A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Detta protokoll beskriver den biaxiella mekaniska karakteriseringen, polariserad rumslig frekvensdomänavbildningsbaserad kollagenkvantifiering och mikrodissektion av tricuspidventilblad. Den tillhandahållna metoden belyser hur bipacksedellagren bidrar till de holistiska bipacksedelsbeteendena.

Abstract

Tricuspidventilen (TV) reglerar det enkelriktade flödet av ooxygenerat blod från höger atrium till höger kammare. TV: n består av tre broschyrer, var och en med unika mekaniska beteenden. Dessa variationer mellan de tre TV-broschyrerna kan förstås ytterligare genom att undersöka deras fyra anatomiska lager, som är atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) och ventricularis (V). Även om dessa lager finns i alla tre TV-broschyrerna, finns det skillnader i deras tjocklekar och mikrostrukturella beståndsdelar som ytterligare påverkar deras respektive mekaniska beteenden.

Detta protokoll innehåller fyra steg för att belysa de lagerspecifika skillnaderna: (i) karakterisera de mekaniska och kollagenfiberarkitekturella beteendena hos den intakta TV-broschyren, (ii) separera de sammansatta skikten (A / S och F / V) i TV-broschyren, (iii) utföra samma karakteriseringar för de sammansatta skikten och (iv) utföra post-hoc histologi bedömning. Denna experimentella ram möjliggör unikt en direkt jämförelse av den intakta TV-vävnaden med vart och ett av dess sammansatta lager. Som ett resultat kan detaljerad information om tv-broschyrernas mikrostruktur och biomekaniska funktion samlas in med detta protokoll. Sådan information kan potentiellt användas för att utveckla TV-beräkningsmodeller som försöker ge vägledning för klinisk behandling av TV-sjukdom.

Introduction

TV: n ligger mellan höger atrium och höger kammare i hjärtat. Under hela hjärtcykeln reglerar TV: n det enkelriktade blodflödet via cyklisk öppning och stängning av TV: ns främre bipacksedel (TVAL), TV: ns bakre broschyr (TVPL) och TV-septalbroschyren (TVSL). Dessa broschyrer är komplexa och har fyra distinkta anatomiska lager – atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) och ventricularis (V) – med unika mikrostrukturella beståndsdelar. Elastinfibrerna i atrialis och ventricularis hjälper till att återställa vävnaden till sin odeformerade geometri efter mekanisk belastning¹. Däremot innehåller fibrosa ett tätt nätverk av undulaterade kollagenfibrer som bidrar till bipacksedelns bärförmåga². Spongiosa består huvudsakligen av glykosaminoglykaner och har antagits möjliggöra skjuvning mellan bipacksedelskikt under hjärtklafffunktion³. Medan alla tre broschyrtyperna har samma anatomiska lager, finns det variationer i skiktens tjocklekar och beståndsdelar som har konsekvenser för broschyrspecifika mekaniska beteenden.

Forskare har undersökt egenskaperna hos TV-broschyrerna med hjälp av plana mekaniska karakteriseringar, histomorfologiska bedömningar och optiska karakteriseringar av kollagenfiberarkitekturen. Till exempel försöker plana biaxiella mekaniska karakteriseringar att emulera fysiologisk belastning genom att applicera vinkelräta förskjutningar på vävnaden och registrera de associerade krafterna. De resulterande kraftförskjutningsobservationerna (eller spänningssträckningsobservationerna) har avslöjat att alla tre TV-broschyrer uppvisar olinjära, riktningsspecifika mekaniska beteenden med mer uppenbara broschyrspecifika svar i radiell vävnadsriktning ^4,5,6. Dessa broschyrspecifika beteenden tros härröra från skillnader i de mikrostrukturella egenskaper som observerats med hjälp av standard histologiska tekniker ^6,7. Vidare syftar andra harmoniska generationens avbildning⁶, ljusspridning med liten vinkel⁸ och polariserad rumslig frekvensdomänavbildning⁷ (pSFDI) till att förstå dessa mikrostrukturella egenskaper och har visat broschyrspecifika skillnader i kollagenfiberorientering och fiberkrump som har konsekvenser för de observerade mekaniska beteendena på vävnadsnivå. Dessa studier har avsevärt förbättrat vår förståelse av vävnadsmikrostrukturen och dess roll i vävnadsnivåbeteenden. Mycket återstår dock att ta itu med när det gäller att experimentellt koppla samman vävnadsmekaniken och den underliggande mikrostrukturen.

