Layer Microdissection av Tricuspid Valve Broschyrer för biaxial mekanisk karakterisering och mikrostrukturell kvantifiering
Summary
Detta protokoll beskriver den biaxiella mekaniska karakteriseringen, polariserad rumslig frekvensdomänavbildningsbaserad kollagenkvantifiering och mikrodissektion av tricuspidventilblad. Den tillhandahållna metoden belyser hur bipacksedellagren bidrar till de holistiska bipacksedelsbeteendena.
Abstract
Tricuspidventilen (TV) reglerar det enkelriktade flödet av ooxygenerat blod från höger atrium till höger kammare. TV: n består av tre broschyrer, var och en med unika mekaniska beteenden. Dessa variationer mellan de tre TV-broschyrerna kan förstås ytterligare genom att undersöka deras fyra anatomiska lager, som är atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) och ventricularis (V). Även om dessa lager finns i alla tre TV-broschyrerna, finns det skillnader i deras tjocklekar och mikrostrukturella beståndsdelar som ytterligare påverkar deras respektive mekaniska beteenden.
Detta protokoll innehåller fyra steg för att belysa de lagerspecifika skillnaderna: (i) karakterisera de mekaniska och kollagenfiberarkitekturella beteendena hos den intakta TV-broschyren, (ii) separera de sammansatta skikten (A / S och F / V) i TV-broschyren, (iii) utföra samma karakteriseringar för de sammansatta skikten och (iv) utföra post-hoc histologi bedömning. Denna experimentella ram möjliggör unikt en direkt jämförelse av den intakta TV-vävnaden med vart och ett av dess sammansatta lager. Som ett resultat kan detaljerad information om tv-broschyrernas mikrostruktur och biomekaniska funktion samlas in med detta protokoll. Sådan information kan potentiellt användas för att utveckla TV-beräkningsmodeller som försöker ge vägledning för klinisk behandling av TV-sjukdom.
Introduction
TV: n ligger mellan höger atrium och höger kammare i hjärtat. Under hela hjärtcykeln reglerar TV: n det enkelriktade blodflödet via cyklisk öppning och stängning av TV: ns främre bipacksedel (TVAL), TV: ns bakre broschyr (TVPL) och TV-septalbroschyren (TVSL). Dessa broschyrer är komplexa och har fyra distinkta anatomiska lager – atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) och ventricularis (V) – med unika mikrostrukturella beståndsdelar. Elastinfibrerna i atrialis och ventricularis hjälper till att återställa vävnaden till sin odeformerade geometri efter mekanisk belastning1. Däremot innehåller fibrosa ett tätt nätverk av undulaterade kollagenfibrer som bidrar till bipacksedelns bärförmåga2. Spongiosa består huvudsakligen av glykosaminoglykaner och har antagits möjliggöra skjuvning mellan bipacksedelskikt under hjärtklafffunktion3. Medan alla tre broschyrtyperna har samma anatomiska lager, finns det variationer i skiktens tjocklekar och beståndsdelar som har konsekvenser för broschyrspecifika mekaniska beteenden.
Forskare har undersökt egenskaperna hos TV-broschyrerna med hjälp av plana mekaniska karakteriseringar, histomorfologiska bedömningar och optiska karakteriseringar av kollagenfiberarkitekturen. Till exempel försöker plana biaxiella mekaniska karakteriseringar att emulera fysiologisk belastning genom att applicera vinkelräta förskjutningar på vävnaden och registrera de associerade krafterna. De resulterande kraftförskjutningsobservationerna (eller spänningssträckningsobservationerna) har avslöjat att alla tre TV-broschyrer uppvisar olinjära, riktningsspecifika mekaniska beteenden med mer uppenbara broschyrspecifika svar i radiell vävnadsriktning 4,5,6. Dessa broschyrspecifika beteenden tros härröra från skillnader i de mikrostrukturella egenskaper som observerats med hjälp av standard histologiska tekniker 6,7. Vidare syftar andra harmoniska generationens avbildning6, ljusspridning med liten vinkel8 och polariserad rumslig frekvensdomänavbildning7 (pSFDI) till att förstå dessa mikrostrukturella egenskaper och har visat broschyrspecifika skillnader i kollagenfiberorientering och fiberkrump som har konsekvenser för de observerade mekaniska beteendena på vävnadsnivå. Dessa studier har avsevärt förbättrat vår förståelse av vävnadsmikrostrukturen och dess roll i vävnadsnivåbeteenden. Mycket återstår dock att ta itu med när det gäller att experimentellt koppla samman vävnadsmekaniken och den underliggande mikrostrukturen.
