitet av 104 celler/cm2 i 5 ml färsk komplett DMEM.
- Byt medium var 3: e dag. För att minimera närvaron av andra glialcelltyper, efter att astrocyter når 50% sammanflöde och före varje mediebyte, tvätta cellerna med fullständig DMEM.
- Aspirera supernatantmediet med en 1 ml pipett och fördela det försiktigt på cellskiktet flera gånger. Se till att hela ytan på cellskiktet är täckt under detta tvättsteg.
- När cellerna når 80% sammanflöde (vanligtvis efter 14 dagar), upprepa trypsiniseringen och samlingen av astrocyter enligt beskrivningen i steg 1.6.
- Frö 5 × 103 av astrocyter på en 7 mm cirkulär glasöverdragsglas belagd med poly-L-lysin (50 μg/ml). Använd dem i experiment efter 48 timmar.
- För att främja mikroglia, efter steg 1.7, låt gliacellerna nå ett sammanflytande lager34. När mikroglialceller uppträder ovanpå astrocytskiktet (efter 10-15 dagar, igenkända av deras mindre, mer ovala kroppar och kortare processer), skaka petriskålen på en orbital shaker i 2 timmar vid 220 rpm.
- Dispergering och sådd av mikrogliaceller
- Tvätta lätt de lossnade och löst fästa cellerna genom att aspirera supernatantmediet med en 1 ml pipettspets och fördela det försiktigt på cellskiktet flera gånger. Var noga med att täcka hela ytan av cellskiktet under detta tvättsteg, samla mediet med de fristående cellerna och överför det till ett 15 ml rör.
- Centrifugera vid 500 × g i 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml medium.
- För cellsuspensionen genom en 21 G-nål för att erhålla en encellssuspension.
OBS: De flesta publicerade metoder använder trypsin eller papain för att dissociera vävnaden; emellertid har 21 G nålar fördelen att förhindra översmältning av celler, vilket möjliggör en mildare dissociation. - Räkna cellerna med en hemocytometer. Frö 5 × 103 mikrogliaceller på en 7 mm cirkulär glastäcke belagd med poly-L-lysin (50 μg/ml). Använd dem i experiment efter 48 timmar.
OBS: Det är svårt att få en ren mikroglialkultur genom att skaka, eftersom oligodendrocytprekursorcellerna och astrocyterna fortfarande kan vara närvarande i ett varierande antal beroende på experimentens erfarenhet. Det immunocytokemiska protokollet som används för att uppskatta närvaron av olika cellpopulationer i glialkulturer har beskrivits på annat håll35.
2. Immunocytokemi
- Skölj cellerna pläterade på täckglas i PBS, 2 x 1 min.
- Fixera cellerna i 4% paraformaldehyd i 20 min vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta i PBS 3 x 5 min.
- Inkubera i en blockerande lösning innehållande 10% normalt åsneserum (NDS)/1% bovint serumalbumin (BSA)/0,1% Triton X-100 i 45 min vid RT.
- Tillsätt 50 μl av en blockerande lösning per täckglas med en diameter på 10 mm.
- Förbered primära antikroppar i 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 i följande utspädningar: mus anti-GFAP 1:300, get anti-Iba1 1:500. Inkubera cellerna med primära antikroppar över natten vid +4 °C.
- Skölj i PBS, 3 x 10 min.
- Inkubera med de sekundära antikropparna konjugerade med en fluorofor: åsna antimus (excitation 488 nm [1:200)) eller åsna anti-get (upphetsad vid 647 nm [1:200)). Inkubera cellerna i 2 timmar vid RT i mörkret.
- Tvätta i PBS, 7 x 5 min.
- Inkubera cellerna med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:4,000) i 10 min vid RT.
- Tvätta i PBS 5 x 5 min.
- Montera täckglasen på mikroskopglas med en monteringslösning; använd en droppe av det per coverslip.
OBS: Antikroppsutspädningar kan variera beroende på producent. Användare måste bestämma optimala utspädningar för sina experiment.
3. Time-lapse videoavbildning
OBS: Lösningar som innehåller det fluorescerande färgämnet bör skyddas mot direkt ljus. Innan du börjar bildexperimentet, se till att glasskyddet inte rör sig när du slår på perfusionen.