Nyligen utförde detta laboratorium mekaniska karakteriseringar av TV-broschyrskikten separerade i två sammansatta lager (A / S och F / V) med hjälp av en mikrodissektionsteknik⁹. Det tidigare arbetet belyste skillnader i skiktens mekaniska egenskaper och bidrog till att ge insikt i hur den skiktade mikrostrukturen bidrar till vävnadens mekaniska beteenden. Även om denna undersökning förbättrade vår förståelse av TV-broschyrens mikrostruktur, hade tekniken flera begränsningar. För det första jämfördes inte egenskaperna hos de sammansatta skikten direkt med den intakta vävnaden, vilket ledde till brist på fullständig förståelse för förhållandet mellan mekanik och mikrostruktur. För det andra undersöktes inte kollagenfiberarkitekturen hos de sammansatta skikten. För det tredje undersöktes endast skikten i TVAL på grund av svårigheter med att samla in de sammansatta skikten från de andra två TV-broschyrerna. Metoden som beskrivs häri ger en holistisk karakteriseringsram som övervinner dessa begränsningar och ger fullständiga karakteriseringar av TV-broschyrerna och deras sammansatta lager.

Detta dokument beskriver mikrodissektionstekniken som separerar de tre TV-broschyrerna i deras sammansatta lager (A / S och F / V) för biaxiella mekaniska och mikrostrukturella karakteriseringar 10,11,12. Detta iterativa protokoll inkluderar (i) biaxiell mekanisk testning och pSFDI-karakterisering av den intakta broschyren, (ii) en ny och reproducerbar mikrodissektionsteknik för att på ett tillförlitligt sätt erhålla de sammansatta TV-skikten, och (iii) biaxiell mekanisk testning och pSFDI-karakterisering av de sammansatta TV-skikten. Vävnaden utsattes för biaxiell dragbelastning med olika kraftförhållanden för mekanisk testning. Sedan användes pSFDI för att bestämma kollagenfiberorienteringen och inriktningen vid olika laddade konfigurationer. pSFDI bevarar den inhemska kollagenfiberarkitekturen, möjliggör belastningsberoende analys och kringgår det typiska behovet av att fixa eller rensa vävnad för kollagenfiberarkitekturanalys, såsom vid andra harmoniska generationens avbildning eller ljusspridning med liten vinkel. Slutligen framställdes vävnaderna med hjälp av standard histologitekniker för att visualisera vävnadsmikrostrukturen. Denna iterativa och holistiska ram möjliggör direkt jämförelse av TV-broschyrens mekaniska och mikrostrukturella egenskaper med dess sammansatta lager.

