Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Микродиссекция слоев трехстворчатых клапанных листовок для двухосной механической характеристики и микроструктурной количественной оценки

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63522
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Biomechanics and Biomaterials Design Laboratory (BBDL), School of Aerospace and Mechanical Engineering, The University of Oklahoma, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (IBEST), The University of Oklahoma

Summary

Этот протокол описывает двухосную механическую характеристику, поляризованную пространственную частотную обработку коллагена на основе визуализации и микродиссекцию листовок трикуспидального клапана. Представленный метод разъясняет, как слои листовок способствуют целостному поведению листовок.

Abstract

Трикуспидальный клапан (ТВ) регулирует однонаправленный поток неоксигенированной крови из правого предсердия в правый желудочек. Телевизор состоит из трех листовок, каждая из которых имеет уникальное механическое поведение. Эти различия между тремя телевизионными листовками могут быть дополнительно поняты путем изучения их четырех анатомических слоев, которые являются атриальными (A), губчатыми (S), фиброзными (F) и желудочковыми (V). Хотя эти слои присутствуют во всех трех телевизионных листовках, существуют различия в их толщине и микроструктурных составляющих, которые дополнительно влияют на их соответствующее механическое поведение.

Этот протокол включает в себя четыре шага для выяснения различий, специфичных для уровня: (i) охарактеризовать архитектурное поведение механического и коллагенового волокна неповрежденной телевизионной листовки, (ii) разделить составные слои (A / S и F / V) телевизионной листовки, (iii) выполнить те же характеристики для составных слоев и (iv) выполнить пост-hoc оценка гистологии. Эта экспериментальная структура уникально позволяет напрямую сравнивать неповрежденную телевизионную ткань с каждым из ее составных слоев. В результате с помощью этого протокола можно собирать подробную информацию о микроструктуре и биомеханической функции телевизионных листовок. Такая информация потенциально может быть использована для разработки телевизионных вычислительных моделей, которые стремятся обеспечить руководство для клинического лечения телевизионного заболевания.

Introduction

Телевизор расположен между правым предсердием и правым желудочком сердца. На протяжении всего сердечного цикла телевизор регулирует однонаправленный кровоток посредством циклического открытия и закрытия передней листовки телевизора (TVAL), задней листовки TV (TVPL) и телевизионной септальной листовки (TVSL). Эти листочки сложны и имеют четыре отдельных анатомических слоя — атриальный (A), губчатый (S), фиброза (F) и желудочковый (V) — с уникальными микроструктурными компонентами. Волокна эластина в предсердиях и желудочковых помогают восстановить ткань до ее недеформированной геометрии после механической нагрузки1. Напротив, фиброза содержит плотную сеть волнистых коллагеновых волокон, которые способствуют несущей способности листовок2. В основном состоящая из гликозаминогликанов, губчатая оболочка была предложена для обеспечения сдвига между слоями листовок во время функции сердечного клапана3. Хотя все три типа листовок имеют одинаковые анатомические слои, существуют различия в толщине слоев и составляющих соотношениях, которые имеют последствия для механического поведения, специфичного для листовки.

Исследователи изучили свойства телевизионных листовок, используя планарные механические характеристики, гистоморфологические оценки и оптические характеристики архитектуры коллагенового волокна. Например, плоские двухосные механические характеристики стремятся имитировать физиологическую нагрузку путем приложения перпендикулярных перемещений к ткани и регистрации связанных сил. Полученные в результате наблюдения за силовым смещением (или напряжением-растяжением) показали, что все три телевизионные листовки демонстрируют нелинейное, специфичное для направления механическое поведение с более очевидными специфическими реакциями в направлении радиальной ткани 4,5,6. Считается, что такое поведение, специфичное для листовок, связано с различиями в микроструктурных свойствах, наблюдаемых с использованием стандартных гистологических методов 6,7. Кроме того, визуализация второй гармонической генерации6, малоугловое рассеяние света8 и поляризованная пространственная визуализация в частотной области7 (pSFDI) направлены на понимание этих микроструктурных свойств и показали специфические различия в ориентации коллагенового волокна и обжиме волокна, которые имеют последствия для наблюдаемого механического поведения на тканевом уровне. Эти исследования значительно продвинули наше понимание микроструктуры ткани и ее роли в поведении на тканевом уровне. Тем не менее, многое еще предстоит решить в экспериментальном соединении тканевой механики и лежащей в ее основе микроструктуры.

Недавно эта лаборатория выполнила механическую характеристику слоев телевизионных листовок, разделенных на два композитных слоя (A/S и F/V) с использованием метода микродиссекции9. Эта более ранняя работа выявила различия в механических свойствах слоев и помогла понять, как слоистая микроструктура способствует механическому поведению тканей. Хотя это исследование улучшило наше понимание микроструктуры телевизионных листовок, метод имел несколько ограничений. Во-первых, свойства композитных слоев не сравнивались напрямую с интактной тканью, что приводило к отсутствию полного понимания взаимосвязи механика-микроструктура. Во-вторых, архитектура коллагеновых волокон композитных слоев не исследовалась. В-третьих, из-за трудностей со сбором композитных слоев из двух других телевизионных листовок были исследованы только слои TVAL. Способ, описанный в настоящем описании, обеспечивает целостную структуру характеристик, которая преодолевает эти ограничения и обеспечивает полную характеристику телевизионных листовок и их составных слоев.