- Framställning av lösningar och celler
- Förbered extracellulär lösning (ECS) för avbildning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukos och 10 mM HEPES. Justera pH till 7,4. Se till att osmolariteten är 280-300 mOsm/kg och förbered ECS utan Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukos, 10 mM HEPES och 0,1 mM EGTA.
- Förbered testlösningarna: 100 μM ATP upplöst i ECS, 1 μM Thg i ECS utan Ca2+ och 0,1 mg / ml ALS IgG i ECS8.
- Överför en täckskiva till en skål med ECS för att tvätta bort hela DMEM. Bered färgämneslösningen genom att späda 1 mM stamlösning av Fluo-4 AM med ECS till den slutliga koncentrationen av 5 μM Fluo-4 AM.
- Placera täckglaset med celler i färgämnesladdningslösningen i 30 minuter vid RT i mörker. Tvätta cellerna i ECS i 20 min.
- Om cellerna inte är tillräckligt belastade (dvs. om den basala nivån av fluorescens är för låg <5% av kamerans dynamiska omfång med exponeringstid större än 400 ms), öka laddningstiden till upp till 45 min till 1 h vid 37 °C. Alternativt kan du blanda Fluo-4 AM-stamlösningen med en lika stor volym av 20% (w / v) tvättmedel (Pluronic) i DMSO innan det späds ut i ECS, vilket gör den slutliga Pluronic-koncentrationen ~ 0,02%.
OBS: De experimentella exemplen på denna studie utfördes med humant IgG isolerat från ALS-patienters blodserum som beskrivits tidigare 4,5,11. Varje experiment utfördes med IgG-prover av en enda patient.
- Video avbildning
OBS: I detta protokoll kombinerades Video Imaging System med en xenon kortbågslampa, ett polykromatorsystem och ett inverterat epifluorescensmikroskop utrustat med vatten-, glycerin- och oljefördjupningsmål. Timelapse-avbildning utfördes med hjälp av ett digitalkamerasystem.- Slå på komponenterna i bildinställningen 15 minuter före experimentet så att systemet når arbetstemperaturen.
- Placera täckbladet i inspelningskammaren med 1 ml arbetslösning (ECS eller ECS utan Ca2+).
- För att välja rätt bildprotokoll, öppna bildprogramvaran och välj filterparen för Fluo4-AM med en excitationsvåglängd vid 480 nm, en dikroisk spegel vid 505 nm och en emissionsvåglängd vid 535 nm i panelen Förvärv.
- Välj synfält och se till att ha ett konsekvent antal celler under hela experimentet. Justera exponeringstiden och detektorförstärkningen på lämpligt sätt på ett sådant sätt att signalen inte är mättad. Välj pseudocolor-läge för förvärv. För mer detaljerade instruktioner, se manualen från tillverkaren.
- Justera samplingsfrekvensen till 1 Hz (1 bildruta per sekund).
- Starta avbildningen genom att förvärva den basala nivån av fluorescens i 3-5 minuter för baslinjebestämning (F0). Säkerställ ett konstant flöde av arbetslösningen.
- Stoppa arbetslösningens flöde och byt till testlösningen under önskad tidsperiod (se även tidsfält i exempel på figur 2 och figur 3). Tvätta cellerna med ett konstant flöde av arbetslösningen mellan varje testlösning i 3-5 minuter.
- Håll lösningsvolymen i inspelningskammaren på ~ 1 ml genom att ordna ett konstant sug från toppen av lösningen (se figur 2E).
OBS: För att applicera behandlingen direkt på de avbildade cellerna placerades ett anpassat leveranssystem tillverkat av en glaspipett (0,8 mm innerdiameter) ~ 350 μm bort och ~ 1 mm ovanför cellerna, i en vinkel på 45 ° kombinerat med lösningsutbytessystemet som innehåller klämventiler och en elektronisk ventilregulator (se figur 2E).
4. Analys av data
- Definiera ett intresseområde (ROI) som motsvarar den enskilda cellen.
- Välj den ram med högsta signalintensitet (dvs. från tillämpningen av ATP) och omsluta en cell med hjälp av programmet Polygonal Tool. Upprepa för alla celler i det förvärvade fältet. Välj fem roi:er i bakgrunden med cirkelverktyget.