Protocol

Alla metoder som beskrivs häri godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Oklahoma. Djurvävnader förvärvades från ett USDA-godkänt slakteri. 1. Biaxial mekanisk karakterisering Vävnadsberedning Hämta en TV-broschyr från frysen, rakblad, en kirurgisk penna, pincett, en pipett med avjoniserat (DI) vatten och en skärmatta. Tina TV-broschyren med 2-3 droppar rumstemperatur DI-vatten.OBS: DI-vatten används istället för fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att undvika PBS-inducerade svårigheter för skiktmikrodissektion. Lägg provet platt på skärmattan med ventricularisskiktet (dvs ytan med chordae-infogningarna) uppåt. Placera provexemplaret så att den radiella riktningen justeras mot Y-riktningen och omkretsriktningen justeras mot X-riktningen.OBS: Omkretsriktningen är orienterad längs ventilens omkrets. Undersök vävnadens insättningsställen. Bestäm ett område, helst ~ 12 x 12 mm, med minst antal stora chordae-infogningar samtidigt som du undviker extremt tunna (dvs. transparenta) områden (figur 1). Vänd provet så att förmaksytan (dvs ytan utan chordae-infogningar) är vänd uppåt. Se till att anvisningarna för den omgivande och radiella bipacksedeln förblir i linje med X- respektive Y-axlarna. Skär ett fyrkantigt prov på 12 x 12 mm från bipacksedelns vävnad som undviker de stora chordae-insättningarna eller tunna ytorna som identifieras i steg 1.1.3. Ta bort de trimmade delarna av broschyrvävnaden med tången och placera dem i en avfallsbehållare. Om det inte är möjligt att helt undvika stora chordae-infogningar, skär vävnaderna så att de ligger längs kanten på det fyrkantiga provet. Att undvika chordae-infogningar är viktigt eftersom det hjälper till att förhindra problem för den senare mikrodissektion. Använd en kirurgisk penna för att placera en liten prick i det övre högra hörnet för att spåra provets orientering. Låt bläcket torka i cirka 30 s. Vänd provet med den ventrikulära ytan (dvs ytan med kordala infogningar) uppåt. Trimma koralfästena på baksidan av vävnaden genom att sträcka chordae från bipacksedeln och använda ett rakblad för att skära nära dess insättningsplats. Vänd provet igen så att förmaksytan (dvs den släta ytan) är vänd uppåt. Mätning av tjocklek Hämta en icke-kontakt laserförskjutningssensor. Nollställ förskjutningssensorn på en plan del av skärmattan nära den trimmade vävnaden.VARNING: Lys inte lasern direkt i ögonen. Placera lasern över provets centrala område. Ta bort luft som fastnat under bipacksedelns yta eftersom det kan orsaka mätfel. För att släppa ut instängd luft, använd antingen pincett för att skjuta bubblan till kanten av vävnaden eller lyft ett hörn av vävnaden. Registrera tjockleken som visas på förskjutningssensorns display. Upprepa ytterligare två mätningar på andra platser i provet. Beräkna den genomsnittliga broschyrtjockleken med hjälp av de tre mätningar som registrerades i föregående steg. Använd det här värdet när du skapar de biaxiella mekaniska karakteriseringsprotokollen. Biaxial testare installation och vävnadsmontering Förbered ett DI-vattenbad vid 37 °C, i enlighet med testsystemets riktlinjer, för att säkerställa temperaturen under fysiologiska förhållanden in vivo . Hämta pincett, vävnadsprovet, monteringshårdvara, ett finspetsat verktyg, flytande cyanoakrylatlim och svartmålade glaspärlor (diameter: 300-500 μm).OBS: Monteringshårdvara inkluderar pinnarna, monteringsbryggan och monteringsgummit. Montera vävnadsprovet på testsystemet. Se till att vävnadens omkretsriktning överensstämmer med X-riktningen, som kan hjälpas av den punkt som tidigare placerats i steg 1.1.6.OBS: Pinnarna som används här bör vara jämnt fördelade över hela vävnadskantlängden. Den effektiva kantlängden är inställd på 10 mm för den intakta vävnaden och >3,3 mm för kompositskikten. Placering av fiducialmarkör Identifiera den centrala en tredjedels kvadratregionen för den monterade vävnaden. Använd de ungefärliga hörnen av detta område för placering av fiducialmarkören. Placera glaspärlor i en vägningsbåt med öppen yta och skapa en liten pool med flytande cyanoakrylatlim i en separat vägbåt. Täck toppen av det finspetsade verktyget med en liten mängd lim. Dutta överflödigt lim på sidan av vägbåten. Skapa ett hörn av den centrala en tredjedels fyrkantiga matrisen genom att försiktigt