Summary
Vi presenterer her en protokoll om hvordan man forbereder primærkulturer av gliaceller, astrocytter og mikroglia fra rottekortiser for time-lapse videoavbildning av intracellulær Ca2+ for forskning på patofysiologi av amyotrofisk lateral sklerose i hSOD1G93A rottemodell.
Abstract
Denne protokollen demonstrerer hvordan man forbereder primære kulturer av gliaceller, astrocytter og mikroglia fra cortices av Sprague Dawley-rotter og hvordan man bruker disse cellene med det formål å studere patofysiologien til amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i rotte hSOD1G93A-modellen . Først viser protokollen hvordan man isolerer og dyrker astrocytter og mikroglia fra postnatale rottekortiser, og deretter hvordan man karakteriserer og tester disse kulturene for renhet ved immuncytokjemi ved hjelp av glial fibrillært surt protein (GFAP) markør av astrocytter og det ioniserte kalsiumbindende adaptermolekylet 1 (Iba1) mikroglialmarkør. I neste trinn beskrives metoder for fargestoffbelastning (kalsiumfølsom Fluo 4-AM) av dyrkede celler og opptak av Ca2+ endringer i videoavbildningseksperimenter på levende celler.
Eksemplene på videoopptak består av: (1) tilfeller av Ca2+ avbildning av dyrkede astrocytter akutt eksponert for immunglobulin G (IgG) isolert fra ALS-pasienter, som viser en karakteristisk og spesifikk respons sammenlignet med responsen på ATP som vist i samme eksperiment. Eksempler viser også en mer uttalt forbigående økning i intracellulær kalsiumkonsentrasjon fremkalt av ALS IgG i hSOD1G93A-astrocytter sammenlignet med ikke-transgene kontroller; (2) Ca 2+ avbildning av dyrkede astrocytter under uttømming av kalsiumlagre av thapsigargin (Thg), en ikke-konkurrerende hemmer av endoplasmatisk retikulum Ca 2+ ATPase, etterfulgt av butikkoperert kalsiuminngang fremkalt ved tilsetning av kalsium i opptaksløsningen, noe som viser forskjellen mellom Ca 2+ butikkdrift i hSOD1G93A og i ikke-transgene astrocytter; (3) Ca 2+ avbildning av dyrkede mikroglia viser overveiende mangel på respons på ALS IgG, mens ATP-applikasjon fremkalte en Ca2+ endring. Dette papiret legger også vekt på mulige advarsler og advarsler angående kritisk celletetthet og renhet av kulturer, og velger riktig konsentrasjon av Ca2 + fargestoff og fargestoffbelastningsteknikker.
Introduction
Cellekulturteknikker har gitt opphav til mange fremskritt innen ulike felt av cellulær nevrofysiologi innen helse og sykdom. Spesielt tillater primære cellekulturer, nylig isolert fra nevronvevet til et laboratoriedyr, eksperimentøren å studere oppførselen til forskjellige celler i forskjellige biokjemiske medier og fysiologiske oppsett. Bruk av forskjellige fluorescerende fysiologiske indikatorer som Ca2+-sensitive fargestoffer i kombinasjon med time-lapse videomikroskopi gir bedre innsikt i de cellulære biofysiske og biokjemiske prosessene i sanntid.
ALS er en ødeleggende nevrodegenerativ sykdom som påvirker øvre og nedre motorneuroner1. Sykdommen har en kompleks patogenese av familiær type, men hovedsakelig av sporadisk form (90% av tilfellene)2. Det er velkjent at ikke-celle autonome mekanismer bidrar til ALS patofysiologi, hovedsakelig på grunn av den essensielle rollen til gliaceller3. ALS er også godt karakterisert som en nevroinflammatorisk sykdom med involvering av humorale og cellulære faktorer av betennelse.
Immunoglobulin G er mye brukt som en molekylær markør i ALS og andre nevrodegenerative sykdommer. Å studere serumnivået til denne markøren kan indikere tilstedeværelsen og stadiet av nevroinflammasjon i sykdommen 4,5,6, mens dens tilstedeværelse i cerebrospinalvæsken kan indikere et brudd på blodhjernebarrieren7. IgG ble også identifisert som avleiringer i ryggmargsmotornevronene hos ALS-pasienter7. Likevel har denne tilnærmingen vist noen uoverensstemmelser i korrelasjonen av nivået av IgG med stadium og egenskaper av sykdommen6.
IgG isolert fra sera hos ALS-pasienter (ALS IgG) kan indusere kalsiumrespons i naive astrocytter8 og glutamatfrigjøring i nevroner, noe som peker på en excitotoksisk effekt - et kjennetegn på ALS-patologi9. Studier på hSOD1G93A ALS-rottemodellen (som inneholder flere kopier av den humane SOD1-mutasjonen10) viste imidlertid en rekke markører for oksidativt stress i dyrkede neurogliaceller11, vev 12,13,14 eller levende dyr 13. Det er bemerkelsesverdig at astrocytter dyrket fra ALS-rottemodellen var mer utsatt for oksidativt stress indusert av peroksid enn astroglia fra ikke-transgene kullkamerater11.