- För att mäta den genomsnittliga signalintensiteten för en enskild cell och bakgrunden för varje tidsram, välj alla ROI och använd kommandot Multi Measure i ROI Manager i ImageJ eller något motsvarande kommando i kommersiell programvara (se materialförteckningen).
- Exportera medelvärdena för signalintensiteten för ROI:erna som ett kalkylblad.
- Beräkna medelvärdet för fem bakgrundsavkastningar och subtrahera den genomsnittliga bakgrunden för varje bildruta från den genomsnittliga ROI-intensiteten för den ram som förvärvats samtidigt.
- För att normalisera erhållna data till baslinjesignalen, använd ekvation (1):
ΔF/F 0 = (F -F 0)/F0 (1)
där F är signalintensiteten för varje tidsram efter bakgrundssubtraktion och F0 är baslinjen Fluo-4 fluorescens.
OBS: En skräddarsydd kod användes i denna studie. - För att analysera kalciumaktivitet, bestäm flera parametrar4: amplituden för kalciumtoppen (ΔF / F 0), den integrerade förändringen (tidsintegral, yta under responsregistreringen) av kalciumtransienten (ΔF / F 0 × s), tid till topp-förfluten tid från stimuleringens början till maximalt kalciumövergående (s), stiga tiden-tiden som förflutit från stimuleringens början till värdet av ΔF / F 0 som når 50%-80% av den maximala amplituden (s), halvbredd-full bredd av en transient vid halv maximal amplitud (s), frekvens av svar om de är repetitiva (Hz).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av olika gliacelltyper i odling
Det tar vanligtvis 15-21 dagar att producera astrocyter för experiment, medan mikrogliaceller tar 10-15 dagar att växa. Immunostaining utfördes för att bedöma cellrenheten hos kulturen. Figur 1 visar uttrycket av dubbelmärkning av den astrocytiska markören GFAP och mikroglialmarkören Iba1 i respektive kultur.
Kalciumavbildning är känt för att avslöja skillnaderna i cellfysiologi hos friska och sjuka astrocyter. Tidigare i vilda astrocyter visade vi att ALS IgG påverkar cellulära Ca2+ genom att mobilisera intra- och extracellulära pooler i cytosolen8. Följande protokoll bestämde om det fanns skillnader mellan kalciumtransienterna i hSOD1G93A och icke-transgena odlade astrocyter som akut exponerades för ALS IgG-prover från patienter. Astrocyter laddade med Fluo4-AM perfuserades med ECS i 3 minuter för att få en stabil baslinje. Därefter applicerades 100 μg/ml ALS IgG i badet i 5 minuter. Astrocyter tvättades med ECS, och sedan applicerades 100 μM ATP i slutet av varje inspelning för att testa hälsan hos varje cell och observera kalciumsvaret på en standardstimulans.
Representativa spår i figur 2A,B visar att hSOD1G93A astrocyter svarar på ALS IgG med en större amplitud av kalciumtransienten, en större övergripande integrerad förändring och en kortare tid till topp än icke-transgena astrocyter. Här bör man dock vara försiktig med att tolka kvantitativa data när envågiga Ca2+-sonder som Fluo4-AM används (se diskussionsavsnittet). Dessutom skiljer sig formen av svaret på ALS IgG från svaret på ATP (notera en snabbare transient med en större amplitud i spåren och cellsynkronicitet i pseudocolorbilder som svar på ATP, figur 2A, B).
Med målet att ytterligare studera ursprunget till skillnaderna i kalciumsvaret på ALS IgG och ATP mellan hSOD1G93A och icke-transgena astrocyter använde vi ett farmakologiskt tillvägagångssätt för att manipulera interna Ca 2+ butiker under kalciumavbildning genom att använda 1 μM Thg. Thg är en icke-selektiv hämmare av endoplasmatisk retikulum Ca2+ ATPas (SERCA), tömning av de intracellulära Ca2+ butikerna nästan omedelbart, vilket återspeglas i en kalciumövergående som varar över flera minuter. För att utesluta effekten av extern Ca 2+ i de observerade fenomenen användes ECS berövad av Ca2+ under experimentet. Efter registrering av fluorescensens basala nivå i 3 minuter applicerades 1 μM Thg i badet i 2 min. Efter Thg-inducerad kalciumutarmning perfuserades astrocyterna med ECS som innehöll Ca2+ för att inducera och övervaka påfyllningen av butikerna. Representativa spår av det beskrivna experimentet visas i figur 2C,D. Som förväntat hade hSOD1G93A-astrocyter en högre nivå av Ca2+ i butikerna, vilket avslöjades av butiksutarmning, vilket indikerar en överbelastning av denna jon. En liknande mekanism har demonstrerats hos odlade astrocyter från SOD1G93A transgena möss36.