trycka den limbelagda spetsen på vävnaden. Ta en glaspärla med pincett och placera den försiktigt ovanpå limpricken. Använd kameran på den biaxiella testenheten för att få hjälp med pärlplaceringen. Upprepa steg 1.4.2 och 1.4.3 för ytterligare tre pärlor tills den fyrkantiga matrisen har slutförts. Se till att pärlorna är ordentligt fastsatta och att deras respektive limprickar inte vidrör eller klibbar ihop. Torka limet innan du sänker vävnaden i vattenbadet. Om pärlorna sitter fast ihop, vänta tills limet torkar, använd sedan pincetten för att försiktigt ta tag i pärlan eller limet och dra bort det från vävnaden.OBS: Limmet och pärlorna ska lossna, så att pärlplaceringen kan sökas igen. Förkonditionering Skapa ett kraftstyrt förkonditioneringsprotokoll, där vävnaden med kantlängd och tjocklek kommer att genomgå sex repetitioner av ekvibisk belastning till en toppmembranspänning T-topp på 40 N / m med en förspänning på 3% × T-topp10 och sträck- och återhämtningstider på 30 s vardera. Skapa en godtycklig testkatalog som tillfälligt lagrar data för framtida beräkningar. Ställ in laddningshastigheten på 4,42 N/m. Skapa en ny testparameteruppsättning med namnet Preconditioning0. Ställ in X-axelns och Y-axelns kontrolllägen för att tvinga och ställ in kontrollfunktionerna på steg. Definiera belastningsstorleken som den kraft som är associerad med T-topp, dvs f-topp = T-topp · L. Definiera förspänningsstorleken som 3% av f-toppen endast för den första repetitionen och definiera både sträcklängden och återhämtningstiden som 30 s. Definiera antalet repetitioner som 10.OBS: Den beräknade toppen först Piola-Kirchhoff-stress, dvs P-topp = T-topp / t, kan överstiga 200 kPa för tunnare vävnader, vilket kan leda till vävnadsrivning under testning. I dessa scenarier justerades den maximala membranspänningen till en maximal första Piola-Kirchhoff-spänning på 200 kPa. Kör förkonditioneringsprotokollet. Efter förkonditionering, registrera provets aktuella X- och Y-dimensioner för användning i de biaxiella testprotokollen. Skapande och utförande av biaxiella testprotokoll Bestäm den tid som krävs för att uppnå den maximala ekvibialkonfigurationen från den efterkonditionerade konfigurationen med önskad förskjutningshastighet. Med tanke på en konstant förskjutningshastighet beräknar du laddningstiderna för de återstående belastningsförhållandena (dvs. TXX: TYY = 1: 0,5 och TXX: TYY = 0,5: 1). Jogga manuellt de linjära ställdonen för att matcha målkrafterna för ett givet belastningsförhållande. Upprepa denna process och registrera bipacksedelns mått för alla belastningsförhållanden. Förbered ett förskjutningsstyrt testprotokoll som biaxiellt förskjuter vävnaden från den efterkonditionerade konfigurationen till de konfigurationer som registrerats i steg 1.6.2 (dvs. TXX:TYY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) inom de tider som fastställs i steg 1.6.1. Se till att varje protokoll har tre laddnings- / lossningscykler för repeterbarhet av det mekaniska beteendet. Skapa en testkatalog som lagrar data för framtida beräkningar. Se till att katalognamnet matchar det aktuella exemplet. Konstruera en ny testparameteruppsättning med namnet 1: 1, ställ in X-axeln och Y-axelns kontrolllägen till förskjutning och ställ in kontrollfunktionerna på ramp. Definiera sträckstorleken som ska vara den konfiguration som registrerades i steg 1.6.1. Definiera förspänningsstorleken som 3 % av f-toppen för endast den första repetitionen och definiera både sträckningstiden och återhämtningstiden som den tid som registrerades i steg 1.6.1. Definiera antalet repetitioner som 3. Upprepa steg 1.6.3.2 för de återstående belastningsförhållandena (dvs. TXX:TYY = 1:0,5 och TXX:TYY = 0,5:1), förutom definiera förspänningsstorleken som ej tillämpad. Se till att sträckningens storlek, sträckningstid och återhämtningstid matchar de som registrerades i steg 1.6.2.OBS: Endast data från den avslutande (tredje) cykeln kommer att användas för stress- och töjningsanalyser. Kör de förskjutningsstyrda protokollen. Efter avslutad biaxial testning, återför vävnaden till dess efterkonditionerade dimensioner.OBS: Testet ska omedelbart avbrytas om vävnaden börjar riva. Ytterligare karakteriseringar Låt vävnaden vara nedsänkt i DI-vatten och monterad på det biaxiella testsystemet. Utför pSFDI-avbildning