Mikrogliaceller i kultur påvirkes av ALS IgG på en mindre tydelig måte. Nemlig viste en BV-2 mikroglialcellelinje en økning i signalet fra fluorescerende markører for oksidativt stress som svar på anvendelsen av bare 4/11 ALS IgG-pasientprøver15. Det er velkjent at mikroglia deltar i mange nevroinflammatoriske patologier, og legger til oksidativt stress og sen progresjonsfase i den ikke-celle autonome mekanismen til ALS16,17. Likevel indikerte dataene med ALS IgGs at disse cellene kanskje ikke er like reaktive som astrocytter til disse humorale faktorene for ALS-betennelse. Flere studier har blitt utført med primære astrocytter fra ALS murine modeller, ikke bare hos valper, men også hos symptomatiske dyr, enten på hjernen eller på ryggmargen 18,19,20,21. Dette gjelder også for mikrogliale primærkulturer, men i mindre grad enn astrocytter og hovedsakelig fra hjernegrupper på embryostadiet22,23,24.
Vi bruker time-lapse videoavbildning av Ca2+ på celler i dyrkning primært som et middel til å følge intracellulære transienter av dette ionet som en fysiologisk markør for eksitotoksisitet. Ved biofysisk karakterisering av disse transientene (amplitude, areal under forbigående, stigningstid, frekvens) kan forskeren således oppnå eksperimentelle diagnostiske parametere fra ulike cellulære modeller av nevrodegenerasjon. Denne teknikken gir dermed en fordel av en kvantitativ fysiologisk vurdering av IgG som sykdomsbiomarkører. Det finnes en stor mengde litteratur om rollen til IgGs og Ca2+ i induksjonen av ALS. De fleste av disse studiene ble utført ved å indusere ALS ved å injisere pasient IgGs i eksperimentelle dyr 25,26,27,28,29, som deretter viste intracellulær Ca 2+ høyde og IgG-avsetninger. En rekke studier undersøkte effekten av ALS IgGs på motorsynapsen in vitro30,31,32. I ovennevnte sammenheng setter teknikken som presenteres her fokus på glialcellene som viktige aktører i den ikke-celle autonome mekanismen til ALS og kvantifiserer deres potensielle excitotoksiske respons på IgGs som humorale faktorer for nevroinflammasjon. Denne tilnærmingen kan ha en bredere anvendelse i testing av andre humorale faktorer som hele sera, CSF eller cytokiner i forskjellige cellekultursystemer og i cellulære modeller av generell betennelse.
Dette papiret beskriver hvordan man forbereder primære kulturer av gliaceller, astrocytter og mikroglia fra cortices av Sprague Dawley-rotter og hvordan man videre kan bruke disse cellene til å studere ALS-patofysiologi med pasient sera-avledet IgG. Protokoller er detaljerte for fargestoffbelastning av dyrkede celler (figur 1) og opptak av Ca2+ endringer i time-lapse videoavbildningseksperimenter. Eksempler på videoopptak vil vise hvordan gliaceller reagerer på ALS IgG sammenlignet med ATP, sistnevnte aktiverer purinerge membranreseptorer. Vist for første gang er et eksempel på hvordan astrocytter isolert fra hSOD1G93A ALS rottehjerne reagerer med en mer uttalt Ca 2+ respons på ALS IgG sammenlignet med ikke-transgene kontroller og hvordan man relaterer denne prosessen til forskjellene i Ca2+ butikkdrift. Også vist er et eksempel på kalsiumavbildning i mikrogliaceller akutt utfordret med ALS IgG, med bare en beskjeden respons av intracellulært kalsium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med EU-direktivene om beskyttelse av dyr for vitenskapelige formål og med tillatelse fra Den etiske kommisjonen ved Det biologiske fakultet, Universitetet i Beograd (godkjenningsnummer EK-BF-2016/08). Når det gjelder pasientmateriale (sera for IgGs), ble det samlet inn til rutinemessig klinisk undersøkelse med informert pasientens samtykke i henhold til Verdens legeforenings etiske retningslinjer (Helsinkideklarasjonen) for forsøk med mennesker. Protokollen ble godkjent av etikkkomiteen ved Clinical Center of Serbia (nr. 850/6).
1. Forberedelse av primær cellekultur
- Isolering av hjernevev
MERK: Isolasjon skal utføres på is, ved hjelp av iskalde løsninger.- Bruk nyfødte valper som er 1-3 dager gamle for primær neonatal cellekultur33.
MERK: For studien som presenteres her, ble Sprague Dawley hSOD1G93A og ikke-transgene rotter brukt. For genotyping ble rottehaler brukt til senere DNA-ekstraksjon og PCR. - Dryss valpens hode med 70% etanol og halshugg det umiddelbart raskt med saks.