В этой статье описывается метод микродиссекции, который разделяет три телевизионные листовки на их составные слои (A / S и F / V) для двухосных механических и микроструктурных характеристик 10,11,12. Этот итеративный протокол включает в себя (i) двухосные механические испытания и характеристику pSFDI неповрежденной листовки, (ii) новый и воспроизводимый метод микродиссекции для надежного получения композитных телевизионных слоев и (iii) двухосные механические испытания и характеристику pSFDI композитных телевизионных слоев. Ткань подвергалась двухосной растягивающей нагрузке с различными соотношениями сил для механических испытаний. Затем pSFDI использовался для определения ориентации и выравнивания коллагенового волокна в различных конфигурациях нагрузки. pSFDI сохраняет нативную архитектуру коллагеновых волокон, позволяет проводить анализ в зависимости от нагрузки и обходит типичную необходимость фиксации или очистки ткани для анализа архитектуры коллагеновых волокон, например, при визуализации генерации второй гармоники или рассеянии света под малым углом. Наконец, ткани были подготовлены с использованием стандартных методов гистологии для визуализации микроструктуры ткани. Эта итеративная и целостная структура позволяет напрямую сравнивать механические и микроструктурные свойства телевизионной брошюры с ее составными слоями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все способы, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Оклахомы. Ткани животных были приобретены на скотобойне, одобренной Министерством сельского хозяйства США.