Kalciumavbildning av mikrogliaceller i odling
Timelapse-avbildning av mikroglia märkt med Fluo-4 AM utfördes på samma sätt som beskrivits för astrocyter (figur 3B). Mikrogliaceller perfuserades med ECS med 2 mM Ca2+ i 3 min för att få en stabil baslinje, följt av badapplicering av 100 μg / ml ALS IgG i 5 min, tvättning med ECS och stimulering med 100 μM ATP. Intressant nog, medan astrocyter lätt svarar på ALS IgG, svarade en stor majoritet av mikrogliaceller inte på ALS IgG (vilket illustreras av att endast en mikrogliacell reagerar med en kalciumövergående cell; rött spår i exemplet med figur 3A). De svarade dock alltid på ATP och på liknande sätt som astrocyter (figur 3A). Observera också ett fall av en spontan Ca2+ transient i cellspåret 2 (figur 3A) som inte bör misstas för ett inducerat svar.
Figur 1: Astrocyter och mikroglia i en primär kultur. Representativa konfokala bilder av astrocyter (vänster) i kultur märkta med GFAP (röd) och mikroglia (höger) i en kultur färgad med Iba1 (grön). Dubbelmärkning (GFAP/Iba1) användes för att indikera kulturens renhet. DAPI användes för att märka kärnor (blå). Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: GFAP = glialfibrillärt surt protein; lba1 = joniserad kalciumbindande adaptermolekyl 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ett exempel på kalciumavbildningsapplikation i en studie av astrocytpatofysiologi. (A) Ett representativt exempel på ett kalciumavbildningsexperiment där hSOD1G93A-astrocyter avbildades i 5 minuter för att samla in fluorescens vid baslinjen ("baslinje"), följt av en akut applicering av ALS IgG (0,1 mg/ml) i 5 minuter ("svar på ALS IgG") och en behandling med 100 μM ATP ("svar på ATP"). Den övre panelen visar pseudofärgbilder (fluorescensintensiteten är färgkodad, där svart motsvarar mycket låg intensitet, medan vitt markerar pixlar med högsta intensitet; färgintensitetsrelationen representeras i en färgfält till höger i den övre panelen på B som motsvarar fluorescensintensiteten hos en enskild cell i vart och ett av experimentets segment ("baslinje", "svar på ALS IgG" och "svar på ATP"). De grå streckade linjerna pekar på pseudofärgbilderna av specifika tidpunkter för det representativa kalciumspåret (i orange). Den grå lådan i mitten av kalciumspåret markerar 5 minuters applicering av ALS IgG. Svart bar under kalciumspåret markerar tillämpningen av ATP. (B) Samma som i (A) utom för icke-transgena astrocyter (spår i blått). C) Ett representativt kalciumspår (orange) i hSOD1G93A-astrocyt som ifrågasätts med 1 μg/ml thapsigargin (svart stapel under spåret) i ECS utan kalcium, följt av tillsats av 2 mM Ca 2+ ("2 mM Ca2+", svart stapel under spåret). (D) Samma som i (C) utom för den icke-transgena astrocyten (spåret är i blått). Amplitudskala = 100% ΔF / F0. Tidsskala = 200 s. Skalstänger = 50 μm. (E) Schema för experimentell installation som visar det skräddarsydda läget för lösningsutbyte och placeringen av pipetten för applicering av biokemiska medel. Förkortningar: ALS = amyotrofisk lateralskleros; IgG = immunoglobulin G; Thg = thapsigargin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ett exempel på kalciumavbildning av odlad mikroglia. (A) Vänster: Brightfield-bild av odlad mikroglia. Eftersom det är svårt att få en ren mikroglialkultur finns astrocyter också här (större platta polygonala celler, se exempel indikerat med pilspets). Både förgrenade (små soma, framträdande processer) och amoeboid microglia (indikerad med gröna respektive gula lådor) finns i kulturen. Mitten: Förstorade gula och cyanlådor från vänster. Röda, blå och violetta linjer markerar avkastningen från vilka den genomsnittliga