- Klipp opp huden med småvinklet saks for å eksponere skallen. Åpne skallen ved å lage et kutt fra foramen magnum mot banene. Deretter lager du et vinkelrett midtlinjekutt. Fjern hjernen fra skallen og legg den i en petriskål som inneholder fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: Rengjør verktøyene mellom avkom for å forhindre krysskontaminering mellom transgene og ikke-transgene valper. Isolering av cortices fra resten av hjernen bør gjøres under et stereomikroskop. - Bruk spissen av tangen, riv forbindelsene mellom begge halvkule. Deretter skiller du halvkulene med buede tang ved å skyve en halvkule forsiktig fra midten til siden.
- Fjern meningene ved å rive dem forsiktig med rette og buede tang.
- Fjern hippocampus ved å klemme den med en buet tang. Kast hippocampus eller bruk den til en annen cellekulturforberedelse.
MERK: Ytterligere trinn bør utføres under den laminære strømningshetten for å sikre sterile forhold.
- Bruk nyfødte valper som er 1-3 dager gamle for primær neonatal cellekultur33.
- Vevshomogenisering og dissosiasjon
- Overfør en cortex til et 15 ml rør fylt med 3 ml kald PBS. Pipet suspensjonen opp og ned med en 1 ml spiss, og fullfør 10-15 slag til suspensjonen blir homogen.
MERK: Vær veldig forsiktig så du ikke produserer bobler i denne prosessen. - Sentrifuge ved 500 × g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend pelleten i 3 ml kald PBS ved å pipettere den opp og ned med en 1 ml spiss. Gjenta sentrifugeringstrinnet.
MERK: Alle oppløsninger som brukes fra dette punktet skal forvarmes til 37 °C. - Kast supernatanten og resuspendere pelleten i 2 ml komplett Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (penicillin og streptomycin). Overfør homogenatet til et 2 ml rør.
- Pass homogenatet gjennom 21 G og 23 G nåler (tre ganger hver) for å lage en suspensjon av enkeltceller.
MERK: Vær veldig forsiktig så du ikke produserer bobler i denne prosessen.
- Overfør en cortex til et 15 ml rør fylt med 3 ml kald PBS. Pipet suspensjonen opp og ned med en 1 ml spiss, og fullfør 10-15 slag til suspensjonen blir homogen.
- Hell cellesuspensjonen tilberedt fra en cortex i en petriskål med en diameter på 60 mm eller en T25-kolbe (med overflaten forbehandlet med et polypeptidbelegg for vekst av klebende celler) som inneholder 3 ml komplett DMEM. Rist petriskålen lett slik at suspensjonen er jevnt fordelt.
- Dyrk cellene i inkubatoren i en fuktet atmosfære med 5 % CO2/95 % luft ved 37 °C.
- Bytt medium 48 timer etter isolasjon og bytt ut mediet hver 3.
- For å fremme astrocytvekst, når celler når 70% -80% sammenløp, vask dem med forvarmet PBS for å fjerne de løst festede gliaceller og spor av FBS i mediet.
- Trypsiniser det underliggende laget av astrocytter ved å tilsette 1 ml forvarmet trypsinløsning (0,25% trypsin, 0,02% EDTA i PBS, sterilfiltrert).
- Legg retten i inkubatoren ved 37 °C i 2-5 min.
- Kontroller cellene under mikroskopet. Når de begynner å løsne, legg til 4 ml komplett DMEM.
- Samle cellesuspensjonen og overfør den til et 15 ml rør. Sentrifuge ved 500 × g i 5 min.
- Kast supernatanten og resuspend pelleten i 1 ml komplett medium. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
- Replate cellene med en tetthet på 104 celler / cm2 i 5 ml fersk komplett DMEM.
- Bytt medium hver 3. For å minimere tilstedeværelsen av andre gliacelletyper, etter at astrocytter når 50% sammenløp og før hver medieutskifting, vask cellene med fullstendig DMEM.
- Aspirer supernatantmediet med en 1 ml pipette og dispenser det forsiktig på cellelaget flere ganger. Forsikre deg om at hele overflaten av cellelaget er dekket under dette vasketrinnet.
- Når cellene når 80% sammenløp (vanligvis etter 14 dager), gjenta trypsiniseringen og samlingen av astrocytter som beskrevet i trinn 1.6.
- Frø 5 × 103 av astrocytter på et 7 mm sirkulært glassdeksel belagt med poly-L-lysin (50 μg / ml). Bruk dem i eksperimenter etter 48 timer.
- For å fremme mikroglia, etter trinn 1.7, la gliacellene nå et sammenflytende lag34. Når mikrogliaceller vises på toppen av astrocyttlaget (etter 10-15 dager, anerkjent av deres mindre, mer ovale legemer og kortere prosesser), rist petriskålen på en orbital shaker i 2 timer ved 220 o / min.
- Dispergering og såing av mikrogliaceller
- Vask lett de frittliggende og løst festede cellene ved å aspirere supernatantmediet med en 1 ml pipettespiss og dispenser den forsiktig på cellelaget flere ganger. Sørg for å dekke hele overflaten av cellelaget under dette vasketrinnet, samle mediet med de frittliggende cellene og overfør det til et 15 ml rør.
- Sentrifuge ved 500 × g i 5 min. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 1 ml medium.