1. Двухосная механическая характеристика

  1. Подготовка тканей
    1. Достаньте листовку телевизора из морозильной камеры, бритвенные лезвия, хирургическую ручку, щипцы, пипетку с деионизированной (DI) водой и режущий коврик. Разморозьте листовку телевизора, используя 2-3 капли воды DI комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вода DI используется вместо фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), чтобы избежать любых трудностей, вызванных PBS для микродиссекции слоя.
    2. Выложите образец плоско на режущий мат желудочковым слоем (т.е. поверхностью с вставками хорд) лицом вверх. Расположите образец так, чтобы радиальное направление совпадало с направлением Y, а окружное направление совпадало с направлением X.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окружное направление ориентировано по окружности клапана.
    3. Исследуйте места введения хорд ткани. Определите область, в идеале ~12 x 12 мм, с наименьшим количеством больших вставок хорд, избегая при этом чрезвычайно тонких (т.е. прозрачных) областей (рисунок 1).
    4. Переверните образец так, чтобы поверхность предсердий (т.е. поверхность без хордовых вставок) была обращена вверх. Убедитесь, что окружное и радиальное направления листовок остаются выровненными с осями X и Y соответственно.
    5. Вырежьте квадратный образец размером 12 х 12 мм из ткани листочка, который позволяет избежать введения больших хорд или тонких областей, определенных на этапе 1.1.3. Удалите обрезанные части ткани листочка щипцами и поместите их в контейнер для отходов.
      1. Если нет возможности полностью избежать больших введений хорд, обрежьте ткани так, чтобы они находились по краю квадратного образца. Избегание вставки хорд важно, так как это помогает предотвратить проблемы для последующей микродиссекции.
    6. Используйте хирургическую ручку, чтобы поместить небольшую точку в правом верхнем углу, чтобы отслеживать ориентацию образца. Дайте чернилам высохнуть в течение примерно 30 с.
    7. Переверните образец желудочковой поверхностью (т.е. поверхностью с хордальными вставками) лицом вверх. Обрежьте хордальные крепления на задней части ткани, растянув хорды от листка и используя лезвие бритвы, чтобы разрезать рядом с местом его вставки. Переверните образец еще раз, чтобы поверхность предсердий (т.е. гладкая поверхность) была обращена вверх.
  2. Измерение толщины
    1. Извлеките бесконтактный лазерный датчик смещения. Обнулите датчик смещения на плоском участке режущего коврика рядом с обрезанной тканью.
      ВНИМАНИЕ: Не светите лазером непосредственно в глаза.
    2. Расположите лазер над центральной областью образца. Удалите воздух, захваченный под поверхностью листовки, так как это может привести к ошибкам измерения. Чтобы выпустить захваченный воздух, либо используйте пинцет, чтобы подтолкнуть пузырь к краю ткани, либо поднимите один угол ткани.
    3. Запишите толщину, отображаемую на дисплее датчика перемещения. Повторите еще два измерения в других местах образца.
    4. Вычислите среднюю толщину листовки, используя три измерения, записанные на предыдущем шаге. Используйте это значение при создании двухосных протоколов механической характеристики.
  3. Установка двухосного тестера и тканевый монтаж
    1. Подготовьте водяную баню DI при 37 °C, следуя рекомендациям системы тестирования, чтобы обеспечить температуру в физиологических условиях in vivo .
    2. Извлеките щипцы, образец ткани, монтажное оборудование, инструмент с мелким наконечником, жидкий цианоакрилатный клей и окрашенные в черный цвет стеклянные шарики (диаметр: 300-500 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажное оборудование включает в себя зубья, монтажный мост и монтажную резину.
    3. Установите образец ткани на систему тестирования. Убедитесь, что окружное направление ткани совпадает с X-направлением, чему может помочь точка, предварительно размещенная на шаге 1.1.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь зубцы должны быть равномерно распределены по всей длине края ткани. Эффективная длина кромки составляет 10 мм для неповрежденной ткани и >3,3 мм для композитных слоев.
  4. Размещение фидуциальных маркеров
    1. Определите центральную треть квадратной области смонтированной ткани. Используйте приблизительные углы этой области для размещения фидуциального маркера.
    2. Поместите стеклянные бусины в открытую весовую лодку и создайте небольшой бассейн жидкого цианоакрилатного клея в отдельной весовой лодке. Покройте верхнюю часть инструмента с тонким наконечником небольшим количеством клея. Нанесите лишний клей на борт весовой лодки.
    3. Создайте один угол центрального квадратного массива в одну треть, осторожно надавливая наконечник с клеевым покрытием на ткань. С помощью щипцов возьмите стеклянную бусину и аккуратно положите ее поверх клеевой точки. Используйте камеру двухосного испытательного устройства для помощи в размещении бусин.
    4. Повторяйте шаги 1.4.2 и 1.4.3 для трех дополнительных шариков до тех пор, пока квадратный массив не будет завершен. Убедитесь, что бусины надежно прикреплены, а их соответствующие клеевые точки не соприкасаются и не слипаются. Высушите клей перед опусканием ткани на водяную баню.
      1. Если бусины склеены, подождите, пока клей высохнет, затем используйте щипцы, чтобы аккуратно схватить бусину или клей и оторвать его от ткани.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клей и бусины должны отрываться, что позволяет повторно укладывать бисероплетение.
  5. Предварительная подготовка
    1. Создайте протокол предварительного кондиционирования с контролем силы, в котором ткань с длиной и толщиной кромки будет подвергаться шести повторениям эквибиаксиальной нагрузки до пика напряжения мембраны Т 40 Н/м с преднагрузкой 3% × Тпиком10 и временем растяжения и восстановления 30 с каждый.
      1. Создайте произвольный каталог тестирования, в котором будут временно храниться данные для будущих вычислений. Установите скорость загрузки равным 4,42 Н/м.
      2. Создайте новый набор параметров тестирования с именем Preconditioning0. Установите режимы управления по осям X и Y для принудительного и установите функции управления на шаг. Определите величину нагрузки как силу, связанную с пиком T, т.е. f пик = Tпик · L. Определите величину преднагрузки как 3% от пика f только для первого повторения и определите как продолжительность растяжения, так и продолжительность восстановления как 30 с. Определите количество повторений как 10.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитанный пик первого напряжения Пиолы-Кирхгофа, т.е. пик P = пик T/t, может превышать 200 кПа для более тонких тканей, что может привести к разрыву тканей во время тестирования. В этих сценариях пиковое напряжение мембраны было скорректировано до максимального первого напряжения Пиолы-Кирхгофа в 200 кПа.
    2. Выполните протокол предварительного кондиционирования. После предварительной подготовки запишите текущие X- и Y-размеры образца для использования в протоколах двухосного тестирования.
  6. Создание и выполнение протоколов двухосного тестирования
    1. Определите время, необходимое для достижения пиковой эквибиаксиальной конфигурации из пост-предусловленной конфигурации с желаемой скоростью смещения. Учитывая постоянную скорость перемещения, вычислите время загрузки для остальных коэффициентов нагрузки (т.е. TXX:TYY = 1:0,5 и TXX:TYY = 0,5:1).
    2. Вручную запускайте линейные приводы в соответствии с целевыми силами для заданного коэффициента нагрузки. Повторите этот процесс и запишите размеры листовки для всех коэффициентов загрузки.
    3. Подготовьте протокол испытаний с контролируемым смещением, который биаксиально смещает ткань из постпредупрежденной конфигурации в конфигурации, зарегистрированные на этапе 1.6.2 (т.е. TXX:TYY = 1:1, 1:0.5, 0,5:1) в течение времени, определенного на этапе 1.6.1. Убедитесь, что каждый протокол имеет три цикла загрузки/разгрузки для повторяемости механического поведения.
      1. Создайте каталог тестирования, в котором будут храниться данные для будущих вычислений. Убедитесь, что имя каталога совпадает с текущим образцом.
      2. Создайте новый набор параметров тестирования с именем 1:1, установите режимы управления по осям X и Y на смещение, а функции управления — на рампу. Определите величину растяжения в конфигурации, записанной на шаге 1.6.1. Определите величину преднагрузки как 3% от пика f только для первого повторения и определите как продолжительность растяжения, так и продолжительность восстановления как время, записанное на шаге 1.6.1. Определите количество повторений как 3.
      3. Повторите этап 1.6.3.2 для остальных коэффициентов нагрузки (т.е. TXX:TYY = 1:0,5 и TXX:TYY = 0,5:1), за исключением определения величины преднагрузки как неприменимой. Убедитесь, что величина растяжения, продолжительность растяжения и продолжительность восстановления соответствуют тем, которые зафиксированы в шаге 1.6.2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа напряжений и деформаций будут использоваться только данные заключительного (третьего) цикла.
    4. Выполняйте протоколы, контролируемые перемещением. После завершения биаксиального тестирования верните ткань к ее посткондиционным размерам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест должен быть немедленно прерван, если ткань начинает разрываться.
  7. Дополнительные характеристики
    1. Оставьте ткань погруженной в воду DI и установленной на двухосевой испытательной системе. Выполните визуализацию pSFDI, как описано в шагах 2.1-2.3.
    2. Размонтируйте ткань. Если это неповрежденная ткань, перейдите к микродиссекции, описанной на этапах 3.1-3.7. Если нет, соберите гистологию, следуя шагу 3.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Водяная баня DI может быть использована для последующих характеристик в течение того же дня.
    3. Повторите шаги 1.2-1.7 со слоями A/S и F/V, полученными после микродиссекции (шаги 3.1-3.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторение протокола тестирования для слоев позволяет напрямую сравнивать неповрежденную ткань с ее собственными слоями.
  8. Процедуры постобработки данных двухосного тестирования
    1. Выполните корреляцию цифровых изображений полученных двухосных тестовых изображений для определения зависящих от времени положений маркеров. Вычислите смещения фидуциальных маркеров с помощью Eq (1). 5 См.
      Equation 6 (1)
      При этом xi(t), Xi и di(t) являются зависящим от времени местоположением, начальным (эталонным) местоположением и смещением маркера i.
    2. Вычислите градиент деформации F , рассматривая конечные маркеры как четырехузловой билинейный конечный элемент, как показано в Eq (2)5
      Equation 1 (2)
      Где BXi и BYi являются производными функций формы для узла i в X- и Y-направлениях соответственно, а ui(t) и vi(t) являются компонентами di(t): di(t) = [ui(t), vi(t)]T.
    3. Вычислите приложенное первое напряжение Пиолы-Кирхгофа P , используя записанные силы, как в Eq (3)5
      Equation 3 (3)
      PXX и PYY являются X- и Y-компонентами P; L и t - длина и толщина края ткани; fX и fY — силы, регистрируемые в направлениях X и Y.
    4. Определите другие меры деформации и напряжения по мере необходимости13, которые включают правильную деформацию Коши-Грина C = FT/F, деформацию Грина-Лагранжа E = (C - I)/2, напряжение Коши σ = J-1PFT и второе напряжение Пиолы-Кирхгофа S = F-1P.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь I — тензор идентичности второго порядка, а J = det(F) — якобиан градиента деформации F.