fluorescensintensiteten över tid extraheras. Höger: Kalciumspår av tre celler i mittpanelen. Spårets färg motsvarar färgen på ROI: erna i mittpanelen. Efter avbildning av kalciumfluorescensen vid baslinjen ("fluorescens") vid 200 s exponerades cellerna för en akut applicering av ALS IgG (0,1 mg/ml) i 5 minuter ("svar på ALS IgG"), följt av 100 μM ATP ("svar på ATP"). Den grå lådan i mitten av kalciumspåret markerar 5 minuters applicering av ALS IgG. Den svarta stapeln under kalciumspåret markerar tillämpningen av ATP. Observera att endast cell 1 (rött spår) som representerar en stor minoritet av cellerna, svarade på ALS IgG, medan alla celler svarade på ATP. (B) Pseudofärgbilder representerar fluorescensintensiteten i vart och ett av registreringssegmenten ("baslinje", "svar på ALS IgG" och "svar på ATP") där orange streckade linjer pekar på de specifika tidpunkterna i de representativa kalciumspåren (A, högra panelen). Gröna och orange lådor markerar amoeboid microglia (samma som i A). Färgintensitetsrelationen representeras i en färgfält till höger. Amplitudskala = 100% ΔF / F0. Tidsskala = 100 s. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: ALS = amyotrofisk lateralskleros; IgG = immunoglobulin G; ROI = region av intresse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument presenterar metoden för primär cellodling som ett snabbt och "på budgeten" -verktyg för att studera olika aspekter av cell (pato) fysiologi såsom ALS i råtta hSOD1G93A-modellen . Tekniken är således lämplig för studier på encellsnivå som kan extrapoleras och undersökas vidare på en högre organisationsnivå (dvs. i vävnadsskivor eller i ett levande djur). Cellodling som teknik har dock några försiktighetsåtgärder. Det är mest kritiskt att göra hjärnvävnadsisolering och dissociation av celler på is och att utföra dessa och efterföljande stadier av isolering och beredning på kortast möjliga tid. Kontaminering är ett ständigt närvarande hinder som kan övervinnas genom att använda välsteriliserad utrustning och vara särskilt försiktig när man utför vävnadsdissociation i den laminära huven37. Det är också viktigt att så rätt densitet av celler. Om antalet celler som är sådda är mindre än önskat antal, kommer detta inte att stödja celltillväxten och förökningen i skålen. Men om cellerna är för täta kommer det att finnas konkurrens mellan dem om näringsämnena i tillväxtmediet och därmed mer celldöd. Det är därför det är lämpligt att räkna de dissocierade cellerna före sådd, åtminstone innan viss erfarenhet uppnås angående det korrekta förhållandet mellan startvävnaden och dissociationsvolymen.
GFAP är en allmänt använd astrocytmarkör och används ofta för att bedöma cellodlingsrenhet38,39. Endast GFAP är dock inte tillräckligt när man studerar astrocytreaktivitet. Det rekommenderas att kombinera det med en spridningsmarkör som Ki67 eller andra astrocytmarkörer (glutaminsyntetas, aldolas-C eller aldehyddehydrogenas-1)18,38. Även om dessa tekniker tenderar att ge rena glialcelltypskulturer, måste man vara försiktig vid bedömningen av odlingscellrenhet. Detta är av särskild betydelse för mikroglialcellkulturer som vanligtvis innehåller vissa oligodendrocytprekursorer eller astrocyter34. Specifika markörer för mikroglialceller lockar mycket intresse. Den mest använda markören är Iba1, men andra ofta använda markörer, såsom differentieringsreceptorer (CD68, CD45) och fraktarkinreceptor (CX3CR1), kan detekteras även i andra celler (för mer information, se40). För närvarande är de mest specifika markörerna för mikroglia TMEM119 och den purinerga receptorn P2Y1241, även om en ny artikel har väckt oro angående TMEM119-specificitet42.