- Før cellesuspensjonen gjennom en 21 G nål for å oppnå en encellet suspensjon.
MERK: De fleste publiserte metoder bruker trypsin eller papain for å dissosiere vevet; Imidlertid har 21 G nåler fordelen av å forhindre overbesvær av celler, noe som gir en mildere dissosiasjon. - Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Frø 5 × 103 mikroglialceller på et 7 mm sirkulært glassdeksel belagt med poly-L-lysin (50 μg / ml). Bruk dem i eksperimenter etter 48 timer.
MERK: Det er vanskelig å oppnå en ren mikrogliakultur ved risting, siden oligodendrocyttforløperceller og astrocytter fortsatt kan være tilstede i et variabelt antall, avhengig av eksperimentørens erfaring. Den immuncytokjemiske protokollen som brukes til å estimere tilstedeværelsen av forskjellige cellepopulasjoner i gliakulturer er beskrevet andre steder35.
2. Immuncytokjemi
- Skyll cellene belagt på deksler i PBS, 2 x 1 min.
- Fest cellene i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur (RT).
- Vask i PBS 3 x 5 min.
- Inkuber i en blokkerende oppløsning som inneholder 10 % normalt eselserum (NDS)/1 % bovint serumalbumin (BSA)/0,1 % Triton X-100 i 45 minutter ved RT.
- Tilsett 50 μL av en blokkeringsløsning per deksel på 10 mm diameter.
- Forbered primære antistoffer i 1% NDS / 1% BSA / 0,1% TritonX-100 i følgende fortynninger: mus anti-GFAP 1:300, geit anti-Iba1 1:500. Inkuber cellene med primære antistoffer over natten ved +4 °C.
- Skyll i PBS, 3 x 10 min.
- Inkuber med sekundære antistoffer konjugert med en fluorofor: esel anti-mus (eksitasjon 488 nm [1:200)) eller esel anti-geit (opphisset ved 647 nm [1:200)). Inkuber cellene i 2 timer ved RT i mørket.
- Vask i PBS, 7 x 5 min.
- Inkuber cellene med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:4,000) i 10 minutter ved RT.
- Vask i PBS 5 x 5 min.
- Monter dekslene på mikroskopglass ved hjelp av en monteringsløsning; Bruk en dråpe av det per deksel.
MERK: Antistofffortynninger kan variere avhengig av produsent. Brukere må bestemme optimale fortynninger for sine eksperimenter.
3. Time-lapse videoavbildning
MERK: Oppløsninger som inneholder fluorescerende fargestoff skal beskyttes mot direkte lys. Før du starter bildeeksperimentet, må du kontrollere at glassdekselet ikke beveger seg når du slår på perfusjonen.
- Fremstilling av løsninger og celler
- Klargjør ekstracellulær løsning (ECS) for avbildning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukose og 10 mM HEPES. Juster pH-verdien til 7,4. Sørg for at osmolariteten er 280-300 mOsm/kg og klargjør ECS uten Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glukose, 10 mM HEPES og 0,1 mM EGTA.
- Forbered testløsningene: 100 μM ATP oppløst i ECS, 1 μM Thg i ECS uten Ca2+ og 0,1 mg/ml ALS IgG i ECS8.
- Overfør ett deksel til en tallerken med ECS for å vaske ut hele DMEM. Forbered fargestoffbelastningsløsningen ved å fortynne 1 mM stamløsning av Fluo-4 AM med ECS til den endelige konsentrasjonen på 5 μM Fluo-4 AM.
- Plasser dekselet med celler i fargestoffbelastningsløsningen i 30 minutter ved RT i mørket. Vask cellene i ECS i 20 minutter.
- Hvis cellene ikke er tilstrekkelig lastet (dvs. hvis basalnivået av fluorescens er for lavt <5% av kameraets dynamiske område med eksponeringstid større enn 400 ms), øker du lastetiden til opptil 45 minutter til 1 time ved 37 ° C. Alternativt kan du blande Fluo-4 AM stamløsning med et likt volum på 20% (w / v) vaskemiddel (Pluronic) i DMSO før fortynning i ECS, noe som gjør den endelige Pluronic-konsentrasjonen ~ 0,02%.
MERK: De eksperimentelle eksemplene på denne studien ble utført med human IgG isolert fra ALS-pasientenes blodsera som beskrevet tidligere 4,5,11. Hvert eksperiment ble utført med IgG-prøver av en enkelt pasient.
- Bildebehandling av video
MERK: I denne protokollen ble Video Imaging System kombinert med en xenon kortbuelampe, et polykromatorsystem og et omvendt epifluorescensmikroskop utstyrt med vann, glyserin og oljenedsenkingsmål. Timelapse-avbildning ble utført ved hjelp av et digitalkamerasystem.- Slå på komponentene i bildeoppsettet 15 minutter før eksperimentet for å la systemet nå arbeidstemperaturen.
- Plasser dekselet i opptakskammeret med 1 ml arbeidsløsning (ECS eller ECS uten Ca2+).