enligt beskrivningen i steg 2.1–2.3. Demontera vävnaden. Om det är en intakt vävnad, fortsätt till mikrodissektion som beskrivs i steg 3.1-3.7. Om inte, samla histologi enligt steg 3.7.OBS: DI-vattenbadet kan användas för efterföljande karakteriseringar inom samma dag. Upprepa steg 1.2-1.7 med A/S- och F/V-skikten som erhållits efter mikrodissektion (steg 3.1–3.6).OBS: Upprepningen av testprotokollet för skikten möjliggör direkt jämförelse av den intakta vävnaden med sina egna lager. Biaxiella testdata efter bearbetningsförfaranden Utför digital bildkorrelation av de förvärvade biaxiella testbilderna för att bestämma de tidsberoende markörpositionerna. Beräkna fiducialmarkörförskjutningarna via Eq (1). 5 (1)Häri är xi (t), Xi och di (t) den tidsberoende platsen, den initiala (referens) platsen och förskjutningen av markören i. Beräkna deformationsgradienten F genom att betrakta de fiduciella markörerna som ett bilinärt finita element med fyra noder, som visas i Eq (2)5 (2)Där BXi och BYi är derivatorna av formfunktionerna för nod i i X- respektive Y-riktningarna, och ui(t) och vi(t) är komponenterna i di(t): di(t) = [ui(t), vi(t)]T. Beräkna den applicerade första Piola-Kirchhoff-spänningen P med hjälp av de registrerade krafterna, som i Eq (3)5 (3)PXX och PYY är X- och Y-komponenterna i P; L och t är vävnadens kantlängd och tjocklek; fX och fY är de krafter som registreras i X- och Y-riktningarna. Bestäm andra töjnings- och spänningsmått efter behov,13 som inkluderar rätt Cauchy-Grön deformation C = FT /F, Green-Lagrange-stammen E = (C – I)/2, Cauchy-spänningen σ = J-1PFT och den andra Piola-Kirchhoff-spänningen S = F-1P. OBS: Häri är jag en andra ordningens identitetstensor, och J = det(F) är jacobianen för deformationsgradienten F. 2. Polariserad rumslig frekvensdomänavbildning Förberedelse av systemetOBS: Om så önskas kan fiduciella markörer tas bort från vävnaden före följande steg. Centrera pSFDI-enheten över provexemplaret (bild 2). Slå på projektorn och belys provet med 490 nm (cyan) ljus. Öppna kameraprogramvaran och inspektera kamerans synfält. Se till att provet är centrerat i ramen och är helt inneslutet i synfältet. Om det monterade provexemplaret är en intakt bipacksedel justerar du DLP-projektorns ljusstyrka (Digital Light Processing) för att säkerställa att vävnaden är helt upplyst utan bländningar på vävnadsytan. Justera inte ljusstyrkan om provet är ett av de sammansatta skikten. Vrid polarisatorn över hela dess rörelseområde för att upptäcka eventuella bländningar eller smuts på polarisatorlinsen. Rengör försiktigt polarisatorlinsen med en mikrofiberduk vid behov. DatainsamlingFöljande datainsamling kan automatiseras med hjälp av programvara, till exempel LabVIEW eller Python. Flytta polarisatorn till sin hemposition – helst i linje med en av de biaxiella testarxlarna. Ta en gråskalebild och spara den på datorn med polarisatorns plats (dvs. 0 °). Vrid polarisatorn 5° och ta en annan gråskalebild. Upprepa den här processen om du vill hämta 37 bilder som sträcker sig från 0° till 180° med ett steg på 5°.OBS: Bilderna från den första pSFDI-avbildningssekvensen kan preliminärt analyseras för att säkerställa önskat optiskt svar från vävnaden. Se steg 2.3 för instruktioner. Upprepa pSFDI-avbildningssekvensen för andra önskade vävnadskonfigurationer, till exempel toppkonfigurationerna för de laddningsprotokoll som beaktas för biaxiell mekanisk testning. Förfaranden för efterbehandling av pSFDI-dataOBS: Följande metod innehåller steg för MATLAB-programspråket. Alla föredragna språk (t.ex. Python, C ++) kan dock användas istället. Använd funktionen MATLAB imread() för att konstruera matriser som innehåller de pixelvisa intensiteterna för de 37 förvärvade bilderna. För enkelhets skyld, ordna dessa som en n × m × 37 tredimensionell matris, där n och m är antalet pixlar längs de två axlarna. Definiera vävnadsregionen av intresse (ROI) med hjälp av den användardefinierade grabit()- funktionen. Anpassa intensitets- och polarisatorvinkeldata för varje ROI-pixel med en 3-term Fourier-serie, som i Eq (4): (4)Häri är I(θ) den pixelvisa intensiteten som en funktion av polarisatorvinkeln, och bi är Fourierkonstanterna. Använd standard linjär minsta kvadratregression för att bestämma bi. Bestäm den pixelvisa fiberorienteringen som polarisatorvinkeln associerad med det maximala värdet på I (θ). Beräkna graden av optisk anisotropi (DOA) via Eq (5). (5) Använd plot() och histogram() för att visualisera de förvärvade fiberorienterings- och DOA-värdena. Spara de bearbetade resultaten för senare användning. 