2. Поляризованная пространственная визуализация частотной области

  1. Подготовка системы
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании фидуциальные маркеры могут быть удалены из ткани до следующих этапов.
    1. Центрируйте устройство pSFDI над образцом (рисунок 2). Включите проектор и осветите образец 490 нм (голубым) светом.
    2. Откройте программное обеспечение камеры и осмотрите поле зрения камеры. Убедитесь, что образец центрирован в раме и полностью содержится в поле зрения.
    3. Если установленный образец представляет собой неповрежденный листок-вкладыш, отрегулируйте яркость проектора цифровой обработки света (DLP), чтобы ткань была полностью освещена без бликов на поверхности ткани. Не регулируйте яркость, если образец является одним из составных слоев.
    4. Вращайте поляризатор во всем диапазоне движения, чтобы обнаружить возможные блики или грязь на линзе поляризатора. Тщательно очистите линзу поляризатора салфеткой из микрофибры по мере необходимости.
  2. Сбор данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий сбор данных может быть автоматизирован с помощью программного обеспечения, такого как LabVIEW или Python.
    1. Переместите поляризатор в его домашнее положение, идеально выровненное с одной из двухосных испытательных осей. Захватите одно изображение в градациях серого и сохраните его на компьютере с расположением поляризатора (т. Е. 0°).
    2. Поверните поляризатор на 5° и сделайте еще одно изображение в градациях серого. Повторите этот процесс, чтобы получить 37 изображений в диапазоне от 0° до 180° с шагом 5°.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения из первой последовательности визуализации pSFDI могут быть предварительно проанализированы для обеспечения желаемого оптического отклика от ткани. Инструкции см. в шаге 2.3.
    3. Повторите последовательность визуализации pSFDI для других желаемых конфигураций тканей, например, пиковых конфигураций протоколов нагрузки, рассматриваемых для двухосных механических испытаний.
  3. Процедуры постобработки данных pSFDI
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий метод включает шаги для языка программ MATLAB. Однако вместо этого может использоваться любой предпочтительный язык (например, Python, C++).
    1. Используйте функцию MATLAB imread() для построения массивов, содержащих пиксельную интенсивность 37 полученных изображений. Для удобства расположите их как n × m × 37 трехмерного массива, где n и m — числа пикселей вдоль двух осей.
    2. Определите интересующую область ткани (ROI) с помощью определяемой пользователем функции grabit( ).
    3. Подгонка данных интенсивности и угла поляризатора для каждого пикселя ROI с помощью 3-терминального ряда Фурье, как в Eq (4):
      Equation 4 (4)
      Здесь I(θ) — пиксельная интенсивность в зависимости от угла поляризатора, а bi — константы Фурье. Используйте стандартную линейную регрессию наименьших квадратов для определения bi.
    4. Определите попиксельную ориентацию волокна как угол поляризатора, связанный с максимальным значением I(θ). Вычислите степень оптической анизотропии (DOA) через Eq (5).
      Equation 5 (5)
    5. Используйте plot() и histogram() для визуализации полученной ориентации волокна и значений DOA. Сохраните обработанные результаты для последующего использования.