- Hvis du vil velge riktig bildebehandlingsprotokoll, åpner du bildebehandlingsprogramvaren og velger filterparene for Fluo4-AM med en eksitasjonsbølgelengde ved 480 nm, et dikroisk speil ved 505 nm og en emisjonsbølgelengde ved 535 nm.
- Velg synsfelt og pass på å ha et konsekvent antall celler gjennom hele eksperimentet. Juster eksponeringstiden og detektorforsterkningen på riktig måte, på en slik måte at signalet ikke er mettet. Velg pseudocolor-modus for oppkjøp. For mer detaljerte instruksjoner, se håndboken fra produsenten.
- Juster samplingsfrekvensen til 1 Hz (1 bilde per sekund).
- Start avbildningen ved å oppnå basalnivået av fluorescens i 3-5 minutter for baselinebestemmelse (F0). Sikre en konstant flyt av arbeidsløsningen.
- Stopp flyten av arbeidsløsningen og bytt til testløsningen i ønsket tidsperiode (se også tidslinjer i eksempler på figur 2 og figur 3). Mellom hver testløsning, vask cellene med en konstant strøm av arbeidsløsningen i 3-5 minutter.
- Hold oppløsningsvolumet i opptakskammeret på ~1 ml ved å arrangere et konstant sug fra toppen av oppløsningen (se figur 2E).
MERK: For å påføre behandlingen direkte på de avbildede cellene, ble et tilpasset leveringssystem laget av en glasspipette (0,8 mm indre diameter) plassert ~ 350 μm unna og ~ 1 mm over cellene, i en vinkel på 45 ° kombinert med løsningsutvekslingssystemet som inneholder klemventiler og en elektronisk ventilregulator (se figur 2E).
4. Analyse av data
- Definer et interesseområde (ROI) som tilsvarer den enkelte cellen.
- Velg rammen med høyest signalintensitet (dvs. fra bruk av ATP) og omkrans en celle ved hjelp av applikasjonen Polygonal Tool. Gjenta for alle cellene i det oppkjøpte feltet. Velg fem avkastninger i bakgrunnen ved hjelp av sirkelverktøyet.
- For å måle den gjennomsnittlige signalintensiteten til en enkelt celle og bakgrunnen for hver tidsramme, velg alle avkastninger og bruk Multi Measure-kommandoen i ROI Manager i ImageJ eller en tilsvarende kommando i kommersiell programvare (se materialtabellen).
- Eksporter de gjennomsnittlige signalintensitetsverdiene for avkastningen som et regneark.
- Gjennomsnittlig fem bakgrunnsavkastninger og trekk den gjennomsnittlige bakgrunnen til hver ramme fra den gjennomsnittlige ROI-intensiteten til rammen som er oppnådd samtidig.
- For å normalisere de oppnådde dataene til grunnlinjesignalet, bruk ligning (1):
ΔF/F0 = (F - F 0)/F0 (1)
hvor F er signalintensiteten for hver tidsramme etter bakgrunnssubtraksjon, og F0 er grunnlinjen Fluo-4 fluorescens.
MERK: En skreddersydd kode ble brukt i denne studien. - For å analysere kalsiumaktivitet, bestem flere parametere4: amplituden til kalsiumtoppen (ΔF / F 0), den integrerte endringen (tidsintegral, overflate under responsopptaket) av kalsiumtransienten (ΔF / F 0× s), tid til topp-forløpt tid fra stimuleringens begynnelse til maksimal kalsiumtransient (s), stigningstid som er gått fra stimuleringens begynnelse til verdien av ΔF / F0 som når 50% -80% av maksimal amplitude (er), halv bredde-full bredde av en forbigående ved halv maksimal amplitude (er), frekvens av responser hvis de er repeterende (Hz).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av forskjellige gliacelletyper i kultur
Det tar vanligvis 15-21 dager å produsere astrocytter for eksperimenter, mens mikrogliaceller tar 10-15 dager å vokse. Immunostaining ble utført for å vurdere cellens renhet av kulturen. Figur 1 viser uttrykket for dobbeltmerking av den astrocytiske markøren GFAP og mikroglialmarkøren Iba1 i respektive kulturer.
Kalsiumavbildning er kjent for å avsløre forskjellene i cellefysiologi hos friske og syke astrocytter. Tidligere i villtype astrocytter viste vi at ALS IgG påvirker cellulær Ca2+ ved å mobilisere intra- og ekstracellulære bassenger inn i cytosol8. Følgende protokoll fastslo om det var forskjeller mellom kalsiumtransientene i hSOD1G93A og ikke-transgene dyrkede astrocytter akutt eksponert for ALS IgG-prøver fra pasienter. Astrocytter lastet med Fluo4-AM ble perfundert med ECS i 3 minutter for å oppnå en stabil baseline. Deretter ble 100 μg / ml ALS IgG påført i badekaret i 5 minutter. Astrocytter ble vasket med ECS, og deretter ble 100 μM ATP påført på slutten av hvert opptak for å teste helsen til hver celle og observere kalsiumresponsen til en standard stimulus.