3. Mikrodissektion av kompositskikt för tricuspidventil Vävnadsfäste på vaxbräda Samla de nödvändiga materialen: vaxbräda, DI-vatten, pipett, skalpell, mikrosax, tunna pincett, böjda pincett, tjocka pincett och stift.OBS: Använd endast pincett utan tänder eller grepp, eftersom pincett av denna typ mycket lätt kan riva den tunna vävnaden i A / S-skiktet när du utför dissektion. Demontera vävnaden från den biaxiella testaren och mät dess tjocklek med hjälp av laserförskjutningssensorn som beskrivs i steg 1.2. Placera vävnaden på vaxbrädan. Undersök ventricularis-sidan av vävnaden för stora chordae-infogningar. Notera positionen för dessa infogningar för att undvika dem under dissektion (kompletterande figur S1). Ta ett fotografi som referens. Sprid vävnaden platt på vaxbrädan med atrialis uppåt. Fäst vävnaden på brädet med stiften: I varje hörn av vävnaden placerar du en stift som är vinklad bort från vävnaden (för bättre visning) och drar vävnaden något spänd (figur 3A). Gör detta medurs eller moturs. Se till att stiften är utanför hålen som skapas av pinnarna när du monterar vävnaden. Justera stiftplaceringen något för att säkerställa att vävnaden är spänd och i en fyrkantig konfiguration (figur 3B) så att vävnaden ligger platt och inte förskjuts under skiktets mikrodissektion. Placera vid behov stift längs vävnadens sida under dissektionen för att sträcka vävnaden mer. Tänk på när du placerar och metar ytterligare stift att de måste arbetas runt under dissektion. Ta bort glaspärlans fiduciella markörer.OBS: Följande steg är valfritt. Det tillsatta DI-vattnet hjälper till att upprätthålla vävnadshydrering och förhindrar att vävnaden fastnar på sig själv under hela mikrodissektionen. Använd en pipett och placera DI-vatten på vävnadens yta så att det helt täcker vävnaden på ett bubbelliknande sätt. Fyll på DI-vattnet efter behov under hela dissektionen. Gör det första hörnet. Välj ett hörn av det fästa exemplaret för att påbörja dissektion. Undvik stora chordae-inlägg och extremt tunna områden. Gör ett snitt i A/S-skiktet genom att lätt dra skalpellen över vävnadsytan längs monteringshålen från mekanisk testning (figur 3C). Se till att snittet är minst 5 mm långt och att snittets kanter börjar dra isär och avslöjar F / V-lagret under. Använd de tunna tångarna (utan en skarp spets) för att gnugga ordentligt längs snittet och dra isär kanterna på snittet (kompletterande figur S2). Om snittet i A/S-lagret inte börjar dra isär, spåra lätt över samma snitt igen med skalpellen tills det börjar göra detta. Var försiktig så att du inte skär för djupt i vävnaden (förbi A / S-kompositskiktet) eftersom det gör det svårare att separera skikten rent. Upprepa steg 3.2 och 3.2.3 för att göra ett andra snitt vinkelrätt mot det första snittet (figur 3D). Se till att de två skärningarna är anslutna och bildar ett hörn. Om de två snitten inte är anslutna, kör den tunna pincetten under det lilla vävnadsområdet som skiljer de två snitten (kompletterande figur S3). Använd sedan saxen försiktigt för att klippa vävnaden. Skala vävnaden från hörnet. Gnid längs snitten med de tunna pincetten tills vävnaden börjar separeras från F / V-skiktet. Så snart en liten bit vävnad är separerad, ta tag i den med pincetten och dra den försiktigt för att ytterligare separera kompositskikten.OBS: Placera alltid spetsen på den tunna pincetten förbi kanten på vävnaden när du tar tag i den. Annars kan de av misstag sticka in ett hål i A / S-kompositskiktet. Fortsätt att skala vävnaden och gnugga sömmen tills den når slutet av de två snitten som gjorts för hörnet. Under hela denna process, byt till större pincett för att ta tag i vävnaden för skalningsprocessen för att förhindra oönskad rippning och rivning av A / S-kompositskiktet. Om det första hörnförsöket har stora problem med separation kan du prova ett annat hörn som utgångspunkt (gå tillbaka till steg 3.2). Förläng snitt, skala vävnaden och gör ett andra hörn. Förläng de två snitten som gjorts för det första hörnet genom att placera skalpellspetsen längst ner på varje snitt och