Nyligen utförde detta laboratorium mekaniska karakteriseringar av TV-broschyrskikten separerade i två sammansatta lager (A / S och F / V) med hjälp av en mikrodissektionsteknik9. Det tidigare arbetet belyste skillnader i skiktens mekaniska egenskaper och bidrog till att ge insikt i hur den skiktade mikrostrukturen bidrar till vävnadens mekaniska beteenden. Även om denna undersökning förbättrade vår förståelse av TV-broschyrens mikrostruktur, hade tekniken flera begränsningar. För det första jämfördes inte egenskaperna hos de sammansatta skikten direkt med den intakta vävnaden, vilket ledde till brist på fullständig förståelse för förhållandet mellan mekanik och mikrostruktur. För det andra undersöktes inte kollagenfiberarkitekturen hos de sammansatta skikten. För det tredje undersöktes endast skikten i TVAL på grund av svårigheter med att samla in de sammansatta skikten från de andra två TV-broschyrerna. Metoden som beskrivs häri ger en holistisk karakteriseringsram som övervinner dessa begränsningar och ger fullständiga karakteriseringar av TV-broschyrerna och deras sammansatta lager.
Detta dokument beskriver mikrodissektionstekniken som separerar de tre TV-broschyrerna i deras sammansatta lager (A / S och F / V) för biaxiella mekaniska och mikrostrukturella karakteriseringar 10,11,12. Detta iterativa protokoll inkluderar (i) biaxiell mekanisk testning och pSFDI-karakterisering av den intakta broschyren, (ii) en ny och reproducerbar mikrodissektionsteknik för att på ett tillförlitligt sätt erhålla de sammansatta TV-skikten, och (iii) biaxiell mekanisk testning och pSFDI-karakterisering av de sammansatta TV-skikten. Vävnaden utsattes för biaxiell dragbelastning med olika kraftförhållanden för mekanisk testning. Sedan användes pSFDI för att bestämma kollagenfiberorienteringen och inriktningen vid olika laddade konfigurationer. pSFDI bevarar den inhemska kollagenfiberarkitekturen, möjliggör belastningsberoende analys och kringgår det typiska behovet av att fixa eller rensa vävnad för kollagenfiberarkitekturanalys, såsom vid andra harmoniska generationens avbildning eller ljusspridning med liten vinkel. Slutligen framställdes vävnaderna med hjälp av standard histologitekniker för att visualisera vävnadsmikrostrukturen. Denna iterativa och holistiska ram möjliggör direkt jämförelse av TV-broschyrens mekaniska och mikrostrukturella egenskaper med dess sammansatta lager.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg för protokollet inkluderar: (i) skiktmikrodissektion, (ii) vävnadsmontering, (iii) fiducialmarkörplacering och (iv) pSFDI-installationen. Lämplig skiktmikrodissektion är den viktigaste och svåraste aspekten av metoden som beskrivs häri. Innan en utredning inleds med hjälp av denna teknik bör dissekatorn/dissektorerna ha långvarig praxis med mikrodissektionstekniken och alla tre TV-broschyrerna. Dissekatorn bör säkerställa att de sammansatta skiktproverna är tillräckligt stora (>3,3 mm) och ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) och Presbyterian Health Foundation. KMC stöddes delvis av University of Oklahoma (OU) Undergraduate Research Opportunity Program och Honors Research Apprenticeship Program. DWL stöddes delvis av National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) och American Heart Association/Children’s Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award #821298). Allt detta stöd erkänns tacksamt.
Materials
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester – Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps – Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps – Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps – Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
References
- Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
- Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
- Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
- Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
- Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
- Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
- Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).
- Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
- Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
- Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -. H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
- Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
- Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
- Reddy, J. N. . An Introduction to Continuum Mechanics. , (2013).
- Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -. H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
- Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).
- Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
- Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
- Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
- Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
- Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