3. Микродиссекция композитных слоев трехстворчатых клапанных листовок

  1. Прикрепление тканей к восковой доске
    1. Соберите необходимые материалы: восковую доску, воду DI, пипетку, скальпель, микроножницы, тонкие щипцы, изогнутые щипцы, толстые щипцы и штифты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только пинцет без зубов или захватов, так как щипцы этого типа могут очень легко разорвать тонкую ткань слоя A/S при выполнении рассечения.
    2. Отсоедините ткань от двухосного тестера и измерьте ее толщину с помощью лазерного датчика смещения, описанного на этапе 1.2. Поместите ткань на восковую доску.
    3. Исследуйте желудочковую сторону ткани на предмет больших вставок хорд. Обратите внимание на положение этих вставок, чтобы избежать их во время вскрытия (дополнительный рисунок S1). Сделайте фотографию для справки.
    4. Выложите ткань плоско на восковую доску атриалисом вверх. Прикрепите ткань к плате с помощью штифтов:
      1. В каждый угол ткани поместите один штифт, который находится под углом от ткани (для лучшего обзора) и слегка притягивает ткань подтянутой (рисунок 3А). Делайте это по часовой стрелке или против часовой стрелки. Убедитесь, что штифты находятся вне отверстий, созданных зубьями при монтаже ткани.
      2. Слегка отрегулируйте расположение штифта, чтобы ткань была подтянутой и в квадратной конфигурации (рисунок 3B), чтобы ткань лежала плоской и не смещалась во время микродиссекции слоя.
      3. При необходимости поместите штифты вдоль боковой стороны ткани во время рассечения, чтобы растянуть ткань больше. При размещении и ловле дополнительных штифтов имейте в виду, что они должны быть обойдены во время рассечения.
      4. Снимите стеклянные шариковые фидуциальные маркеры.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий шаг является необязательным. Добавленная вода DI помогает поддерживать гидратацию тканей и предотвращает прилипание ткани к себе на протяжении всей микродиссекции.
      5. Используя пипетку, поместите воду DI на поверхность ткани так, чтобы она полностью покрывала ткань пузырьковым образом. Пополняйте воду DI по мере необходимости на протяжении всего рассечения.
  2. Сделайте начальный угол.
    1. Выберите угол закрепленного образца, чтобы начать вскрытие. Избегайте больших вставок хорд и чрезвычайно тонких областей.
    2. Сделайте разрез в слое A/S, слегка перетащив скальпель по поверхности ткани вдоль монтажных отверстий из механических испытаний (рисунок 3C). Убедитесь, что разрез имеет длину не менее 5 мм, а края разреза начинают раздвигаться, открывая слой F / V под ним.
    3. Используйте тонкие щипцы (без острого кончика), чтобы плотно потереть вдоль разреза и раздвинуть края разреза (дополнительный рисунок S2).
      1. Если разрез в слое A/S не начинает раздвигаться, слегка проведите по тому же срезу снова скальпелем, пока он не начнет это делать. Будьте осторожны, чтобы не врезаться слишком глубоко в ткань (мимо композитного слоя A / S), так как это затрудняет чистое разделение слоев.
    4. Повторите шаги 3.2 и 3.2.3, чтобы сделать второй разрез перпендикулярным первому срезу (рисунок 3D). Убедитесь, что два разреза соединены и образуют угол.
      1. Если два разреза не соединены, проведите тонкий пинцет под небольшой областью ткани, разделяющей два разреза (дополнительный рисунок S3). Затем осторожно используйте ножницы, чтобы разрезать ткань.
  3. Отклейте ткань от угла.
    1. Растирайте вдоль разрезов тонкими щипцами до тех пор, пока ткань не начнет отделяться от слоя F / V. Как только небольшой кусочек ткани отделится, обхватите его пинцетом и осторожно потяните его для дальнейшего разделения композитных слоев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда помещайте кончик тонкого пинцета мимо края ткани при захвате. В противном случае они могут случайно проткнуть отверстие в композитном слое A/S.
    2. Продолжайте отслаивать ткань и растирать шов до тех пор, пока он не достигнет конца двух разрезов, сделанных для угла. На протяжении всего этого процесса переключайтесь на более крупные пинцеты, чтобы захватить ткань для процесса шелушения, чтобы предотвратить нежелательное разрыв и разрыв композитного слоя A / S.
      1. Если первая попытка поворота имеет серьезные проблемы с разделением, попробуйте другой угол в качестве отправной точки (вернитесь к шагу 3.2).
  4. Вытяните разрезы, отклейте ткань и сделайте второй угол.
    1. Вытяните два разреза, сделанных для первого угла, поместив кончик скальпеля в нижнюю часть каждого разреза и слегка проведя его по поверхности ткани (рисунок 4А). Убедитесь, что все удлинительные разрезы имеют размер не менее 5 мм, а удлинители разрезов соединяются с исходными разрезами и продолжают следовать за отверстиями для швов или швов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если удлинительный срез слишком глубокий, то необходимо тщательно контролировать предстоящее отслаивание, чтобы гарантировать, что участки фиброзы не разделены композитным слоем A/S (рисунок 5A).
    2. Продолжайте расширять разрезы и отслаивать верхний композитный слой A/S обратно, протирая шов до тех пор, пока одна сторона не будет закончена. Обратите внимание, что ткань будет отделена полностью вдоль одного разреза; убедитесь, что шов между композитными слоями A/S и F/V является прямым (рисунок 4B).
    3. Повторите инструкции на шагах 3.2 и 3.3, чтобы создать второй угол перпендикулярно концу полностью отслаиваемой стороны (рисунок 4C).
  5. Полностью разделите слой A/S.
    1. Вытяните оставшиеся разрезы, избегая больших вставок хорд. Продолжайте разделять слои A/ S и F / V, используя методы трения и вытягивания, используемые для первого угла. Запишите несколько соображений или проблем, которые могут возникнуть в ходе этого процесса:
      1. Исключайте вставки хорд из зоны разделения A/S (рис. 5B) только в том случае, если это исключение позволит получить образец A/S, достаточно большой для экспериментальных характеристик (>3,3 мм).
      2. Если ткань разрывается или образуется отверстие, немедленно прекратите отделение ткани. Чтобы предотвратить попадание пинцета, поместите ножницы в любое отверстие, которое образуется, и отрежьте ткань от центра. Если дефект образуется вдоль шва разделения, то начинают отделять ткань вдоль другого края для предотвращения дальнейшего разрыва (рисунок 5С).
      3. Ищите межслойные соединения, которые могут появляться при отделении ткани и предотвращайте дальнейшее разделение ткани без высокого риска разрыва (рисунок 5D). Обратите внимание, что это тонкие, но прочные пряди, которые необходимо аккуратно разрезать ножницами. Избегайте создания отверстия в слое A/S или разрезания вниз слоя F/V, так как это приведет к неравномерному разделению.
      4. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока не будет отделен как можно больший выборочный слой A/S. Отметьте ориентацию образца с помощью хирургической ручки (рисунок 6А).
  6. Закончите рассечение.
    1. Ножницами разрезать вдоль шва отделения оставшийся край ткани (рисунок 6B). Убедитесь, что этот срез находится как можно ближе к шву разделения.
    2. Поместите отдельный композитный слой A/S ровно на режущий мат. При необходимости используйте скальпель для выпрямления краев ткани и создания квадратной формы ткани, подходящей для двухосного механического испытания. Поместите слой A/S в воду DI до тех пор, пока он не будет готов к тестированию.
    3. Отметьте ориентацию слоя F/V, оставшегося на восковой доске. Вырежьте максимально возможный квадрат из области, где был удален слой A/S (рисунок 6C), затем поместите его в воду DI.
  7. Гистология
    1. Иссечение двух полосок ткани, выровненных с окружным и радиальным направлениями, для использования в гистологии. Используйте разные протоколы для неповрежденных и составных слоев (например, A/S и F/V).
      1. Для неповрежденного слоя возьмите образцы из ткани, которая остается прикрепленной к восковой доске. Используйте ткань вне отверстий для швов, так как эта часть ткани не была рассечена и будет представлять собой неповрежденный листок.
      2. Для композитных слоев A/S и F/V собирайте гистологические образцы только после полного завершения их тестирования и визуализации. Смонтируйте образец из двухосной испытательной системы, положите ткань на режущий мат и иссейте кольцевые и радиальные полоски с помощью лезвия бритвы.
    2. Поместите иссеченные полоски в тканевые кассеты и погрузите кассеты в 10% формалин.
    3. Отбросьте оставшуюся ткань. Очистите инструменты для рассечения с помощью чистящего состава (см. Таблицу материалов).
    4. После 24-48 ч фиксации переведите кассеты на этанол, где их можно хранить неопределенно долго до гистологической обработки и окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот гистологический анализ может подтвердить, что микродиссекция прошла успешно. ВНИМАНИЕ: 10% формалин вызывает раздражение кожи и серьезные повреждения глаз. Это также может вызвать аллергическую реакцию или рак через вдыхание. При обращении носите соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, очки и лабораторный халат, и используйте только в хорошо проветриваемых помещениях, например, в вытяжном шкафу. Когда контейнер не используется, убедитесь, что контейнер для хранения плотно закрыт.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Микродиссекция даст образцы A/S и F/V относительно равномерной толщины, которые могут быть установлены на (коммерческом) двухосном испытательном устройстве. Гистологический анализ неповрежденного листочка и двух рассеченных слоев проверит, правильно ли ткань была разделена вдоль границы между губчатой и фиброзой (рисунок 7). Кроме того, гистологические микроснимки могут быть использованы для определения толщины слоя ткани и составляющих массовых фракций с использованием программного обеспечения ImageJ. Неудачная рассечение происходит, когда он производит образец A/S, который слишком мал для установки на двухосевой тестер. Это чаще всего происходит, когда A/S разрывается во время пилинга или когда в F/V слое возникает отверстие из-за толстых хорд.