dra den lätt längs vävnadsytan (figur 4A). Se till att alla förlängningsskärningar är minst 5 mm och att de skurna förlängningarna ansluts till de ursprungliga snitten och fortsätter att följa tine- eller suturhålen.OBS: Om förlängningsskärningen är för djup måste den kommande skalningen övervakas noggrant för att säkerställa att delar av fibrosa inte separeras med A / S-kompositskiktet (figur 5A). Fortsätt att förlänga snitten och dra tillbaka det övre sammansatta A / S-lagret medan du gnuggar sömmen tills ena sidan är klar. Observera att vävnaden kommer att separeras helt längs ett snitt; se till att sömmen mellan de sammansatta A/S- och F/V-skikten är rak (figur 4B). Upprepa instruktionerna i steg 3.2 och steg 3.3 för att skapa ett andra hörn vinkelrätt mot slutet av den helt skalade sidan (bild 4C). Separera A/S-lagret helt. Förläng de återstående snitten samtidigt som du undviker stora chordae-infogningar. Fortsätt att separera A/S- och F/V-lagren med hjälp av gnidnings- och dragteknikerna som används för det första hörnet. Anteckna flera överväganden eller problem som kan uppstå under den här processen: Uteslut chordae-infogningarna från A/S-separationsområdet (figur 5B) endast när detta undantag tillåter ett A/S-prov som är tillräckligt stort för experimentella karakteriseringar (>3,3 mm). Om vävnaden tårar eller ett hål bildas, sluta separera vävnaden omedelbart. För att förhindra att pincett fångas, placera saxen i alla hål som bildas och skär vävnaden bort från mitten. Om defekten bildas längs separationssömmen, börja sedan separera vävnaden längs en annan kant för att förhindra ytterligare rivning (figur 5C). Leta efter mellanlageranslutningar som kan uppstå när vävnaden separeras och förhindra ytterligare separering av vävnaden utan hög risk för rippning (figur 5D). Observera att dessa är tunna men starka trådar som måste skäras noggrant med sax. Undvik att skapa ett hål i A/S-lagret eller skära nedåt i F/V-lagret, eftersom det skulle orsaka ojämn separation. Fortsätt den här processen tills största möjliga prov av A/S-lagret har separerats. Markera provets orientering med hjälp av operationspennan (figur 6A). Avsluta dissektion. Använd saxen för att skära längs separationssömmen för den återstående vävnadskanten (figur 6B). Se till att detta snitt är så nära separationssömmen som möjligt. Placera det separerade A/S-kompositskiktet plant på skärmattan. Använd vid behov skalpellen för att räta ut kanterna på vävnaden och skapa en fyrkantig vävnadsform som är lämplig för biaxiell mekanisk testning. Placera A/S-skiktet i DI-vatten tills det är klart att testas. Markera orienteringen för F/V-lagret som finns kvar på vaxbrädet. Klipp ut den största möjliga fyrkanten ur området där A/S-skiktet togs bort (figur 6C) och placera det sedan i DI-vatten. Histologi Skär ut två vävnadsremsor – i linje med omkrets- och radiella riktningar – för användning i histologi. Använd olika protokoll för de intakta och de sammansatta skikten (dvs. A / S och F / V). För det intakta skiktet, ta proverna från vävnaden som förblir fäst vid vaxbrädan. Använd vävnaden utanför tine/suturhålen, eftersom denna del av vävnaden inte har dissekerats och kommer att representera den intakta bipacksedeln. För de sammansatta A/S- och F/V-skikten ska du bara samla in histologiprover efter att ha slutfört testningen och avbildningarna. Demontera provet från det biaxiella testsystemet, lägg vävnaden platt på en skärmatta och skär ut de omgivande och radiella remsorna med ett rakblad. Placera de utskurna remsorna i vävnadskassetter och sänk ner kassetterna i 10% formalin. Kassera den återstående vävnaden. Rengör dissektionsverktygen med rengöringsförening (se materialtabellen). Efter 24-48 timmars fixering överför kassetterna till etanol, där de kan lagras på obestämd tid tills histologibehandling och färgning.OBS: Denna histologiska analys kan bekräfta att mikrodissektion är framgångsrik. VARNING: 10% formalin orsakar hudirritation och allvarlig ögonskada. Det kan också orsaka en allergisk reaktion eller cancer genom inandning. Vid hantering, använd lämplig personlig skyddsutrustning, såsom handskar, skyddsglasögon och en labbrock, och använd endast i välventilerade utrymmen, till exempel i en dragskåp. När den inte används, se till att förvaringsbehållaren är tätt stängd.