Representative spor i figur 2A, B viser at hSOD1G93A-astrocytter reagerer på ALS IgG med større amplitude av kalsiumtransienten, en større samlet integrert endring og kortere tid til topp enn ikke-transgene astrocytter. Her bør man imidlertid være forsiktig med å tolke kvantitative data når enkeltbølgelengde Ca2+-sonder som Fluo4-AM brukes (se diskusjonsdelen). I tillegg kan formen på responsen på ALS IgG skilles fra responsen på ATP (merk en raskere forbigående med større amplitude i sporene og cellesynkronitet i pseudofargebilder som svar på ATP, figur 2A, B).
Med mål om å studere opprinnelsen til forskjellene i kalsiumresponsen på ALS IgG og ATP mellom hSOD1G93A og ikke-transgene astrocytter, brukte vi en farmakologisk tilnærming til å manipulere interne Ca 2+-lagre under kalsiumavbildning ved å bruke 1 μM Thg. Thg er en ikke-selektiv hemmer av endoplasmatisk retikulum Ca2+ ATPase (SERCA), nedbryting av de intracellulære Ca2+-lagrene nesten umiddelbart, noe som gjenspeiles i et kalsium som varer over flere minutter. For å utelukke effekten av ekstern Ca 2+ i de observerte fenomenene, ble ECS fratatt Ca2+ brukt under forsøket. Etter registrering av basalnivået av fluorescensen i 3 minutter ble 1 μM Thg påført i badekaret i 2 minutter. Etter Thg-indusert kalsiummangel ble astrocytter perfundert med ECS som inneholdt Ca2+ for å indusere og overvåke påfyllingen av lagrene. Representative spor av det beskrevne eksperimentet er vist i figur 2C, D. Som forventet hadde hSOD1G93A-astrocytter et høyere nivå av Ca2+ i butikkene, som avslørt ved butikkuttømming, noe som indikerer en overbelastning av dette ionet. En lignende mekanisme er vist i dyrkede astrocytter fra SOD1G93A transgene mus36.
Kalsiumavbildning av mikrogliaceller i dyrkning
Timelapse-avbildning av mikroglia merket med Fluo-4 AM ble utført på samme måte som beskrevet for astrocytter (figur 3B). Mikrogliaceller ble perfundert med ECS med 2 mM Ca2+ i 3 minutter for å oppnå en stabil baseline, etterfulgt av badepåføring på 100 μg/ml ALS IgG i 5 minutter, vasking med ECS og stimulering med 100 μM ATP. Interessant nok, mens astrocytter lett reagerer på ALS IgG, reagerte et stort flertall av mikrogliaceller ikke på ALS IgG (som illustrert ved at bare en mikroglialcelle reagerte med kalsiumtransient; rødt spor i eksemplet i figur 3A). Imidlertid reagerte de alltid på ATP og på samme måte som astrocytter (figur 3A). Legg også merke til et tilfelle av en spontan Ca2+ forbigående i cellespor 2 (figur 3A) som ikke må forveksles med indusert respons.
Figur 1: Astrocytter og mikroglia i en primærkultur. Representative konfokale bilder av astrocytter (venstre) i kultur merket med GFAP (rød) og mikroglia (høyre) i en kultur farget med Iba1 (grønn). Dobbeltmerking (GFAP/Iba1) ble brukt for å indikere kulturens renhet. DAPI ble brukt til å merke kjerner (blå). Skala barer = 50 μm. Forkortelser: GFAP = glial fibrillært surt protein; lba1 = ionisert kalsiumbindende adaptermolekyl 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Et eksempel på kalsiumavbildningsapplikasjon i en studie av astrocyttpatofysiologi. (A) Et representativt eksempel på et kalsiumavbildningseksperiment der hSOD1G93A-astrocytter ble avbildet i 5 minutter for å samle baseline fluorescens ("baseline"), etterfulgt av en akutt påføring av ALS IgG (0,1 mg/ml) i 5 minutter ("respons på ALS IgG"), og en behandling med 100 μM ATP ("respons på ATP"). Topppanelet viser pseudofargebilder (intensitet av fluorescens er fargekodet, hvor svart tilsvarer svært lav intensitet, mens hvite markerer piksler med høyeste intensitet; fargeintensitetsforhold er representert i en fargelinje til høyre i topppanelet til B som tilsvarer fluorescensintensiteten til en individuell celle i hvert av segmentene i eksperimentet ('baseline', 'respons på ALS IgG', og 'respons på ATP'). De grå stiplede linjene peker på pseudofargebildene av bestemte tidspunkter for det representative kalsiumsporet (i oransje). Den grå boksen i midten av kalsiumsporet markerer 5 minutters påføring av ALS IgG. Svart bar under kalsiumsporet markerer anvendelsen av ATP. (B) Samme som i (A) bortsett fra ikke-transgene astrocytter (spor i blått). (C) Et representativt kalsiumspor (oransje) i hSOD1G93A astrocytt utfordret med 1 μg / ml thapsigargin (svart bar under sporet) i ECS uten kalsium, etterfulgt av tilsetning av 2 mM Ca 2 + ('2 mM Ca2+', svart linje under sporet). (D) Samme som i (C) bortsett fra den ikke-transgene astrocytten (spor er i blått). Amplitudeskala = 100 % ΔF/F0. Tidsskala = 200 s. Skalastenger = 50 μm. (E) Skjema for det eksperimentelle oppsettet som viser den skreddersydde modusen for løsningsutveksling og plassering av pipetten for biokjemisk agentapplikasjon. Forkortelser: ALS = amyotrofisk lateral sklerose; IgG = immunglobulin G; Thg = thapsigargin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et eksempel på kalsiumavbildning av dyrkede mikroglia. (A) Venstre: Brightfield-bilde av dyrkede mikroglia. Siden det er vanskelig å oppnå en ren mikroglialkultur, er astrocytter også tilstede her (større flate polygonale celler, se eksempel indikert med pilspiss). Både forgrenet (liten soma, fremtredende prosesser) og amoeboid microglia (indikert med henholdsvis grønne og gule bokser) er tilstede i kulturen. Midt: Forstørrede gule og cyan bokser fra venstre. Røde, blå og fiolette linjer markerer avkastningen som den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten over tid ekstraheres fra. Til høyre: Kalsiumspor av tre celler i det midterste panelet. Fargen på sporet tilsvarer fargen på avkastningen i midtpanelet. Etter å ha avbildet baseline kalsiumfluorescens ("baseline fluorescens") i 200 s, ble cellene utsatt for en akutt påføring av ALS IgG (0,1 mg / ml) i 5 minutter ("respons på ALS IgG"), etterfulgt av 100 μM ATP ("respons på ATP"). Den grå boksen i midten av kalsiumsporet markerer 5 minutters påføring av ALS IgG. Den svarte linjen under kalsiumsporet markerer anvendelsen av ATP. Merk at bare celle 1 (rødt spor) som representerte et stort mindretall av celler, reagerte på ALS IgG, mens alle celler reagerte på ATP. (B) Pseudofargebilder representerer fluorescensintensiteten i hvert av segmentene av opptakene ("baseline", "respons på ALS IgG" og "respons på ATP") der oransje stiplede linjer peker på de spesifikke tidspunktene i de representative kalsiumsporene (A, høyre panel). Grønne og oransje bokser markerer amoeboid microglia (samme som i A). Forholdet mellom fargeintensitet er representert i en fargelinje til høyre. Amplitudeskala = 100 % ΔF/F0. Tidsskala = 100 s. Skala barer = 50 μm. Forkortelser: ALS = amyotrofisk lateral sklerose; IgG = immunglobulin G; ROI = interesseområde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen presenterer metoden for primærcelledyrking som et raskt og "på budsjettet" verktøy for å studere ulike aspekter av celle (pato) fysiologi som ALS i rotte hSOD1G93A-modellen . Teknikken er dermed egnet for studier på enkeltcellenivå som kan ekstrapoleres og undersøkes videre på et høyere organisasjonsnivå (dvs. i vevsskiver eller i et levende dyr). Celledyrking som teknikk har imidlertid noen forbehold. Det er mest kritisk å gjøre hjernevevisolasjon og dissosiasjon av celler på is og å utføre disse og påfølgende stadier av isolasjon og forberedelse på kortest mulig tid. Forurensning er en alltid tilstedeværende hindring som kan overvinnes ved å bruke godt sterilisert utstyr og ta særlig forsiktighet i å utføre vevsdissosiasjon i laminær hette37. Det er også viktig å frø riktig tetthet av celler. Hvis antall celler som er sådd er mindre enn ønsket antall, vil dette ikke støtte celleveksten og forplantningen i parabolen. Men hvis cellene er for tette, vil det være konkurranse mellom dem om næringsstoffene i vekstmediet, og dermed mer celledød. Derfor er det tilrådelig å telle de dissosierte cellene før såing, i hvert fall før det oppnås noen erfaring med det riktige forholdet mellom startvevet og dissosiasjonsvolumet.
GFAP er en mye brukt astrocyttmarkør og brukes ofte til å vurdere cellekulturens renhet38,39. Imidlertid er bare GFAP ikke tilstrekkelig når man studerer astrocytreaktivitet. Det anbefales å kombinere det med en spredningsmarkør som Ki67 eller andre astrocyttmarkører (glutaminsyntetase, aldolase-C eller aldehyddehydrogenase-1)18,38. Selv om disse teknikkene har en tendens til å gi rene gliacelle-type kulturer, må det tas hensyn til å vurdere kulturcellerenhet. Dette er spesielt viktig for mikrogliacellekulturer som vanligvis inneholder noen oligodendrocyttforløpere eller astrocytter34. Spesifikke markører for mikrogliaceller tiltrekker seg mye interesse. Den mest brukte markøren er Iba1, men andre ofte brukte markører, som differensieringsreseptorer (CD68, CD45) og frakttalkinreseptor (CX3CR1), kan også påvises i andre celler (for mer detaljert, se40). For tiden er de mest spesifikke markørene for mikroglia TMEM119 og den purinerge reseptoren P2Y1241, selv om et nylig papir har reist bekymring angående TMEM119-spesifisitet42.