Контролируемые смещением механические испытания и постобработка дают данные о напряжении деформации, описывающие нелинейное механическое поведение ткани (рисунок 8). Образцы, как правило, анизотропны, где направление окружной ткани имеет более жесткую механическую реакцию, чем направление радиальной ткани (таблица 1). Эти низкорастягивающие и высокорастягивающие свойства могут быть количественно определены с помощью дополнительных методов анализа 6,14. Коллективная оценка диапазона соотношений двухосных сил дает дополнительное представление о направленной связи ткани (т. Е. Сила оси X зависит от силы оси Y и наоборот). Важно отметить, что механическое поведение одного направления ткани в этих различных соотношениях сил может проявлять компрессионные деформации во время неэквивибиаксиальных деформаций. Это уникальное поведение обычно возникает из-за высоко выровненных коллагеновых волокон вдоль направления сжимающей ткани.

Данные pSFDI дают цветовые карты ориентации коллагенового волокна и DOA (рисунок 9). В частности, эти цветовые карты обеспечивают всестороннее понимание архитектуры коллагенового волокна во всем образце ткани. Одним из уникальных преимуществ метода неразрушающего pSFDI является возможность сравнивать результаты в различных конфигурациях нагрузки и понимать, как коллагеновые волокна переориентируются и разгибаются / выравниваются для поддержки приложенной нагрузки. Эти результаты являются неоптимальными, если проецируемый свет слишком яркий или темный во время визуализации, если проецируемый свет не поддерживается последовательно через неповрежденный листок и его слои, если на образце есть большие пузырьки или мусор, если на ткани слишком много клея от размещения фидуциальных маркеров или если уровень водяной бани становится слишком низким и создает точки яркого света. Все это приводит к неточным представлениям отраженной интенсивности по сравнению с данными угла поляризатора, что мешает определенной ориентации волокна и вычисляемому DOA.