Representative Results

Mikrodissektion kommer att ge A / S- och F / V-prover med relativt enhetliga tjocklekar som kan monteras på en (kommersiell) biaxial testanordning. Histologianalys av den intakta bipacksedeln och de två dissekerade skikten kommer att verifiera om vävnaden separerades korrekt längs gränsen mellan spongiosa och fibrosa (figur 7). Dessutom kan histologimikrograferna användas för att bestämma vävnadsskiktets tjocklekar och ingående massfraktioner med hjälp av ImageJ-programvaran. En m…

Discussion

Kritiska steg för protokollet inkluderar: (i) skiktmikrodissektion, (ii) vävnadsmontering, (iii) fiducialmarkörplacering och (iv) pSFDI-installationen. Lämplig skiktmikrodissektion är den viktigaste och svåraste aspekten av metoden som beskrivs häri. Innan en utredning inleds med hjälp av denna teknik bör dissekatorn/dissektorerna ha långvarig praxis med mikrodissektionstekniken och alla tre TV-broschyrerna. Dissekatorn bör säkerställa att de sammansatta skiktproverna är tillräckligt stora (>3,3 mm) och ha…

Materials

10% Formalin Solution, Neutral Buffered	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Detergent	Alconox		cleaning compound
BioTester – Biaxial Tester	CellScale Biomaterials Testing		1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat	Dahle	B0027RS8DU
Deionized Water	N/A
Fine-Tipped Tool	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Forceps – Curved	Scientific Labwares	16122
Forceps – Thick	Scientific Labwares	161001078
Forceps – Thin	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale Biomaterials Testing	Version 10.66
Laser Displacement Sensor	Keyence	IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Version 2020a
Micro Scissors	HTI Instruments	CAS55C
Pipette	Belmaks	360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device	N/A		Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)	VWR International	H3515541105024
Surgical Pen	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Business Source	BSN32351
Wax Board	N/A		Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat	Pure Ponta	mdo-azoc-1030