Introduksjon av timelapse live-cell imaging gir fordelen av å overvåke cellulære prosesser, for eksempel Ca2 + signalering, i sanntid. I tillegg gir moduleringen av celleoppførsel ved å bruke forskjellige kjemiske midler (f.eks. Thg her) ytterligere informasjon for beskrivelse av veiene og signalbudbringere aktivert i en sunn celle eller en cellulær sykdomsmodell (isolert og dyrket her fra hSOD1G93A ALS-rotte). Når du arbeider med cellemembranpermeable fluorescerende fargestoffer som Fluo-4 AM, er det viktig å finne riktig konsentrasjon og inkubasjonstid for fargestoffet for å fylle det indre av cellen. Hvis det tar for lang tid, kan fargestoffopptaket økes ved å holde cellene i en inkubator ved 37 °C. I mer alvorlige tilfeller kan et mildt vaskemiddel (f.eks. Pluronic F-127) brukes i lasteløsningen. Det anbefales heller ikke å oppnå det ovennevnte ved å øke konsentrasjonen av fargestoffet over 10 μM. Faktisk, ved høyere konsentrasjoner, kan fargestoffet fungere som en Ca 2+ buffer og dempe Ca2+ signalamplituden.
Det er også verdt å nevne at i tillegg til Fluo-4 og lignende enkeltbølgelengdefarger, finnes det Ca 2+ -sensitive ratiometriske fargestoffer (f.eks. Fura-2) som avgir ved en måling og ved en Ca2+ -ufølsom referansebølgelengde. Slike målinger er dermed ufølsomme for skjevheten forårsaket av ujevn fargestofffordeling i cellen og for endringer i den optiske banen. Likevel er det tilrådelig å bruke enkeltbølgelengdefarger, spesielt med høyaffinitetsindikatorer som Fluo-4, i tilfeller der relative målinger gjøres i samme prøve, eller hvor man først og fremst følger dynamikken i prosessen og ikke reelle Ca2+ konsentrasjonsendringer43. Disse målingene kan likevel ikke brukes til kvantitative data når det gjelder Ca2+-konsentrasjon, og det må utvises forsiktighet ved tolkning av amplituder fra dataene som presentert i figur 2.
Vi har her demonstrert hvordan bruk av dette avbildningsanlegget på levende celler - astrocytter i kultur - kan avsløre subtile intracellulære mekanismer for patofysiologi som påfylling av Ca 2+ butikker og butikkdrevet Ca2+ oppføring, som er forstyrret i ALS-modellen, i samsvar med tidligere resultater på murine celler36. Dette kan da forklare en høyere følsomhet av hSOD1G93A-astrocytter til ALS IgG som foreslått her, som kan potensere patologiens progresjon. For å sammenligne målinger i slike eksperimenter, er det tilrådelig å ha en lignende celletetthet i synsfeltet, og at de samme cellerommene tas for avkastning (f.eks. Soma vs prosesser).
Et eksempel ble vist her at mikrogliaceller ikke reagerte på ALS IgG med samme kraft som astrocytter. Dette er i tråd med funnet av den knappe genereringen av peroksid i mikrogliacellelinjen ved ALS IgG-behandling15. Samlet sett peker denne tilnærmingen på en cellespesifikk respons på IgG relatert til ALS, også et viktig faktum realisert ved bruk av rene cellekulturer av mikroglia versus astroglia. Bruk av gliaceller fra modellene av nevropatofysiologi eller avledet fra pasienters induserbare pluripotente stamceller har fremtiden for fysiologisk biomarking i alvorlige nevrale sykdommer som ALS. Det ville derfor være viktig å forstå fin Ca2+ signalering som fingeravtrykk av den spesielle tilstanden til sykdommen eller å skille mellom forskjellige excitotoksiske sykdommer. For disse formålene må en maskinlæringsprosedyre utvikles og dataopptak kategoriseres. I tillegg kan disse cellene dyrkes i kultur og sådd i en mikrofluidisk enhet som skal brukes til diagnose eller for pasientstratifisering av nevrodegenerativ sykdom ved å fremkalle et svar på ulike humorale faktorer av nevroinflammasjon (f.eks. Sera, IgG, CSF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av departementet for utdanning vitenskap og teknologisk utvikling Republikken Serbia kontrakt nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, FENS - NENS Education and Training Cluster-prosjektet "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation", og EC H2020 MSCA RISE-stipend #778405. Vi takker Marija Adžić og Mina Perić for å levere immunhistokjemibildene og Danijela Bataveljić for hjelp med papirskriving.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957 (2022).
- Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
- Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6 (2009).
- Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710 (2021).
- Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
- Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
- Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
- Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
- Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
- Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
- Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
- Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619 (2017).
- Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
- Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
- Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
- Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355 (2021).
- Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209 (2020).
- Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880 (2019).
- Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
- Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
- Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
- Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121 (2016).
- Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573 (2019).
- Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
- Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
- Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
- Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
- Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100 (2020).
- Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
- Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
- Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198 (2020).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
- Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