Figure 1
Рисунок 1: Выбор области микродиссекции. (A) Идентификация проблемных областей, которых следует избегать, и (B) целевой области для микродиссекции слоя. Шкала = 10 мм (A, B). Сокращения: Рад. = радиальный; Окружность = окружность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Система pSFDI интегрирована с двухосным испытательным устройством. Ключевые компоненты обоих устройств маркированы. Сокращения: pSFDI = поляризованная пространственная частотная область визуализации7; DLP = цифровая обработка света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Начало микродиссекции листочка. (A) Растяжение ткани подтянутой при размещении штифтов, (B) закрепленная ткань, готовая к микродиссекции, (C) внесение первого разреза в композитный слой A/S и (D) создание первого угла разрезов в композитный слой A/S. Шкала брусков = 10 мм. Сокращения: Рад. = радиальная; Circ. = окружность; A/S = атриалис/спонгиоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Разделение композитного слоя A/S. (A) Расширение разрезов на композитный слой A/S, (B) разделение композитного слоя A/S путем тщательного отслаивания и (C) создание второго угла. Шкала шкалы = 10 мм. Сокращения: Рад. = радиальная; Circ. = окружность; A/S = атриалис/спонгиоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Потенциальные проблемы во время микродиссекции листовки. (A) Неудачное разделение композитных слоев A/S и F/V, (B) корректировка площади микродиссекции во избежание вставки хорд, (C) создание нового разделительного шва из-за нежелательного отверстия и (D) межслойное соединение, соединяющее композитные слои A/S и F/V. Шкала стержней = 5 мм (A-C), 10 мм (D). Сокращения: Рад. = радиальный; Circ. = окружность; A/S = атриалис/спонгиоза; F/V = фиброза/желудочковый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Завершение микродиссекции. (A) Обозначение правого верхнего угла для ориентации, (B) разделение A/S с помощью ножниц и (C) извлечение композитного слоя F/V с маркировкой ориентации. Шкала = 10 мм Аббревиатуры: Рад. = радиальная; Circ. = окружность; A/S = атриалис/спонгиоза; F/V = фиброза/желудочковый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Гистологическая оценка. Микроснимки, показывающие окружные поперечные сечения неповрежденной листовки (A) и (B) правильно разделенных слоев A/S и F/V. Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: атриалис/спонгиоза; F/V = фиброза/желудочковая; VIC = клапанная интерстициальная клетка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Репрезентативные результаты двухосных механических испытаний для равнобиаксиального коэффициента нагрузки. Данные о натяжении мембраны в сравнении с данными о растяжении (А) переднего листа трехстворчатого клапана, (В) заднего листа трехстворчатого клапана и (С) листа перегородки трехстворчатого клапана. Сокращения: атриалис/спонгиоза; F/V = фиброза/желудочковый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Репрезентативные результаты pSFDI. (A) Необработанное изображение листовки во время оценки pSFDI, (B) количественная ориентация волокна, показанная с помощью цветовой карты, и (C) количественная степень оптической анизотропии, показанная с помощью цветовой карты, с указанием выравнивания волокон. Стрелками обозначены области с избытком клея от фидуциальных маркеров. Верхний ряд демонстрирует хорошие изображения, в то время как нижний ряд демонстрирует плохие изображения. Шкала брусков = 4 мм. Аббревиатуры: град. = градусы; DOA = степень оптической анизотропии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Композитный слой λокружность λрад
А/С 1.26 ± 0.05 1.37 ± 0.05
Ф/В 1.17 ± 0.03 1.32 ± 0.08

Таблица 1: Среднее растяжение композитного слоя. Средние пиковые растяжки композитных слоев, показывающие ожидаемые изменения в механическом поведении. Эта таблица извлечена из 9. Сокращения: атриалис/спонгиоза; F/V = фиброза/желудочковый.

Дополнительный рисунок S1: Определение областей, которых следует избегать во время микродиссекции. (A) Изучение желудочковой стороны образца ткани на предмет введения хорд, (B) отслеживание, где находятся сложные участки, когда ткань помещена атриальными наклонами вверх, и (C) планирование первоначальных разрезов, чтобы избежать идентифицированных областей. Шкала шкалы = 10 мм. Сокращения: Рад. = радиальная; Окружность = окружность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Демонстрация трения вдоль порезов. (А) Срез перед трением тупым пинцетом и (В) края среза, отделяющиеся еще больше после трения. Шкала шкалы = 10 мм. Сокращения: Рад. = радиальная; Окружность = окружность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Неподключающие разрезы. Пинцет используется для идентификации тонкой области ткани, разделяющей два разреза, прежде чем аккуратно разрезать ткань ножницами. Шкала шкалы = 10 мм. Сокращения: Рад. = радиальная; Окружность = окружность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические этапы для протокола включают: (i) микродиссекцию слоя, (ii) крепление ткани, (iii) размещение фидуциального маркера и (iv) установку pSFDI. Микродиссекция соответствующего слоя является наиболее важным и сложным аспектом способа, описанного в настоящем описании. Прежде чем начать расследование с использованием этого метода, диссектор (диссекторы) должен иметь долгосрочную практику с техникой микродиссекции и всеми тремя телевизионными листовками. Диссектор должен обеспечивать, чтобы образцы композитного слоя были достаточно большими (>3,3 мм) и имели равномерную толщину. Гистология должна быть использована для подтверждения того, что рассечения последовательно имеют точное разделение слоев.

Для крепления ткани ткань должна быть прикреплена к двухосному тестеру таким образом, чтобы ткань была плоской без какого-либо искусственного растяжения или сморщивания. Эти ошибки приведут к неточным механическим данным. Композитные слои более подвержены этим ошибкам из-за их более тонкой природы. При прикреплении фидуциальных маркеров крайне важно, чтобы маркеры располагались в центральной трети области ткани и не прилипали друг к другу. Неправильное размещение маркеров приведет к неточной количественной оценке растяжений тканей. Наконец, проецируемая pSFDI яркость света должна быть тщательно отобрана и оставаться неизменной для неповрежденной ткани и композитных слоев. Если яркость изменяется, результаты pSFDI не могут быть сопоставлены между неповрежденной тканью и ее составными слоями.