Introduktion av timelapse live-cell imaging erbjuder fördelen med att övervaka cellulära processer, såsom Ca2+ signalering, i realtid. Dessutom ger modulering av cellbeteende genom att applicera olika kemiska medel (t.ex. Thg här) ytterligare information för beskrivningen av de vägar och signalbudbärare som aktiveras i en frisk cell eller en cellulär sjukdomsmodell (isolerad och odlad här från hSOD1G93A ALS-råtta). När man arbetar med cellmembrangenomsläppliga fluorescerande färgämnen som Fluo-4 AM är det viktigt att hitta rätt koncentration och inkubationstid för färgämnet att fylla cellens inre. Om det tar för lång tid kan färgupptaget ökas genom att cellerna hålls i en kuvös vid 37 °C. I svårare fall kan ett milt tvättmedel (t.ex. Pluronic F-127) användas i lastlösningen. Det rekommenderas inte heller att uppnå ovanstående genom att höja koncentrationen av färgämnet över 10 μM. Faktum är att vid högre koncentrationer kan färgämnet fungera som en Ca 2+ buffert och dämpa Ca2+ signalamplituden.
Det är också värt att nämna att förutom Fluo-4 och liknande envåglängdsfärger finns det Ca 2+ -känsliga ratiometriska färgämnen (t.ex. Fura-2) som avger vid en mätning och vid en Ca2+ -okänslig referensvåglängd. Sådana mätningar är således okänsliga för den bias som orsakas av ojämn färgfördelning i cellen och för förändringar i den optiska banan. Ändå är det lämpligt att använda envågiga färgämnen, särskilt med indikatorer med hög affinitet som Fluo-4, i fall där relativa mätningar görs inom samma prov, eller där man främst följer processens dynamik och inte verkliga Ca2+ koncentrationsförändringar43. Dessa mätningar kan dock inte användas för kvantitativa data i termer av Ca2+ koncentration, och försiktighet är nödvändig vid tolkning av amplituder från data som presenteras i figur 2.
Vi har här visat hur användning av denna avbildningsanläggning på levande celler-astrocyter i odling-kan avslöja subtila intracellulära mekanismer för patofysiologi, såsom påfyllning av Ca 2+ butiker och butiksdriven Ca2+ -post, som störs i ALS-modellen, i enlighet med tidigare resultat på murina celler36. Detta kan sedan förklara en högre känslighet hos hSOD1G93A-astrocyter för ALS IgG som föreslås här, vilket kan förstärka patologins progression. För att jämföra mätningar i sådana experiment är det lämpligt att ha en liknande celldensitet i synfältet och att samma cellfack tas för ROI (t.ex. soma vs processer).
Ett exempel visades här att mikrogliaceller inte svarade på ALS IgG med samma kraft som astrocyter. Detta är i linje med upptäckten av den knappa genereringen av peroxid i mikrogliacelllinjen vid ALS IgG-behandling15. Sammantaget pekar detta tillvägagångssätt på ett cellspecifikt svar på IgG relaterat till ALS, också ett viktigt faktum som realiseras genom användning av rena cellkulturer av mikroglia kontra astroglia. Att använda gliacellerna från modellerna av neuropatofysiologi eller härledda från patienters inducerbara pluripotenta stamceller har framtiden för fysiologisk biomärkning vid svåra neurala sjukdomar som ALS. Det skulle därför vara viktigt att förstå fin Ca2+ signalering som fingeravtryck av det specifika tillståndet av sjukdomen eller att skilja mellan olika excitotoxiska sjukdomar. För dessa ändamål måste en maskininlärningsprocedur utvecklas och datainspelningar kategoriseras. Dessutom kan dessa celler odlas i odling och utsädes i en mikrofluidisk anordning som ska användas för diagnos eller för patientstratifiering av neurodegenerativ sjukdom genom att framkalla ett svar på olika humorala faktorer av neuroinflammation (t.ex. sera, IgG, CSF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ministeriet för utbildningsvetenskap och teknisk utveckling Republiken Serbien kontrakt nr 451-03-9/2021-14 / 200178, FENS - NENS Education and Training Cluster-projektet "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation" och EC H2020 MSCA RISE-bidrag #778405. Vi tackar Marija Adžić och Mina Perić för att de levererade immunhistokemibilderna och Danijela Bataveljić för hjälp med pappersskrivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
- Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
- Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
- Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
- Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
- Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
- Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
- Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
- Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
- Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
- Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
- Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
- Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
- Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
- Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
- Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
- Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
- Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
- Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
- Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
- Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
- Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
- Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
- Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
- Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
- Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
- Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
- Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
- Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
- Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
- Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