Гибкость способа, описанного в настоящем описании, заключается главным образом в двухосной механической характеристике, в то время как большая часть поиска и устранения неисправностей возникает во время микроструктурной количественной оценки коллагена на основе pSFDI. Протоколы испытаний с контролируемым смещением обеспечивают два ключевых преимущества по сравнению с альтернативными протоколами испытаний с контролируемой силой: (i) кривые напряжения-растяжения являются более плавными без колебаний и (ii) скорость перемещения (мм/с) и скорость деформации (%/с) могут контролироваться напрямую, а не скоростью нагрузки (Н/м). Тем не менее, по-прежнему крайне важно выполнить контролируемое силой предварительное кондиционирование перед механической характеристикой, чтобы получить повторяемые кривые смещения силы и определить конфигурацию ткани, которая обеспечивает равнобиаксиальное напряжение. После определения эквибиаксиальной конфигурации другие желаемые коэффициенты нагрузки (например, TXX: TYY = 1: 0,5 и TXX: TYY = 0,5: 1) могут быть определены путем ручной пробежки линейных приводов. Это позволяет высокоточно воспроизводить целевое двухосное напряжение с дополнительными преимуществами схемы с контролируемым смещением. Кроме того, этот универсальный протокол механических испытаний может быть скорректирован для учета большего количества коэффициентов нагрузки или других уникальных условий нагрузки, таких как чистый сдвиг или расслабление напряжения. Дополнительная количественная оценка pSFDI может быть включена в эти новые протоколы или в отдельных точках вдоль путей загрузки. Прежде чем выполнять эти характеристики pSFDI, невероятно важно убедиться, что на ткани нет бликов, пузырьков или мусора. Часто необходимо тестировать различные ориентации поляризатора, высоту жидкости в ванне PBS или методы предотвращения / удаления мусора и пузырьков, чтобы обеспечить успешную и точную количественную оценку pSFDI.

Существует три основных ограничения микродиссекции слоя. Во-первых, неповрежденная ткань может быть разделена только на два композитных слоя, что означает, что все четыре анатомических слоя не могут быть индивидуально изолированы. Это связано с тем, что ткань слишком тонкая, чтобы попытаться разделить все четыре анатомических слоя, а отсутствие структурных компонентов в губчатой оболочке исключает ее микродиссекцию. Во-вторых, этот протокол использует воду DI вместо PBS. В то время как PBS ближе к физиологической среде15, использование PBS во время тестирования привело к последовательным, неудачным рассечениям из-за частого разрыва композитного слоя A /S. Использование воды DI сразу же увеличило легкость и успешность рассечений, значительно уменьшив вероятность появления отверстий и разрывов в композитном слое A/S. В-третьих, хотя экспериментальный протокол предназначен для предоставления согласованных данных между неповрежденными и составными слоями, существуют заметные различия между образцами в механических и микроструктурных свойствах (таблица 1). Эта изменчивость может несколько сбить с толку анализ данных; однако наш опыт9 и обширные исследования из литературы 4,5,16,17 показывают, что он попадает в типичные результаты механической характеристики трехстворчатого клапана.

Представленный протокол имеет важное значение по трем основным причинам. Во-первых, это единственный протокол, который успешно разделяет слои всех трех телевизионных листовок. Во-вторых, структура этого протокола позволяет напрямую сравнивать механические и коллагеновые архитектурные свойства неповрежденной телевизионной листовки с ее составными слоями. В-третьих, эта уникальная система pSFDI позволяет количественно оценивать и визуализировать зависящие от нагрузки изменения в архитектуре коллагенового волокна.

Этот метод расслоения слоя может быть применен к дополнительным тканям со слоистой морфологией, таким как глаз или кожа. Комбинированная механико-структурная структура характеристики также может быть использована для тканей с установленными процедурами разделения слоев, таких как оставшиеся сердечные клапаны, артерии или ткани пищевода 18,19,20. В то время как механическое тестирование играет определенную роль в понимании механических свойств биологических тканей, pSFDI является гораздо более новой разработкой, которая еще не полностью реализована в сообществе биомеханики мягких тканей. Этот протокол обеспечивает новый метод синтеза этих методов для биологических тканей и обеспечивает дальнейшее понимание отношений между тканью и микроструктурой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Грантом американской кардиологической ассоциации на развитие ученых (16SDG27760143) и Пресвитерианским фондом здоровья. KMC был частично поддержан Программой исследовательских возможностей для студентов Университета Оклахомы (OU) и Программой обучения исследованиям с отличием. DWL был частично поддержан Стипендией Национального научного фонда для аспирантов (GRF 2019254233) и Американской кардиологической ассоциацией / Фондом детского сердца Predoctoral Fellowship (награда No 821298). Вся эта поддержка с благодарностью признается.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Solution, Neutral Buffered Sigma-Aldrich HT501128-4L
Alconox Detergent Alconox cleaning compound
BioTester - Biaxial Tester CellScale Biomaterials Testing 1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat Dahle B0027RS8DU
Deionized Water N/A
Fine-Tipped Tool HTI INSTRUMENTS NSPLS-12
Forceps - Curved Scientific Labwares 16122
Forceps - Thick Scientific Labwares 161001078
Forceps - Thin Scientific Labwares 16127
LabJoy CellScale Biomaterials Testing Version 10.66
Laser Displacement Sensor Keyence IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue Loctite 2436365
MATLAB MathWorks Version 2020a
Micro Scissors HTI Instruments CAS55C
Pipette Belmaks 360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device N/A Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera.
See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel THINKPRICE TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) VWR International H3515541105024
Surgical Pen LabAider LAB-Skin-6
T-Pins Business Source BSN32351
Wax Board N/A Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat Pure Ponta mdo-azoc-1030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
  2. Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
  3. Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
  4. Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
  5. Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
  6. Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
  7. Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).
  8. Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
  9. Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
  10. Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
  11. Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
  12. Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
  13. Reddy, J. N. An Introduction to Continuum Mechanics. , Cambridge University Press. (2013).
  14. Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
  15. Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).
  16. Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
  17. Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
  18. Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
  19. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
  20. Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).

Tags

Биоинженерия выпуск 180
Микродиссекция слоев трехстворчатых клапанных листовок для двухосной механической характеристики и микроструктурной количественной оценки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casey, K. M., Laurence, D. W., Tang, … More

Casey, K. M., Laurence, D. W., Tang, M., Lee, C. H. Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification. J. Vis. Exp. (180), e63522, doi:10.3791/63522 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter